Name: 성인 마우스의 급성 스트리아탈 슬라이스의 산소 소비율 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-08T12:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
Description: 배우세요 성인 마우스 급성 스트리아탈 슬라이스에서 산소 소비율을 측정하는 방법을. Seahorse XF 분석기를 활용하여 미토콘드리아 기능을 생리학적으로 관련성 높은 환경에서 평가합니다. 파킨슨병과 헌팅턴병 연구에 활용됩니다.

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우리는 Wangchen Tsering과 Pamela Walter가이 원고를 비판적으로 읽고 편집 한 것에 대해 감사드립니다. 이 연구는 National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) (NS054773에서 C.J. L., NS098393에서 H.Z.까지)와 Thomas Jefferson University의 신경 과학과 (Startup Funds to H.Z.)의 지원을 받았습니다.

동물 작업을 포함한 모든 절차는 국내 및 국제 지침에 따라 수행되었으며 토마스 제퍼슨 대학의 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다. 3 내지 14개월의 나이에 수컷 FVB/NTac 마우스를 사용하였다. 다음 단계는 멸균되지 않은 환경에서 수행되었지만 가능한 한 모든 것을 깨끗하게 유지하도록주의해야합니다.
참고 : 여기에 제시된 방법은 Zhi et al.24에 의해보고 된 연구에 확립되어 사용되었습니다. 여기에 설명 된 실험은 Seahorse XF24 세포외 플럭스 분석기를 사용했습니다 ( 표 참조). 이러한 방법은 XFe24 분석기에 적용할 수 있으며 일부 결과는 이 분석기를 사용하여 확인되었습니다.
1. 하이드레이트 카트리지 센서(분석 1일 전)
<ol><li>세포외 플럭스 분석 키트( 표 자료 참조)를 열고 센서 카트리지(녹색) 및 유틸리티 플레이트(클리어; 그림 1A). 센서 카트리지를 옆으로 두고(센서를 위로 올림) 센서를 만지지 마십시오.</li>
	<li>600 μL의 교정 용액(pH 7.4)을 유틸리티 플레이트의 각 웰에 첨가한다. 센서 카트리지를 유틸리티 플레이트 위에 놓고 센서를 교정 솔루션에 잠급니다. 유틸리티 및 센서 카트리지 플레이트의 삼각형 노치가 올바르게 정렬되어 있는지 확인합니다(그림 1B).</li>
	<li>세포외 플럭스 분석 키트를 교정 용액의 증발을 방지하기 위해 밀봉 필름으로 밀봉한 다음,CO2 또는 산소가 보충되지 않은 37°C 인큐베이터에 밤새 놓는다.</li>
</ol>2. 티슈 플레이트 준비(분석 당일)
<ol><li>췌도 포획 마이크로 플레이트를 열고 조직 앉기를 위해 췌도 플레이트를 꺼냅니다.</li>
	<li>사전 산소화된 개질된 인공 뇌척수액 (ACSF, 조성물 140 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 2.4 mM CaCl2, 1.3 mM MgSO4, 0.3 mM KH2PO4,25 mM 글루코스, 10 mM HEPES, pH 7.2) 완충액의적절한 부피 (웰 당 625 μL)를 50 mL 튜브 내에서 37°C로 가온하였다. 그런 다음 BSA를 최종 농도 4 mg / mL에 첨가하여 호흡 완충액을 준비하십시오. 일반적으로 50 mL는 한 접시에 충분합니다.</li>
	<li>625μL의 호흡 완충액(25mM 포도당과 4mg/mL BSA가 있는 사전 산소화 ACSF 완충액)을 췌도 플레이트의 각 웰에 조심스럽게 넣고 플레이트가 흔들리지 않도록 합니다. 센서 카트리지 위에 잔류 방울이 없고 각 웰의 버퍼에 기포가 없는지 확인합니다.</li>
</ol>3. 급성 줄무늬 슬라이스 준비 및 절제 슬라이스 배치
<ol><li>자궁경부 탈구 후 마우스를 탈구시키고, 즉시 10 mL의 빙냉 예비산소화 절단액 (125 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 3.7 mM MgSO4,0.3 mM KH2PO4, 10 mM 글루코스, pH 7.4)에서 뇌를 해부한다.</li>
	<li>섹션 코로나 스트리아탈 슬라이스는 제조사의 지시에 따라 비브라톰( 재료 표 참조)을 얼음처럼 차갑고 산소가 공급된 절삭 용액에서 150μm의 두께로 합니다.</li>
	<li>절편을 50 mL의 산소화된 ACSF (125 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 26 mMNaHCO3, 2.4 mMCaCl2, 1.3 mM MgSO4, 0.3 mMKH2PO4, 10 mM 글루코스, 2 mM HEPES, pH 7.4)로 회수하고, 실온에서 최대 30분 동안 용액에 보관하였다 (RT).</li>
	<li>회복 후, 슬라이스를 5 mL의 호흡 완충액과 함께 35 mm x 10 mm 페트리 접시로 옮긴다.</li>
	<li>스테인리스 스틸 생검 펀치 (예를 들어, 직경 1.5 mm)를 사용하여 슬라이스 된 뇌의 원하는 영역에 원형 조직 조각을 만듭니다. 펀치로 부드럽게 누르면서 슬라이스를 버퍼에 보관하십시오. 펀치가 조직을 절단할만큼 충분히 세게 눌려져 있는지 확인하십시오. 조직의 나머지 부분을 제거하고 펀치를 들어 올린 다음 원형 조직 조각을 버퍼로 제거하십시오.</li>
	<li>1mL 피펫 팁의 맨 끝을 잘라 직경 1.5-2.0mm의 구멍을 만들고 구멍을 뚫은 슬라이스를 잡고 캡처 화면 상단으로 옮기는 데 사용합니다. 펀치된 뇌 조직 한 조각을 흡입하고 조심스럽게 조직을 캡처 스크린의 메쉬 측면에 놓습니다(그림 2A). 캡처 화면은 한쪽에 메쉬가 부착 된 원형 플라스틱 조각입니다. 참고: 캡처 스크린은 마이크로플레이트 팩(재료 표 참조)에 포함되어 있으며 Schuh et al.23에 사용된 것과 유사합니다.</li>
	<li>종이 티슈를 부드럽게 사용하여 캡처 화면을 간단히 건조시킵니다. 수분이 제거되면 조직이 끈적 거리게되어 슬라이스가 메쉬의 중앙에 부착 될 수 있습니다. 슬라이스를 너무 많이 말리지 마십시오, 그렇지 않으면 손상 될 것입니다.</li>
	<li>캡처 화면 슬라이스를 핀셋으로 옆으로 잡고 인큐베이팅 섬 플레이트의 웰 중 하나에 놓습니다(그림 2B). 슬라이스를 떨어 뜨리지 않도록주의하십시오. 그렇다면 화면을 꺼내 새 슬라이스를 놓습니다. 참고: 뇌 조각을 췌도 판의 두 개의 배경 보정 우물(A1 및 D6)에 넣지 마십시오.</li>
	<li>췌도 플레이트를 37°C에서 적어도 30분 동안 인큐베이터에서 인큐베이션하여 분석을 실행하기 전에 온도 및 pH 평형화를 허용한다.</li>
</ol>4. 원하는 화합물로 카트리지 적재
<ol><li>목적 화합물을 개질된 ACSF (37°C)에서 포트 A 내지 D에 대한 작업 농도의 10x, 11x, 12x 및 13x의 최종 스톡 농도로 각각 희석하고, pH 7.4로 조정한다. 시험은 포트 A 내지 D로부터 순서대로 화합물을 투여할 것이다. 이 실험을 위해, 10 mM 피루베이트 (포트 A), 20 μM 올리고마이신 (포트 B), 10 μM 또는 FCCP (포트 C) 및 20 μM 안티마이신 A (포트 D)의 다른 농도와 함께 다음 용액을 사용하였다.</li>
	<li>희석된 화합물 75μL를 센서 카트리지의 적절한 주입 포트에 부드럽게 예비로딩합니다. 팁을 주입 포트의 벽에 대해 팁과 함께 45° 각도로 주입 포트에 반쯤 놓습니다. 팁은 주입 포트의 바닥에 완전히 삽입해서는 안되며, 이로 인해 포트를 통해 복합 누출이 발생할 수 있습니다.</li>
	<li>기포가 생기지 않도록 포트에서 팁을 조심스럽게 빼내십시오. 기포가 완화되지 않도록 카트리지의 어느 부분도 탭하지 마십시오.</li>
	<li>주입 포트에서 균일한 로딩을 육안으로 검사합니다. 모든 액체가 포트에 있고 카트리지 위에 잔류 방울이 없는지 확인하십시오.</li>
	<li>센서 카트리지를 유틸리티 플레이트 위에 놓고 30분 동안 인큐베이터(비CO2)에 넣어 다시 37°C까지 가열할 수 있도록 한다. 유틸리티 플레이트를 잡기만 하면 조심스럽게 다루십시오. 가능한 한 적게 움직입니다.</li>
</ol>5. 교정 및 분석 수행
<ol><li>분석 템플릿을 소프트웨어에 로드합니다. 녹색 START 버튼을 누릅니다.</li>
	<li>올바른 프로토콜을 로드해야 합니다. 프로토콜은 3 분 혼합, 3 분 대기 및 2 분 측정 시퀀스의 조합을 포함합니다 (이 세 단계는 하나의 측정을 형성합니다). 기기 설정25의 하드웨어 설정에서 프로브 헤드의 거리를 26,600에서 27,800으로 변경합니다. XFe24 분석기의 프로브 헤드를 변경할 필요가 없습니다. 시작을 누릅니다.</li>
	<li>유틸리티 플레이트의 센서 카트리지를 계측기 트레이에 로드합니다. 노치는 앞쪽, 왼쪽 모서리에 있습니다. 플레이트가 올바르게 장착되고 평평한지 확인하십시오. 교정을 위해 약물로 채워진 센서 카트리지를 분석기에 로드합니다.</li>
	<li>화면의 지시에 따라 센서를 교정하고 평형을 조정하십시오. 이것은 약 30 분이 걸립니다.</li>
	<li>교정 단계가 완료되면 교정 플레이트를 제거하고 췌도 플레이트 (메쉬 및 조직 조각 포함)로 교체하십시오.</li>
	<li>분석 프로토콜을 사용하여 플레이트의 각 웰에서 산소 소비량을 측정한다. 프로토콜은 3 분 믹스, 3 분 대기 및 2 분 측정 시퀀스 (이 세 단계가 하나의 측정을 형성)의 조합을 포함하며, 이때 OCR이 계산됩니다.</li>
	<li>전체 실험을 위해 4x OCR 측정을 포함하여 기준선을 만든 다음 4x 측정으로 포트 A (pyruvate)를 주입 한 다음 8x 측정으로 포트 B (올리고 마이신)를 주입 한 다음 5x 측정으로 포트 C (FCCP)를 주입하고 마지막으로 6x 측정으로 포트 D (안티 마이신 A)를 주입합니다. 참고: 각 화합물 주입 후의 이 측정 횟수는 측정이 고원에 도달하는 시기에 따라 결정됩니다.</li>
	<li>OCR 측정 데이터와 커플링 효율 데이터를 분석한다.</li>
</ol>

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</ol>

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우리가 개발 한 방법을 사용하면 XF 분석기를 사용하여 4 시간의 시간 동안 성인 마우스의 줄무늬 조각에서 OCR을 측정 할 수있었습니다. 이 방법은 해부학적으로 정의 된 뇌 구조에서 절제 된 펀치에서 세포 생물 에너지를 측정하는 새로운 방법을 제공합니다. 분석되는 조직 샘플이 다소 작기 때문에 질병에 관련된 특정 뇌 영역의 대사 매개 변수를 조사 할 수 있습니다. 또한, 급성 슬라이스를 사용하는 것은 고립 된 미토콘드리아 또는 배양 된 세포 및 유기형 슬라이스로는 달성 될 수없는 생리 학적 세포 환경을 더 밀접하게 모방합니다. 또한, 단일 동물의 여러 뇌 영역 또는 하나의 24-웰 플레이트에서 여러 동물에 걸쳐 OCR을 측정하면이 새로운 기술을 구현하는 연구의 통계적 힘이 크게 증가합니다.
이것은 성인 마우스의 급성 줄무늬 조각에서 OCR 측정의 첫 번째 프로토콜입니다. 초점은 주로 PD와 헌팅턴 병에 관련된 뇌 영역 중 하나이기 때문에 STR에 집중되었습니다. 우리 연구의 기...

미토콘드리아 기능 장애는 파킨슨 병 (PD), 헌팅턴 병 및 알츠하이머 병 1,2,3을 포함한 여러 신경 질환에 연루되어 있습니다. PINK1 녹아웃 (KO) 마우스 및 래트와 같은 PD 모델은 손상된 미토콘드리아 기능 4,5,6,7,8,9,10,11을 나타낸다. 노화된 PINK1 KO 마우스의 선조체(STR) 또는 전뇌로부터 분리된 미토콘드리아는 복합체 I 7,10,12,13에서 결함을 나타낸다. 산소 소모율(OCR)을 직접 측정하는 것은 OCR이 미토콘드리아(14)의 주요 기능인 ATP 생산과 결합되기 때문에 미토콘드리아 기능을 평가하는 가장 일반적인 방법 중 하나이다. 따라서 질병 모델 또는 환자 유래 샘플 / 조직에서 OCR을 측정하면 미토콘드리아 기능 장애가 어떻게 질병으로 이어지는지 조사하는 데 도움이 될 수 있습니다.
현재, 클라크 전극 및 다른 O2 전극,O2 형광 염료, 및 세포외 플럭스 분석기 15,16,17,18,19를 포함하는 미토콘드리아 OCR을 측정하는 몇 가지 방법이 있다. 이점으로서,O2 전극-기반 방법은 다양한 기판이 용이하게 첨가될 수 있게 한다. 그러나 여러 샘플을 동시에 측정하기에는 충분하지 않습니다. 전통적인O2 전극 기반 방법과 비교할 때, 세포 배양 또는 정제 된 미토콘드리아에서 OCR에 일반적으로 사용되는 도구 인 세포 외 플럭스 분석기는 향상된 처리량 15,18,20을 제공합니다. 그럼에도 불구하고, 이러한 모든 방법은 단리된 미토콘드리아 또는 세포 배양물6,16,17,19,20,21에서 OCR을 측정하기 위해 일반적으로 적용된다. 미토콘드리아의 분리는 의도하지 않은 손상을 일으키고, 추출된 미토콘드리아 또는 세포 배양물은 온전한 뇌 조각(22)보다 생리학적으로 덜 관련된다. 미세전극이 슬라이스에 사용되는 경우에도, 이들은 배양된 세포(23)에서보다 덜 민감하고 작동하기가 더 어렵다.
이러한 도전들을 충족시키기 위해, 우리는 XF24 세포외 플럭스 분석기를 사용하는 방법을 개발했는데, 이는 마우스(24)의 급성 삼중항 뇌 조각으로부터의 다중 대사 파라미터의 분석을 가능하게 한다. 이 기술은 OCR을 통해 미토콘드리아 호흡의 지속적인 직접 정량화를 제공합니다. 간단히 말해서, 삼중 뇌 조각의 작은 부분은 췌도 판의 우물에 배치되며, 분석기는 산소 및 양성자 형광 기반 바이오 센서를 사용하여 OCR 및 세포 외 산성화 속도를 각각17,21,25로 측정합니다.
분석기의 독특한 특징 중 하나는 최대 네 개의 화합물 또는 시약을 순차적으로 주입하면서 OCR을 계속 측정 할 수있는 네 개의 주입 웰입니다. 이것은 기저 미토콘드리아 OCR, ATP 연결 OCR 및 최대 미토콘드리아 OCR과 같은 여러 세포 호흡 파라미터의 측정을 가능하게 한다. 여기에 제시된 프로토콜에 대한 측정 동안 주입된 화합물은 첫 번째 용액 웰(포트 A)에서 10 mM 피루베이트, 두 번째 용액 웰(포트 B)에서 20 μM 올리고마이신, 세 번째 웰(포트 C)에서 10 μM 카보닐 시아나이드 4-(트리플루오로메톡시)페닐히드라존(FCCP), 및 네 번째 웰(포트 D)에서 20 μM 안티마이신 A의 작동 농도를 작동시키고, Fried et al.25에 근거하여. 이들 농도는 작동 농도였고, 10x, 11x, 12x 및 13x의 스톡 용액은 용액 포트 A를 내지 D에 각각 주입하였다는 점에 유의해야 한다. 각 용액을 사용하는 목적은 다음과 같았다: 1) 피루베이트가 없었기 때문에, FCCP의 첨가는 이용가능한 기질의 제한에 의해 야기된 감소된 OCR 반응을 가질 것이기 때문에 필요하였다; 2) 올리고마이신은 ATP 신타제를 억제하고 ATP 연결된 호흡의 측정을 허용한다; 3) FCCP는 인산화로부터 산화를 해제하고 최대 미토콘드리아 용량의 측정을 허용한다; 4) 안티마이신 A는 전자 수송 사슬에서 콤플렉스 III을 억제하고, 따라서, 미토콘드리아에 연결되지 않은 OCR의 측정을 허용한다.
사용된 올리고마이신의 농도는 다음과 같은 이유에 기초하여 결정되었다: 1) 대부분의 세포 유형(단리된 미토콘드리아 또는 세포 배양물)에 대한 올리고마이신의 권장 투여량은 1.5 μM이다. 경험에 비추어 볼 때, 해리 된 세포 용량의 보통 3x-10x는 구배가있을 수 있고 슬라이스 내의 용액의 침투에는 시간이 걸리기 때문에 슬라이스 실험에 사용됩니다. 따라서, 농도는 5 μM 내지 25 μM의 범위이어야 한다. 2) A 20 μM 농도는 Fried et al.25에 기초하여 선택되었다. 더 높은 농도는 올리고마이신의 비특이적 독성으로 인해 시도되지 않았다. 3) Underwood et al.26의 보고서에서 저자들은 올리고마이신에 대한 적정 실험을 수행했으며 6.25, 12.5, 25 및 50 μg / mL의 용량이 유사한 억제를 초래한다는 것을 발견했습니다. 올리고마이신 농도가 높을수록 (50 μg/mL) 더 많이 억제되지는 않았지만 더 큰 차이가 있었다. 4) 우리의 관찰에서, 결정 인자는 올리고마이신의 침투 능력 인 것으로 보인다. 올리고마이신이 조직에 침투하는 것은 어렵고, 그래서 최대 반응인 고원에 도달하는 데 적어도 7 내지 8 사이클이 걸리는 이유이다. 고원에 도달하는 한, 억제는 최대로 가정된다.
줄무늬 조각에서 OCR을 측정하기 위해 세포외 플럭스 분석기를 적용하는 주요 기술적 과제는 조직 저산소증을 예방하는 것입니다. 완충액이 측정의 전체 기간 (약 4 시간) 동안 산소화되지 않았기 때문에, 저산소증은 중심 문제였다. 이것은 산소가 샘플 전체에 걸쳐 확산 될 수없는 두꺼운 조직 샘플의 경우 특히 그렇습니다. 이 문제를 극복하기 위해 슬라이스를 150 μm 두께로 절개하여 주변 산소가 뇌 조각의 중간에 침투 할 수 있도록했습니다. 또한, 4 mg / mL 소 혈청 알부민 (BSA)을 사전 산소화 된 인공 뇌척수액 (ACSF) 완충액에 첨가하여 이전에 제안 된 바와 같이 최대 OCR의 결정을 용이하게했습니다23. 우리는 세포가 살아 있는지 여부를 조사했습니다. 먼저, Hoechst 33258 (10 μM) 및 요오드화 프로피듐 (10 μM)을 사용하여 세포가 이러한 조건에서 건강한지 여부를 조사했습니다. 그런 다음 중간 스파이니 뉴런이 패치 클램프 기록을 사용하여 기능적으로 건강한지 여부를 조사했습니다. 우리는 또한 삼중 절편에서 도파민 (DA) 말단이 빠른 스캔 전압전류법을 사용하여 DA 방출을 측정함으로써 기능적으로 건강한지 여부를 평가했습니다. 결과는 산소화되지 않은 줄무늬 조각 (ACSF / BSA 그룹)이 산소화 된 대조군24만큼 건강하다는 것을 보여주었습니다.
그런 다음 슬라이스 두께와 펀치 크기의 다양한 조합을 테스트하여 플럭스 호흡 분석을위한 최적의 스트리아 슬라이스 조건을 결정했습니다. 두께(150 μm 및 200 μm) 및 펀치 크기(직경 1.0 mm, 1.5 mm 및 2.0 mm)가 상이한 Dorsal striatal 슬라이스를 분석기를 사용한 OCR 분석에 사용하였다. 직경 1.5mm의 펀치 크기로 두께가 150μm인 스트리아탈 슬라이스는 분석기(24)에 대해 최적의 범위 내에서 가장 높은 결합 효율 및 OCR을 가졌다.

<table><tbody><tr><td>Accumet AB150 pH 탁상용 측정기</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-636-AB150</td><td></td></tr><tr><td>스트렙토마이세스에서 pH 안티마이신 A를 측정합니다.</td><td>SIGMA</td><td>A8674</td> 미토콘드리아 소 혈청 알부민(BSA)<td>의 복합체 III을 억제하기 위해</td></tr><tr><td>SIGMA</td><td></td> <td>A6003</td><td>변형된 인공 뇌척수액(BSA-ACSF)을 만들기 위해카르</td></tr><tr><td>보닐 시안화물 4-(트리플루오로메톡시) 페닐히드라존(FCCP)</td><td>SIGMA</td><td>C2920</td><td>미토콘드리아 호흡</td></tr><tr><td>D-포도</td>당을 분리하려면 <td>SIGMA</td><td>G8270</td><td>인공 뇌척수액(ACSF)을 만들기 위해</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>SIGMA</td><td>D8418</td><td>화합물</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>SIGMA</td><td>H3375</td><td>인공 뇌척수액 (ACSF)을 만들기 위해</td></tr> 가<tr><td>습 비 CO2 인큐베이터</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-683-230D</td><td>37 °C에서 플레이트를 수화하려면; </td></tr><tr><td>스트렙토마이세스 디아스타토크로모진의 C 올리고마이신</td><td>SIGMA</td><td>O4876</td><td>미토콘드리아 ATP 합성효소</td></tr><tr><td>억제 파라필름</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td></td><td>밀봉 필름</td></tr><tr><td>로테논</td><td>토크리스</td><td>3616</td><td>미토콘드리아의 복합체 I 억제</td></tr><tr><td>XF Calibrant Solution 500 mL</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>103681-100</td><td>해마 보정용 솔루션</td></tr><tr><td>Seahorse XF 세포외 플럭스 분석기</td><td>산소 소비율 분석에 사용되는 Seahorse Bioscience</td><td></td><td></td> 장비, 구세대</tr><tr><td>Seahorse XFe24 세포외 플럭스 분석기</td><td>산소 소비율 분석에 사용되는</td><td>Seahorse Bioscience</td><td></td> 장비, 차세대</tr><tr><td>Seahorse XF24 FluxPaks</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>101174-100</td><td>플럭스 분석기 센서 카트리지, 조직 배양 플레이트, 캡처 스크린 패키지,&nbsp; Calibrant 용액 및 교정 플레이트; 분석 키트.</td></tr><tr><td>피루브산 나트륨</td><td>SIGMA</td><td>P2256</td><td>기질 공급의 기질 제한 제약을 방지하기 위해</td></tr><tr><td>스테인리스 스틸 생검 펀치</td><td>Miltex</td><td></td><td>슬라이스 펀칭에 사용되는 장치</td></tr><tr><td>멸균 세포 배양 접시, 35 x 10 mm</td><td>Eppendrof</td><td>0030700102</td><td>슬라이스 펀치에 사용</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1200</td><td>뇌 조직 슬라이스</td></tr><tr><td>수조</td><td>Thermo Scientific Precision</td><td>282-115</td><td>열 버퍼 및 용액</td></tr></tbody></table>

성인 마우스의 급성 스트리아탈 슬라이스의 산소 소비율 측정

Measurement of Oxygen Consumption Rate in Acute Striatal Slices from Adult Mice

미토콘드리아는 세포 ATP 생산, 반응성 산소 종 조절 및Ca2+ 농도 조절에 중요한 역할을 합니다. 미토콘드리아 기능 장애는 파킨슨 병 (PD), 헌팅턴 병 및 알츠하이머 병을 포함한 여러 신경 퇴행성 질환의 발병기전에 연루되어 있습니다. 이러한 질병의 모델에서 미토콘드리아의 역할을 연구하기 위해, 우리는 미토콘드리아 기능의 대리자로서 산소 소모율 (OCR)을 통해 미토콘드리아 호흡을 측정 할 수 있습니다. OCR은 이미 세포 배양물뿐만 아니라 단리된 미토콘드리아에서도 성공적으로 측정되었다. 그러나 이러한 기술은 급성 뇌 조각에서 OCR을 측정하는 것보다 생리 학적으로 관련성이 적습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 저자들은 Seahorse XF 분석기를 사용하여 성인 마우스의 급성 줄무늬 조각에서 OCR을 직접 측정하는 새로운 방법을 개발했습니다. 이 기술은 PD 및 헌팅턴 병과 관련된 뇌 영역 인 선조체에 중점을두고 최적화되어 있습니다. 분석기는 24웰 플레이트를 사용하여 살아있는 세포 분석을 수행하며, 이를 통해 24개의 샘플에 대한 동시 동역학적 측정이 가능합니다. 이 방법은 원형 펀치 조각의 삼중항 뇌 조각을 샘플로 사용합니다. 우리는 PD의 마우스 모델의 줄무늬 슬라이스에서 더 낮은 기저 OCR을 확인함으로써이 기술의 효과를 입증합니다. 이 방법은 PD 및 헌팅턴 병 분야에서 일하는 연구자들에게 광범위한 관심사가 될 것입니다.

이 연구의 첫 번째 단계는 슬라이스에서 선조체의 섹션을 소비하는 데 사용되는 슬라이스 두께와 펀치 크기를 최적화하는 것이 었습니다 (그림 3A). 150μm 두께의 슬라이스와 1.5mm 펀치 크기로 커플링 효율에 의해 결정된 최상의 결과를 제공했습니다(그림 3B-C). 도 3B에 도시된 바와 같이, OCR은 10% 미만의 런다운과 함께 5시간 동안 비교적 안정하다. 또한, 선조체에서 피질 뉴런 및 중간 스파이니 뉴런의 패치 클램프 기록뿐만 아니라, DA 방출의 빠른 스캔 순환 전압전류법(FSCV) 측정뿐만 아니라, Zhi et al.24에 나타난 바와 같이, 뉴런 및 말단이 이 제제에서 완전히 기능적이었음을 입증하기 위해 기능적 측정이 사용되었다. 여기에 포함되어, 우...

산소 소비율 (OCR)은 미토콘드리아 기능에 대한 일반적인 프록시이며 다른 질병 모델을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 Seahorse XF 분석기를 사용하여 다른 방법보다 생리 학적으로 관련성이 높은 성인 마우스의 급성 줄무늬 조각에서 OCR을 직접 측정하는 새로운 방법을 개발했습니다.

Mitochondria play an important role in cellular ATP production, reactive oxygen species regulation, and Ca2+ concentration control. Mitochondrial ...

우리는 해마 XF 분석기를 사용하여 산소 소모율을 직접 측정하는 새로운 방법을 개발했습니다. 그러나 성인 마우스로부터의 급성 슬라이드 슬라이스에서 미토콘드리아 기능에 대한 일반적인 프록시. 이 방법은 해부학적으로 정의 된 뇌 구조에서 펑크에있는 에너지에 의해 세포를 측정합니다.급성 슬라이스를 사용하는 것은 미토콘드리아 또는 배양 세포를 분리하는 방법을 달성할 수 없는 생리학적 세포 환경을 더 밀접하게 모방한다. 이 방법은 파킨슨 병과 헌팅턴 병 분야에서 일하는 연구자들에게 광범위한 관심사가 될 것입니다. 시작하려면 세포외 플럭스 분석 키트를 열고 센서 카트리지와 유틸리티 플레이트를 모두 제거하십시오.그런 다음 센서 카트리지를 따로 놓고 센서를 만지지 마십시오. 그런 다음 유틸리티 플레이트의 각 벽에 600 마이크로 리터의 교정 용액을 추가하십시오. 센서 카트리지를 유틸리티 플레이트 위에 놓고 센서를 교정 솔루션에 잠기면 유틸리티와 센서 카트리지 플레이트의 삼각형 노치가 올바르게 정렬되었는지 확인합니다.그 후, 검량액의 증발을 방지하기 위해 세포외 플럭스 분석 키트를 밀봉 필름으로 밀봉한 다음, 이산화탄소 또는 산소가 보충되지 않은 섭씨 37도 배양기에 하룻밤 동안 보관한다. 아일렛 캡처 마이크로 플레이트를 열고 조직 앉기를 위해 아일렛 플레이트를 꺼냅니다. 그런 다음 적절한 부피의 사전 산소화 된 변형 된 인공 뇌척수액 완충액을 50 밀리리터 튜브에서 섭씨 37도까지 따뜻하게하십시오.다음으로 BSA를 밀리리터 당 네 밀리그램의 최종 농도에 첨가하여 호흡 완충액을 준비하십시오. 625 마이크로리터의 호흡 완충액을 아일렛 플레이트의 각 웰에 조심스럽게 첨가하면서 플레이트를 흔들지 않도록 하여 각 웰의 버퍼에 기포가 존재하지 않도록 합니다. 즉시 얼음처럼 차가운 사전 산소화 된 절단 용액 10 밀리리터로 뇌를 해부하십시오.이어서, 비브라톰 섹션 코로나 스트리아탈 슬라이스를 사용하여, 얼음처럼 차가운 예비산소화 절단 용액에서 150 마이크로미터의 두께로 제조자의 지시에 따라. 다음으로, 50 밀리리터의 산소화 된 인공 뇌척수액에서 조각을 회수하십시오. 그리고 실온에서 최대 30 분 동안 용액에 보관하십시오.회복 후, 조각을 5 밀리미터의 호흡 버퍼가있는 35 x 10 밀리미터 페트리 접시로 옮깁니다. 스테인레스 스틸 생검 펀치를 사용하여 슬라이스를 버퍼에 유지하면서 펀치를 부드럽게 눌러 슬라이스 된 뇌의 원하는 영역에 원형 조직 조각을 만듭니다. 그런 다음 나머지 조직을 제거하고 펀치를 들어 올려 원형 조직 조각을 버퍼로 제거하십시오.그런 다음 한 밀리리터 피펫 팁의 맨 끝을 잘라 한 점 다섯 ~ 두 점 제로 밀리미터 직경의 구멍을 만들고 펀치 된 슬라이스를 잡고 캡처 화면 상단으로 옮기는 데 사용합니다. 펀치 된 뇌 조직의 한 조각을 흡입하고 조심스럽게 캡처 스크린의 메쉬 측면, 한쪽에 메쉬가 부착 된 원형 플라스틱 조각에 조직을 놓습니다. 종이 티슈를 사용하여 캡처 화면을 부드럽게 말리고 습기를 제거하여 조직이 끈적 거리고 메쉬 중앙에 부착되도록합니다.그런 다음 캡처 화면 슬라이스를 핀셋으로 아래로 잡고 인큐베이팅 아일렛 플레이트의 웰 중 하나에 놓습니다. 그런 다음 아일렛 플레이트를 섭씨 37도에서 적어도 30분 동안 인큐베이터에서 인큐베이션하여 분석을 실행하기 전에 온도 및 pH 평형화를 허용한다. BSA가 없는 원하는 화합물 및 변형된 인공 뇌척수액을 포트 A 내지 D에 대한 작업 농도의 최종 스톡 농도로 각각 희석한다.희석된 화합물 75 마이크로리터를 주입 포트의 벽에 대해 팁과 함께 45도 각도로 주입 포트 내로 반쯤 배치하여 센서 카트리지의 적절한 주입 포트에 부드럽게 예비로딩하면, 완전히 삽입하면 포트를 통한 화합물 누출이 발생할 수 있습니다. 그런 다음 기포를 만들지 않고 포트에서 팁을 조심스럽게 꺼내고 카트리지의 어느 부분도 탭하지 마십시오. 그런 다음 주입 포트를 육안으로 검사하여 모든 액체가 포트에 있고 카트리지 위에 잔류 방울이 없는지 확인하십시오.센서 카트리지를 유틸리티 플레이트 위에 놓은 후 30분 동안 인큐베이터에 넣어 섭씨 37도까지 가열할 수 있도록 하면서 유틸리티 플레이트를 잡고 가능한 한 적게 움직여 조심스럽게 취급합니다. 먼저 소프트웨어에 분석 템플릿을 로드한 다음 녹색 시작 버튼을 누릅니다. 그런 다음 유틸리티 플레이트의 센서 카트리지를 계측기 트레이에 로드하여 플레이트가 올바르게 장착되고 평평한지 확인하고 약물로 채워진 센서 카트리지를 분석기에 로드하여 교정하십시오.그런 다음 화면의 지시 사항을 따라 보정하십시오. 그리고 센서의 평형을 유지하십시오. 평형 단계가 완료되면 교정 플레이트를 제거하고 메쉬 및 조직 조각이 들어있는 아일렛 플레이트로 교체하십시오.그런 다음 원고에 기재된 바와 같은 분석 프로토콜을 사용하여 플레이트의 각 웰에서 산소 소모율을 측정하십시오. 다음으로, 산소 소모율 측정 데이터와 커플링 효율 데이터를 분석한다. 대조군에서 슬라이스의 상이한 두께 및 펀치 크기에 대한 산소 소모율은 전체 측정에 걸쳐 안정한 기저 호흡을 나타냈고, 슬라이스의 부피에 비례하였다.또한, 산소 소모율은 10 % 미만의 런다운으로 다섯 시간 동안 상대적으로 안정적이었습니다. 미토콘드리아 결합 효율을 비교하였고 150 마이크로미터 두께와 1.5 밀리미터 크기의 펀치에서 슬라이스가 가장 높은 결합 효율을 보였다. 산소 소모율은 Pink1 녹아웃의 젊은 및 노인 그룹과 그들의 연령 일치 야생형 마우스에 대해 측정되었다.기저 산소 소모율은 어린 마우스에 대한 녹아웃 및 야생형 그룹 모두에서 유사하였다. 그러나 이전 그룹의 녹아웃 마우스에 대해서는 감소하였다. 그러나, 넉아웃 마우스에서의 미토콘드리아 기능장애는 젊은 연령 그룹에 대해 관찰되었고, Pink1의 녹아웃에 의한 감소된 결합 효율에 의해 나타난다.이 프로토콜의 중요한 단계에는 두뇌 조각을 준비하고, 캡처 화면 상단으로 전송하고, 슬라이드를 웰에 배치하고, 측정 중에 캡처 화면에 부착하는 것이 포함됩니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

출처: Zhi, L. et al., 성체 마우스의 급성 선조체 절편의 산소 소비율 측정. J. Vis. 특급 (2022). 이 비디오는 마우스 선조체 뇌 절편에서 미토콘드리아 산소 소비율(OCR)을 측정하는 방법을 보여줍니다. 티슈 플레이트와 센서 카트리지를 준비하고 플럭스 분석기에 로드하는 단계를 자세히 설명하고 OCR 패턴의 기초가 되는 세포 과정을 설명합니다.

Detection of Oxygen Consumption Rate in Acute Mouse Brain Slices (급성 마우스 뇌 절편의 산소 소비율 측정)

현재 프로토콜 있는 사용자가 자기 공명 현미경 데이터의 수집 하는 동안 급성 hippocampal 및 대뇌 피 질의 조각 준비의 유지할 수 있는 방법을 설명 합니다.

대사 지원 Excised, 자기 공명 현미경 중 생활 뇌 조직

이 논문에서 초파리의 permeabilized 직업적인의 고해상도 respirometry를 사용 하 여 산소 소비량을 측정 하는 방법을 설명 합니다. 이 기술은 조직의 고전적인 미토 콘 드 리아 격리 기술에 비해 최소한의 금액을 요구 하 고 얻은 결과 더 순수 관련.

조직의 최소 금액을 사용 하 여 초파리의 Permeabilized 섬유에 미토 콘 드리 아 산소 소비량의 측정

선물이 산소 소비와 초파리 melanogaster 애벌레와 성인 두뇌에 있는 세포 외 산성화를 측정 하기 위한 프로토콜. 신진 대사 분석기는 적응 하 고 최적화 된 프로토콜 활용 됩니다. 마이크로 조직 억제는이 프로토콜의 중요 한 구성 요소 설계 하 고이 분석에 그들의 사용을 위해 특히 창조 되었다.

초파리 melanogaster Larval 및 성인 두뇌의 변화 분석

신진 대사 속도 있는 변경은 측정 하는 것은 다양 한 질병과 노화의 진행을 이해의 중심입니다. 여기, 우리는 더 밀접 하 게 유사한 생리 적인 상태와 미토 콘 드리 아 활동을 수정 하는 새로운 약물 노출에 도움이 있습니다 전체 머리 산소 소비를 측정 하는 새로운 기법을 제시.

측정 및 해석의 전체 산소 소비 속도 비행 머리 세그먼트

이 프로토콜의 목표는 어떻게 다양 한 요인에에서 산소 소비를 변경할 수 있습니다 검사 마우스 신생아 cardiomyocytes 모델 시스템으로 사용 하는 방법을 보여 줍니다.

세포 외 유출 분석기를 사용 하 여 기본 교양된 마우스 신생아 Cardiomyocytes에 산소 소비 속도 분석

미토 콘 드리 아 호흡은 중요 organismal 생존; 따라서, 산소 소비 속도 미토 콘 드리 아 건강의 훌륭한 지표 이다. 이 프로토콜에 기저 측정 하는 상업적으로 사용할 수 있는 respirometer 사용 하 여 설명 하 고 최대 산소 소비 속도에 라이브, 그대로, 그리고 자유롭게 운동 꼬마 선 충.

그대로 꼬마 선 충 에 산소 소비 속도의 측정

고분해능 호흡계를 사용하여 산화 인산화를 평가하는 것은 미토콘드리아와 세포 에너지 대사의 기능 분석의 필수적인 부분이되었습니다. 여기에서는 챔버 및 마이크로 플레이트 기반 고해상도 호흡계를 사용하여 세포 에너지 대사를 분석하기위한 프로토콜을 제시하고 각 장치의 주요 이점에 대해 논의합니다.

챔버 및 플레이트 기반 호흡계를 사용하여 세포 및 조직의 생물 에너지를 평가하기위한 고해상도 호흡 측정법

형광 센서에 결합된 고분해능 호흡법은 미토콘드리아 산소 소비량과 반응성 산소 종(ROS) 생성을 결정합니다. 본 프로토콜은 투과화된 좌골 신경에서 미토콘드리아 호흡률 및 ROS 생산을 평가하는 기술을 기술한다.

고해상도 호흡 측정법에 의한 좌골 신경의 미토콘드리아 기능 평가

전기량 호흡 측정법은 작은 유기체의 신진대사율을 측정하는 데 이상적입니다. 본 연구에서 Drosophila melanogaster에 대해 적응시켰을 때, 측정된O2 소비량은 이전 연구에서 야생형 D. melanogaster에 대해 보고된 범위 내에 있었습니다. 더 작고 덜 활동적인 CASK 돌연변이의 플라이당 O2 소비량은 야생형보다 현저히 낮았습니다.

전기량 미세호흡계를 사용한 초파리 멜라노가스터의O2 소비량 측정

배우세요 성인 마우스 급성 스트리아탈 슬라이스에서 산소 소비율을 측정하는 방법을. Seahorse XF 분석기를 활용하여 미토콘드리아 기능을 생리학적으로 관련성 높은 환경에서 평가합니다. 파킨슨병과 헌팅턴병 연구에 활용됩니다.

성인 마우스의 급성 스트리아탈 슬라이스의 산소 소비율 측정

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