Name: 蓝藻细胞外囊泡的分离和表征 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: 学习蓝藻细胞外囊泡的分离与表征技术，掌握超滤、密度梯度超速离心及透射电镜等方法。该方案适用于Synechocystis sp. PCC6803培养物及环境样品，为研究蓝藻生物学中囊泡功能提供关键技术支撑。

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作者感谢i3S科研平台“&#34;生物界面与纳米技术&#34;”和“&#34;组织学与电子显微镜&#34;”提供的支持，后者为葡萄牙生物成像国家平台（PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122）的成员。我们还感谢西班牙科尔多瓦大学J. A. Gonzalez-Reyes教授在优化透射电子显微镜超薄切片染色方案方面提供的帮助，以及葡萄牙波尔图大学Cecília Durães博士和Ana Rita Pinto博士在纳米颗粒追踪分析方面的支持。
本工作由美国国家科学基金会（NSF，项目编号 OCE-2049004，授予 SJB）、欧洲区域发展基金（FEDER）通过葡萄牙 2020 年竞争力与国际化运营计划（COMPETE 2020 POCI）以及葡萄牙科学技术基金会/科学、技术和高等教育部通过项目 POCI-01-0145-FEDER-029540（PTDC/BIA-OUT/29540/2017，授予 PO）共同资助。同时，衷心感谢葡萄牙科学技术基金会为 SL 提供的博士奖学金 SFRH/BD/130478/2017 以及为 PO 提供的 FCT 研究员资助 IF/00256/2015。M.C.M.-M. 获得了“地平线 2020”框架计划（Horizon 2020）中的玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里个人奖学金（Marie Skłodowska-Curie Individual Fellowship，重整合议组）的支持（项目编号 H2020-MSCA-IF-2018-RI-844891）。

作者声明无利益冲突。

一般注意事项 
本实验方案（图1）以一系列可选步骤的形式呈现，旨在强调在蓝细菌胞外囊泡研究中并不存在一种适用于所有情况的通用方法。研究人员可根据自身特定的模式生物、实验问题/目标以及设备条件，选择本方案中适用且合适的部分加以使用。所有囊泡分离方法均涉及权衡取舍，并不可避免地引入一定程度的偏差。尽管应尽可能减少此类偏差，但最关键的是必须按照适当的MISEV（胞外囊泡研究最低信息标准）指南36详细报告所采用的方法学。
培养物生长 
蓝细菌培养物可从全球众多培养保藏中心之一轻松获得。一些例子包括法国罗斯科夫生物研究所的罗斯科夫培养保藏中心（Roscoff Culture Collection）、法国巴黎巴斯德研究所的巴斯德培养保藏中心（Pasteur Culture Collection），以及美国缅因州的普罗瓦索利-吉拉尔海洋藻类与微生物国家中心（Provasoli-Guillard National Center for Marine Algae and Microbiota, NCMA）。所选蓝细菌菌株必须在适当的培养基和环境条件下进行培养，不同菌株之间的培养条件差异显著。常用的蓝细菌培养基列表可在各培养保藏中心网站或其他出版物中找到37,38,39。
与许多典型的实验室异养模式生物所采用的方法相比，蓝细菌胞外囊泡的研究面临一些独特的挑战。Escherichia coli等其他微生物的囊泡浓度通常比蓝细菌高出数个数量级14,16,40。这种差异可能源于较低的细胞密度和/或囊泡生成速率，因此可能需要相对较大的培养体积（约1–20 L或更多），才能获得足量材料用于大规模分析。因此，建议研究人员先通过小规模培养测试囊泡产量，以确定实现其研究目标所需的材料量。此外，在开展任何实验之前，必须强调验证实验所用培养基是否存在可检测的颗粒背景的重要性，因为这些背景物质可能干扰囊泡群体的定量，降低囊泡浓度/尺寸测量的灵敏度，或污染最终的囊泡制备样品。
该领域的另一个挑战在于，并非所有蓝细菌都能在纯培养条件下良好生长，甚至有些根本无法生长。在未获得无菌培养物之前，对物理囊泡特征、产生速率或内容物的解释未必能得出关于群落中某一菌株所产囊泡的明确结论。研究人员还应考虑，在使用特定纳米颗粒分析工具时，可能存在其他类型的颗粒并被误认为是囊泡，因为这些工具未必能够区分不同类型的颗粒。例如，验证所用菌株是否缺乏前噬菌体可能是至关重要的 通过 基因组测序、诱导实验或其他方法，或不释放其他类型的颗粒物质。根据我们的经验，大多数蓝细菌囊泡均为 &#60;直径为0.2 µm，但在研究新菌株或不同生长条件时，应确认使用0.45 µm孔径滤膜是否会影响纯化后颗粒的尺寸分布。
培养条件的许多方面都可能影响囊泡的产生及其内容物41,42。因此，必须尽可能记录并控制培养过程中的物理和化学条件（包括光照强度、温度和培养基成分），以确保实验结果的可重复性。对囊泡内容物进行任何化学分析时，都必须考虑背景成分，尤其是在进行高通量的“组学”分析时。当使用成分未明确定义的培养基时（例如以天然海水为基础或添加酵母提取物或胰蛋白胨的培养基），这一点尤为关键。根据实验目的，使用成分明确的培养基可能是更优选择。
研究人员需要定期仔细监测培养物的生长动态，以确保了解特定批次培养物所处的生长阶段，而不仅仅是在任意时间点后收集样品。囊泡的组成在不同生长阶段可能有所不同，尤其是在指数生长期和稳定期之间41,42。例如，在稳定期采集的囊泡中至少有一部分可能来源于不同的细胞机制，如细胞裂解，而这种机制在指数生长期不会发生。尽管这仍可能具有重要的生物学意义，但明确样品来源至关重要。如果蓝细菌培养物达到目标生长阶段时无法立即进行样品浓缩，则建议立即通过离心和/或直接0.2 µm过滤，将细胞与&#60;0.2 µm组分分离，并将无细胞滤液在4 °C下保存。以此方式保存数天，对囊泡的浓度或粒径分布几乎不会产生明显影响。
囊泡纯化 
在蓝细菌囊泡分离流程中，经常需要从大量培养物中分离囊泡，这是至关重要的步骤。当处理较大体积的样品时，在进行后续分离步骤之前，需要先对囊泡进行浓缩。通常建议使用标称截留分子量为 100 kDa 的浓缩装置（如切向流过滤膜或离心柱），因为这类装置可在保留合理浓缩时间的同时，有效分离低分子量的可溶性物质；但 30 kDa 的滤膜也常被成功应用。尽管目前在细胞外囊泡研究领域，已有多种不依赖超速离心的囊泡纯化方法逐渐流行（例如尺寸排阻色谱法、基于微流控的系统、亲和捕获技术以及基于沉淀的方法），但根据我们的经验，这些方法往往会导致得率降低，且通常难以适用于所需的培养体积。
研究人员在进行囊泡纯化时，需考虑碘克沙醇背景液以及洗涤/重悬缓冲液的组成，以确保其与后续应用的兼容性。在许多情况下，最终的囊泡样品可重悬于培养基或成分与培养基相似的特定缓冲液中（例如天然海水与人工海水）。然而，对于海洋蓝细菌来源的囊泡而言，这可能不可行，因为其分析通常需要进一步的实验处理，而接近海水浓度的高盐环境会抑制多种酶促反应。在此类情况下，标准实验室缓冲液（如经0.2 µm滤膜过滤的1x PBS）通常能够有效维持海洋蓝细菌囊泡的稳定性，并更适用于后续实验操作。
密度梯度纯化是否必要取决于实验目标和培养物组成，但为了获得更严格纯净且可重复的样品，强烈建议进行该步骤。细胞外囊泡（EV）群体具有异质性，其浮力密度范围较广，并且会因菌株、生长条件及其他因素而进一步变化4,5,6。上述列出的密度代表了在碘克沙醇中蓝细菌培养物和野外样品囊泡通常所见的密度范围，但在其他菌株中的结果可能有所不同。其他密度梯度介质（如蔗糖和CsCl）也可用于囊泡分离，但在这些介质中囊泡将迁移至不同的浮力密度。不同的梯度介质可能对脂质包裹病毒的回收产生偏差43&#160;，并可能影响来自不同菌株囊泡的回收效率。
在囊泡分离及本方案所述的梯度纯化过程中，囊泡可能在多个步骤中发生损失，从而降低得率，并增加为获得特定终末囊泡产量所需起始材料的用量，以满足后续应用的需求。在超速离心后处理囊泡沉淀时需格外小心。尽管某些蓝细菌囊泡可能含有类胡萝卜素或其他化合物，使囊泡样品呈现一定程度的颜色（图2），但根据菌株或材料量的不同，直接观察到囊泡沉淀并非总是可行。应明确所用离心机转子类型下沉淀所在的位置。如条件允许，建议通过电子显微镜检查纯化后的囊泡样品，以确认所获得终产物的组成。
储存条件对囊泡及其内容物的影响仍是一个未解决的问题。尽管研究发现储存对蓝细菌囊泡的大小或浓度没有显著影响14，但分离得到的囊泡制剂的功能可能会随时间发生变化44。尽管应尽可能避免冻融循环，但冷冻样品对囊泡总体数量和大小的影响似乎较小。需要注意的是，冻融循环可能会影响囊泡内容物的组成，例如与囊泡相关的核酸长度或蛋白质的稳定性。
来自野外样品的囊泡 
从自然水生环境中分离细胞外囊泡的现有方法在概念和操作上与本文所述的大体积培养物处理方法相似。然而，前者可能需要更大的样品体积。此类野外样品通常需要收集、过滤并浓缩数百至数千升的水样，才能获得足够用于分析的材料。根据所用样品的浊度，可能需要在使用0.2 µm滤膜之前增加一个或多个预过滤步骤。所选用的切向流过滤（TFF）装置应能够合理地在较短时间内（理想情况下为数小时内）处理如此大量的样品，同时避免对样品施加过高的压力。在实际操作中，这通常需要比基于培养样品所用装置更大的总过滤膜表面积，以及更大直径的管路以实现更高的流速。虽然增加的过滤膜表面积可能导致与较小规模TFF系统相比颗粒损失略有增加，并产生更大的终末浓缩体积，但这些因素必须与整体处理时间的考量相权衡。对于某些情况，例如长时间的海洋学考察，样品在采集后需多日才能返回实验室，我们建议在野外现场完成初始的0.2 µm过滤和TFF步骤。由此获得的较小体积浓缩物可在船上于4 °C或-80 °C保存（根据设备可用性及后续分析需求而定），直至运回实验室进行最终处理。
从其他有机和无机的小颗粒中分离和纯化细胞外囊泡具有挑战性，目前尚无完美的方法来分离不同类型的颗粒。例如，碘克沙醇密度梯度可能无法有效分离样品中存在的所有类型的囊泡和病毒。由于不同采样位点中干扰颗粒的种类及其物理特性各不相同，目前尚无法提供一种能够可靠分离所有类型水生小颗粒的通用方案。必须通过反复试验，优化梯度中使用的碘克沙醇浓度范围以及超速离心条件，以实现最佳分离效果；同时可能需要收集体积更小、分辨率更高的密度组分。根据具体实验情况，使用氯化铯（CsCl）梯度替代碘克沙醇可能有助于分离环境中的颗粒45。然而，如上所述，渗透压条件的改变可能导致最终回收产物出现偏差。
囊泡表征 
纳米颗粒分析仪器目前尚未在微生物学实验室中常规配备，但正变得越来越普及。所有方法均有其优缺点，我们并不特别推荐某一种平台在蓝细菌囊泡研究中优于其他所有平台；事实上，各种方法在成本、分辨率、操作便捷性、检测限、与不同培养基/缓冲液背景的兼容性以及数据可重复性方面均存在特定的权衡。除了上述基于纳米颗粒跟踪分析的仪器外，其他方法如纳米流式细胞术、微流控电阻脉冲传感以及可调电阻脉冲传感,也可被应用46,47。使用者应仔细了解所用仪器的具体细节，并验证其在自身实验系统中的适用性，因为我们在使用某些平台与海水培养基时已遇到困难。我们鼓励该领域朝着对囊泡尺寸、浓度和产生速率进行定量表征的方向发展。以每毫升颗粒数为基础测量囊泡浓度，而非基于蛋白质含量或其他指标，将有助于将囊泡纳入更定量的研究框架，并实现不同菌株和条件之间的比较。目前仍需进一步努力，提升对&#60;100 nm颗粒浓度测量的校准能力。
直接从0.2 µm滤过的培养上清液中测量囊泡产生率，以尽量减少颗粒损失，该方法可与其他上述纯化步骤相关联。然而，这也意味着该方法不一定能区分真正的细胞外囊泡与培养物中存在的其他小颗粒。仅计数特定大小范围内的颗粒（例如直径50–250 nm）可能有助于排除部分异常值，但需通过形态学观察确认所沉淀的颗粒 &#60;0.2 µm培养物中的内容物需通过透射电镜（TEM）或其他方法证实为膜结合囊泡，才能明确声称所测量的是囊泡的产生，而非类囊泡颗粒的产生。
囊泡表征的一个关键因素是确保囊泡样品在纳米颗粒分析仪器的适当线性灵敏度范围内进行检测。当样品浓度过高时，&#160;用干净的缓冲液稀释该样品并重新分析是十分简便的。另一方面，&#160;某些蓝细菌培养物的细胞和/或囊泡密度相对较低，有时会导致囊泡制备物低于某些仪器的检测限。在进行大量囊泡纯化时若出现此情况，可考虑培养更大体积的培养物，将最终产物重新离心并重悬于较小体积中，或评估分离过程中是否存在造成过度损失的步骤，并设法减少损失。在测定囊泡产生速率时，解决方案不一定如此直接。如有必要，样品可进行浓缩，但首先应考察培养基的调整是否可能提高细胞密度，或是否可在指数生长期较晚时间点获取浓度足够高的样品。
局限性 
与任何实验方案一样，采用这些方法进行囊泡分离存在明确的局限性。这些方法并不能保证分离出完全纯净的囊泡样品。无论是培养物还是野外样品，都可能含有其他在密度梯度中迁移行为与囊泡相似的物质。尽管如此，至少在最低要求上，这类附加的纯化方法对于确保囊泡分析的严谨性和可重复性至关重要。虽然本文是在蓝细菌的背景下描述囊泡分离方法，但许多其他微生物的培养物中也含有浓度相对较低的囊泡，因此文中所述步骤应具有普遍适用性。预计这些方法不会成为一成不变的固定方案，而应作为推动未来在多种微生物来源的胞外囊泡研究中取得进一步进展的起点。未来需要将这些方法与其他技术相结合，例如尺寸排阻色谱柱或不对称场流分离技术，以提高从培养物和环境样品中区分和分离不同类别的纳米颗粒的能力。我们还希望，随着纳米颗粒表征技术的不断进步，这些技术能够持续发展，从而提升我们分析囊泡群体内部异质性、其内容物以及它们在环境中确切功能作用的能力。

细胞外囊泡（EVs）是一类球形结构，直径约为20-400 nm，几乎所有生物体均可向其周围环境释放此类结构1,2,3。囊泡由脂质双分子层包被，自身无法复制。在革兰氏阴性细菌中，这些结构主要通过外膜局部“出芽”形成，但其他过程如鞭毛运动、细胞裂解以及内外膜物质的分泌也可能产生囊泡4,5。EVs 可携带多种生物分子，包括脂质、可溶性蛋白和膜蛋白、核酸以及代谢物，并可在细胞间转运这些物质4,5,6。鉴于这些特性，目前正通过研究 EVs 探索其在多种生物学过程中的潜在作用，包括细胞间通讯、生物膜形成、水平基因转移、宿主-噬菌体相互作用以及营养物质交换等4,6。
蓝细菌是一类庞大且多样化的革兰氏阴性菌，包括单细胞和丝状生物。从多个角度来看，它们都具有研究价值，例如了解其生理特性与多样性7,8、它们在生态系统中所发挥的关键功能9,10，以及其在生物技术中的应用潜力11,12。蓝细菌存在于多种生境中，既可以是海洋、淡水和陆地环境中的自由生活生物，也可以与苔藓、蕨类、植物形成共生关系，或存在于地衣和海绵中13。它们在水生生态系统中作为重要的初级生产者，通过产氧光合作用生成氧气和有机碳9,10，其中一些种类还具有固定大气氮的能力7。海洋和淡水蓝细菌，包括 Prochlorococcus、Synechococcus 和 Synechocystis，在实验室条件下能够产生细胞外囊泡（EVs）14,15,16，且在自然环境中也能检测到蓝细菌来源的囊泡14,17。目前尚不清楚蓝细菌囊泡的生物学和生态学功能，但该领域的进一步研究有望为蓝细菌的生理学、分化机制、通讯策略、进化过程及营养相互作用等问题提供新的见解。此外，蓝细菌EVs能够携带多种类生物分子，这一特性可能具有商业应用前景18,19。
本实验方案描述了从蓝细菌培养物和野外样品中分离和表征囊泡的方法，旨在推动并促进对蓝细菌胞外囊泡生物学的更广泛研究。尽管此处描述的工作流程类似于从其他细菌中分离和表征EV的方法，但蓝细菌培养物和野外样品通常比宿主相关或致病性模式系统中常见的细胞和囊泡浓度更低20,21,22。因此，蓝细菌EV的研究在培养和囊泡分离方面需要特殊的考虑和优化，且不同菌株和培养基背景之间还存在进一步差异。由于单一方案无法在所有菌株、生长条件和下游应用中均表现理想，我们提供了多种可选方案，并讨论了其中的权衡取舍，以便研究人员根据自身的科学问题选择最合适的方法。

<table><tbody><tr><td>1x 磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.4</td><td>自制缓冲液</td><td>---</td><td>可用于囊泡的标准洗涤/储存缓冲液；可在实验室配制或商业购买</td></tr><tr><td>2% 醋酸铀溶液</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>22400-2</td><td>负染色 - 透射电子显微镜（TEM）</td></tr><tr><td>4x Laemmli 样品缓冲液</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0747</td><td>囊泡样品蛋白水解前的变性处理，脂多糖（LPS）染色所必需</td></tr><tr><td>Amicon Ultra 离心过滤器（100 kDa）</td><td>Merck</td><td>UFC9100XX</td><td>离心超滤的替代选项</td></tr><tr><td>BG11 培养基</td><td>自制培养基</td><td>---</td><td>&lt;em&gt;Synechocystis &lt;/em&gt;sp. PCC 6803 的培养培养基</td></tr><tr><td>200 目铜载碳支持膜，CF200-Cu</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71150</td><td>透射电子显微镜（TEM）载网</td></tr><tr><td>easiGlow 辉光放电清洗系统</td><td>Ted Pella</td><td>91000</td><td>商用 TEM 载网辉光放电器</td></tr><tr><td>EMbed 812 环氧树脂</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>14120</td><td>超薄切片 - 透射电子显微镜（TEM）</td></tr><tr><td>真空系统用滤器支架</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>300-4000</td><td>带滤膜支撑板的可重复使用单元</td></tr><tr><td>戊二醛&amp;nbsp; Ⅰ级</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882-10X1ml</td><td>超薄切片 - 透射电子显微镜（TEM）</td></tr><tr><td>HEPES [N-(2-羟乙基)哌嗪-N&amp;prime;-(2-乙磺酸)钠盐]</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7006</td><td>蓝细菌生长培养基的缓冲剂</td></tr><tr><td>柠檬酸铅三水合物</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>17800</td><td>电子显微镜染色剂</td></tr><tr><td>Macrosep Advance 离心装置（Omega 膜，100K）</td><td>Pall</td><td>MAP100C36</td><td>用于小体积样品的离心超滤</td></tr><tr><td>Millipore Pellicon 3 TFF 模块</td><td>EMD Millipore</td><td>XX42P0060 或 XX42P0080</td><td>浓缩大体积样品的替代 TFF 选项</td></tr><tr><td>Milli-Q Reference 水纯化系统</td><td>Merck</td><td>Z00QSV0WW</td><td>用于制备一级超纯水的水纯化系统</td></tr><tr><td>NanoSight</td><td>Malvern Panalytical</td><td>LM14 或 NS300</td><td>纳米颗粒追踪分析</td></tr><tr><td>Optima L80 XP 超速离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td>L80 XP</td><td>超速离心机（或类似型号）</td></tr><tr><td>OptiPrep / 碘克沙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1556</td><td>密度梯度介质</td></tr><tr><td>四氧化锇试剂级</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>201030</td><td>超薄切片 - 透射电子显微镜（TEM）</td></tr><tr><td>Pall Centramate PE TFF 支架</td><td>Pall Corporation</td><td>FS002K10</td><td>适用于浓缩数十至数百升样品的 TFF 模块；需额外配备 30 或 100 kDa 滤膜模块以匹配预估体积</td></tr><tr><td>Masterflex L/S 蠕动泵</td><td>Cole-Parmer</td><td>07559-07</td><td>驱动大规模 TFF 模块的泵</td></tr><tr><td>活塞梯度分馏仪</td><td>Biocomp Instruments</td><td>152-001</td><td>自动化密度梯度分馏</td></tr><tr><td>70 Ti 转子用聚碳酸酯管</td><td>Beckman Coulter</td><td>355618</td><td>带盖组件的可重复使用超速离心聚碳酸酯铝管</td></tr><tr><td>Pro99 培养基</td><td>自制培养基</td><td>---</td><td>&lt;em&gt;Prochlorococcus&lt;/em&gt;的培养培养基</td></tr><tr><td>Pro-Q Emerald LPS 凝胶染色试剂盒</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P20495</td><td>LPS 染色</td></tr><tr><td>SN 培养基</td><td>自制培养基</td><td>---</td><td>用于培养蓝细菌海洋菌株（如 &lt;em&gt;Synechococcus&lt;/em&gt;）的培养基</td></tr><tr><td>三水合二甲胂酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0250-100G</td><td>制备用于透射电子显微镜（TEM）的囊泡样品时的缓冲剂</td></tr><tr><td>SW32Ti 摆动桶转子</td><td>Beckman Coulter</td><td>369650</td><td>超速离心转子，可容纳 6 × ~40 mL 管；适用于大量物质的沉淀</td></tr><tr><td>SW60Ti 摆动桶转子</td><td>Beckman Coulter</td><td>335650</td><td>超速离心转子，可容纳 6 × ~4.5 mL 管；适用于梯度纯化和最终囊泡洗涤</td></tr><tr><td>1 mL 鲁尔注射器</td><td>BD Plastipak</td><td>303172</td><td>用于囊泡分离及将样品装入纳米颗粒追踪分析（NTA）设备</td></tr><tr><td>0.2 &amp;micro;m 注射器滤器</td><td>Pall Corporation</td><td>4602</td><td>用于从培养物中分离囊泡</td></tr><tr><td>TAPS [N-[三(羟甲基)甲基]-3-氨基丙磺酸]</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5130</td><td>蓝细菌生长培养基的缓冲剂</td></tr><tr><td>透射电子显微镜</td><td>JEOL</td><td>JEM-1400</td><td>或类似型号显微镜</td></tr><tr><td>Type 70 Ti 固定角钛转子</td><td>Beckman Coulter</td><td>337922</td><td>超速离心转子，可容纳 8 × ~39 mL 管；适用于大量物质的沉淀</td></tr><tr><td>来自 &lt;em&gt;Streptomyces griseus&lt;/em&gt; 的 XIV 型蛋白酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5147</td><td>用于胞外囊泡（EVs）蛋白的蛋白水解酶，LPS 染色所必需</td></tr><tr><td>SW32Ti 转子用 UltraClear 管</td><td>Beckman Coulter</td><td>344058</td><td>一次性超速离心管</td></tr><tr><td>SW60Ti 转子用 UltraClear 管</td><td>Beckman Coulter</td><td>344062</td><td>一次性超速离心管</td></tr><tr><td>Ultramicrotome PowerTome XL, PT-PC</td><td>RMC Products,&amp;nbsp; Boeckeler Instruments</td><td>75501</td><td>用于超薄切片的切片机 - 透射电子显微镜（TEM）</td></tr><tr><td>Universal 320 R 离心机</td><td>Hettich</td><td>Z654736</td><td>此型号或任何类似的台式/落地式通用离心机均可用于细胞沉淀</td></tr><tr><td>真空装置</td><td>KNF Neuberger</td><td>N026.3 AT.18</td><td>或任何类似的真空泵和捕集装置</td></tr><tr><td>Vivaflow 200 100,000 MWCO PES</td><td>Sartorius</td><td>VF20P4</td><td>TFF 模块，适用于 2–3 L 样品。可连接不同模块以处理更高体积（图 1）。</td></tr><tr><td>Whatman Polycap TC 胶囊滤器（0.2/0.2&amp;micro;m）</td><td>Cytiva</td><td>6717-9502</td><td>用于过滤大体积液体的胶囊滤器</td></tr><tr><td>Zetasizer</td><td>Malvern Panalytical</td><td>Zetasizer Nano ZS</td><td>动态光散射（DLS）仪器</td></tr></tbody></table>

蓝细菌胞外囊泡的分离与表征

Isolation and Characterization of Cyanobacterial Extracellular Vesicles

蓝细菌是一类多样化的光合自养型革兰氏阴性细菌，在全球生态系统中发挥着关键作用，并作为重要的生物技术研究模型。近期研究表明，海洋和淡水蓝细菌均可产生细胞外囊泡——&#160;由微生物外表面释放的小型膜结合结构。尽管囊泡可能参与多种生物学过程，但其在蓝细菌生物学中的具体功能作用仍 largely 未知。为促进并推动该领域的研究，本文提供了一套详细的方案，用于分离、浓缩和纯化蓝细菌胞外囊泡。本研究论述了已成功从大量培养物中分离囊泡的方法学 原绿球藻，集胞藻，以及 集胞藻属介绍了对这些菌株囊泡样品进行定量和表征的方法，同时描述了从水体野外样品中分离囊泡的技术。最后，还讨论了在蓝细菌囊泡纯化过程中常见的典型挑战、针对不同下游应用的方法学考量，以及不同方法之间的权衡取舍。

图1展示了蓝细菌囊泡分离流程的概览，突出了本文所述方案的关键步骤。特别值得注意的是将蓝细菌生物量与小颗粒（囊泡）组分分离、浓缩囊泡样品以及囊泡的分离与纯化步骤（图1，步骤2至4），这些步骤对于获得可重复的囊泡制备物至关重要。图2展示了从蓝细菌Synechocystis sp. PCC 6803中分离和表征胞外囊泡的代表性结果。研究表明，该蓝细菌的外膜含有类胡萝卜素31，因此通过超速离心直接沉淀获得的囊泡样品呈现特征性的橙色（图2A）。将囊泡沉淀重悬后，可通过透射电子显微镜（TEM）观察囊泡，方法包括使用醋酸铀酰对样品进行负染色（图2B）或观察超薄切片（图2C）。可利用动态光散射（DLS）（图2D）和纳米颗粒追踪分析（NTA）（图2E）来评估囊泡的粒径分布和浓度。采用本方案，在OD730为1.0的指数生长期Synechocystis sp. PCC 6803培养物中，通常每毫升可获得约3.5 ± 1.0 × 108个纳米颗粒。可进行生化分析以补充对分离囊泡的物理表征。例如，将纯化的Synechocystis sp. PCC 6803囊泡在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离，并对脂多糖（LPS）进行染色（图2F）。由于LPS特异性存在于外膜32，检测LPS可验证膜结合囊泡的存在，并可作为同一菌株不同制备样品间囊泡相对含量分析的标志物33。比较低分子量与高分子量LPS的相对丰度，可提示不同样品间囊泡组成的差异34,35。
<img alt="蓝细菌培养及囊泡分离流程图；步骤包括离心、过滤，以及通过DLS、TEM和NTA进行表征。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63481/63481fig01v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：蓝细菌胞外囊泡（EV）分离与表征的实验流程。 培养物生长（1）及从培养基中分离蓝细菌生物量（2）的示意图。收集含囊泡的无细胞样品并进行浓缩（3），随后对胞外囊泡（EV）进行分离与纯化（4）。根据具体应用需求，可采用透射电子显微镜（TEM）、纳米颗粒追踪分析（NTA）、动态光散射（DLS）和脂多糖（LPS）谱型分析中的一种或多种组合对囊泡制剂进行表征（5）。RT，室温。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63481/63481fig01largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="EVs 分析：TEM 染色、超薄切片、DLS、NTA 图谱；LPS 凝胶结果、示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63481/63481fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：集胞藻属Synechocystis sp. PCC 6803 胞外囊泡分离与表征的代表性结果。（A）对 600 mL 培养至 OD730 为 1.0–1.5 的 Synechocystis sp. PCC 6803 菌液所获得的无细胞培养上清液进行超速离心后，得到的胞外囊泡沉淀（EVs 沉淀）照片。注意囊泡沉淀典型的橙色，该颜色来源于外膜中的类胡萝卜素。（B,C）Synechocystis sp. PCC 6803 囊泡样品经负染色（B）和超薄切片（C）后的透射电子显微镜（TEM）照片。比例尺分别为 200 nm 和 50 nm。样品在 80 kV 下操作的透射电子显微镜中观察。（D）典型的动态光散射（DLS）图谱，显示囊泡体积分布随囊泡直径（单位：nm）的变化情况。彩色线条表示同一样品三次技术重复的测量数据。（E）Synechocystis 胞外囊泡尺寸分布（单位：nm）的代表性纳米颗粒追踪分析（NTA）数据。黑线表示三次技术重复的平均值，红线表示平均值的标准误差。（F）通过 16%（w/v）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离囊泡样品，并使用商业化的 LPS 染色试剂盒染色后，检测到脂多糖（LPS）谱型。可检测到分别对应于粗糙型和光滑型 LPS 形式的低分子量和高分子量 LPS。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63481/63481fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
补充文件 1：计算 r 的公式。该公式用于确定指数生长期两个时间点之间（通常为时间过程的起始和结束）每个细胞每代产生的囊泡数量。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63481/Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">请点击此处下载该文件</a>。

本方案详细描述了从蓝细菌培养物中分离、浓缩和表征细胞外囊泡的方法。同时讨论了从不同规模培养物中纯化囊泡的技术路径、各方法之间的权衡，以及处理野外样品时的注意事项。

蓝细菌是一类多样化的光合作用革兰氏阴性细菌，在全球生态系统中发挥着关键作用，并作为重要的……

本方案具有重要意义，因为它不仅展示了从不同规模的培养物中纯化囊泡的方法、各种方法之间的权衡与差异，还涉及了野外样品处理时的注意事项。蓝细菌在囊泡取样与分析方面带来了独特的挑战。这些技术已成功地从培养物及环境样品中分离并富集了囊泡。对于体积小于500毫升的样品浓缩，首先使用1类超纯水冲洗15至20毫升的超滤离心浓缩管。将浓缩管放入离心机中，在4°C条件下以4,400 × g离心。弃去滤过液，并至少重复此步骤两次。将上清液样品加入经水冲洗的浓缩管中，在相同条件下离心。重复此步骤，直至样品浓缩至终体积为15至30毫升。若需浓缩超过500毫升的体积，应按照文中所述方法搭建装置，进行切向流过滤。将蠕动泵连接至进样管路，并在回流管路上安装可调节夹具。按照文中的描述对切向流过滤系统进行消毒，然后用一升一级超纯水冲洗装置。向样品储液器中加入孔径小于0.2微米的滤液。缓慢提高截留液管路的泵速和回压水平，以增加滤过液管路的产出量。继续运行切向流过滤，并在物料被移除时，向储液槽中补充培养上清液。当储液槽中的体积达到维持进液管路流动且不引入气泡所需的最小体积时，停止浓缩样品。用夹子关闭流出管路。移除截留液管路上的背压。将浓缩的上清液以每分钟20至40毫升的循环速率通过滤器再循环10分钟，以最大化回收率。将截留液转移至一个洁净的容器中，将进样管从样品中取出，并收集浓缩后的物质。使用移液器回收样品储液器中残留的任何物质。通过0.2微米的一次性注射器滤器过滤浓缩后的上清液。如有需要，可将最终浓缩物在4°C下保存约三周，然后再进行囊泡纯化。为沉淀浓缩的培养样品，将其放入洁净的超速离心管中，并加入洁净的培养基或缓冲液，确保管子充满。离心后，用移液器吸除上清液。用新鲜的培养基或洗涤缓冲液（如1×磷酸盐缓冲液）重新洗涤沉淀物，并重复离心步骤。使用1毫升移液器轻轻吹打，将最终沉淀物重悬于新鲜培养基中，然后转移至洁净容器。如需进行密度梯度超速离心，按文中所述方法配制碘克沙醇储备液。将1份4X缓冲液与3份60%碘克沙醇储备液混合，配制成45%碘克沙醇溶液。用1X缓冲液将45%碘克沙醇稀释，制备出终浓度分别为40%、35%、30%、25%、20%、15%和10%的梯度介质储备液。然后，小心地将等量的上述各浓度碘克沙醇梯度储备液依次叠加至超速离心管中，充分利用整个离心管的容积。离心后，使用移液器小心吸取或使用组分收集器，将约4.5毫升的梯度液分成每份0.5毫升的组分。使用分析天平和校准过的移液器测定每份组分的密度，单位为克/毫升。将样品从离心管中取出，称量其质量，然后将样品重新放回离心管中。将各个组分用新离心管中的洁净缓冲液稀释，随后进行洁净培养基或缓冲液洗涤。小心加入五微升囊泡，静置五分钟。通过将网格边缘接触一张洁净滤纸来移除样品。用移液器吸取 20 至 50 微升 2% 醋酸铀酰溶液，滴加到覆盖有塑料膜的平坦表面上。然后将载网漂浮于液滴表面染色 2 分钟。用滤纸吸去醋酸铀酰溶液，再将载网在超纯水滴上短暂漂浮以洗涤。使用洁净的注射器将超纯水注入腔室，并确保无气泡产生。点击“start camera”以查看腔室中拇指印周围的最佳区域。将“screen gain”和“camera level”滑块调至最大，然后逐渐降低至最低水平，以观察最微弱的颗粒。根据需要调整焦距，确保视野中颗粒大致均匀可见，并继续用超纯水冲洗，直至腔室清洁。使用1毫升注射器将囊泡样品加入腔室，并确认采集参数。在SOP下拉菜单中选择“标准测量”，并调整设置，以采集至少三次技术重复，每次录制60秒视频。按下“create and run script”，按照提示操作，并在各重复样本之间向腔室推入约100微升样品。通过点击“analysis”和“open experiment”来确定颗粒参数，并加载样品文件。选择“process selected files”，等待分析完成。从集胞藻（Synechocystis sp. PCC6803）中分离和表征细胞外囊泡的结果显示，其外膜含有类胡萝卜素，使得通过超速离心直接沉淀收集的囊泡样品呈现特征性的橙色。将重悬的囊泡沉淀通过透射电子显微镜进行检测，可采用醋酸铀酰对样品进行负染色，或观察超薄切片。使用动态光散射和纳米颗粒追踪分析评估囊泡的大小分布和浓度。将纯化的集胞藻属 sp. PCC6803 囊泡在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上分离，并对脂多糖进行染色。应在浓缩囊泡样品前后分别取样，以确保切向流过滤系统正常工作，并确认囊泡正在被浓缩。随后需使用纳米颗粒跟踪分析技术对两个样品进行测量。未来还需将此方法与其他技术（如尺寸排阻色谱法或不对称场流分离法）相结合，以提高从培养物和环境样品中区分和分离小颗粒的能力。该技术有助于研究蓝细菌囊泡及其在蓝细菌生物学中的特定功能作用。

isolation-characterization-cyanobacterial-extracellular

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

蓝藻细胞外囊泡的分离和表征

来源：Biller, S. J., et al．蓝细菌胞外囊泡的分离与表征．J. Vis. Exp.

利用透射电子显微镜观察蓝细菌胞外囊泡

来源：Watson, D. C., et.al. 大肠杆菌及其他细菌来源细胞外囊泡的可扩展分离与纯化. J. Vis. Exp.

细菌外膜来源的胞外囊泡的分离与富集

来源：Watson, D. C., 等. 从大肠杆菌及其他细菌中可扩展地分离与纯化细胞外囊泡. J. Vis. Exp.

使用尺寸排阻色谱法分离细菌胞外囊泡

本视频演示了利用尺寸排阻色谱法（SEC）从结核分枝杆菌（Mycobacterium...

一种用于纯化分枝杆菌胞外囊泡的尺寸排阻色谱技术

本文描述了分离蓝细菌释放的碳水化合物聚合物及其胞外蛋白质组的实验方案。这两种方法均包含获得高纯度聚合物或蛋白质的关键步骤，所得产物可用于进一步分析或应用。此外，这些方案也可根据用户的特定需求轻松进行调整。...

向外探索：蓝细菌释放的碳水化合物聚合物与蛋白质的分离

本报告重点阐述了从小胶质细胞或血液单核细胞中分离细胞外囊泡（EV）的时间顺序要求。在体外实验中，评估了小胶质细胞来源的EV对神经突起生长的调控作用，同时研究了血液单核细胞来源的EV对C6胶质瘤细胞侵袭的调控功能。研究目标是更深入地理解这些EV作为免疫介质在特定微环境中的生物学功能。...

免疫细胞来源的细胞外囊泡的表征及其对细胞微环境功能影响的研究

细菌囊泡在致病过程中发挥重要作用，并具有广阔前景的生物技术应用价值。由于囊泡具有异质性，其分析和应用受到限制；因此，亟需一种简单且可重复的方法来分离不同大小的囊泡。本文中，我们展示了利用尺寸排阻色谱法分离由Aggregatibacter...

利用尺寸排阻色谱分析细菌外膜囊泡的异质性

细菌会分泌携带生物活性分子的纳米级细胞外囊泡（EVs）。EV研究主要关注其生物发生机制、在微生物间及宿主-微生物相互作用和疾病中的作用，以及潜在的治疗应用。本文介绍了一种可放大的从多种细菌中分离EV的方法流程，以促进EV研究的标准化。...

可扩展的细胞外囊泡分离与纯化方法 大肠杆菌 及其他细菌

本方案详细描述了通过不连续蔗糖密度梯度离心法从蓝细菌中分离藻胆体的方法。通过77K荧光发射光谱和SDS-PAGE分析确认完整藻胆体的组分。所得藻胆体组分适用于透射电子显微镜负染和质谱分析。...

蓝细菌中完整藻胆体的分离与表征

最新一代的细胞外囊泡（EV）表征工具能够同时对单个EV的多个参数进行分析。纳米流式细胞术可对大于45...

单个细胞外囊泡跨膜蛋白的纳米流式检测表征

本文展示了从人体受试者的生物液体（如泪液和唾液）中收集的细胞外囊泡（EVs）的表征方法。该方法所使用的扫描仪能够检测仅1...

表征生物体液中的细胞外囊泡

学习蓝藻细胞外囊泡的分离与表征技术，掌握超滤、密度梯度超速离心及透射电镜等方法。该方案适用于Synechocystis sp. PCC6803培养物及环境样品，为研究蓝藻生物学中囊泡功能提供关键技术支撑。

蓝细菌胞外囊泡的分离与表征

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