Name: 고함량 스크리닝 및 분석 응용을 위한 구상체의 대규모 생산을 위한 강력한 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: 배우세요 다세포 종양 구상체를 대규모로 생산하는 방법을 통해 고함량 스크리닝 및 형태학적 분석을 수행하세요. 이 기법은 약물 전달 및 세포 독성 평가 연구에 활용됩니다.

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저자들은 Science Foundation Ireland (SFI) (16 / RI / 3745)에서 JCS에 대한 인프라 연구 보조금의 지원을 인정합니다. UCD 세포 스크리닝 실험실에서의 작업은 UCD 과학 대학의 지원을 받습니다. ASC는 아일랜드 연구위원회 (IRC) 아일랜드 대학원 장학금 (GOIPG / 2019 / 68)의 정부에서 자금을 지원합니다. 저자는 또한 실험실의 모든 구성원에게 그들의 의견과 도움이되는 토론에 감사드립니다. 그림 1의 아트웍은 BioRender에서 생성되었습니다.

1. 세포 배양
<ol><li>미디어 준비<ol>
<li>세포주의 종류에 따라 특정 세포 배양 배지를 준비한다. 세포 유지를 위한 모든 배지에 10% 태아 소 혈청(FBS)이 포함되어 있는지 확인하십시오. 참고: 다른 세포주는 다른 배지를 사용합니다. HT-29 결장 암종 세포 (ATCC HTB-38)는 맥코이스 5A + 10% FBS에서 성장한다. HepG2 간세포암종 세포(ATCC HB-8065)는 최소 필수 배지 + 1% L-글루타민 + 10% FBS에서 성장한다. H358 기관지 폐포 암종 세포 (ATCC CRL-5807)는 RPMI 1640 배지 + 1% L-글루타민 + 10% FBS에서 성장한다. L-글루타민과 FBS를 포함하는 모든 배지는 완전한 배지로 지칭된다. 세포를 도금하여 구상체로 성장할 때, ECM 지하실 물질의 착색을 피하기 위해 10 % FBS가있는 페놀 적색이없는 배지가 필요하며, 이는 이미징 과정에서 아티팩트를 유발할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>계대 배양 세포<ol>
<li>세포가 약 80% 합류할 때, 2mL의 트립신-EDTA(0.25% (w/v) 트립신/0.53 mM EDTA)로 간단히 세척하십시오. 트립신-EDTA를 흡인하고, 신선한 트립신-EDTA 3 mL를 첨가하고, 37°C에서 3-5분 동안 인큐베이션한다.</li>
		<li>세포가 세포 배양 접시에서 분리되면 신선한 완전 배지 7 mL를 첨가하십시오.</li>
		<li>세포 현탁액 1 mL를 새로운 10 cm 세포 배양 접시에 넣고 신선한 완전 배지 9 mL를 첨가하여 1:10 희석된 세포를 수득하였다.</li>
		<li>세포를 5% CO2가 있는 가습된 인큐베이터에서 37°C에서 배양한다.</li>
		<li>세포주에 따라 3-5일마다 세포를 계대배양한다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 구상체의 생성
<ol><li>ECM 지하실 재료로 96웰 플레이트를 코팅하십시오.<ol>
<li>ECM 지하 재료를 얼음 위에서 하룻밤 사이에 해동하십시오.</li>
		<li>ECM basement 물질을 -20°C로 유지된 미리 냉각된 팁을 사용하여 차가운 페놀 적색 무혈청 배지에 희석한다. 참고: ECM basement 물질의 최종 농도는 사용된 세포주에 따라 달라진다. HT-29 및 H358 세포의 경우 ECM 지하실 재료 4mg·mL-1 을 사용하십시오. HepG2 세포의 경우, 환원 성장 인자 ECM basement 물질의 4 mg·mL-1 을 사용하십시오.</li>
		<li>ECM basement 재료/배지 용액 15μL를 96웰 이미징 플레이트에 피펫팅합니다. 참고: 대규모 스페로이드 생산의 경우, ECM 지하실 재료가 들어있는 팁과 저장소가 냉각되는 한 이 단계는 8채널 피펫과 96채널 피펫팅 헤드를 모두 사용하여 수행할 수 있습니다.</li>
		<li>플레이트를 4°C에서 91 x g 에서 20분 동안 원심분리한다.</li>
		<li>플레이트를 37°C에서 30분 이상 인큐베이션하지 않는다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>계대 배양 및 세포 수<ol>
<li>플레이트 인큐베이션 기간 동안, 세포를 트립신-EDTA로 인큐베이션하고, 이들을 10% FBS를 함유하는 완전한 배지에 재현탁시킨다.</li>
		<li>10 μL의 세포 현탁액을 혈구계 계수 챔버에 피펫한다. 챔버의 4 사분면에있는 세포 수를 계산하십시오.</li>
		<li>4개의 사분면 내의 평균 세포 수를 결정함으로써 세포 현탁액 내의 세포 수를 계산한다. 참고: 셀은 자동화된 셀 카운팅 장치를 사용하여 계산할 수도 있습니다.</li>
		<li>세포를 실온에서 4분 동안 135 x g 에서 원심분리한다 (RT).</li>
		<li>일단 세포가 펠릿화되면, 상청액을 흡인하고, 세포를 페놀 적색이 없는 완전 배지에 재현탁시켜 mL당 1 x 106 세포의 농도를 얻는다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ECM 지하실 물질 코팅 플레이트에 세포를 시드<ol>
<li>세포를 페놀 적색이 없는 완전 배지에 희석한다. 참고: 시딩된 세포의 밀도는 사용된 세포주에 의존한다. HT-29 및 HepG2 세포의 경우, 웰 당 3 x 104 세포가 시딩되고; H358 세포의 경우, 웰 당 4 x 104 세포가 시딩됩니다.</li>
		<li>세포를 웰 당 35 μL의 총 부피로 시드한다. 원형 동작으로 드롭 방향으로 추가하십시오. 참고: 대규모 스페로이드 생산의 경우 피펫팅 원형 운동을 달성할 수 있는 한 이 단계를 8채널 피펫으로 수행할 수 있습니다.</li>
		<li>세포를 5% CO2가 있는 가습된 인큐베이터에서 37°C에서 1시간 동안 인큐베이션한다.</li>
		<li>페놀 레드-프리 완전 매질에서 ECM 기저 물질의 용액을 준비하고, 이는 웰 내의 최종 농도 2% ECM 기저 물질을 초래한다. 이를 달성하기 위해, 웰 당 23.8 μL의 페놀 적색이 없는 완전한 배지에 1.2 μL의 ECM basement 물질을 첨가하여, 웰 당 60 μL의 최종 부피를 생성한다.</li>
		<li>세포를 5% CO2가 있는 가습된 인큐베이터에서 37°C에서 인큐베이션한다.</li>
		<li>다음날, 배지를 100 μL의 신선한 페놀 무함유 완전 배지로 교체한다.</li>
		<li>매초마다 배지를 100 μL의 신선한 페놀 적색 무함유 완전 배지로 교체하십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 구상체의 면역형광염색
참고: 이 프로토콜은 Nürnberg et al., 202015에서 채택되었습니다. 이러한 적응은 주로이 프로토콜에 설명 된 구상체가 Nürnberg et al. work15 에서 사용 된 것보다 작기 때문에 더 짧은 배양 시간을 촉진한다는 사실에 근거합니다. 예를 들어, 차단 시간은 2h에서 1h로 감소합니다. 또한, 프로토콜이 스페로이드의 높은 처리량 생산을 위해 설계됨에 따라, 모든 처리 단계는 구상체가 배양되는 웰에서 수행되며, 이는 개별 스페로이드를 튜브로 옮길 필요가 없음을 의미합니다.
<ol><li>고정 및 염색에 필요한 모든 용액과 완충액을 준비하십시오.<ol>
<li>물 200 mL 당 PBS 정제 1개를 첨가하여 인산완충식염수(PBS)를 제조하였다. PBS를 오토클레이브합니다.</li>
		<li>파라포름알데히드(PFA)를 3.1.3-3.1.4 단계에 따라 준비한다.</li>
		<li>가열된 교반기를 사용하여 PBS 400 mL를 흄 후드에서 60-70°C로 가열한다. 교반하면서 PFA 15g을 첨가한다. 일단 PFA가 용해되면, 50 μL의 1 M CaCl2 및 50 μL의 1 M MgCl2를 첨가한다.</li>
		<li>PBS 100 mL를 첨가하여 최종 부피를 500 mL로 만든다. NaOH를 사용하여 PFA를 pH 7.4로 평형화시킨다. PFA를 멸균 진공 필터(기공 크기 0.22 μm)를 통해 여과하고, 분취량을 -20°C에서 저장한다.</li>
		<li>PBS 50 mL에 글리신 3.75 g을 첨가하여 1 M 글리신 원액을 제조하였다. 4°C에서 보관한다.</li>
		<li>PBS 2.4 mL에 100 μL의 트리톤 X-100, 1 mL의 디메틸설폭사이드(DMSO) 및 1.5 mL의 1 M 글리신을 첨가하여 5 mL의 투과화 완충액을 제조하였다. 4°C에서 2주 이상 보관하지 마십시오.</li>
		<li>PBS 4.9 mL에 100 μL의 트리톤 X-100, 0.5 mL의 DMSO 및 0.05 g의 소 혈청 알부민(BSA)을 첨가하여 5 mL의 블로킹 완충액을 제조하였다. 블로킹 완충액을 1.5 mL 튜브 내로 분취하고, -20°C에서 보관한다.</li>
		<li>PBS 4.74 mL에 10 μL의 폴리소르베이트 20, 0.05 g의 BSA 및 250 μL의 DMSO를 첨가하여 5 mL의 항체 인큐베이션 완충액을 제조하였다. 항체 인큐베이션 완충액을 1.5 mL 튜브에 분취하고, 이를 -20°C에 보관한다. 참고: 여기에 설명된 프로토콜에서 구상체는 96웰 플레이트의 내부 60개 웰에만 조립되지만, 플레이트의 96개 웰 모두에서 준비할 수 있습니다. 내부 60 웰에서만 구상체를 준비하는 이유는 일부 높은 수치 조리개 대물 렌즈가 일부 플레이트 유형의 '스커트'로 인해 외부 웰의 전체 우물을 물리적으로 이미지 할 수 없기 때문입니다. 위의 부피는 구상체를 함유 한 60 웰의 제조에 충분합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>구상체를 고치고 침투하십시오.<ol>
<li>구상체에서 배지를 조심스럽게 제거하여 ECM basement 재료 층이 방해받지 않도록하십시오.</li>
		<li>구상체를 매번 3분 동안 70 μL의 PBS로 두 번 세척한다.</li>
		<li>구상체를 37°C에서 1시간 동안 70 μL의 3% PFA로 고정시켰다.</li>
		<li>구상체를 매번 3분 동안 70 μL의 PBS로 두 번 세척한다.</li>
		<li>70 μL의 0.5 M 글리신 용액으로 37°C에서 30분 동안 켄칭한다.</li>
		<li>RT에서 30분 동안 70 μL의 투과화 완충액을 사용하여 구상체를 투과시킨다.</li>
		<li>구상체를 매번 3분 동안 70 μL의 PBS로 두 번 세척한다.</li>
		<li>구상체를 70 μL의 블로킹 완충액 중에서 37°C에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 참고: 구상체가 고정되면 모든 후속 처리 단계는 8채널 피펫 또는 96웰 피펫팅 헤드(사용 가능한 경우)를 사용하여 수행할 수 있습니다. 이것은 이미징 전에 스페로이드 준비의 속도를 증가시킵니다.</li>
	</ol></li>
	<li>일차 및 이차 항체를 이용한 면역염색 구상체<ol>
<li>일차 항체를 항체 인큐베이션 완충액에서 적절한 희석액으로 희석하고 각 웰에 70 μL를 첨가한다. 구상체를 일차 항체와 함께 밤새 인큐베이션한다. 주: 희석은 사용된 특정 항체에 의존한다. 본원에 나타낸 예에서, 리소좀은 1:500의 희석을 사용하여 마우스 항-LAMP1 항체로 면역염색된다.</li>
		<li>다음날, 구상체를 매번 3분 동안 PBS 70 μL로 5회 세척한다.</li>
		<li>2차 항체를 1:500의 희석액으로, 형광 접합된 팔로이드인을 1:500에, 및 Hoechst 33342 (1 mg mL-1 스톡으로부터)를 항체 인큐베이션 완충액에서 1:5000으로 희석하고, 각 웰에 70 μL를 첨가한다. 하룻밤 동안 배양하십시오. 주: 항체 희석은 사용된 특정 항체에 의존한다. 높은 광안정성과 높은 밝기를 보여주는 고도로 교차 흡착된 이차 항체를 권장합니다.</li>
		<li>다음날, 구상체를 매번 3분 동안 PBS 70 μL로 5회 세척한다. 참고: 플레이트는 구상체가 PBS로 덮여 있는 한 이미징 전에 RT에서 최대 두 주 동안 보관할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>4. 구상체의 이미지 수집 및 분석
<ol><li>이미지 수집<ol>
<li>구상체가 들어있는 96-웰 플레이트를 공초점 고함량 스크리닝 현미경에 삽입하십시오.</li>
		<li>사용 된 형광단을 자극하기 위해 적절한 레이저를 선택하십시오.</li>
		<li>크로스 토크를 피하기 위해 채널을 순차적으로 획득하십시오.</li>
		<li>적절한 목표를 사용하여 구상체를 이미지화하십시오. 참고: 가능한 경우 침수 목표를 사용하는 것이 좋습니다. 예를 들어, 20x/1.0 NA 목표는 ~77개의 시야각에서 전체 우물을 이미지화할 수 있습니다. 63x/1.15 NA 목표는 약 826개의 시야각으로 우물 전체를 이미지화할 수 있습니다.</li>
		<li>이미지는 구상체의 깊이에 따라 ~ 30-40 개의 슬라이스를 이미지화하고, 각 슬라이스는 앞의 슬라이스에서 1.5 μm 간격으로 촬영됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>이미지 분석<ol>
<li>구상체의 형태학적 분석을 위해서는 4.2.2-4.2.6단계를 따르십시오.</li>
		<li>형광 컨쥬게이션된 팔로이드 염색에 기초하여 구상체를 분절한다.</li>
		<li>Hoechst 33342 염색에 기초하여 핵을 분절한다.</li>
		<li>세포질에 존재하는 잔류 Hoechst 33342 염색에 의해 각 세포의 세포질을 분절한다.</li>
		<li>부피, 표면적, 구형도 및 구상체 당 핵 수를 포함하여 구상체의 다양한 형태 학적 특성을 계산하십시오. 참고: 이 정보는 선택한 이미지 분석 소프트웨어에 내장된 다양한 알고리즘을 사용하여 추출됩니다.</li>
		<li>이미지를 추가로 처리하여 75,000 μm3 보다 작고 900,000 μm3보다 큰 구상체를 제거합니다. 참고: 이 값은 여러 구상체의 융합으로 인해 발생할 수 있는 매우 작은 셀 어셈블리 및 대형 어셈블리를 제거할 수 있도록 하기 위한 제안입니다. 스페로이드는 이 단계에서 다른 크기 클래스로 분류할 수도 있습니다.</li>
		<li>구상체 내의 단일 세포를 분석하려면 4.2.8-4.2.12단계를 따르십시오.</li>
		<li>형광 컨쥬게이션된 팔로이드 염색에 기초하여 구상체를 분절한다.</li>
		<li>Hoechst 33342 염색에 기초하여 핵을 분절한다.</li>
		<li>세포질에 존재하는 잔류 Hoechst 33342 염색에 의해 각 세포의 세포질을 분절한다.</li>
		<li>이차 항체 염색에 기초하여 리소좀을 분절한다.</li>
		<li>세포당 리소좀의 수, 세포 부피 및 세포 표면적을 포함하여 각 구상체 내의 세포의 상이한 형태학적 특성을 계산한다. 참고: 이 정보는 선택한 이미지 분석 소프트웨어에 내장된 다양한 알고리즘을 사용하여 추출됩니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

저자들은 이 작품과 관련된 경쟁적인 이해관계가 없다고 선언한다.

여기에 설명된 접근법은 HCS 및 HCA에 적합한 방식으로 웰당 수백 개의 구상체를 생성하기 위한 플랫폼을 상세히 설명한다. 웰 당 하나의 스페로이드 형성 만 허용하는 평평한 바닥 및 둥근 바닥 ULA 플레이트의 사용과 같은 다른 인기있는 방법과 비교할 때,18,19,이 방법은 스크리닝 형식으로 많은 수의 구상체로부터 고해상도 정보를 추출 할 수있는 기회를 제공합니다. 특히,이 방법은 다양한 종양 유형을 나타내는 3 개의 다른 세포주에서 입증되었으며, 다양한 모델에서 다양한 세포 과정을 연구하는 데 광범위한 적합성을 강조합니다. 이 방법을 사용하여 생성 된 구상체는 크기와 모양에 약간의 변동성을 보여 주지만 HCA는 크기 (또는 관심있는 다른 매개 변수)별로 쉽게 분류 할 수 있습니다. 우리 실험실은이 접근법을 성공적으로 사용하여 스페로이드 크기의 함수로서 나노 입자 유도 독성을 연구했습니다. 중요하게도, 구상체의 모든 상이...

전통적으로, 세포-기반 분석은 고체 기질 상에서 성장하는 단층에서 수행되었으며, 이는 효과적으로 2차원(2D) 환경으로서 고려될 수 있다. 그러나, 2D 세포 배양 모델은 일부 맥락에서 생리학적 관련성이 결여되어 세포들 사이에서 발생하는 많은 복잡한 상호작용을 복제할 수 없다는 것이 점점 더 인식되고 있다1. 3차원(3D) 세포 배양 방법은 연구자들 사이에서 빠르게 인기를 얻고 있으며, 3D 세포 모델은 조직 환경에서 세포가 직면하는 생리적 조건을 더 잘 모방할 수 있는 높은 잠재력을 보여준다2. 사용 된 3D 셀 어셈블리에는 여러 가지 유형이 있지만 가장 일반적인 두 가지 유형은 구상체와 오가노이드입니다. 구상체는 다양한 세포주에서 성장할 수 있으며, 사용되는 세포 유형과 조립 방법에 따라 다양한 모양과 크기를 채택 할 수 있습니다3. 더욱이, 구상체는 또한 이들이 암 세포주로부터 성장할 때 다세포 종양 구상체 (MCTS)로 지칭될 수 있으며, 이들 모델은 전임상 시험관내 약물 전달 및 독성 연구에 특히 사용되는 것을 발견하였다4,5. 반면에 오가노이드는 우리 몸의 조직과 장기를보다 잘 모방하는 것을 목표로하며보다 복잡한 형태 학적 배열을 채택 할 수 있습니다. 오가노이드의 생산은 성체 줄기 세포 또는 만능 줄기 세포의 사용을 포함하며, 이는 관심있는 조직 또는 기관과 유사한 적절한 세포로 재 프로그래밍 될 수 있습니다. 그들은 주로 장기의 발달을 조사하고 질병 및 숙주 - 병원체 상호 작용을 모델링하는 데 사용됩니다6.
3D 셀 어셈블리를 생성하는 데 사용되는 다양한 방법이 있습니다. 스캐폴드-기반 방법은 세포가 부착되거나 성장할 수 있는 기질 또는 지지체를 제공한다. 이러한 스캐폴드는 다양한 형상을 가질 수 있으며 다양한 상이한 재료로 만들어질 수 있다. 가장 흔한 것은 세포외 매트릭스 (ECM) 성분과 하이드로젤이며, 이들은 세포의 자연적인 세포외 환경과 유사하도록 설계되어 생리적 상호작용을 촉진한다4,7. ECM basement 물질은 Engelbreth-Holm-Swarm 마우스 육종 종양으로부터 추출되었으며, 라미닌, IV형 콜라겐 및 펄레칸8을 포함하는 ECM 성분의 풍부한 혼합물을 함유하는 것으로 나타났다. 그러나, 그것의 유리한 구성에도 불구하고, 그것의 사용에는 두 가지 주요 과제, 즉 배치 대 배치 가변성과 10 °C8,9 이하와 그 이상의 두 가지 다른 응집체 상태를 갖는다는 것이 있습니다. 대조적으로, 하이드로젤은 그 성분 및 강성에 대하여 유연하다는 장점이 있으며, 이들은 원하는 특정 3D 셀 어셈블리에 적합하도록 맞춤화될 수 있다7,10. 스캐폴드 기반 방법은 오가노이드 성장에 필수적이지만 구상체에도 널리 사용됩니다. 세포가 자라는 표면에 부착되는 것을 방지하여 작동하는 스캐폴드가없는 방법은 일반적으로 스페로이드 어셈블리와 만 호환됩니다. 예를 들어 세포를 구상체로 응집시킬 수 있는 평평한 바닥 또는 U-바닥을 갖는 초저 부착(ULA) 플레이트 또는 스피너/회전 플라스크에서 세포의 지속적인 교반 사용10이 포함됩니다.
다양한 생물학적 사건을 연구하기 위해 3D 세포 어셈블리를 사용하는 것이 빠르게 인기를 얻고 있습니다. 그러나 그들의 문화를 위해 선택된 방법이 적절하고 다운 스트림 분석 계획과 양립 할 수 있어야합니다. 예를 들어, ULA 플레이트의 사용은 높은 일관성의 구상체를 생성한다; 그러나, 이 방법은 웰 당 단일 스페로이드의 생산으로 제한되고, 따라서 처리량을 제한한다. 3D 구조물의 형광 이미징이 계획될 때 특별한 고려가 필요하다. 조립체가 성장되는 기판 또는 플레이트는 광학적으로 호환될 필요가 있으며, 사용되었을 수 있는 임의의 스캐폴드에 의해 야기되는 광산란의 영향을 최소화하기 위해 주의를 기울여야 한다11. 이 특별한 문제는 현미경 대물 렌즈의 개구수가 증가함에 따라 더욱 심각해진다.
아마도 3D 세포 모델로 작업하기 위해 선택하는 주요 이유 중 하나는 전체 어셈블리뿐만 아니라 그 안에있는 개별 세포에 대한 체적 이미징 데이터를 추출하는 것입니다. 특히 MCTS 모델은 치료제가 외부에서 중앙 세포로 어떻게 전달되는지에 대한 우리의 이해를 심화시키는 데 매우 강력하다는 것을 증명하기 시작했습니다 (종양에서 필요하기 때문에)12, 따라서 다른 층의 개별 세포로부터 지식을 얻는 것이 필수적입니다. 개별 세포로부터 정량적 정보를 추출하는 이미징 기술은 고함량 분석(HCA)이라고 불리며 스크리닝13의 맥락에서 강력한 접근 방식입니다. 현재까지 HCA는 거의 독점적으로 단층 배양에 적용되어 왔지만,이 접근법이 광범위한 세포 기능 및 과정을 연구 할 수있게 해주는 3D 배양에 적용 할 수있는 힘을 가지고 있다는 인식이 증가하고 있습니다14. 많은 수의 3D 어셈블리를 분석하여 각 구조에서 셀 수준 데이터를 제공 할 수 있다는 분명한 이점이 있습니다. 그러나 잠재적으로 두꺼운 셀 어셈블리의 이미징과 관련된 문제 및 생성 된 대규모 데이터 세트는 극복해야합니다.
이 기사에서는 96-웰 포맷으로 MCTS를 대규모로 생산하기 위한 강력한 스캐폴드 기반 방법을 제시합니다. 이 방법은 각 웰에서 수백 개의 3D 셀 어셈블리를 쉽게 생산할 수 있습니다. 실시예는 간, 폐 및 결장의 고형 종양 모델을 나타내는 세 가지 상이한 세포 유형에 대해 제시된다. 형성되는 구상체는 다양한 크기일 수 있으며, 따라서 HCA는 특정 크기 및/또는 형태학의 구조를 선택하는데 사용된다. 이 기능은 관찰 된 모든 표현형이 다른 크기의 구상체에 걸쳐 비교 될 수 있지만 모두 동일한 웰에서 동일한 방식으로 처리 될 수 있다는 추가적인 이점을 제공합니다. 이 접근법은 고해상도 이미징과 호환되며, 중요한 것은 동일한 셀룰러 어셈블리에서 세포 수준 및 하위 세포 수준의 정량적 데이터를 모두 제공하는 것입니다. 스페로이드 생산의 이러한 방법은 웰 당 단일 스페로이드를 생성하는 방법에 비해 추가적인 이점을 가지며, 각 웰에서 생산된 많은 수의 스페로이드가 전사체 및 프로테옴 프로파일링과 같은 다른 다운스트림 분석을 위해 잠재적으로 충분한 바이오매스를 제공한다는 것이다.

<table><tbody><tr><td>0.05% 트립신-EDTA (1x), 페놀 레드</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA)</td><td>시그마 알드리치</td><td>A6003</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘</td><td>Fisher Scientific</td><td>10050070</td><td></td></tr><tr><td>Cellular Scientific 울트라 마이크로플레이트, 조직 배양 처리, 검정색, 96웰(뚜껑 포함</td>) <td>Perkin Elmer</td><td>6055302</td><td>이 플레이트는 Phenoplates</td></tr><tr><td>로 이름이 변경되었습니다.Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Foetal Bovine Serum (FBS), 적격, EU 승인, 남미 원산지, 열 비활성화</td><td>Gibco</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP381-1</td><td></td></tr><tr><td>염소 항-마우스 IgG (H+L) 고도의 교차 흡착 2차 항체, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11029</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine 용액, 200 mM</td><td>Gibco</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma Aldrich</td><td>14533</td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘</td><td>Fisher Scientific</td><td>10647032</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, LDEV-free, 10 mL</td><td>Corning</td><td>356237</td><td>이 Matrigel 제형은 BD Biosciences</td></tr><tr><td>Matrigel Growth Factor Reduced에서 동일한 카탈로그 번호로 찾을 수 있습니다. Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>356231</td><td>이 Matrigel 제형은 Corning</td></tr><tr><td>McCoy의 5A 배지</td><td>Gibco</td><td>26600023</td><td></td></tr><tr><td>McCoy의 5A 배지 with L glutamine and sodium bicarbonate, without phenol red</td><td>Hyclone</td><td>10358633</td><td></td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium (MEM)</td><td>Gibco</td><td>21090022</td><td></td></tr><tr><td>에서도 동일한 카탈로그 번호로 찾아볼 수 있습니다최소 필수 배지(MEM), 글루타민 없음, 페놀 레드</td><td>없음 Gibco 51200046</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse monoclonal anti-LAMP1 항체(농축액)</td><td>개발 연구 Hybridoma Bank</td><td>H4A3-a</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer counting chamber</td><td>Hirschmann</td><td>8100203</td><td></td></tr><tr><td>Nunclon tissue culture dish with lid, 폴리스티렌, 92 mm x 17 mm</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>150350</td><td></td></tr><tr><td>Opera Phoenix HCS 시스템 및 Harmony HCA 소프트웨어</td>, <td>Perkin Elmer</td><td>HCSHH14000000</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드(PFA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr>, <tr><td>Phalloidin Alexa Fluor 568</td>, <td>Invitrogen</td><td>A12380</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS) 정제</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr>, <tr><td>폴리소르베이트 20</td>, <td>Sigma Aldrich</td><td>P5927</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement</td><td>Gibco</td><td>61870010</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium, 글루타민 미포함, 페놀 레드</td><td>없음 Gibco</td><td>11835063</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Stericup 멸균 진공 필터 장치</td><td>Millipore</td><td>SCGVU05RE</td><td></td></tr></tbody></table>

고함량 스크리닝 및 분석 응용을 위한 구상체의 대규모 생산을 위한 강력한 방법

A Robust Method for the Large-Scale Production of Spheroids for High-Content Screening and Analysis Applications

고함량 스크리닝 (HCS) 및 고함량 분석 (HCA)은 연구자들에게 세포에서 대규모 정량적 표현형 측정을 추출 할 수있는 능력을 제공하는 기술입니다. 이 접근법은 세포 생물학에서 근본적인 사건과 적용된 사건의 광범위한 범위에 대한 우리의 이해를 깊게하는 데 강력한 것으로 입증되었습니다. 현재까지이 기술에 대한 대부분의 응용 프로그램은 단층에서 자란 세포의 사용에 의존해 왔지만 그러한 모델이 조직에서 발생하는 많은 상호 작용 및 과정을 재검토하지 않는다는 것이 점점 더 실현되고 있습니다. 이와 같이, 구상체 및 오가노이드와 같은 3차원(3D) 세포 어셈블리의 개발 및 사용에 있어서 출현이 있었다. 이러한 3D 모델은 암 생물학 및 약물 전달 연구의 맥락에서 특히 강력하지만, HCS 및 HCA에 적합한 재현 가능한 방식으로 생산 및 분석하는 것은 많은 도전 과제를 제시합니다. 여기에 상술된 프로토콜은 다세포 종양 구상체(MCTS)의 생성을 위한 방법을 설명하고, HCS 및 HCA와 양립가능한 방식으로 세 개의 상이한 세포주에 적용될 수 있음을 입증한다. 이 방법은 웰 당 수백 개의 구상체의 생산을 용이하게하며, 스크리닝 정권에서 사용될 때 웰 당 수백 개의 구조물로부터 데이터를 얻을 수 있으며 모두 동일한 방식으로 처리 할 수 있다는 특별한 이점을 제공합니다. 고분해능 형광 이미징을 위해 구상체를 처리하는 방법과 HCA가 각 스페로이드 내의 개별 세포뿐만 아니라 스페로이드 수준에서 정량적 특징을 추출하는 방법을 자세히 설명하는 예도 제공됩니다. 이 프로토콜은 세포 생물학에서 중요한 질문의 넓은 범위에 대답하기 위해 쉽게 적용될 수 있습니다.

이 프로토콜에서는 다양한 종양 조직을 표현하기 위해 다양한 세포 유형을 사용하여 구상체 형태의 3D 세포 배양 어셈블리를 생산하는 강력한 방법이 자세히 설명되어 있습니다. 이 방법을 사용하면 웰 당 수백 개의 구상체를 생성 할 수 있으므로 세포 기반 분석을 고함량 방식으로 수행 할 수 있습니다 (그림 1). 이 접근법은 이전에 HT-29 구상체16 에서의 나노입자 흡수 및 HepG2 구상체17에서의 나노입자-유도 독성을 연구하는데 사용되어 왔다. 이 방법은 광학 품질 플레이트의 우물 바닥을 가로 질러 스캐폴드 재료의 얇고 균일 한 분포를 생산하는 데 의존합니다. 세포는 각 웰에 시딩되고, 더 나아가 스캐폴드 물질은, 낮은 농도에서, 세포 상에 오버레이로서 첨가된다. 이것은 구상체의 성장도 지원하는 염기를 초래하며, 이는 수백 개의 구상체가 96-웰 플레이트의 각 웰에서 배양될 수 있음을 의미...

이 프로토콜은 대규모 고함량 스크리닝 및 분석에 적합한 방식으로 세 가지 유형의 구상체를 생산하는 방법을 자세히 설명합니다. 또한, 이들이 스페로이드 및 개별 세포 수준에서 어떻게 분석될 수 있는지를 보여주는 예들이 제시된다.

High-content screening (HCS) and high-content analysis (HCA) are technologies that provide researchers with the ability to extract large-scale ...

이 프로토콜은 자동화된 현미경 검사에 적합한 다중 웰 플레이트의 각 웰에서 수백 개의 다세포 종양 구상체를 생산하는 방법을 제공한다. 생성 된 스페로이드는 다른 크기 클래스로 분류 될 수 있으며 모든 세포에서 아세포 정보를 추출 할 수 있습니다. 이 기술은 직접 스크리닝 및 RNA 간섭 연구에 사용할 수있는 충분한 혈청을 생산합니다.ECM 지하실 재료를 차가운 페놀 레드 세럼프리 배지에 희석하여 섭씨 영하 20도에서 유지되는 미리 냉장 팁을 사용하십시오. ECM 지하실 재료와 중간 용액 15 마이크로 리터를 96 웰 이미징 플레이트에 베팅했습니다. 플레이트를 섭씨 네 도에서 91배 G에서 20분 동안 원심분리한다.플레이트를 섭씨 37도에서 30분 이상 배양하지 않는다. 여행과 EDTA를 셀에 추가하십시오. 인큐베이션이 끝날 때 세포를 섭씨 37도에서 인큐베이션하고, 세포를 10%FBS를 함유하는 완전한 배지에 현탁시킨다.10 마이크로리터의 세포 현탁액을 혈구계 계수 챔버에 피펫. 챔버의 네 사분면에있는 셀 수를 계산하십시오. 센트라는 실온에서 네 분 동안 135배 G에서 세포를 본다.이 세포를 펠릿화하고, 상청액을 흡인하고, 세포를 페놀 적색 무함유 완전 배지에 재현탁시켜 밀리리터당 6개의 세포에 10의 농도를 얻는다. 세포를 페놀 적색 유리 완전 배지에 희석한다. 세포를 웰 당 35 마이크로리터의 총 부피로 원형 운동으로 적하하는 것을 본다.세포를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소가 있는 가습된 인큐베이터에서 한 시간 동안 배양한다. ECM 지하실 물질의 1.2 마이크로리터에서 웰 당 23.8 마이크로리터의 페놀 레드 프리 완전 매질로, 웰 당 60 마이크로리터의 최종 부피를 초래한다. 세포를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소로 가습된 인큐베이터에서 배양한다.다음날 배지를 100 마이크로 리터의 신선한 페놀 레드 프리 완전 배지로 교체하십시오. 구상체가 들어있는 96 웰 플레이트를 공초점 고함량 스크리닝 현미경에 삽입하십시오. 사용 된 바닥을 자극 할 적절한 레이저를 선택하십시오.누화를 피하기 위해 채널을 순차적으로 획득하고 적절한 목표를 사용하여 구상체를 이미지화하십시오. 구상체의 형태를 분석하기 위해, 형광 접합된 FLoid에 기초하여 구상체를 분절하고 염색한다. 육각 세 개, 세 개, 세 개, 네 개, 두 개의 염색에 기초하여 핵을 분절한다.각 세포의 세포질을 잔류 육각 세 개, 세 개, 네 개, 두 개, 세포질에 존재하는 염색에 의해 분절한다. 부피, 표면적, 구형도 및 그의 구상체 당 핵의 수를 포함하여 구상체의 다른 형태 학적 특성을 계산하십시오. Ross는 75 입방 마이크로 미터보다 작고 900, 000 입방 마이크로 미터보다 큰 구상체를 제거하는 이미지를 추가로 가지고 있습니다.구상체 내의 단일 세포를 분석하기 위해, 형광 컨쥬게이션된 스페로이드 염색에 기초하여 구상체를 분절한다. 육각 세 개, 세 개, 세 개, 네 개, 두 개의 염색에 기초하여 핵을 분절한다. 세포질에 존재하는 잔류 육각 세 개, 세 개, 세 개, 네 개, 두 개의 염색에 의해 각 세포의 세포질을 분절한다.이차 항체 염색에 기초하여 리소좀을 분절한다. 세포당 리소좀의 수, 세포 부피 및 세포 표면적을 포함하여 각 구상체 내의 세포의 상이한 형태학적 특성을 계산한다. 이 그림은 서로 다른 공초점 평면의 이미지를 포함하여 세 가지 유형의 구상체에 대한 개요를 잘 보여줍니다.전체 구상체의 체적보기도 표시됩니다. 도면은 pH 세분화 과정을 나타내고, 패널 A는 전체 구상체를 부피 관점에서 보여준다. 패널 B는 단일 구상체의 모든 세포 내에서 세포질, 핵 및 리소좀의 세트 세분화를 표시한다.세포질과 핵은 육각 세 개, 네 개, 두 개의 염색에 기초하여 분절된다. 및 리소좀은 항-항체 염색일 실험실에 기초하여 분절된다. 패널 C는 패널 B와 동일한 세그먼트를 표시하지만 세 개의 일반 보기로 표시됩니다.구상체 수준에서 다양한 형태학적 측정이 이루어질 수 있다. 이러한 측정에는 구상체 당 핵의 수뿐만 아니라 이들 펠리시티, 부피 및 pH의 표면적의 계산이 포함됩니다. 세 가지 스페로이드 유형에서 각 세포의 전형적인 부피.세포 당 리소좀의 수뿐만 아니라이 그림에 나와 있습니다. SP 생성 초기에 초기 셀 안착 밀도를 최적화하는 것은 중요한 단계입니다. 그림은 너무 많은 세포를 추가하면 여전히 구상체 형성이 가능하다는 것을 보여줍니다.그러나, 이것은 구상체 인 경우 융합을 초래할 수 있습니다. 이러한 방식으로 생산된 구상체는 전사체 및 프로테오믹 분석을 거칠 수 있다. 이 기술은 이러한 나노 입자의 약물 전달의 흡수를 정량적으로 분석하고 구상체 내의 개별 세포에 대한 독성을 평가하는 데 사용됩니다.

a-robust-method-for-large-scale-production-spheroids-for-high-content

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 상업적으로 이용 가능한 마이크로 웰 플레이트를 사용하여 균일 한 크기 및 구성 제어 종양 상체의 (수천 수백 수천) 많은 수의 생성을위한 프로토콜을 소개합니다.

마이크로 웰 플레이트를 사용하여 크기 조절 종양 상체 많은 수의 생산

우리는 명 시야 현미경으로 이미지화 입체 종양 구형 체의 크기를 측정하기 위해 높은 처리량 이미지 분석 소프트웨어 애플리케이션을 제시한다. 이 응용 프로그램은 약물 화면에서 상체를 사용하고자하는 연구자들에게 도움이됩니다 상체에 치료 약물의 효과를 조사하기 위해 신속하고 효과적인 방법을 제공합니다.

종양 상체의 높은 처리량의 이미지 분석 : 자동으로 정확하게 상체의 크기를 측정하는 사​​용자 친화적 인 소프트웨어 응용 프로그램

수성 2상 시스템을 사용하여 고처리량 96웰 플레이트 형식으로 암세포 스페로이드를 로봇 프린팅하기 위한 프로토콜이 제시됩니다.

약물 테스트를위한 수성 2 단계 시스템으로 암 세포 타원체의 로봇 생산

전임상 시험에서 인간 대상 시험으로 전환되는 새로운 약물 표적을 식별하는 것은 과학적인 우선 순위입니다. 이를 위해 여기에서는 유전자 고갈이 암 세포주 스페로이드에 미치는 영향을 조사하기 위한 기능적 유전체학 접근 방식을 설명하며, 이는 생체 내에서 인간 암을 보다 적절하게 모델링합니다.

기능 유전체학에게 검사를 활용하여 암 세포 회전 타원체 문화에 잠재적으로 소설 약 표적을 식별하는

여기에서는 세포 응집을 통해 3D 세포 스페로이드를 형성하기 위한 빠르고 유연한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이는 여러 세포 유형에 쉽게 적용할 수 있으며 세포 이동, 침습 또는 아노이키스 분석을 포함한 다양한 응용 분야와 세포-매트릭스 상호 작용의 이미징 및 정량화에 적합합니다.

3D 회전 타원체 생산을위한 효율적이고 유연한 셀 집계 방법

다양 한 질병의 표시 더 순수 관련 모델 개발 및 구현에 약물 발견 프로그램 되. 여기에 설명 된 새로운 모델 시스템 spheroids를 경작 하 고 종양학 신약에 대 한 검색 하는 높은 처리량 1536-잘 접시 기반 시스템에서 상영 될 수 방법을 3 차원 종양을 보여 줍니다.

마약 검사에 대 한 높은 처리량 3 차원 종양 Spheroids의 생성

본 프로토콜은 3D 프린팅된 스탬프와 같은 장치를 사용하여 비용 효율적으로 조직 스페로이드를 대규모로 생산하는 기술을 설명합니다.

3D 프린팅된 스탬프와 같은 장치를 통한 조직 스페로이드 생성

종양 구상체는 종양 세포-미세환경 상호작용 및 치료 반응을 평가하기 위해 점점 더 활용되고 있다. 본 프로토콜은 신속한 광학 클리어링을 사용하여 3D 종양 구상체의 반고처리량 이미징을 위한 견고하지만 간단한 방법을 기술한다.

종양 구상체의 반 높은 처리량 분석을 위한 신속한 광학 클리어링

재현성이 높은 스페로이드를 성장시키고 이미지 캡처 및 단백질체학을 사용하여 표현형 특성을 분석하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

기능적 3D 스페로이드 세포 배양의 반자동 표현형 분석

이 글에서는 3차원 종양 스페로이드를 구성하기 위한 표준화된 방법을 보여줍니다. 자동화된 이미징 시스템을 사용한 스페로이드 관찰 및 이미지 기반 딥러닝 분석을 위한 전략도 설명합니다.

약물 평가 연구를 위한 3D 종양 스페로이드 생성

여기에서는 후속 다중 파라미터 라이브 셀 현미경을 수행하기 위한 다양한 다세포 스페로이드 형성 방법을 설명합니다. 형광 평생 이미징 현미경(FLIM), 세포 자가형광, 염색 염료 및 나노 입자를 사용하여 살아있는 3차원(3D) 암 및 줄기 세포 유래 스페로이드에서 세포 대사, 저산소증 및 세포 사멸을 분석하는 접근 방식을 시연합니다.

다세포 스페로이드의 생산 및 다중 파라미터 Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM)

배우세요 다세포 종양 구상체를 대규모로 생산하는 방법을 통해 고함량 스크리닝 및 형태학적 분석을 수행하세요. 이 기법은 약물 전달 및 세포 독성 평가 연구에 활용됩니다.

고함량 스크리닝 및 분석 응용을 위한 구상체의 대규모 생산을 위한 강력한 방법

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