Name: Selfing caenorhabditis 선충류의 생태 조사를 수행하기위한 고도로 확장 가능한 접근법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-01T14:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: 배우세요 Caenorhabditis 선충류의 대규모 생태 조사 방법을. 모바일 데이터 수집 플랫폼과 클라우드 데이터베이스를 활용하여 현장에서 정확한 분리 및 동정이 가능합니다. 이 기술은 생태학 및 분자생물학 연구에 필수적인 데이터 관리 효율성을 크게 향상시킵니다.

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이 연구는 노스웨스턴 대학교의 창업 기금과 국립 과학 재단 경력 상 (IOS-1751035)에 의해 지원되었으며, 둘 다 E.C.A.에 수여되었습니다.

<ol><li>Frézal, L., Félix, M. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+outside+the+Petri+dish%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">C. elegans outside the Petri dish.</a> eLife. 4, 05849(2015).</li>
<li>Sivasundar, A., Hey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sampling+from+natural+populations+with+RNAI+reveals+high+outcrossing+and+population+structure+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Sampling from natural populations with RNAI reveals high outcrossing and population structure in Caenorhabditis elegans.</a> Current Biology: CB. 15 (17), 1598-1602 (2005).</li>
<li>Kiontke, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phylogeny+and+molecular+barcodes+for+Caenorhabditis%2C+with+numerous+new+species+from+rotting+fruits%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Evolutionary+Biology%22%5BJournal%5D)">A phylogeny and molecular barcodes for Caenorhabditis, with numerous new species from rotting fruits.</a> BMC Evolutionary Biology. 11, 339(2011).</li>
<li>Petersen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ten+years+of+life+in+compost%3A+temporal+and+spatial+variation+of+North+German+Caenorhabditis+elegans+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Ecology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Ten years of life in compost: temporal and spatial variation of North German Caenorhabditis elegans populations.</a> Ecology and Evolution. 5 (16), 3250-3263 (2015).</li>
<li>Richaud, A., Zhang, G., Lee, D., Lee, J., Félix, M. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+local+coexistence+pattern+of+selfing+genotypes+in+Caenorhabditis+elegans+natural+metapopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The local coexistence pattern of selfing genotypes in Caenorhabditis elegans natural metapopulations.</a> Genetics. 208 (2), 807-821 (2018).</li>
<li>Ferrari, C., Salle, R., Callemeyn-Torre, N., Jovelin, R., Cutter, A. D., Braendle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ephemeral-habitat+colonization+and+neotropical+species+richness+of+Caenorhabditis+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Ecology%22%5BJournal%5D)">Ephemeral-habitat colonization and neotropical species richness of Caenorhabditis nematodes.</a> BMC Ecology. 17 (1), 43(2017).</li>
<li>Crombie, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+sampling+of+Hawaiian+Caenorhabditis+elegans+reveals+high+genetic+diversity+and+admixture+with+global+populations%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Deep sampling of Hawaiian Caenorhabditis elegans reveals high genetic diversity and admixture with global populations.</a> eLife. 8, 50465(2019).</li>
<li>Crombie, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+adaptation+and+spatiotemporal+patterns+of+genetic+diversity+revealed+by+repeated+sampling+of+Caenorhabditis+elegans+across+the+Hawaiian+Islands%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Local adaptation and spatiotemporal patterns of genetic diversity revealed by repeated sampling of Caenorhabditis elegans across the Hawaiian Islands.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Noble, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selfing+is+the+safest+sex+for+Caenorhabditis+tropicalis%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Selfing is the safest sex for Caenorhabditis tropicalis.</a> eLife. 10, 62587(2021).</li>
<li>Cutter, A. D., Morran, L. T., Phillips, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Males%2C+Outcrossing%2C+and+Sexual+Selection+in+Caenorhabditis+Nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Males, Outcrossing, and Sexual Selection in Caenorhabditis Nematodes.</a> Genetics. 213 (1), 27-57 (2019).</li>
<li>Petersen, C., Dirksen, P., Schulenburg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+we+need+more+ecology+for+genetic+models+such+as+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%3A+TIG%22%5BJournal%5D)">Why we need more ecology for genetic models such as C. elegans.</a> Trends in Genetics: TIG. 31 (3), 120-127 (2015).</li>
<li>Haber, M., Schüngel, M., Putz, A., Müller, S., Hasert, B., Schulenburg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+history+of+Caenorhabditis+elegans+inferred+from+microsatellites%3A+evidence+for+spatial+and+temporal+genetic+differentiation+and+the+occurrence+of+outbreeding%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Evolutionary history of Caenorhabditis elegans inferred from microsatellites: evidence for spatial and temporal genetic differentiation and the occurrence of outbreeding.</a> Molecular Biology and Evolution. 22 (1), 160-173 (2005).</li>
<li>Barrière, A., Félix, M. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+C.+elegans+and+Related+Nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Isolation of C. elegans and Related Nematodes.</a> WormBook. , https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK19764/ (2018).</li>
<li>Poullet, N., Braendle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sampling+and+isolation+of+C.+elegans+from+the+natural+habitat%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Sampling and isolation of C. elegans from the natural habitat.</a> Methods in Molecular Biology. 1327, 221-229 (2015).</li>
<li>Di Bernardo, M., Crombie, T. A., Cook, D. E., Andersen, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((easyFulcrum%3A+An+R+package+to+process+and+analyze+ecological+sampling+data+generated+using+the+Fulcrum+mobile+application%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">easyFulcrum: An R package to process and analyze ecological sampling data generated using the Fulcrum mobile application.</a> PloS one. 16 (10), 0254293(2021).</li>
<li>Mobile data collection & workflow automation in NCAP. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.fulcrumapp.com/">https://www.fulcrumapp.com/</a> (2021).</li>
<li>Nematode Isolation Application. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.fulcrumapp.com/apps/nematode-isolation">https://www.fulcrumapp.com/apps/nematode-isolation</a> (2021).</li>
<li>Nematode Field Sampling Application. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.fulcrumapp.com/apps/nematode-field-sampling">https://www.fulcrumapp.com/apps/nematode-field-sampling</a> (2021).</li>
<li>JOVE wild_isolate-genotyping-template. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://docs.google.com/spreadsheets/d/1oEP40jy6_K6Wkwn7Qm4iF58rTUe4JWk2zhJ20-keoOk/edit">https://docs.google.com/spreadsheets/d/1oEP40jy6_K6Wkwn7Qm4iF58rTUe4JWk2zhJ20-keoOk/edit</a> (2021).</li>
<li>Nucleotide BLAST: Search nucleotide databases using a nucleotide query. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://blast.ncbi.nim.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastSearch">https://blast.ncbi.nim.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastSearch</a> (2021).</li>
<li>easyFulcrum. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://andersenlab.org/easyfulcrum/articles/easyFulcrum.html">http://andersenlab.org/easyfulcrum/articles/easyFulcrum.html</a> (2021).</li>
<li>Andersen, E. C., Bloom, J. S., Gerke, J. P., Kruglyak, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+variant+in+the+neuropeptide+receptor+npr-1+is+a+major+determinant+of+Caenorhabditis+elegans+growth+and+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A variant in the neuropeptide receptor npr-1 is a major determinant of Caenorhabditis elegans growth and physiology.</a> PLoS Genetics. 10 (2), 1004156(2014).</li>
<li>Tuli, M. A., Daul, A., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WormBook%3A+Caenorhabditis+Nomenclature%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">WormBook: Caenorhabditis Nomenclature.</a> WormBook. , (2018).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WormBook%3A+Maintenance+of+C.+Elegant%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">WormBook: Maintenance of C. Elegant.</a> WormBook. , (2006).</li>
</ol>

저자는 이해 상충을보고하지 않습니다.

이 프로토콜에는 주의해서 실행해야 하는 중요한 단계가 포함되어 있습니다. 예를 들어, 현장 및 격리 팀은 현장에서 샘플을 수집하거나 실험실의 샘플에서 선충류를 분리하기 전에 응용 프로그램에서 올바른 수집 프로젝트를 신중하게 선택하는 것이 중요합니다. 잘못된 컬렉션 프로젝트를 선택한 경우 잘못된 데이터 레코드는 온라인 레코드 편집 도구를 사용하여 Fulcrum 데이터베이스에서 가장 잘 수정됩니다. 이 프로세스는 잘못 배치 된 많은 레코드에 지루할 수 있습니다. 그러나 데이터베이스는 레코드에 대한 변경 사항을 유지하므로 수집 및 격리 레코드에 대한 완전한 감사가 가능합니다. 이 프로토콜의 다른 중요한 단계는 현장에서 샘플을 처리하고 해당 샘플에서 분리 된 선충류를 처리하는 것입니다. Caenorhabditis 선충류가 샘플링 및 선적 단계에서 생존하도록하려면 샘플의 온도를 4 °C와 25 ° C 사이에서 유지해야합니다. 25 °C 이상의 온도는 C. elegans14에서 불임을 일으킬 수 있습니다. 선충류에 대한 손실을 최소화하기 위해 가능한 한 오일 이내에 샘플을 수집 가방에서 수집 접시로 옮기십시오. 선충류가 격리 된 후에는 멸망하기 전에 유전자형화되고 냉동 보존되는 것이 중요합니다. 곰팡이와 박테리아 오염으로 인해 S-플레이트가 불쾌해질 수 있기 때문에 두 주에서 세 주 이상 된 S 플레이트에서 살아있는 선충류를 찾기가 어렵습니다.
이 프로토콜은 연구자가 현장에서 수집하기를 원할 수있는 다양한 유형의 데이터를 수용하기 위해 쉽게 수정할 수 있습니다. 예를 들어, 응용 프로그램 편집을 위해 Fulcrum의 온라인 GUI를 사용하여 새로운 데이터 입력 필드로 'Nematode 필드 샘플링'응용 프로그램을 쉽게 사용자 정의 할 수 있습니다. 또한, 데이터 분석 패키지인 easyFulcrum은 새로운 데이터를 처리할 때 이러한 편집을 수용할 수 있습니다15. 사용자가 매력적으로 생각할 수 있는 또 다른 수정은 현장에서 다른 샘플링 방법을 사용하는 것이다. 연구자들은 개별 기판을 샘플링하는 대신 여러 기판 유형을 포함하는 더 큰 영역을 샘플링하기를 원할 수 있습니다. 이 더 큰 샘플은 Baermann 깔때기 또는 트레이 추출 방법을 사용하여 실험실에서 가장 잘 처리됩니다13. 중요한 것은 C 레이블 및 S- 레이블의 사용이 여전히 이러한 기술에 적용되므로 모바일 응용 프로그램과 호환된다는 것입니다.
이 프로토콜의 주요 한계는 실험실에서 격리되기 전에 선충류의 처리 시간과 관련이 있습니다. 첫째, 샘플 수집과 선충류 분리 사이의 지연 시간은 수집 시점에 주어진 샘플에 선충류의 발달 단계를 기록하는 것을 불가능하게 만듭니다. 둘째, 남성의 빈도와 자연에서의 교차는 Caenorhabditis 선충류를 자아 짓기위한 주요 진화론 적 질문입니다10. 이 방법은 선충류가 격리되기 전에 여러 세대를 거쳤을 가능성이 높기 때문에 이러한 질문을 해결하는 데 적합하지 않습니다. 지연된 격리는 본질적으로 남성 빈도에 대한 직접적인 증거가 불가능하다는 것을 의미합니다. 더욱이, 유전자형 형성 단계 동안의 다세대 지연은 선충류 균주가 서열화되기 전에 아웃크로스(heterozygosity)의 게놈 증거가 침식될 것임을 의미한다. 자연에서 이형접합체를 확인하기 위해, 자연으로부터 직접 분리된 선충류에 의해 생성된 자손이 시퀀싱2에 사용된다. 이 프로토콜의 또 다른 잠재적 한계는 그것이 자아 Caenorhabditis의 확인에 편향되어 있다는 것입니다. 이것은 자아 종의 고립 된 선충류가 수정 된 여성이 격리 된 경우에만 증식 할 수있는 의무적 인 아웃 크로스 (outcrossers)보다 증식 할 가능성이 더 높기 때문입니다.
이 수집 방법은 기존의 수집 프로토콜13,14를 기반으로 한다. 이 기술의 주요 발전은 대규모 수집 프로젝트와 관련된 방대한 양의 생태 및 분자 데이터를 쉽게 구성 할 수 있도록 모바일 기술 및 맞춤형 소프트웨어를 사용하는 것입니다. 이 수집 프로토콜을 사용하여 생성 된 생태 데이터는 Caenorhabditis 종의 자연 개체군에 대한 뛰어난 질문을 해결하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어,이 방법으로 생성 된 데이터는 하와이 제도 전역의 종에 대한 틈새 선호도를 발견하는 데 사용되었습니다. 또한, 냉동 보존 선충류의 게놈을 시퀀싱함으로써 연구자들은 유전 적 변이의 패턴이 생태 데이터와 어떻게 상호 관련되어 있는지 조사 할 수 있습니다. 이러한 종류의 연구는 Caenorhabditis 집단에서 지역 적응의 시그니처를 밝혀 낼 수 있으며 자연 맥락에서 유전 적 변이의 관련성에 대한 중요한 통찰력을 제공 할 수 있습니다8. Caenorhabditis 선충류의 많은 유전자에 대한 기능적 이해를 얻으려면 생태 연구가 필요할 수 있습니다11. C. elegans의 경우에도 유전자의 상당 부분이 기능적 주석이 부족하지만, 시퀀싱되는 최초의 다세포 동물이자 지구상에서 가장 철저히 연구 된 동물 중 하나임에도 불구하고. 이 수집 프로토콜은 야생 Caenorhabditis 선충류의 수집과 생태학 및 자연 유전 적 다양성에 대한 연구를 촉진함으로써 이러한 지식 격차를 해결하는 데 도움이되도록 개발되었습니다.

지난 이십 년 동안 Caenorhabditis 선충류의 생태학에 대한 관심이 높아졌습니다. 이 연구들로부터 우리는 자유 살아있는 Caenorhabditis 종들이 온대 및 열대 지방의 일시적인 미세 서식지에서 분리 될 수 있다는 것을 알고 있으며, 때로는 대칭에서 식물 물질을 분해하는 것과 관련된 미생물 꽃을 먹습니다.1,2,3,4,5,6,7,8 . 우리는 또한 자기 수정의 수렴 진화가 속 (genus )에서 세 번 발생했으며, 자가화는 C. briggsae, C. elegans 및 C. tropicalis9,10의 지배적 인 번식 방식이라는 것을 배웠습니다. 이 셀커 중 C. elegans는 지구상에서 가장 널리 연구 된 동물 중 하나이며 생물학에서 중요한 발전을 이루기 위해 연구원들에 의해 사용되었습니다. 중요하게도, 다른 자가성 Caenorhabditis 종은 많은 C. elegans 실험 이점을 공유하고 있으며 속의 비교 연구를 빠르게 진행하고 있습니다. 그러나 야생에서 이러한 선충류의 비밀스러운 특성으로 인해 생태학과 자연 다양성을 연구하기가 어려워 유전자의 생물학적 기능과 진화가 종 간의 유전 적 다양성을 형성하는 방법을 이해하는 데 중요합니다.10,11.
야생에서 Caenorhabditis 선충류를 자행하는 생태학을 연구하는 데 가장 큰 도전은 작은 크기입니다. 성인 선충류는 종종 길이가 1mm 이하입니다. 이 도전은 연구자가 야생에서 기질을 샘플링하고 야생에서 동물을 관찰 할 수있는 능력없이 실험실의 기질에서 관심있는 선충류를 분리하려고 시도해야합니다. 숙련 된 전문가조차도 현미경으로 다른 자유 살아있는 선충류와 자가하는 Caenorhabditis 선충류를 구별하기가 어렵다는 것을 알기 때문에 선충류는 일반적으로 기질에서 제거되고 격리되어 확립 된 분자 바코드를 사용하여 서열 동일성에 의해 확인되기 전에 증식하도록 방치됩니다.3,12,13,14 . 이러한 방식으로 각 선충류를 처리하는 데 필요한 시간과 노력은 연구자들이 실험실에서 분리 된 각 선충류의 신원을 현장에서 샘플링 된 정확한 기질 및 관련 생태 데이터로 추적 할 수 있어야하기 때문에 조직적 도전을 제시합니다. 여기에서는 현장에서 자가하는 Caenorhabditis 선충류를 효율적으로 수집하고 식별하고이 격리 물을 관련 공간 및 생태 데이터와 대규모로 충실하게 연결하기위한 단계별 프로세스를 설명합니다.
이 수집 방법은 모바일 데이터 수집 플랫폼, 클라우드 기반 데이터베이스 및 R 소프트웨어 환경을 사용하여 생태 조사의 규모와 정확성을 높입니다. Fulcrum은 대부분의 모바일 장치에서 작동하며 사용자가 https://www.fulcrumapp.com(위치 기반 데이터)를 수집하고 구성하는 사용자 지정 응용 프로그램을 빌드할 수 있는 사용자 지정 데이터 수집 플랫폼입니다. 이 프로토콜은 맞춤형 데이터 수집 응용 프로그램을 사용하여 현장에서 공간적으로 명시 적 생태 데이터를 구성하고 해당 데이터를 실험실에서 격리 된 선충류의 신원과 정확하게 연결하는 방법에 대한 자세한 지침을 제공합니다. 이 프로토콜은 또한 확립 된 분자 바코드를 사용하여 자아 Caenorhabditis 선충류를 효율적으로 식별하는 방법을 설명합니다. 이러한 방법의 데이터는 동반 된 R 소프트웨어 패키지 easyFulcrum15를 사용하여 간단하고 재현 가능하게 처리하여 자연 Caenorhabditis 집단의 생태학 및 유전 적 다양성을 탐구 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>접착 라벨</td><td>Avery</td><td>61533</td><td>C-라벨 및 S-라벨 인쇄</td></tr><tr><td>아가로스</td><td>Thomas Scientific</td><td>C748D75</td><td>아가로스 젤 준비</td></tr><tr><td>백팩</td><td></td><td></td><td>각 팀원이 하루 동안 장비, 샘플, 음식 및 물을 담을 수 있는 백팩입니다.</td></tr><tr><td>골판지 상자</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS261</td><td>S-플레이트 보관</td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Neamtode 용해, SSU 및 ITS2 PCR</td></tr><tr><td>수집 백</td><td>지퍼 잠금</td><td>NA</td><td>기판 수집</td></tr><tr><td>디지털 온도/습도계</td><td>Preciva</td><td>HT-86</td><td>주변 온도 및 습도 측정</td></tr><tr><td>분석 범위</td><td>NA</td><td>NA</td><td>선충 분리, 용해</td></tr><tr><td>일회용 저장 탱크</td><td>USA Scientific</td><td>1306-1010</td><td>알리쿼팅 PCR 마스터 믹스 및 로딩 염료</td></tr><tr><td>DNA 래더, 1 KB 플러스</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0243</td><td>SSU 및 ITS2 PCR 제품 시각화</td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Thomas Scientific</td><td>CB4430-2</td><td>PCR 마스터 믹스 구성 요소</td></tr><tr><td>easyFulcrum R 패키지</td><td>NA</td><td>NA</td><td>http://andersenlab.org/easyfulcrum/articles/easyFulcrum.html</td></tr><tr><td>EDTA 용액(0.5M pH 8.0)</td><td>NA</td><td></td><td>NA 레시피에 대한 보충 표 3 참조</td></tr><tr><td>에탄올(95%)</td><td>NA</td><td></td><td>NA 샘플 도금, 숟가락 살균</td></tr><tr><td>브롬화 에티듐 용액(10mg/mL)</td><td>VWR</td><td>97064-602</td><td>SSU 및 ITS2 PCR 제품 시각화</td></tr><tr><td>모바일 장치용 외부 배터리 충전기</td><td>NA</td><td></td><td>NA iPhone 또는 Android용 외부 배터리 충전기 및 충전 케이블</td></tr><tr><td>플라스크(500mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB501500</td><td>아가로스 젤 준비</td></tr><tr><td>식품</td><td>NA</td><td></td><td>NA 팩 그에 따라</td></tr><tr><td>젤 전기영동 장치</td><td>Thermo Scientific</td><td>B2</td><td>Visualizing SSU 및 ITS2 PCR 제품</td></tr><tr><td>젤 전기영동 전원 공급 장치</td><td>BioRad</td><td>1645050</td><td>SSU 및 ITS2 PCR 제품 시각화</td></tr><tr><td>겔 로딩 염료, 6x</td><td>NEB</td><td>B7022S</td><td>SSU 및 ITS2 PCR 제품 시각화</td></tr><tr><td>ITS2 프라이머 세트</td><td>NA</td><td></td><td>oECA1687 = 포워드 프라이머 CTGCGTTACTTACCACGAATTG CARAC, oECA202 = 리버스 프라이머 GCGGTATTTGCTACTACCAYYAM GATCTGC</td></tr><tr><td>ITS2 염기서열분석 프라이머</td><td>NA</td><td>NA</td><td>oECA306 = 포워드 프라이머 CACTTTCAAGCAACCCGAC</td></tr><tr><td>용해 완충액</td><td>NA</td><td>NA</td><td>선충류 용해, 레시피 프로토콜 참조</td></tr><tr><td>마이크로파</td><td>NA</td><td>NA 아</td><td>가로스 젤 준비</td></tr><tr><td>모바일 장치</td><td>NA</td><td>NA 비행기</td><td>모드에서 충전 전화. Fulcrum 앱의 GPS 위치는 사진에서 추출한 GPS 위치에 비해 정확하지 않습니다. 이 설정을 사용하면 전력을 덜 사용하고 더 정확한 GPS 측정값을 얻을 수 있습니다.</td></tr><tr><td>NGMA 플레이트, 10cm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td>C-플레이트, NGMA 플레이트 프로토콜은 Andersen et al. 2014 참조.</td></tr><tr><td>NGMA 플레이트, 3.5cm</td><td>Greiner Bio-One</td><td>5662-7102Q</td><td>S-플레이트, NGMA 플레이트 프로토콜은 Andersen et al. 2014 참조.</td></tr><tr><td>비접촉 적외선 온도계</td><td>Etekcity</td><td>B00837ZGRY</td><td>기판 온도 측정</td></tr><tr><td>종이 타월</td><td>NA</td><td>NA</td><td>봉지에 담긴 샘플에서 과도한 수분을 흡수하기 위한 종이 타월.</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-374-12</td><td>플레이트 씰링</td></tr><tr><td>PCR 접착 호일</td><td>VWR</td><td>60941-126</td><td>PCR 접착 호일</td></tr><tr><td>PCR 버퍼(10x)</td><td>Thomas Scientific</td><td>CB3702-7</td><td>PCR 마스터 믹스 구성</td></tr><tr><td>요소 PCR 플레이트(96-well)</td><td>Thomas Scientific</td><td>1149K04</td><td>SSU 및 ITS2 PCR</td></tr><tr><td>연필</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 숟가락</td><td>NA</td><td></td><td>NA 샘플 도금 플래티넘</td></tr><tr><td>픽</td><td>NA</td><td>NA 선</td><td>충 분리, 용해</td></tr><tr><td>사전 라벨링 된 지퍼락 수집 백</td><td>NA</td><td>NA</td><td>C 라벨 바코드가 사전 라벨링 된 지퍼 잠금 비닐 백 번들. 각 번들에는 고무 밴드로 포장된 25개의 바코드 백이 포함되어야 합니다.</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma</td><td>3115879001</td><td>Nematode lysis, 사용 직전 lysis 버퍼에 추가</td></tr>됨 <tr><td>R 소프트웨어</td><td>NA</td><td>NA</td><td>R 소프트웨어: 통계 컴퓨팅을 위한 언어 및 환경 https://www.R-project.org/</td></tr> <tr><td>소프트 쿨러 백 및 아이스팩</td><td>NA</td><td>NA</td><td>컬렉션 쿨러 및 쿨러 팩은 주변 온도가 25°C 이상일 때 샘플을 시원하게 유지합니다.</td></tr><tr><td>예비 배터리</td><td>NA</td><td>NA</td><td>샘플링 장비용 추가 배터리</td></tr><tr><td>SSU 프라이머 세트</td><td>NA</td><td></td><td>NA oECA1271 = 포워드 프라이머 TACAATGGAAGGCAGCAGGC, oECA1272 = 리버스 프라이머 CCTCTGACTTTTTCGTTCTTGATTAA</td></tr><tr><td>스트립 튜브 캡(12-well)</td><td>Thomas Scientific</td><td>1159V29</td><td>선충 용해</td></tr><tr><td>스트립 튜브(12-well)</td><td>Thomas Scientific</td><td>1159V31</td><td>선충 용해</td></tr><tr><td>TAE 완충액 (1x)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>SSU 및 ITS2 PCR 산물 시각화. 레시피</td></tr><tr><td>Taq 중합효소</td>, <td>Thomas Scientific</td><td>C775Y45</td><td>PCR 마스터 믹스 성분</td></tr><tr><td>, Thermocycler</td>, <td>NA</td>, <td>NA</td>, <td>Neamtode lysis, SSU 및 ITS2 PCR</td></tr>, <tr><td>Water</td>, <td>NA</td>, <td>NA, NA</td><td>Pack</td></tr>에 대해서는 보충 표 3을 참조하십시오</tbody></table>.

selfing caenorhabditis 선충류의 생태 조사를 수행하기위한 고도로 확장 가능한 접근법

A Highly Scalable Approach to Perform Ecological Surveys of Selfing Caenorhabditis Nematodes

Caenorhabditis elegans 는 생물학의 주요 모델 유기체 중 하나이지만 최근에야 연구자들은 자연 생태학에 중점을 두었습니다. 자연적 맥락에서 C. elegans 에 대한 정보의 상대적 희소성은 자연에서 작은 선충류의 확인과 관련된 도전에서 비롯됩니다. 이러한 도전에도 불구하고 C. elegans 의 생태학에 대한 관심이 높아짐에 따라 실험실 외부의 삶에 관한 풍부한 새로운 정보가 생겨났습니다. 자연에서 C. elegans 에 대한 강화 된 검색은 많은 새로운 Caenorhabditis 종의 발견에 기여했으며 congeneric 선충류가 썩어가는 식물 물질과 관련된 미생물 꽃을 먹는 야생에서 자주 서식한다는 것을 밝혀 냈습니다. 새로운 종의 확인은 또한 수컷과 자기 수정 헤르마프로디테스의 안드로디오시스 교미 시스템이 Caenorhabditis에서 독립적으로 세 번 진화했다는 것을 밝혀 냈습니다. 다른 두 종의 자가종인 C. briggsae 와 C. tropicalis는 C. elegans 의 실험적 이점을 공유하고 자기 수정을 포함한 중요한 특성의 기계론적 기초에 대한 비교 연구를 가능하게 했다. 이러한 발전에도 불구하고,이 중요한 종의 생태와 자연 다양성에 대해 많은 것을 배워야합니다. 예를 들어, 우리는 여전히 많은 유전자에 대한 기능적 정보가 부족하며, 이는 자연 생태학에 대한 이해를 통해서만 얻을 수 있습니다. Caenorhabditis 선충류를 자칭하는 생태 연구를 용이하게하기 위해, 우리는 야생에서 선충류를 수집 할 수있는 고도로 확장 가능한 방법을 개발했습니다. 우리의 방법은 모바일 데이터 수집 플랫폼, 클라우드 기반 데이터베이스 및 R 소프트웨어 환경을 사용하여 야생에서 선충류를 수집하고, 관련 생태 데이터를 기록하고, 분자 바코드를 사용하여 야생 선충류를 식별하는 연구자의 능력을 향상시킵니다.

이 프로토콜은 하와이와 캘리포니아를 포함한 여러 지역에서 Caenorhabditis 선충류를 수집하는 데 사용되었습니다. Caenorhabditis 선충류의 분리 성공률은 수집 위치, 기후, 샘플링 경험 및 샘플링 된 기질 유형에 따라 다릅니다. 이 프로토콜은 하와이 제도를 광범위하게 샘플링하는 데 사용되어 왔으며, 아홉 개의 수집 프로젝트가 수년 및 계절에 걸쳐 수행되었습니다. Caenorhabditis 종을 자가하는 격리 성공률은 C. briggsae (4,506 샘플 중 162 개, 3.6 %)와 C. elegans (4,506 개 샘플 중 163 개, 3.6 %)와 거의 동일하며 C. tropicalis (4,506 개 샘플 중 26 개, 0.58 %)8의 경우 훨씬 낮습니다. 각각의 자아 종은 다른 기질 범주에 비해 썩어가는 과일과 꽃 기질에 풍부합니다. 시료 썩은 과일과 꽃 기질 연구자가 기질 선호도를 특성화하기보다는 성공률을 극대화하려고 시도하는 경우. 그러나, 성공률은 선택된 기판의 품질에 따라 달라진다. 예를 들어, 과일과 꽃 기질 중에서 너무 건조하거나 젖거나 신선한 기질 은 Caenorhabditis 선충류를 생성하지 못할 가능성이 큽니다.
이 수집 프로토콜의 확장성은 한 쌍의 연구원이 야생에서 수집 할 수있는 컬렉션 수에서 분명합니다. 예를 들어, 2018년 10월, 이 수집 프로토콜을 사용하는 한 쌍의 연구원은 하와이 제도 두 곳의 여러 위치에서 7일 동안 총 1,000개 이상의 샘플을 수집할 수 있었습니다. 이 현장 팀은 하룻밤 사이에 샘플을 실험실로 운송했으며, 여덟 명의 연구원 팀이 샘플에서 2,000 개 이상의 선충류를 분리했습니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 현장에서 필요한 장비 및 인력을 줄임으로써 원격 위치에서의 샘플링과 관련된 비용을 최소화한다는 것입니다. 이 프로토콜을 사용하면 소규모 현장 팀이 샘플링에 집중할 수 있으며 격리 팀은 선충류를 분리하기 위해 현미경 및 한천 플레이트를 해부하는 것과 같은 깨지기 쉽고 무거운 장비를 사용하여 가정 기관에서 샘플을 처리 할 수 있습니다. 또한 모바일 데이터 수집 응용 프로그램의 구현을 통해 샘플과 관련된 모든 필드 데이터를 C 레이블에 직접 연결할 수 있으므로 격리 팀이 샘플을 처리하는 동안 현장 팀과 독립적으로 작업 할 수 있습니다.
이 수집 프로토콜을 사용하는 연구원은 수집 프로젝트 전에 선충류를 분리하는 데 필요한 노력을 고려해야합니다. 격리 및 식별 단계는 속도 제한이 있으며 소규모 수집 팀은 샘플로 절연기를 빠르게 압도 할 수 있습니다. 또한 많은 컬렉션을 처리하는 데 필요한 실험실 공간은 진행중인 연구를 방해 할 수 있습니다 (그림 3). 또한, 일부 고립 된 선충류는 유전자형에 대한 추가 노력이 필요합니다. 예를 들어, 분리물의 약 2%는 첫 번째 용해 시도 후에 SSU PCR 프라이머 세트로 증폭되지 않으며, 용해 물질이 ITS2 프라이머 세트를 사용한 증폭에 적합한지 확인하기 위해 재용해되어야 한다(그림 8). 또한, 분리물의 약 3%는 Sanger 시퀀싱의 초기 라운드 후에 품질 서열을 생성하지 못합니다. 이러한 격리물의 경우, 또 다른 용해 라운드, ITS2 PCR 및 생어 시퀀싱이 종종 필요하며, 이는 격리 팀의 핸드 타임을 증가시킬 수 있습니다. 중요하게도, 서열 동일성만으로는 새로운 Caenorhabditis 종을 정당화하기에 충분한 증거가 아니다(그림 7). 분리물을 새로운 Caenorhabditis 종으로 올리는 것을 적절하게 정당화하기 위해서는 짝짓기 실험을 수행하고 형식화 된 표본을 확립하기 위해 추가적인 노력이 이루어져야합니다13. 타이핑된 표본에 대한 공식적인 형태학적 설명도 바람직하지만 필수는 아니다3. 함께, 이러한 고려 사항은이 수집 프로토콜을 채택 한 연구원이 수집 프로젝트가 시작되기 전에 자원이 적절하게 할당되었는지 확인하기 위해 격리 및 식별 단계에 대한 시험 테스트의 이점을 누릴 수 있음을 시사합니다. 중요한 것은 소규모 수집 프로젝트조차도 프로세스가 재현성이 뛰어나고 실험실 그룹 전체에서 품질 관리 목적으로 데이터를 쉽게 감사 할 수 있기 때문에이 프로토콜의 이점을 누릴 수 있다는 것입니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63486/63486fig01.jpg"> 그림 1 : 기질 예. (A) 이상적인 썩는 과일은 이미지 (1)의 중앙에 나타나 있으며, 열매는 거의 인식 할 수 없습니다. 덜 썩은 과일이 근처에 표시됩니다. 갓 떨어진 과일을 샘플링하지 마십시오 (2). (B) 이상적으로 분해 된 꽃이 상단 (3)에 표시됩니다. 갓 떨어진 꽃을 샘플링하지 마십시오 (4). (C) 마른 잎의 최상층 아래의 어두운 잎 깔짚은 Caenorhabditis 선충류를 자칭하기 위해 샘플링 할 때 이상적입니다 (5). 마른 잎 깔짚을 샘플링하지 마십시오 (6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/63486fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63486/63486fig02.jpg"> 그림 2: 선충류 필드 샘플링 모바일 응용 프로그램. (A) Fulcrum의 Apple 장치에서 선충류 필드 샘플링 응용 프로그램을 연 후의 초기 화면입니다. 오른쪽 하단의 빨간색 화살표는 새 컬렉션 레코드를 만드는 데 사용되는 + 단추를 가리킵니다. (B) Apple 장치에 표시된 새로운 컬렉션 레코드의 예. 빨간색 화살표는 컬렉션 레코드 화면 상단의 '프로젝트' 필드를 가리킵니다. 현장에서 샘플링할 때 올바른 프로젝트를 선택해야 합니다. 프로젝트 필드는 기본적으로 후속 컬렉션 레코드를 만들 때 사용된 마지막 프로젝트로 설정됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/63486fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63486/63486fig03.jpg"> 그림 3: 샘플을 도금하기 전에 정리된 수집 가방 및 수집 플레이트. 이 그림은 왼쪽의 C 라벨이 붙은 수집 백의 샘플을 보여줍니다. 각 수집 가방에는 그 위에 일치하는 C 라벨이 붙은 10cm 플레이트가 있습니다. 오른쪽에는 수집 가방에서 옮겨진 후 샘플 재료가 들어있는 10cm 수집 플레이트가 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/63486fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63486/63486fig04.jpg"> 그림 4: 적절하게 이송된 샘플이 있는 수집 플레이트(C-플레이트). 박테리아 잔디밭의 가장자리에 놓인 분해 과일이있는 10cm C 플레이트. C 라벨은 플레이트 뚜껑에 부착되어 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/63486fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63486/63486fig05.jpg"> 그림 5: 선충류 격리 모바일 응용 프로그램. (A) Fulcrum 모바일 응용 프로그램의 응용 프로그램 선택 화면입니다. 빨간색 화살표는 선충류 격리 응용 프로그램을 가리 킵니다. (B) Fulcrum의 Apple 장치에서 선충류 격리 응용 프로그램을 연 후 초기 화면. 오른쪽 아래에 있는 빨간색 화살표는 새 격리 레코드를 만드는 데 사용되는 + 단추를 가리킵니다. (C) Apple 장치에 표시된 새로운 격리 레코드의 예. 빨간색 화살표는 격리 기록 화면 상단의 '프로젝트' 필드를 가리킵니다. 격리할 때 올바른 프로젝트를 선택해야 합니다. 프로젝트 필드는 기본적으로 후속 격리 레코드를 만들 때 사용된 마지막 프로젝트로 설정됩니다. (D) C-라벨 아래의 선택 필드를 탭한 후 사용자는 검색 버튼(빨간색 화살표)을 탭하여 선충류를 격리하는 C 라벨을 찾습니다. (E) C 라벨을 선택한 후 사용자는 장치 카메라를 사용하여 C 플레이트를 촬영합니다. (F) 사용자는 C 플레이트에 선충류가 있는지 여부를 입력합니다. S-레이블은 격리할 선충류가 있는 경우 격리 레코드에 추가됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/63486fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63486/63486fig06.jpg"> 그림 6: NCBI BLAST 결과 페이지 . (1) 모든 시퀀스의 BLAST 결과를 보는 데 사용되는 드롭다운 메뉴입니다. (2) 드롭 다운에서 선택한 현재 시퀀스에 대한 설명. 이 경우 S-label S-05554에 대한 결과가 표시됩니다. (3) S-05554의 최고 블래스트 히트가 표시됩니다. 자주색 텍스트는 이 정렬을 시각화하는 링크가 클릭되었음을 나타냅니다. 가능한 새로운 Caenorhabditis 종을 확인하기 위해 눈으로 정렬을 검사하십시오, 위의 9.8 단계를 참조하십시오. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/63486fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63486/63486fig07.jpg"> 그림 7: NCBI BLAST 정렬 시각화 예. (A) C. kamaaina 대상 시퀀스에 정렬된 격리물의 ITS2 쿼리 시퀀스의 예. (1) 정렬의 동일성 비율 (89 %)으로, 상위 BLAST 히트에 대해 낮습니다. (2) 질의와 주제 서열 (G 내지 A) 사이의 불일치. (3) 정렬 알고리즘에 의해 만들어진 피사체 서열에서 네 개의 염기쌍 갭; 쿼리 또는 주제의 간격은 정렬이 불량함을 나타냅니다. (4) 많은 불일치와 틈새가있는 정렬의 중심에있는 일반화 된 영역. 이와 같은 영역은 쿼리 서열이 새로운 Caenorhabditis 종에서 나올 수 있음을 시사합니다. 표시된 것은 2017 년에 발견 된 새로운 종 인 C. oiwi의 실제 정렬 예입니다. (B) 격리물의 ITS2 질의 서열과 피사체 서열 사이의 양호한 정렬의 예. (5) 정렬의 퍼센트 동일성 (99 %)은 일반적으로 쿼리 시퀀스가 피험자와 동일한 종의 분리에서 비롯된 것임을 의미합니다. (6) 완벽한 정체성을 가진 정렬의 중심 영역. 이와 같은 영역은 쿼리 격리가 주제와 동일한 종일 가능성이 있음을 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/63486fig07large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63486/63486fig08.jpg"> 그림 8: SSU 및 ITS2 PCR 산물. 상부 겔은 12개의 대표적인 샘플에 대해 SSU 프라이머 세트로 생성된 PCR 산물을 보여준다. DNA 사다리는 참조로 왼쪽에 포함되어 있습니다. Caenorhabditis 선충류에 대한 SSU PCR 산물은 길이가 약 500 bp이다. 샘플 2-12는 SSU 프라이머 세트로 증폭되었으나 샘플 하나는 증폭되지 않았다. 샘플에 대한 500 bp SSU 앰플리콘의 부재는 용해 물질이 품질이 좋지 않았고 샘플을 재용해해야한다는 것을 암시한다. 하단 겔은 상부 겔에 표시된 동일한 12개의 샘플에 대해 ITS2 프라이머 세트로 생성된 PCR 산물을 나타낸다. 사다리와 샘플은 두 겔 모두에 대해 동일한 방향입니다. 12개의 샘플 중 여섯 개는 ITS2 프라이머 세트로 증폭되지 않았다. SSU 및 ITS2 밴드를 갖는 샘플은 생어 시퀀싱되고 NCBI BLAST 알고리즘을 사용하여 서열 유사성에 의해 식별된다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/63486fig08large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 1 : C 레이블. 2500개의 고유한 C-레이블이 포함된 PDF 파일입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/C-labels.pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 2: S-레이블. 5000개의 고유한 S-레이블이 포함된 PDF 파일입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/S-labels.pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 표 1 : 현장 자료. 선충류를 샘플링하기 위해 현장에서 사용되는 재료의 포장 목록. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/Supplemental_Table_1.xlsx" target="_blank">이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 표 2: PCR 조리법 및 열순환기 조건. ITS2 및 SSU PCR에 대한 PCR 레시피 및 열주기 조건 표입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/Supplemental_Table_2.xlsx" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 표 3 : 전기 영동 버퍼 조리법. 0.5 M pH 8.0 에틸렌디아민테트라아세트산 용액(EDTA) 및 TRIS-아세테이트-EDTA(TAE) 완충용액에 대한 레시피이다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/Supplemental_Table_3.xlsx" target="_blank">이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

이 프로토콜은 자아 Caenorhabditis 선충류의 대규모 생태 조사를 수행하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법의 주요 장점은 자연에서 수집 된 선충류와 관련된 생태 및 분자 데이터의 효율적인 조직 및 분석입니다.

Selfing caenorhabditis 선충류의 생태 조사를 수행하기위한 고도로 확장 가능한 접근법

Caenorhabditis elegans is one of the major model organisms in biology, but only recently have researchers focused on its natural ecology. The relative ...

이 프로토콜은 자연에서 Caenorhabditis 선충류의 분리 및 식별을 간소화하고 선충류의 자연 환경과 관련된 중요한 생태 및 환경 데이터를 기록하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 모바일 데이터 수집 플랫폼, 클라우드 기반 데이터베이스 및 표준화 된 데이터 처리 기능을 활용하여 가능하게하는 확장 성 및 정확성입니다. 시작하려면 Caenorhabditis 선충류를 조사 할 위치를 확인하십시오.Fulcrum 프로젝트를 만들려면 무료 교육 계약을 사용하여 Fulcrum 온라인 계정을 만들고 선충류 필드 샘플링 응용 프로그램을 추가하십시오. 그런 다음 선충류 격리 응용 프로그램을 추가하십시오. QR 코드 라벨 세트를 C-라벨로 인쇄하여 컬렉션을 추적하고 S-라벨을 추적하여 선충류 격리를 추적하십시오.포장을 위해 C-라벨을 Ziploc 비닐 봉지에 부착하십시오. 실험실에서 사용할 수 있도록 S-라벨 세트를 보관하십시오. Fulcrum 모바일 앱의 드롭다운 메뉴에서 선충류 필드 샘플링을 선택하고 더하기 키를 눌러 프로젝트에서 새 레코드를 시작합니다.기판의 사진을 찍으십시오. C-레이블 필드를 탭하고 스캔을 선택합니다. 모바일 장치 카메라를 사용하여 수집 가방의 바코드를 스캔한 다음 완료를 탭합니다.기판 필드를 탭하고 기판 유형을 선택합니다. 비접촉 온도계를 사용하여 기판의 표면 온도를 측정하고 기판 온도 필드에 값을 기록하십시오. 또한 주변 온도와 습도를 측정하고 기록하십시오.화면 왼쪽 상단의 저장을 탭하여 Fulcrum에 저장하고 기록하십시오. 수집 가방을 장갑으로 뒤집어 스틱이나 다른 단단한 조각이없는 기질의 큰 스푼을 모아 기판을 집어 들고 가방을 밀봉하십시오. 각 Ziploc 가방에 대해 가방의 C 라벨을 기록하고 OP50 박테리아가 발견 된 10 센티미터 플레이트의 뚜껑에 일치하는 C 라벨을 부착하십시오.깨끗한 플라스틱 숟가락을 사용하여 각 수집 백에서 C 플레이트로 샘플 한 스푼을 옮깁니다. Fulcrum 응용 프로그램의 응용 프로그램 메뉴에서 선충류 격리를 선택하십시오. 그런 다음 오른쪽 하단의 더하기 아이콘을 탭하여 새 격리 레코드를 만듭니다.선택 버튼을 탭하여 샘플과 연결된 C-Label을 찾습니다. 검색 아이콘을 누릅니다. 그런 다음 스캔 아이콘을 탭하여 C 라벨 QR 코드를 스캔하십시오.해부 현미경으로 C 플레이트에서 선충류를 찾으십시오. 샘플 필드의 웜을 탭하여 샘플에 선충류가 있음을 기록하십시오. 선충류가 없으면 C 플레이트를 파라 필름으로 만들고 생물학적 위험 쓰레기통에 버리십시오.선충류가있는 경우 C 플레이트에서 최대 다섯 개의 선충류를 분리하고 각각을 자체 S 플레이트로 옮깁니다. 그런 다음 S 라벨이 붙은 플레이트 필드를 탭하여이 분리에 사용 된 S 플레이트로 들어갑니다. 오른쪽 하단의 더하기를 누릅니다.S-Label을 탭한 다음 스캔을 클릭하여 장치 카메라를 연 다음 S-플레이트에서 S-Label QR 코드를 스캔합니다. 격리 기록에 모든 정보가 올바르게 추가되면 오른쪽 상단의 저장 버튼을 탭한 다음 격리 된 선충류로 S 플레이트를 파라 필름 한 다음 선충류가있는 S 플레이트를 고정하도록 지정된 영역에 따로 두십시오. Fulcrum 웹 사이트에 로그인하고 선충류 격리 응용 프로그램을 선택하십시오.내보내기를 클릭하여 선충류 격리 s_labeled_plates가 포함 된 zip 파일을 다운로드하십시오. csv 파일. 야생 격리 지노타이핑 템플릿 Google 시트로 이동하여 Google 스프레드시트를 복사합니다.선충류 격리 s_labeled_plates에서 복사 한 S- 라벨을 놓습니다. csv 열을 지노타이핑 시트에 넣습니다. 격리 후 48 시간 후에 S-플레이트에서 증식하는 동물을 확인하십시오.S-플레이트에 증식하는 동물이 있는 경우, 유전자형 분석 시트의 증식 48 컬럼에 하나를 입력한 다음, S-플레이트를 48시간 증식 박스라고 표시된 박스로 옮긴다. 격리 후 48시간에 증식하지 않았던 S-플레이트를 격리 후 168시간에 다시 확인한다. S-플레이트가 현재 증식하고 있다면, 지노타이핑 시트의 증식(168) 컬럼에 하나를 입력한 다음, S-플레이트를 168시간 증식 박스로 라벨링된 박스로 옮긴다.Google 시트에서 유전자형을 필터링하여 용해할 하나의 증식 상자에 S-레이블만 포함시킨 다음 용해 노드를 통해 S-레이블 열을 선택합니다. 용해될 각 증식 상자에 대한 용해 워크시트를 인쇄하십시오. 용해 될 샘플에 대해 12 웰 스트립 튜브를 준비하십시오.하나의 스트립 튜브를 풀고 반복 파이프터로 각 캡에 여덟 마이크로 리터의 용해 버퍼를 추가하십시오. 소스 플레이트에서 세 마리에서 다섯 마리의 동물을 용해 워크 시트에 표시된 캡 위치로 선택하십시오. 최대 여덟 개의 스트립 튜브에 대해 반복하고 스트립 튜브를 영하 80도 냉동실에 놓습니다.스트립 튜브 세트를 제거하고 열순환기에서 용해 프로그램을 실행하십시오. 그런 다음 용해물을 섭씨 영하 80도에서 최대 일주일 동안 보관하십시오. 영하 80도 냉동고에서 스트립 튜브를 제거하고 얼음 위에서 용해 물질을 해동하십시오.용해 물질이 해동되는 동안 ITS2 및 SSU 마스터 믹스를 얼음 위의 별도의 튜브에 준비하십시오. 두 마이크로리터의 용해물을 저용량 다중 채널 피펫으로 PCR 플레이트의 적절한 웰에 첨가한다. 적절한 열순환 프로그램으로 PCR을 실행하고 지노타이핑 시트에 ITS2 또는 SSU PCR 제품을 생산하는 S-라벨을 기록하십시오.ITS2 양성인 각 샘플에 대해 나머지 ITS2 PCR 산물을 사용하여 생어 시퀀싱을 수행하고 시퀀싱 플랫폼에서 각 S-Label에 대한 seq 출력 파일을 가져옵니다. 웹 브라우저에서 NBCI BLAST 웹 사이트로 이동하여 BLAST 검색을 시작합니다. Caenorhabditis 종에 대한 BLAST가 있는 S-플레이트 서열의 경우, 종 ID 컬럼에 히트된 상위 BLAST의 전체 속 및 종 이름을 입력하십시오.Caenorhabditis 명명법 규칙에 따라 고유한 이름으로 균주의 이름을 지정하고 균주 이름 열에 균주 이름을 입력합니다. 데이터를 처리하려면 Fulcrum 웹 사이트로 이동하여 Fulcrum 데이터베이스에서 원시 프로젝트 데이터를 내보냅니다. 새 R 스크립트를 열고 easyfulcrum 비네트의 지시에 따라 컬렉션 데이터를 처리합니다.NBCI BLAST에서 S-Label S-05554의 결과는 최고 히트가 Caenorhabditis briggsae임을 보여줍니다. 또한, 일부 고립 된 선충류는 유전자형에 대한 추가 노력이 필요합니다. 예를 들어, 약 2%의 분리물은 첫 번째 용해 시도 후에 SSU PCR 프라이머 세트로 증폭되지 않으며, 용해 물질이 ITS2 프라이머 세트를 사용한 증폭에 적합한지 확인하기 위해 재용해되어야 한다.이 절차에 따라 연구자들은 야생 선충류 분리 물과 관련된 생태 및 환경 데이터를 탐구하여 특정 선충류 종을 보유 할 가능성이 가장 높은 위치와 기질 특성을 식별 할 수 있습니다.

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Research

연구

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Caenorhabditis elegans 건강에 영향을 미치는 미생물 분리물의 고처리량 스크리닝

이 프로토콜은 외부 박테리아를 제거하기 위해 감기 마비 및 표면 표백에 이어 박테리아 식민지화 된 Caenorhabditis elegans의 96-well 파괴를 설명합니다. 생성 된 현탁액은 한천 플레이트에 도금되어 많은 수의 개별 웜에서 박테리아 부하의 정확하고 중간 처리량 정량화를 허용합니다.

단일 웜 데이터를 사용하여 예쁜꼬마선충-박테리아 상호작용의 이질성 정량화

Caenorhabditis elegans는 건강, 수명 및 스트레스에 대한 탄력성을 조사하기위한 강력하고 저렴한 방법을 갖춘 우수한 모델 시스템 역할을합니다.

Caenorhabditis elegans의 수명과 건강 상태를 측정하기위한 저비용 방법 조사

예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans) 은 숙주-마이크로바이옴 상호작용을 유도하는 분자 결정 요인을 조사할 수 있는 강력한 모델입니다. 우리는 예쁜꼬마선충(C. elegans ) 생리학의 주요 측면과 함께 장내 마이크로바이옴 집락화의 단일 동물 수준을 프로파일링하는 고처리량 파이프라인을 제시합니다.

예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans) 장내 마이크로바이옴의 정량화 및 분석을 위한 유동 지렁이 측정법의 적용

배우세요 Caenorhabditis 선충류의 대규모 생태 조사 방법을. 모바일 데이터 수집 플랫폼과 클라우드 데이터베이스를 활용하여 현장에서 정확한 분리 및 동정이 가능합니다. 이 기술은 생태학 및 분자생물학 연구에 필수적인 데이터 관리 효율성을 크게 향상시킵니다.

Selfing caenorhabditis 선충류의 생태 조사를 수행하기위한 고도로 확장 가능한 접근법

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