Name: 식물 기생 선충류 Ditylenchus dipsaci 배양 및 스크리닝 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-31T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: 배우세요 Ditylenchus dipsaci 배양 및 중간 처리량 화학 스크리닝 기술을 통해 신규 살선충제를 발굴하는 방법을. 이 기술은 농작물 해충 방제와 식량 안보에 기여합니다.

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저자들은 Ditylenchus dipsaci 문화를 제공하고 문화 방법에 대한 조언을 위해 Qing Yu (Agriculture and Agri-Food Canada) 박사를 인정합니다. Benjamin Mimee 박사 (농업 및 농업 식품 캐나다)와 Nathalie Dauphinais (농업 및 농업 식품 캐나다)는 식물 기생 선충류의 체외 문화에 대한 조언을 제공합니다. 앤드류 번스 박사와 숀 해링턴 (Sean Harrington) 박사가 프로젝트와 원고에 대한 유용한 제안을했습니다. JK는 NSERC Alexander Graham Bell Canada 대학원 학자입니다. PJR은 CIHR 프로젝트 보조금 (313296)에 의해 지원됩니다. PJR은 화학 유전학의 캐나다 연구 위원장 (Tier 1)입니다.

본 연구에 사용된 D. dipsaci 균주 G-137은 프린스 에드워드 카운티의 Fish Lake 4 Variety 마늘에서 수집되었으며 캐나다 농업 및 농식품 캐나다에서 제공했습니다. 신선한 문화를 시작하는 경우, 접종 방법론15에 대해서는 Poirier et al.을 참조하십시오.
1. D. 딥사시의 배양
<ol><li>이전에 보고된 작업15에 따라 미디어와 플레이트를 준비한다.<ol>
<li>500 mL의 영양 한천 (NA) 배지를 23 g / L의 NA ( 재료 표 참조) 및 초순수로 준비하십시오. 멸균 기술을 사용하여 오토클레이브 NA 배지 25mL를 일회용 페트리 접시 20개(직경 100mm x 깊이 15mm)에 붓습니다. 한천이 ~2시간 동안 뚜껑을 켠 상태에서 실온(22°C)에서 응고되도록 허용하고 나중에 사용할 수 있도록 따로 보관합니다.</li>
		<li>최소 유기물이 있는 3.2 g/L의 GA 기본 배지, 20 g/L의 수크로오스, 15 g/L의 한천 및 증류수를 포함하는 Gamborg B-5 (GA) 배지 500 mL를 준비하십시오 ( 자료 표 참조). 멸균 기술을 사용하여 오토클레이브 GA 배지 50mL를 일회용 페트리 접시 10개(직경 100mm x 깊이 25mm)에 붓습니다. 한천이 뚜껑을 켠 상태에서 실온(22°C)에서 응고되도록 ~5시간 동안 방치하고, 새싹이 옮겨질 때까지 멸균 백에 실온에서 똑바로 보관한다. 참고: 과도한 미디어 플레이트는 오염이 발생할 경우 만들어집니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>이전 작업15에서 수정 된 방법에 따라 종자 살균을 수행하십시오.<ol>
<li>2 L 비이커 1개를 교반 바, 2 포셉, 유리 페트리 접시 및 증류수 1 L로 오토클레이브합니다. 95% EtOH 용액 200mL와 15% 상업용 표백제 용액 200mL를 준비한다.</li>
		<li>완두콩 씨앗을 사용하십시오 ( 재료 표 참조). 실험실 벤치의 Bunsen 버너 불꽃 근처의 교반 막대가있는 멸균 된 2L 비커에 150 개의 씨앗을 붓습니다.</li>
		<li>비이커 내의 종자에 95% EtOH 200 mL를 첨가하고, 교반 플레이트에서 5분 동안 격렬하게 저어준 다음, 폐기물 용기에 EtOH를 붓는다.</li>
		<li>표백제 용액을 비커에 부어 씨앗을 완전히 담그십시오. 교반 접시에서 20 분 동안 격렬하게 저어 준 다음 표백제를 폐기물 용기에 붓습니다.</li>
		<li>비커에 증류수를 붓고 씨앗을 담그고 20 분 동안 교반 접시에 격렬하게 저어줍니다. 물 세척을 세 번 반복하고 각 세척 후 증류수를 붓습니다. 마지막 물 세척 후, 유리 페트리 접시에 살균 된 씨앗을 붓는다.</li>
		<li>오염을 확인하기 위해, 멸균된 포셉을 사용하여 층류 홍수 후드의 각 10cm NA 플레이트(단계 1.1.1에서 제조)에 6개의 종자를 옮깁니다. 접시의 둘레 주위에 씨앗을 배열하십시오 (깃털 씨앗이 가장 잘 작동합니다). 플레이트를 실험실 랩핑 필름에 개별적으로 감싸고 26°C에서 3일 동안 어둠 속에서 인큐베이션한다. 참고 : 필요한 것보다 더 많은 씨앗을 도금하면 오염되지 않은 씨앗을 선택적으로 사용할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>아래 단계에 따라 새싹 전달을 수행하십시오.<ol>
<li>층류 후드에서 멸균된 포셉을 사용하여 각 GA 플레이트에 오염되지 않은 종자 2개를 플레이트에 플레이트합니다(단계 1.1.2에서 준비). 플레이트를 실험실 래핑 필름에 개별적으로 감싸고 종자가 싹을 틔울 수 있도록 실온에서 7-10 일 동안 배양하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>이전 작업(15)으로부터 수정된 방법에 따라 시험관내 사육을 수행한다.<ol>
<li>20 g/L 수크로오스 용액 50 mL를 준비한다. 필터는 수크로오스 용액을 멸균하고 따로 보관하십시오.</li>
		<li>층류 후드에서 뿌리 조직 (~2cm3)을 함유 한 한천 조각을 기존 배양 접시에서 자릅니다. 완두콩 묘목이있는 새로운 GA 플레이트에 수크로오스 용액 500 μL를 피펫하고 수크로오스 위에 한천 큐브를 놓습니다. 플레이트를 실험실 래핑 필름에 개별적으로 감싸고 실온에서 알루미늄 호일로 늘어선 상자에서 배양물을 유지한다 (∼22°C).</li>
		<li>배양을 유지하기 위해 8-9주마다 신선한 GA 플레이트 상에 선충류를 계대배양한다. 선충류는 ~ 8 주 후에 추출 될 준비가되었습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. D. dipsaci의 추출 및 수집
<ol><li>아래 단계에 따라 D. dipsaci 의 추출을 수행하십시오.<ol>
<li>50mL 비이커, 80mm 깔때기, 150mL 증류수 및 커피 필터를 오토클레이브합니다. 깔때기를 비커에 넣고 깔때기를 멸균 커피 필터로 정렬하십시오.</li>
		<li>층류 후드에서 멸균 메스를 사용하여 한천과 뿌리 조직을1cm3 로 자릅니다. 한천 큐브를 커피 필터가 늘어선 깔때기로 옮기고 한천에 증류수를 천천히 부어 커피 필터를 적셔줍니다.</li>
		<li>비이커에서 커피 필터가 늘어선 깔때기를 제거하고 커피 필터가 늘어선 깔때기를 교체하면 수위가 필터 바닥에 닿을 때까지 비이커를 증류수로 채 웁니다.</li>
		<li>커피 필터가 늘어선 깔때기와 비커를 알루미늄 호일로 덮으십시오. 웜이 커피 필터를 통해 수집 비커로 이동할 수 있도록 벤치 탑에 하룻밤 (16 시간) 두십시오. 참고 : 선충류 배양 플레이트는 해부 현미경으로 검사 할 때 웜이 한천으로 기어 들어갔을 때 추출 할 준비가되었습니다. 전형적으로, 플레이트는 초기 접종 후 6-8 주 후에 추출 준비됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>D. dipsaci의 수집을 수행하십시오. 참고 : 다음날 D. dipsaci 웜은 비커의 바닥에 정착 할 것입니다.<ol>
<li>커피 필터 라이닝된 깔때기를 제거하고 수집 비이커로부터 최고 40 mL의 물을 흡인하고; 정착 된 웜을 방해하지 않도록하십시오. 10 mL 플라스틱 혈청학적 피펫을 사용하여, 남아있는 액체를 15 mL 원뿔형 원심분리 튜브에 수집한다. 참고: 이 컬렉션은 분석에서 직접 사용할 수 있습니다. 24시간 이내에 사용하지 않을 경우 4°C에 둔다. 웜은 이동성에 눈에 띄는 영향없이 4 °C에서 3 일 동안 방치 할 수 있습니다. 깔때기를 제거하면 수집 비커의 웜이 방해받을 수 있습니다. 수집하기 전에 바닥에 정착하게하십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 시험관내 소분자화
<ol><li>하기 단계에 따라 분석 플레이트를 준비한다.<ol>
<li>오토클레이브 증류수를 멸균 트로프에 붓고, 다채널 피펫을 사용하여, 골짜기로부터 증류수 40 μL를 평평한 바닥 96-웰 플레이트의 각 웰에 분주한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>고정 도구 준비 및 화학 물질 추가<ol>
<li>실험실 벤치의 Bunsen 버너 불꽃 근처에 피너 트레이( 재료 표 참조)를 설치하십시오. 연속 피너 트레이에 다음을 추가합니다: 핀 세척 용액 25 mL, 50% DMSO 35 mL(물 중), 증류수 45 mL, 70% EtOH 55 mL, 95% EtOH 65 mL. 블롯팅 용지 한 장을 각 트레이 앞에 놓습니다.</li>
		<li>세척 용액의 핀을 에머징하고 용액에서 핀을 위아래로 3회(3배) 이동시켜 고정 도구를 청소합니다. 이 프로토콜에서 '3x'와 '10x'는 솔루션에서 피너를 각각 세 번 또는 10 번 위아래로 움직이는 것으로 정의됩니다. 블롯팅 용지에 핀을 블롯합니다. 이 절차를 한 번 더 반복하십시오.<ol>
<li>다음으로, 핀을 증류수에서 3x 헹구고 핀을 블롯팅합니다. 이 절차를 한 번 더 반복하십시오.</li>
			<li>마지막으로 핀을 95% EtOH로 3배 헹구고 핀을 블롯팅합니다. 한 번 더 반복하십시오. 피너를 화염시키고 에탄올이 증발하도록하십시오.</li>
		</ol>
</li>
		<li>96웰 화학 스톡 플레이트의 화학 물질을 화학 플레이트에 3x를 고정한 다음 핀 10X를 분석 플레이트로 옮겨 분석 플레이트에 추가합니다. 세척 용액 앞의 종이에 닦으십시오.</li>
		<li>블롯팅 용지에서 그 사이에 블롯팅하여 다음 순서로 세척하여 플레이트 사이의 고정 도구를 청소하십시오 : 50 % DMSO (한 번), 증류수에서 3x (한 번), 75 % EtOH에서 3x (한 번), 95 % EtOH에서 3x (두 번). 피너를 화염시키고 에탄올이 증발하도록하십시오.</li>
		<li>모든 고정이 완료되면 3.2.2단계를 반복합니다. 주: 스크리닝은 60 μM의 최종 농도에서 수행되었다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>웜 추가<ol>
<li>먼저 재현탁 한 다음 관찰을 위해 슬라이드에 낮은 보존 팁을 사용하여 5 μL를 피펫팅하여 수집에서 선충류의 수를 계산하십시오. 해부 현미경을 사용하여 5 μL의 선충류의 수를 계산하십시오.<ol>
<li>멸균 증류수를 사용하여 농도를 2 웜 / μL로 조정하십시오. 다중 채널 피펫과 골짜기를 사용하여 96웰 플레이트의 각 웰에 10μL(~20개의 웜)를 추가합니다. 주: 대략 15,000 D. 딥사시 선충류는 기술된 배양 및 수집 방법을 사용하여 배양 플레이트 당 수집될 것이다. 스무 개의 웜이 우물 당 사용되는데, 그 이유는 작은 수가 모바일 및 움직이지 않는 웜의 명확한 시각화와 회계를 용이하게하기 때문입니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>실험실 포장 필름에 접시를 밀봉하고 젖은 종이 타월로 감싸십시오. 박스에 넣고 200 rpm으로 설정된 20°C 진탕 배양기에서 끈적끈적한 패드에 부착한다. 접시의 움직임을 최소화하기 위해 여분의 축축한 종이 타월을 추가하여 접시가 상자에서 안정화되도록하십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 데이터 수집 및 분석
<ol><li>해부 현미경으로 5 일째에 접시를 관찰하십시오. DMSO 용매 대조군 및 약물 처리 웰에서 D. dipsaci 의 이동 수 및 총 수를 계수한다.<ol>
<li>웜이 비교적 움직이지 않는 경우, 2 μL의 1 M NaOH를 40 mM의 최종 농도로 웰에 첨가하여19,20의 이동을 자극한다. 참고 : NaOH를 추가 한 후 웜은 즉시 움직이며 5 분 이내에 볼 필요가 있습니다. 모바일 웜의 수와 웜의 총 수는 모바일 웜의 비율을 계산하는 데 사용됩니다. 분석의 길이는 스크린의 목적에 따라 변경될 수 있다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>모바일 웜의 비율을 계산합니다. D. dipsaci 스크린에서는 재현 가능하게 0 % 모바일 웜을 산출 한 웰이 강력한 히트로 분류됩니다. 참고 : 해부 현미경 단계에서 플레이트의 장시간 노출은 광원이 플레이트를 가열하고 생물 분석에 대한 다양한 효과를 유도 할 수 있기 때문에 피할 수 있습니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

중요한 단계 프로토콜의 단순성에도 불구하고 프로토콜에는 성공 가능성을 극대화하기 위해 추가주의해야 할 중요한 단계가 있습니다. 첫째, 씨앗을 과다 표백하면 성장을 방해 할 수 있습니다. 따라서 표백 용액에서 종자의 시간을 20 분 이하로 제한하는 것이 필수적입니다. 둘째, Storelli et al.에 의해 이전에 언급된 바와 같이, 선충류의 겉보기 건강은 4°C에서16°C에서 저장될 때 시간에 따라 감소한다. 수집 직후에 선충류를 사용하면 최적의 선별 조건을 달성 할 수 있다는 추가적인 확신을 얻을 수 있습니다. 장기간 보관이 필요한 경우 튜브의 뚜껑이 산소 교환을 허용하도록 단단히 조이지 않았는지 확인하십시오. 셋째, 완두콩이 제안 된 시간 동안 NA 플레이트에서 자라는 것을 보장하면 실험자는 어떤 씨앗이 오염되었는지 판단 할 수 있습니다. 넷째, 선충류를 첨가하기 전에 GA 플레이트에 완두콩을 과도하게 재배하면 감염이 약화되고 선충류 수확량이 감소합니다. 마지막으로, 제어하기 어려운 많은 요인이 선별 결과에 영향을 줄 수 있습니다. 따라서, 결과의 재현성을 보장하기 위해 상이한 배양 플레이트로부터 수집된 PPN을 사용하여 상이한 요일 및 이상적으로 다수의 독립적인 복제 스크린을 수행하는 것이 필수적이다.
방법의 한계 프로토콜의 한계는 청소년에서 성인에 이르기까지 수집 된 웜의 발달 단계를 동기화하지 못한다는 것입니다. 따라서 모든 화면에서 드러나는 강력한 히트는 여러 단계에서 효과적 일 수 있습니다. 그러나 이 프로토콜은 효과적인 스테이지별 히트를 간과할 위험을 증가시킵니다. 두 번째 고려 사항은 시험관 내 스크리닝이 네마티드 발견 파이프 라인의 첫 번째 단계로 간주되어야한다는 것입니다. 토양 기반 분석은 히트의 번역성을 테스트하기 위해 파이프 라인에 우수한 첨가물입니다.
프로토콜의 중요성과 적용 본원에 기술된 프로토콜은 간단하고 쉽게 복제된다. 또한이 프로토콜은 Pratylenchus penetrans를 포함한 실험실의 다른 PPN에 약간의 수정 만 수행하여 성공적으로 적용되었습니다. 새롭고 안전한 PPN 통제 조치를 개발하는 것은 세계 식량 안보를 보장하는 데 필수적입니다. 이것은 D. dipsaci와 같은 종에 대해 특히 사실이며, 일반적으로 현재 허용되는 다양한 화학 네마티드13,14에 관대합니다. 따라서 여기에 설명 된 프로토콜은 전 세계적으로 인간 건강에 중요한 기여를 할 수있는 잠재력을 가지고 있습니다.

식물 기생 선충류 (PPN)는 세계 식량 생산의 12.3 %의 손실에 책임이 있으며 매년 1,2,3 년에약 157 억 달러의 피해를 입힌 것으로 추정됩니다. 불행히도, 효과적인 화학 네마티드가 금지되었거나 인간의 안전 및 환경 문제로 인해 증가하는 제한에 직면하고 있기 때문에 PPN을 제어 할 수있는 능력이 약화되고 있습니다. 이것은 주로 이전 세대의 살충제4의 선충류 선택성이 좋지 않기 때문입니다. 지난 25 년 동안 여섯 개의 새로운 화학 네마티 타이드가 시범 운영되거나 시장에 도입되었습니다5. 이 중 하나는 이미 유럽에서 금지되었으며, 다른 하나는 인간 heatlh 6,7에 미치는 영향에 대해 조사되는 동안 중단되었습니다. 따라서 PPN에 대해 매우 선택적인 새로운 네마티드에 대한 절실한 필요성이 있습니다.
줄기와 전구 선충류 인 Ditylenchus dipsaci (D. dipsaci)는 경제적으로 영향력있는 PPN4입니다. D. dipsaci는 30 개의 생물학적 인종에 걸쳐 거의 500 종의 식물을 감염시키고 호밀, 귀리, 마늘, 양파 및 부추 8,9와 같은 농업적으로 가장 중요한 작물을 대상으로합니다. 예를 들어, D. dipsaci는 최근 온타리오와 퀘벡의 마늘 밭을 채찍질하여 최대 90 % 10,11의 손실을 입었습니다. 지리적 분포는 거의 유비쿼터스이며 아메리카 대륙 (캘리포니아 및 플로리다 포함), 유럽, 아시아 (중국 포함) 및 오세아니아9를 포함합니다. D. dipsaci는 잎이나 상처 및 렌티셀에 구내마타로 들어가는 철새 내기생충으로 세포벽을 무너뜨리기 위해 효소를 방출합니다(12). D. dipsaci가 작물에 미치는 영향을 복합화하여, PPN에 의한 손상은 식물을 이차 감염에 취약하게 만든다11. 불행히도, D. dipsaci는 다른 선충류 균주13,14에 비해 현재 선충제에 대해 높은 내성 수준을 보여줍니다.
이 프로토콜은 D. dipsaci의 배양과 소분자 후보 네마티드에 대한 대규모 스크린에서의 사용을 설명합니다. 간략하게, D. 딥사치 개체군은 멸균된 감보그 B-5(GA) 배지(15)에서 배양된 완두콩 식물 상에서 유지되고 확장된다. GA 배지에서 종자 콩나물을 재배하기 전에 종자는 일련의 세척을 통해 멸균되어야하며 오염을 확인하기 위해 영양 한천 (NA)에 도금되어야합니다. 종자 살균은 존재할 수있는 박테리아 및 곰팡이 오염 물질을 탐지하는 데 필수적입니다. 오염되지 않은 씨앗은 GA 플레이트로 옮겨지며, 종자 콩나물은 감염에 대비하여 자랍니다. 종자 콩나물을 함유하는 GA 플레이트는 뿌리 조직을 함유하는 한천 조각을 신선한 플레이트로 옮겨서 이전 배양 플레이트로부터의 선충류에 감염된다. 6-8 주 후, 선충류는 GA 배지에서 추출되고 커피 필터 라이닝 깔때기를 통해 수집 비이커로 여과됩니다. 선충류는 일단 적절한 수가 수집되면 다양한 생물 검정에 사용될 수 있습니다. 이 프로토콜에 기술된 기술은 배양 플레이트 당 대략 15,000 D. 딥사시를 생성한다. D. dipsaci를 육성하기위한 대체 프로토콜이 출판되었습니다16,17.
이전 작업(18)에 기초한 시험관내 소분자 스크리닝 분석이 또한 여기에 기재되어 있다. 웜 건강의 대리자로서, 우물 당 20 선충류의 이동성은 소분자 노출 5 일 후에 검사됩니다. 웜 이동성을보다 잘 시각화하기 위해 NaOH가 추가되어 살아있는 웜의 움직임을 증가시킵니다19,20. 이 프로토콜은 중간 처리량 스크리닝을 허용하고 소분자의 nematicidal 잠재력을 평가하는 데 유용한 데이터를 제공합니다. 상이한 선충류 수집 기술이 사용되는 경우(16,17), 그럼에도 불구하고 본원에 기재된 소분자 스크리닝 방법론이 구현될 수 있다.

<table><tbody><tr><td>15mL 튜브</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.205</td><td></td></tr><tr><td>집게 2</td>개 <td>Almedic</td><td>7747-A10-108</td><td></td></tr><tr><td>2L 비커</td><td>Pyrex</td><td>CLS10002L</td><td></td></tr><tr><td>50mL 비커</td><td>Pyrex</td><td>CLS100050</td><td></td></tr><tr><td>96 웰 플레이트</td><td>Sarstedt</td><td>83.3924</td><td></td></tr><tr><td>알루미늄 호일</td><td>Alcan Plus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>세균 한천</td><td>BioShop</td><td>AGR001.5</td><td></td></tr><tr><td>커피 필터</td><td>이름 없음 브랜드</td><td>716</td><td></td></tr><tr><td>상업용 표백제 6%</td><td>Lavo Pro 6</td><td>DIN102358107</td><td></td></tr><tr><td>일회용 페트리 접시(10cm x 1.5cm)</td><td>Fisherbrand</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>일회용 페트리 접시(10cm x 2.5cm)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z358762</td><td></td></tr><tr><td>해부 범위</td><td>라이카</td><td>Leica MZ75</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>시그마-알드리치</td><td>472301-500ML</td><td></td></tr><tr><td>깔때기</td><td>VWR</td><td>414004-270</td><td></td></tr><tr><td>갬보그 B5</td><td>시그마-알드리치</td><td>G5893-10L</td><td></td></tr><tr><td>유리 페트리 접시</td><td>VWR</td><td>75845-546</td><td></td></tr><tr><td>유리 슬라이드</td><td>MAGNA</td><td>60-1200</td><td></td></tr><tr><td>보푸라기 없는 블로팅 페이퍼</td><td>V& P Scientific</td><td>VP 522-100</td><td></td></tr><tr><td>저잔류 피펫 팁(200uL)</td><td>LABFORCE</td><td>1159M44</td><td></td></tr><tr><td>다중 채널 피펫</td><td>Eppendorf Research Plus</td><td>3125000036</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045-500G</td><td></td></tr><tr><td>영양 한천</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>70148-100G</td><td></td></tr><tr><td>파라필름</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>완두콩 씨앗</td><td>온타리오 종자 회사</td><td>D-1995-250G</td><td></td></tr><tr><td>핀 세척 솔루션</td><td>V & P 사이언티픽</td><td>VP110A</td><td></td></tr><tr><td>피너</td><td>V& P Scientific</td><td>VP381N</td><td></td></tr><tr><td>피너 린스 트레이</td><td>V& P Scientific</td><td>VP 421</td><td></td></tr><tr><td>시약 저장소(다채널 피펫용 뚜껑 포함</td>) <td>Sigma-Aldrich</td><td>BR703459</td><td></td></tr><tr><td>진탕 인큐베이터</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>I26</td><td></td></tr><tr><td>멸균 수술용 블레이드</td><td>MAGNA</td><td>sb21-100-a</td><td></td></tr><tr><td>교반 막대</td><td>Fisherbrand</td><td>2109 -</td> 1451359 <td></td></tr><tr><td>자당</td><td>BioShop</td><td>SUC507.1</td><td></td></tr></tbody></table>

식물 기생 선충류 ditylenchus dipsaci 배양 및 스크리닝

Culturing and Screening the Plant Parasitic Nematode Ditylenchus dipsaci

식물 기생 선충류 (PPN)는 매년 세계 식량 작물의 12 % 이상을 파괴하며, 이는 매년 약 157 억 달러 (USD)가 손실되는 것과 같습니다. 전 세계 인구가 증가하고 경작지가 제한됨에 따라 PPN 침입을 통제하는 것이 식량 생산에 매우 중요합니다. 작물 수확량을 극대화하는 도전은 선충류 선택성이 부족하기 때문에 효과적인 살충제에 대한 제한 사항이 가중되고 있습니다. 따라서 새롭고 안전한 화학 네마티드를 개발하는 것은 식량 안보에 필수적입니다. 이 프로토콜에서, PPN 종 Ditylenchus dipsaci 의 배양 및 수집이 입증된다. D. dipsaci는 경제적으로 손상되고 대부분의 현대 네마티드에 상대적으로 내성이 있습니다. 현재의 연구는 또한 새로운 소분자 nematicides에 대한 스크린에서 이러한 선충류를 사용하는 방법과 데이터 수집 및 분석 방법론에 대한 보고서를 설명합니다. 입증 된 파이프 라인은 일주일에 수천 개의 화합물의 처리량을 제공하며 Pratylenchus penetrans와 같은 다른 PPN 종과 함께 사용하기 위해 쉽게 적용 할 수 있습니다. 본원에 기술된 기술들은 새로운 네마티드를 발견하는데 사용될 수 있으며, 이는 차례로 점점 더 배고픈 세계를 먹여 살리는 것을 돕기 위해 PPN과 안전하게 싸우는 고도로 선택적인 상용 제품으로 더욱 발전될 수 있다.

독립적인 반복실험은 재현 가능한 히트를 나타냅니다. 복제 스크린 사이의 예상되는 변동을 설명하기 위해, 표본 이동성의 평균 및 변동은 최근 스크린의 세 개의 대표적인 플레이트로부터 플롯된다(그림 1). 스크린의 세 번의 반복실험은 세 개의 상이한 날에 수행되었다. 세 플레이트 모두 음수 (용매 전용) 대조군 (어두운 막대)을 가지며 세트 내의 샘플에는 확립 된 네마티드가 포함되어 있습니다. 나머지 화합물은 현재 Roy 실험실에서 특성화되고 있는 맞춤형 라이브러리로부터 유래한다. 동일한 분자를 가진 C. elegans로 수행 된 유사한 스크린 (SC, JK, PJR, 미공개 결과)과 비교할 때, D. dipsaci를 사용한 적중률은 현저히 낮으며 많은 약물 플레이트는 활성을 나타내지 않습니다 (그림 1A). 일부 플레이트는 완전히 재현 가능한 히트를 가지며(그림 1B,C), 다른 플레이트는 활성이 다양합니다(그림 1C). 스크리닝된 다른 종(도시되지 않음)에 비해, D. dipsaci는 화합물에 대한 그의 반응에서 더 적은 가변성을 나타낸다. 그럼에도 불구하고, 반복실험은 재현 가능한 히트의 식별에 필요한 것으로 간주됩니다.
Nematicides는 Ditylenchus dipsaci를 고정시키는 능력이 다양합니다. D. dipsaci에 대해 시험된 일곱 가지 특징화된 네마티드 중에서, 오직 Fluopyram만이 본원에 기재된 검정에서 강력한 활성을 나타낸다(도 1C). 이것은 D. dipsaci가 nematicides13,14에 관대하다는 것을 보여주는 이전 연구와 일치합니다. Fyopyram은 선충류 선택적 방식으로 전자 수송 사슬의 콤플렉스 II를 억제하고 로틸렌슐루스 레니포르미스 및 멜로이도인 인코그니타 4,21,22를 포함한 다양한 PPN을 제어하는데 사용되는 상업적 네마티드이다. Fluopyram 및 시험된 농도에서 활성이 결여된 네마티드 중 하나(Oxamyl)23은 D. dipsaci를 사용한 용량-반응 분석을 통해 보다 상세하게 조사되었다. Fyopyram은 9.3 μM의 EC50 (8.2 내지 10.5 μM 사이의 95% 신뢰 구간 포함)을 갖는 D. dipsaci 이동성에 대한 명백한 용량 의존적 효과를 유도한다 (도 2A, B). 이러한 결과는 Storelli et al., 202013으로부터 공개된 시험관내 결과에 기초하여 예상된다. 옥사밀은 120 μM의 농도까지 이동성에 유의한 영향을 미치지 않는다(p=0.3632, 짝을 이루지 않은 t-test)(도 2C, D).
수산화나트륨은 분석 감도를 향상시킵니다. 액체 배양18에서 C. elegans의 거의 지속적인 수영 활성과는 달리, D. dipsaci 동물은 극적으로 덜 이동성이 있습니다. 이것은 문화16의 기생 선충류들 사이에서 드문 일이 아닙니다. 병든 웜과 '휴식' 웜을 구별하는 데 도움이 되도록 40mM의 NaOH가 분석 종점에서 사용되어 19,20이 가능한 개체의 움직임을 자극합니다(그림 3). 이 기술은 부정적인 통제 우물에있는 모든 웜이 움직이고 화면에서 오탐의 예외적으로 낮은 배경을 산출한다는 점을 감안할 때 웜을 고정시키는 작은 분자를 명확하게 식별 할 수있게합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63438/63438fig01v2.jpg"> 그림 1: 화면 출력의 예 D. dipsaci 를 갖는 세 개의 생물학적 반복실험(열린 원)을 나타낸 세 개의 플레이트 각각에서 소분자(60 μM)에 대해 수행하였다. 세 플레이트 모두 0.6%의 DMSO 용매 전용 컨트롤(어두운 막대)을 가지고 있습니다. 용매 제어 또는 알려진 네마티드와 달리 명시된 경우를 제외하고, 세 플레이트의 웰에는 공급 업체로부터 구입 한 비교적 특징이없는 약물 유사 화합물이 포함되어 있습니다 (Burns et al., 2015 참조)18. (A) 소분자 라이브러리로부터의 96 웰 플레이트는 D. dipsaci에 대해 관찰 가능한 생체활성을 갖는 임의의 분자가 결여되어 있다. (B) 소분자 라이브러리로부터의 96 웰 플레이트는 D. dipsaci 이동성을 재현가능하게 방해하는 단일 분자를 갖는다. (c) 특징화된 네마티드인 플루오피람(fluo), 이프로디온(ipro), 아바멕틴(abam), 플루엔술폰(flue), 티옥사젠(tiox), 옥사밀(oxam), 및 wact-11을 함유하는 96웰 약물 플레이트. 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63438/63438fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63438/63438fig02.jpg"> 도 2: 이동성 검정을 이용한 양성 및 음성 결과의 예 . (A) NaOH 첨가 전 5일 후에 플루오피람의 농도 를 증가시키는 D. dipsaci 의 노출 후의 말단 표현형의 예. (B) 플루오피람의 지시된 농도에 대한 노출 5일 후의 D. dipsaci 의 이동에 대한 용량-반응 분석. (C,D) 옥사밀을 제외하고 A, B와 동일합니다. 각 그래프는 매일 세 번의 반복실험으로 이틀에 걸쳐 수행된 임상시험을 보여줍니다. 각 그래프의 y축은 웰 내의 총 동물 수를 기준으로 이동하는 동물의 수로서 계산된 각 웰에서 웜의 이동 분율을 나타낸다. 두 그래프의 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타냅니다. 눈금 막대는 1mm를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63438/63438fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63438/63438fig03.jpg"> 도 3: 40 mM의 NaOH를 첨가한 후의 D. dipsaci의 이동성. NaOH의 효과는 용매 전용 대조군 (A), tioxazafen (B), 또는 fluopyram (C)의 존재하에 D. dipsaci 샘플에 첨가된 후 5일 공동 인큐베이션한 후에 이루어진다. 눈금 막대는 1mm를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63438/63438fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

본 프로토콜은 Ditylenchus dipsaci를 배양, 수집 및 스크리닝하기 위한 안정적이고 간단한 방법을 기술한다.

식물 기생 선충류 Ditylenchus dipsaci 배양 및 스크리닝

Plant-parasitic nematodes (PPNs) destroy over 12% of global food crops every year, which equates to roughly 157 billion dollars (USD) lost annually. With ...

이 프로토콜은 기술과 중간 처리량의 화학 스크린을 배양하여 Ditylenchus dipsaci와 싸우기위한 새로운 nematicides의 발견을 허용합니다. 이 기술의 단순성으로 인해 일주일에 수천 개의 화합물을 스크리닝하여 nematicidal 잠재력을 가진 화합물을 식별 할 수 있습니다. 이 기술은 작물의 식물 기생 선충류를 죽이는 새로운 화합물을 식별 할 수 있으므로 세계 식량 공급을 증가시킬 수 있습니다.시작하려면 500 밀리리터의 영양 한천 또는 NA 배지를 NA 리터 당 23 그램과 초순수로 준비하십시오. 멸균 기술을 사용하여 25 밀리리터의 오토클레이브 NA 매체를 일회용 100mm 직경, 15mm 깊이의 페트리 접시 20 개에 붓습니다. 최소 유기물을 함유 한 GA 기본 배지 리터 당 3.2 그램, 수크로오스 리터 당 20 그램, 한천 리터 당 15 그램 및 증류수가 들어있는 Gamborg B5 또는 GA 배지 500 밀리리터를 준비하십시오.멸균 기술을 사용하여 오토클레이브 GA 미디어 50 밀리리터를 일회용 페트리 접시 10 개에 붓습니다. 종자 살균을 수행하려면 실험실 벤치의 Bunsen 버너 불꽃 근처의 교반 막대가있는 멸균 된 두 리터 비커에 완두콩 씨앗 150 개를 붓습니다. 씨앗에 95 % 에탄올 200 밀리리터를 넣고 볶음 접시에서 5 분 동안 격렬하게 저어줍니다.그런 다음 에탄올을 폐기물 용기에 붓습니다. 표백제 용액을 비커에 부어 씨앗을 완전히 담그십시오. 볶음 접시에 20 분 동안 격렬하게 저어줍니다.그런 다음 표백제를 폐기물 용기에 붓습니다. 비커에 증류수를 붓고 씨앗을 담그고 볶음판에 20분 동안 격렬하게 저어줍니다. 마지막 물 세척 후, 유리 페트리 접시에 살균 된 씨앗을 붓는다.오염을 확인하려면 멸균된 포셉을 사용하여 층류 후드의 각 10센티미터 NA 플레이트에 여섯 개의 씨앗을 옮깁니다. 접시의 둘레 주위에 씨앗을 배열하십시오. 플레이트를 실험실 포장 필름에 개별적으로 감싸고 섭씨 26도에서 사흘 동안 어둠 속에서 배양하십시오.층류 후드에서 멸균된 포셉으로 각 GA 플레이트에 오염되지 않은 두 개의 씨앗을 플레이트에 플레이트합니다. 씨앗이 싹을 틔울 수 있도록 실온에서 7 ~ 10 일 동안 배양하십시오. 리터 당 20 그램의 수크로오스 용액 50 밀리리터를 준비하십시오.필터는 자당 용액을 멸균하고 따로 보관하십시오. 층류 후드에서 뿌리 조직을 포함하는 한천 조각을 기존 배양 플레이트에서 자릅니다. 완두콩 묘목이있는 새로운 GA 플레이트에 500 마이크로 리터의 자당 용액을 피펫하고 자당 위에 한천 큐브를 놓습니다.실온에서 알루미늄 호일이 늘어선 상자에 배양물을 유지한다. 문화를 유지하기 위해, 선충류를 여덟 주에서 아홉 주마다 신선한 GA 플레이트에 계대배양한다. 선충류는 약 여덟 주 후에 추출 될 준비가되었습니다.층류 후드에서 한천과 뿌리 조직을 멸균 메스가있는 한 센티미터 큐브로 자릅니다. 한천 큐브를 커피 필터가 늘어선 깔때기로 옮기고 한천에 증류수를 천천히 부어 커피 필터를 적셔줍니다. 비이커에서 커피 필터가 늘어선 깔때기를 제거하고 커피 필터가 늘어선 깔때기를 교체하면 수위가 필터 바닥에 닿을 때까지 비이커를 증류수로 채 웁니다.커피 필터가 늘어선 깔때기와 비커를 알루미늄 호일로 덮으십시오. 웜을 수집하려면 커피 필터가 늘어선 깔때기를 제거하고 수집 비이커에서 상위 40 밀리리터의 물을 흡인하여 정착 된 웜을 방해하지 마십시오. 나머지 액체를 10 밀리리터 플라스틱 혈청 학적 피펫이있는 15 밀리리터 원뿔형 원심 분리 튜브에 모으십시오.분석 플레이트를 준비하려면 오토클레이브 증류수를 멸균 트로프에 붓고 골짜기에서 증류수 40 마이크로리터를 다채널 피펫이 있는 평평한 바닥 96웰 플레이트의 각 웰에 분배합니다. 화학 플레이트에 세 번 고정하여 96웰 화학 스톡 플레이트의 화학 물질을 분석 플레이트에 추가합니다. 이어서, 핀을 분석 플레이트 내로 10회 옮긴다.세척 용액 앞의 종이에 닦으십시오. 컬렉션에서 선충류의 수를 계산하려면 먼저 컬렉션을 다시 일시 중단 한 다음 슬라이드에 낮은 보존 팁을 사용하여 용액의 다섯 마이크로 리터를 피펫하십시오. 해부 현미경을 사용하여 다섯 마이크로 리터의 선충류의 수를 계산하십시오.그런 다음 멸균 증류수를 사용하여 마이크로 리터 당 두 개의 웜으로 농도를 조정하십시오. 다음으로, 10 마이크로리터의 샘플을 다채널 피펫 및 골짜기로 96-웰 플레이트의 각 웰에 첨가한다. 접시를 젖은 종이 타월로 싸서 상자에 넣으십시오.그런 다음 여분의 젖은 종이 타월을 추가하여 플레이트의 움직임을 최소화하고 200RPM으로 설정된 섭씨 20도 진탕 인큐베이터의 끈적 끈적한 패드에 부착하십시오. 해부 현미경으로 다섯 번째 날에 플레이트를 관찰하십시오. DMSO 용매 대조군 및 약물 처리 웰에서 이동 및 총 D.dipsaci의 수를 계산합니다.웜이 움직이지 않으면 운동을 자극하기 위해 웰에 40 밀리몰의 최종 농도에 두 마이크로 리터의 원몰 수산화 나트륨을 첨가하십시오. 모바일 웜의 비율을 계산합니다. D.dipsaci 화면에서는 재현 가능하게 0 % 모바일 웜을 산출 한 우물이 강력한 히트로 분류됩니다.세 개의 상이한 약물 플레이트를 60-마이크로몰의 농도로 스크리닝하였고, 여기서 각각의 약물 플레이트는 세 개의 생물학적 반복실험을 갖는다. 세 플레이트 모두 DMSO 용매 전용 대조군의 6%를 포함했다. 소분자 라이브러리의 약물을 포함하는 많은 플레이트에는 D.dipsaci에 대해 관찰 가능한 생체 활성을 가진 분자가 부족했습니다.일부 판은 완전히 재현 가능한 히트를 보였고, 다른 판에는 특징적인 네마티드가 포함되어 있으며 그 활성이 다양했습니다. 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타냅니다. 여기서, fluopyram은 분석에서 강력한 활성을 나타내었다.Fyopyram은 9.3-마이크로몰의 EC50을 사용하여 D.dipsaci 이동성에 대한 명백한 용량 의존적 효과를 유도하였다. 옥사밀은 120-마이크로몰 농도까지 이동성에 유의한 영향을 미치지 않았다. 옥사밀은 120-마이크로몰의 농도까지 이동성에 유의한 영향을 미치지 않았다.수산화나트륨의 첨가는 움직이지 않는 벌레를 검출하는데 있어서 분석 민감도를 향상시켰다. 40 밀리몰의 수산화나트륨은 유능한 개체에서 움직임을 자극하기 위해 분석 종점으로 사용되었고, 따라서 휴식 웜과 병든 웜을 구별합니다. 이 프로토콜은 D.dipsaci 및 다른 종에 대한 새로운 작용 메커니즘을 가진 화합물의 식별을 가능하게했습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

루트 매듭 nematodes있는 화면 식물 별개의 두 가지 방법이 설명되어 있습니다. 설명한 방법은 번식 프로그램에서 이러한 식물의 이용을 촉진 비파괴 방식으로 nematodes과 높은 처리량 화면을 포함합니다.

루트 - 매듭 Nematodes과 높고 낮은 처리량 화면 Meloidogyne SPP.</em

형광 현미경을 사용하여 Nematodes에 박테리아를 머릿속으로

이 비디오에서는 선충에 대한 저분자 선충제의 효능을 확인하기 위한 스크리닝 분석을 시연합니다. 선충제는 노출 후 샘플에서 이동성 선충의 수를 감소시키는 경우 효과적인 것으로 간주됩니다.

Small Molecule Nematicides 스크리닝 분석: Ditylenchus dipsaci 에 대한 잠재적 선충제를 스크리닝하는 중간 처리량 방법

곤충 병원성 선충은 곤충의 다양한 기생 토양에 서식하는 회충 있습니다. 각각의 토양 샘플 및 감염된 곤충 사체에서 선충의 복구를 위해 곤충 유혹하고 수정 된 화이트 트랩, 우리는 두 가지 기술을 사용하여 토양 선충의 분리에 사용되는 샘플링 방법을 보여줍니다.

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재배<em&gt; Heligmosomoides Polygyrus :</em&gt; 면역 선충 기생충과 은닉하는 제품

소나무 선충인 Bursaphelenchus xylophilus의 짝짓기 행동을 조사하기 위한 프로토콜이 제시됩니다. B. xylophilus의 행동 특징은 짝짓기 과정에 설명되어 있습니다.

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르니포름 선충 저항을 위한 면 유전자형 검열

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Entomopathogenic 선충류는 박테리아와 공생하며 함께 선천적 인 면역 체계를 손상시켜 곤충을 성공적으로 감염시킵니다. 선충류 감염의 유전 적 기초에 대한 연구를 촉진하기 위해 엔토모 병원성 선충류를 유지하고 유 전적으로 조작하는 방법이 설명됩니다.

Entomopathogenic Nematodes 배양 및 유전자 조작

이 프로토콜은 생체 내 온실 조건에서 Solanum tuberosum 뿌리를 식물 기생 선충과 감염시키고 광학 현미경을 통한 뿌리 구조의 조직화학적 분석을 위해 감자 체외 형질전환 뿌리를 감염시키는 것을 설명합니다.

유도된 구조적 변화의 평가를 위한 식물 기생 선충을 사용한 감자 뿌리의 생체 내 및 체외 감염

우리는 농부들이 생물 살충제로서 곤충병원성 선충을 대량 번식하는 두 가지 방법을 제시합니다. 첫 번째 방법은 선충 배양 기질로 폴리아크릴아마이드 젤을 사용하고, 두 번째 방법은 폴리머 코팅된 면모를 배양 기질로 사용합니다. 두 방법 모두 곤충 시체 내에서 선충을 생 체 내에서 전파하는 데 의존합니다.

곤충병원성 선충의 재배자 기반 생체 내 전파

배우세요 Ditylenchus dipsaci 배양 및 중간 처리량 화학 스크리닝 기술을 통해 신규 살선충제를 발굴하는 방법을. 이 기술은 농작물 해충 방제와 식량 안보에 기여합니다.

식물 기생 선충류 Ditylenchus dipsaci 배양 및 스크리닝

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