Name: 미세 해부된 마우스 맥락막 신경총으로부터 면역 세포의 분리 및 특성화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: 학습하세요 마우스 맥락막 신경총에서 면역 세포를 분리하고 유세포 분석으로 거대식세포와 T세포를 특성화하는 방법을. 이 기술은 뇌 면역 미세환경 연구에 활용됩니다.

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Institut Pasteur Animalerie Centrale과 CB-UTechS 시설 회원들에게 도움을 주신 것에 감사드립니다. 이 작업은 파스퇴르 연구소에 의해 재정적으로 지원되었습니다.

모든 절차는 실험실 동물 취급에 대한 유럽 집행위원회의 지침, 지침 86/609/EEC에 동의했습니다. 그들은 윤리위원회 번호 59, CETEA/CEEA No. 089, dap210067 및 APAFIS #32382-2021070917055505 v1의 승인을 받았습니다.
1. 물질의 제조
<ol><li>모든 항체 (물질 표)를 4°C에서 저장하고, 광 노출로부터 보호한다.</li>
	<li>DAPI 원액 (1 mg/mL): 분말을 PBS-/- (표 물질), 분취액에 재현탁시키고, -20°C에서 저장한다.</li>
	<li>DAPI 작업 용액 (0.1 mg/mL): DAPI 원액을 PBS-/- 1:10의 비율로 희석합니다.</li>
	<li>자기-활성화 세포 분류(MACS) 완충액: PBS-/-에서 2mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 및 0.5% 소 혈청 알부민(BSA)(표 자료)을 준비한다.</li>
	<li>콜라게나제 IV 원액 (20 U/μL): 분말을 PBS+/+ (표 물질), 분취액에 재현탁시키고, -20°C에서 보관한다. 참고: 콜라게나제 IV는 MgCl2가 완전히 활성화되어야 합니다. 콜라게나제 IV 용액을 동결-해동시키지 마십시오.</li>
	<li>마취제-진통제액: PBS-/-의 1 mL에 케타민 150 μL(150 mg/kg), 25 μl의 자일라진(5 mg/kg) 및 330 μl의 부프리케어(0.1 mg/kg)를 혼합한다. 참고 : 마취 - 진통제 용액을 일시적으로 준비하고 하루 이상 보관하지 마십시오.</li>
	<li>헤파린 용액 (100 U/mL): 분말을 PBS-/-에 재현탁시킨다.</li>
	<li>튜브를 PBS-/-로 채워진 디캔터 삼각에 연결하는 주입 주입 시스템을 준비합니다. 23G 바늘을 주입 튜브의 말단에 연결하십시오. 주입 삽입물을 열고 튜브에 기포가 없을 때까지 PBS를 실행하게하십시오.</li>
	<li>빛이 장착 된 쌍안 확대경을 준비하십시오.</li>
</ol>2. C57BL/6 마우스의 하우징
<ol><li>CP 골수성 또는 T 세포의 분석을 위해, 각각에 대해 네 마리의 마우스를 사용하고 네 개의 CP를 풀링한다(각 측심실에서 두 개, 세 번째 심실 및 네 번째 심실 CP; 총 여덟 마리의 마우스에 대해). CP를 풀링하지 않으면 낮은 풍부도로 인해 CP에서 희귀 한 면역 집단을 검출하지 못할 위험이 있습니다.</li>
	<li>마우스가 실험 전에 적어도 7 일 동안 순응하게하십시오. 생쥐를 일정한 온도 및 습도, 12/12 h 또는 14/10 h 빛/어두운 주기, 물 및 표준 펠렛 식품 광고 리비툼으로 병원균이없는 조건에서 보관하십시오.</li>
</ol>3. PBS 관류 및 뇌 해부
<ol><li>각 마우스의 무게를 10 μL/g의 마취제-진통제 혼합 용액(단계 1.6)을 복강내 주입한다.</li>
	<li>효율적인 진통제를 위해 약 30 분 정도 기다리십시오 (마우스의 숫자를 꼬집어 마취의 깊이를 확인하십시오).</li>
	<li>마취 된 마우스를 뒤쪽, 해부 지지대 위에 평평하게 놓고 손바닥을 해부 지지대에 테이프로 붙입니다.</li>
	<li>포셉으로 동물의 피부를 꼬집고 가위를 사용하여 복부, 횡격막 및 흉부를 열어 심장을 노출시킵니다. 참고 : 흉부가 열리면 뇌는 무산소가됩니다. 관류의 다음 단계를 통해 정확하고 신속하게 진행해야합니다.</li>
	<li>20 μL의 100 U/mL 헤파린 용액을 좌심실에 직접 주입하십시오.</li>
	<li>미세한 가위로 오른쪽 심방에서 적어도 3mm의 절개를하여 혈액이 몸 밖으로 흘러 나오도록하십시오.</li>
	<li>직후, 주입 튜브의 말단에 놓인 23 G 바늘을 좌심실의 끝을 통해 삽입하십시오.</li>
	<li>주입 시스템을 최대로 열고 완전한 관류를 기다립니다 : 약 6 mL / min의 유속으로 23G 바늘을 사용하면 관류가 3 분 안에 완료됩니다. 참고 : 간과 같은 장기의 변색조차도 관류 효능을 증명합니다.</li>
	<li>주입 시스템을 닫고 심장 심실에서 바늘을 제거하십시오.</li>
	<li>마우스의 손바닥에서 테이프를 제거합니다. 마우스를 복부 위치에 놓습니다.</li>
	<li>포셉으로 동물의 피부를 꼬집고 가위를 사용하여 눈에서 귀까지 머리 꼭대기의 피부를 제거하십시오.</li>
	<li>가위의 도움으로 눈 사이에서 두개골을 먼저 자른 다음 각 눈에서 마세터 근육 바로 위의 척수까지 옆으로 자릅니다. 이를 위해 가위의 사지를 사용하고 가위로 뇌가 손상되지 않도록 부드럽게 진행하십시오.</li>
	<li>눈 사이의 사지에서 꼬집어 포셉으로 두개골을 엽니 다.</li>
	<li>가위를 사용하여 척수를 자르고 집게로 뇌를 추출하여 뇌의 측면 측면에 두 점을 놓고 기울여 얼음처럼 차가운 PBS + / +로 채워진 페트리 접시에 넣으십시오. 그런 다음 CP가 즉시 수집됩니다. 참고 : 관류 효능을 확인하기 위해 뇌의 변색을 확인하십시오.</li>
</ol>4. 뇌에서 맥락막 신경총의 해부
<ol><li>뇌 등쪽을 페트리 접시에 올려 놓고 쌍안 루페의 목표 아래에 놓습니다.</li>
	<li>포셉의 도움으로 뇌를 제자리에 유지하고, 반구 사이의 중간 선을 통해 다른 포셉의 두 끝을 아래로 삽입하십시오.</li>
	<li>포셉을 사용하여 캘로섬과 해마가있는 피질을 중격에서 멀리 당겨 측심실과 세 번째 심실의 일부를 노출시킵니다.</li>
	<li>측면 CP를 양쪽 끝에서 불타는 측심실을 감싸는 긴 베일로 식별하십시오. 얇은 포셉의 두 끝을 사용하여 측면 CP를 잡으십시오. 해마의 후부 접힘에 의해 숨겨질 수있는 삼각형 후부 부분을 수집하도록주의하십시오.</li>
	<li>대측 반구의 코퍼스 캘로섬과 해마로 피질을 중격에서 당겨 세 번째 심실 전체와 반대쪽 측심실을 노출시킵니다.</li>
	<li>세 번째 CP를 미세 포셉으로 수집하고, 이는 세분화 된 표면 측면을 가진 짧은 구조로 식별 될 수 있습니다.</li>
	<li>다른 측면 CP를 수집합니다.</li>
	<li>소뇌와 중뇌 사이에 포셉의 두 끝을 삽입하십시오. 폰과 수질에서 소뇌를 분리하여 네 번째 심실을 노출시킵니다.</li>
	<li>네 번째 CP를 측면 오른쪽 끝에서 소뇌와 수질 사이의 왼쪽 끝으로 네 번째 심실을 정렬하는 세분화 된 표면 측면이있는 긴 구상 구조로 식별하십시오. 미세한 집게로 네 번째 CP를 수집하십시오. 참고: 포셉의 실란 베이스 코팅은 포셉에 CP의 끈적임을 방지할 수 있습니다.</li>
	<li>다른 일곱 마리의 마우스 각각에 대해 3.1-4.9단계를 반복합니다. 한편, 수집된 CP는 얼음 위에 놓인 튜브 내에 일시적으로 보관될 수 있다.</li>
</ol>5. 유세포 분석을 위한 시료 제조
<ol><li>750 μL의 PBS+/+로 모든 해부된 CP를 함유하는 튜브를 채운다. 참고: 튜브에 얇은 포셉을 가진 해부된 CP의 증착은 PBS+/+의 작은 부피를 가져온다. 오히려 CP 조직의 가능한 손실을 피하기 위해 기존의 부피를 750 μL로 제거하고 이를 PBS+/+ 의 신선한 750 μL로 교체하는 것보다 완료한다.</li>
	<li>20 U/μL 콜라게나제 IV 원액 15 μL(단계 1.5 참조)를 첨가하여 400 U/mL의 최종 농도를 측정합니다. 참고: DNAse I (150 μg/mL)는 과도한 세포 응집을 방지할 수 있습니다.</li>
	<li>CP를 콜라게나제 IV와 함께 45분 동안 온화한 교반 (300 RPM) 하에 37°C에서 인큐베이션한다.</li>
	<li>CP 해리를 마무리하기 위해 약 10 번 위아래로 부드럽게 피펫하십시오.</li>
	<li>CP 튜브 1.5 mL를 MACS 완충액(레시피 단계 1.4 참조)으로 채워 콜라게나제 IV 활성을 정지시킨다. 참고: 콜라게나제 IV 활성은 저온에서 중단되고 혈청 알부민에 의해 억제된다.</li>
	<li>세포를 500 x g에서, 4°C에서 5분 동안 원심분리한다. 상청액을 버리고 세포를 1.5 mL의 MACS 완충액으로 세척한다.</li>
	<li>세포를 5분 동안, 4°C에서 500 x g 에서 원심분리한다. 상청액을 버리고 세포를 220 μL의 MACS 완충액에 재현탁시킨다.</li>
	<li>10 μL의 분취량을 염색되지 않은 대조군으로 사용할 세포 현탁액으로부터 분리한다(다음 단계 5.18).</li>
	<li>DAPI 모노염색 대조군으로 사용되는 세포 현탁액으로부터 10 μL의 분취량을 분리한다(다음 단계 5.12).</li>
	<li>나머지 200 μL를 마우스 항-마우스 CD16/CD32 차단 항체 (1:100)와 함께 4°C에서 20분 동안 예비인큐베이션하여, 비특이적 Fc-매개된 상호작용을 차단한다.</li>
	<li>세포를 두 개의 100 μL 튜브로 분할한다(하나는 골수성 세포 분석을 위한 것이고, 다른 하나는 T 세포 분석을 위한 것이다)(다음 단계 5.14).</li>
	<li>DAPI-모노염색된 대조군(단계 5.9)을 위해 10 μL의 세포로 샘플을 취하고, 이를 MACS 완충액으로 최대 100 μL까지 채운다(다음 단계 5.14).</li>
	<li>항체 모노염색 (단계 5.14.4) 및 모든 염색된 대조군 (단계 5.14.5)을 위해 100 μL의 MACS를 함유하는 열한 개의 새로운 튜브를 제조하고, 각각에 보상 비드의 방울을 첨가한다. 참고: 보정 제어를 통해 형광 검출 레이저의 전압을 설정하고 다른 채널에서 형광 염료의 잠재적 비특이적 신호 검출을 평가하여 추가로 보정할 수 있습니다.</li>
	<li>샘플의 항체 인큐베이션:<ol>
<li>골수성 샘플: 0.1 mg/mL DAPI (1:100) (단계 1.3 참조), FITC 안티-마우스 CD45 (1:100), PE-Dazzle 594 안티-마우스 CD11b (1:100), APC 안티-마우스 CX3CR1 (1:100), BV711 안티-마우스 Ly6C (1:100), PE 안티-마우스 F4/80 (1:100), 및 APC-Cy7 안티마우스 IA-IE (1:100)를 첨가한다.</li>
		<li>T 세포 샘플: 0.1 mg/mL DAPI (1:100), FITC 항-마우스 CD45 (1:100), PE-Dazzle 594 항-마우스 CD11b (1:100), APC 항-마우스 TCRβ (1:100), PE 항-마우스 CD8a (1:100), 및 APC-Cy7 항-마우스 CD4 (1:50)를 첨가한다.</li>
		<li>DAPI-모노 염색 대조군 (단계 5.12부터): DAPI 0.1 mg/mL (1:100)를 첨가한다.</li>
		<li>항체 모노-염색된 보상 비드: 골수성 및 T 세포 샘플에 대해 이전에 사용된 아홉 개의 항체 각각을 (동일한 희석), 개별적으로 (각 튜브마다 하나씩) 비드를 함유하는 아홉 개의 튜브에 첨가한다. 참고: 모노 염색된 보상 대조군은 보상 단계 동안 사용된 각각의 형광 마커에 대한 형광의 양성 피크의 결정을 가능하게 할 것이다. 분석기는 이들을 염색되지 않은 대조군 CP 세포에서 관찰된 음성 신호와 비교할 것이다.</li>
		<li>항체 올-염색된 보상 비드: 골수성 염색에 사용되는 모든 항체를 한 튜브에 첨가하고 T 세포 염색에 사용되는 항체를 다른 튜브에 첨가한다. 참고: 모든 염색된 보정 컨트롤을 통해 각 형광 레이저 검출의 전압을 설정하고 다른 채널에서 형광 염료의 잠재적인 비특이적 신호 검출을 평가할 수 있습니다.</li>
		<li>빛에 노출되지 않도록 얼음 위에서 30-45 분 동안 배양하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>최대 1.5mL의 모든 튜브를 MACS 버퍼로 채웁니다. 세포 및 보상 비드를 500 x g에서, 5분 동안, 4°C에서 원심분리한다.</li>
	<li>상청액을 버리고 세포 및 보상 비드를 1.5 mL의 MACS 완충액으로 세척한다.</li>
	<li>세포 및 보상 비드를 500 x g에서, 5분 동안, 4°C에서 원심분리한다. 상층액을 버리십시오.</li>
	<li>세포 및 보상 비드를 500 μL의 MACS 완충액에 재현탁시킨다. 염색되지 않은 대조군(단계 5.8)을 최대 500μL까지 MACS 버퍼로 채운다.</li>
	<li>각 튜브를 70 μm 스트레이너 (염색되지 않은 CP, DAPI 모노염색된 대조군, 및 골수성 및 T 세포 샘플)를 통해 CP 세포로 여과한다.</li>
</ol>6. 유세포 측정
참고: 이 프로토콜에 사용되는 유량계에는 355nm UV 레이저, 405nm 바이올렛 레이저, 488nm 블루 레이저, 561nm 황록색 레이저 및 637nm 적색 레이저 등 5개의 레이저가 장착되어 있습니다.
<ol><li>세포계 설정, 추적(CST) 인터페이스 및 CST 제어 비드를 사용하여 세포계에 대한 일일 품질 관리 검사를 수행하여 분석, 기기 품질 및 일관된 표적 형광 강도 간의 일관성을 보장합니다.</li>
	<li>유세포 분석기 실험을 설정하려면 이변량 플롯 및 히스토그램을 사용하여 새 실험을 만듭니다. 획득을 모니터링하기 위해 각 색상에 대한 전방 산란 영역(FSC-A) 및 측면 산란 영역(SSC-A) 플롯과 히스토그램 플롯이 포함되었는지 확인합니다.</li>
	<li>염색되지 않은 대조군 CP 셀에서 FSC-A 및 SSC-A 파라미터에 대한 PMT 전압을 설정하여 세포 형태를 정의합니다.</li>
	<li>염색되지 않은 대조군 CP 세포 상의 형광 피크의 네거티브 피크와 모든 항체로 염색된 보상 비드를 사용하여 플루오크롬의 양성 피크를 설정하고 검출기 신호가 스케일을 벗어나지 않고 다른 채널에서 너무 강하게 교차 검출되지 않도록 보장함으로써 각 형광 마커의 전압을 정의한다.</li>
	<li>보정 매트릭스를 만들어 각 단색 보정 컨트롤을 분석합니다. 적절한 FSC-A/SSC-A 모집단에 게이팅한 후 히스토그램 플롯에서 단일 염색된 대조군을 확인하고 보정 컨트롤을 기록합니다. 모든 단일 염색된 샘플을 기록한 후, 보상 매트릭스를 계산한다.</li>
	<li>골수성 및 T 세포 집단 둘 다에 대해 검출된 모든 사건을 기록한다.</li>
</ol>7. CP 골수성 세포 게이팅
<ol><li>FSC-A 대 SSC-A 및 셀의 게이트(크기 기준)를 선택합니다.</li>
	<li>FSC-A 대 순방향 산란 높이(FSC-H)를 사용하여 단일 셀에 대한 도터 게이트를 만듭니다.</li>
	<li>DAPI 대 FSC-A를 사용하여 라이브 셀에 대한 딸 게이트를 만들어 DAPI+ 셀을 제외합니다.</li>
	<li>CD45 대 FSC-A를 가진 CD45+ 면역 세포에 대한 딸 게이트를 생성하십시오.</li>
	<li>CD45+ 세포로부터 딸 게이트를 생성하고, CD11b 대 F4/80을 선택하고, 다음의 두 그룹을 확인한다: CD11b+ F4/80+ 및 CD11b+ F4/80- 집단 (다음 단계 7.8).</li>
	<li>CD11b+ F4/80+ 셀에 대한 딸 게이트를 만들고 CX3CR1 대 IA-IE를 선택합니다. CD11b+ F4/80high CX3CR1+ IA-IE+ BAM 및 CX3CR1+ IA-IE- 대식세포로 추가로 명명된 CX3CR1+ IA-IE+ BAM을 모두 식별합니다.</li>
	<li>CD11b+ F4/80+ CX3CR1+ IA-IE- 대식세포에 대한 딸 게이트를 만들고 F4/80 대 CD11b를 선택합니다. CD11bhigh F4/80중간체와 CD11b+ F4/80high집단을 모두 확인하십시오. CD11bhigh F4/80중간체 CX3CR1+ IA-IE-Kolmer의 상복부 대식세포 및 CD11b+ F4/80high CX3 CR1 + IA-IE- BAM은 각각 참고: CD11bhigh F4/80중간체 CX3CR1+ IA-IE- 및 CD11b+ F4/80high CX3CR1+ IA-IE- 세포는 F4/80중간체-F4/80high와 CD11bhigh-CD11b+ 수준 사이에 약간 혼합된 것으로 나타났다.</li>
	<li>CD11b+ F4/80-집단으로부터(단계 7.5), Ly6C 대 IA-IE에 대한 게이트. IA-IE+ Ly6C- 개체군과 주로 단핵구/호중구에 해당하는 IA-IE- Ly6C+ 세포를 모두 선택합니다. 참고 : IA-IE- Ly6C + 세포의 높은 존재는 염증 상태가없는 동물의 관류 효능에 문제를 반영 할 가능성이 큽니다. 그들의 풍요로움은 낮아야 한다.</li>
	<li>CD11b+ F4/80- IA-IE+ Ly6C-집단에 대한 딸 게이트를 생성하고, CD11b 대 CX3CR1을 선택하고, CD11bhigh CX3CR1low 및 CD11b+ CX3CR1-집단을 모두 식별한다.</li>
</ol>8. CP T 세포 게이팅
<ol><li>FSC-A 대 SSC-A 및 셀의 게이트(크기 기준)를 선택합니다.</li>
	<li>FSC-A 대 순방향 산란 높이(FSC-H)를 사용하여 단일 셀에 대한 도터 게이트를 만듭니다.</li>
	<li>DAPI 대 FSC-A를 사용하여 라이브 셀에 대한 딸 게이트를 만들어 DAPI+ 셀을 제외합니다.</li>
	<li>CD45 대 FSC-A를 가진 CD45+ 면역 세포에 대한 딸 게이트를 생성하십시오.</li>
	<li>CD45+ 세포로부터 딸 게이트를 생성하고 TCRβ 대 CD11b를 선택한다. CD11b+ 골수성 세포를 배제하고 TCRβ+ CD11b-T 세포 집단을 선택한다.</li>
	<li>TCRβ+ CD11b-모집단에 대한 딸 게이트를 생성하고 CD4 대 CD8a를 선택하십시오. CD8-CD4+ T 세포 및 CD8+ CD4-T 세포 둘 다를 확인한다.</li>
</ol>

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<li>Baruch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging-induced+type+I+interferon+response+at+the+choroid+plexus+negatively+affects+brain+function%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Aging-induced type I interferon response at the choroid plexus negatively affects brain function.</a> Science. 346 (6205), 89-93 (2014).</li>
<li>Deczkowska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mef2C+restrains+microglial+inflammatory+response+and+is+lost+in+brain+ageing+in+an+IFN-I-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Mef2C restrains microglial inflammatory response and is lost in brain ageing in an IFN-I-dependent manner.</a> Nature Communications. 8 (1), (2017).</li>
<li>Silva-Vargas, V., Maldonado-Soto, A. R., Mizrak, D., Codega, P., Doetsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+niche+signals+from+the+choroid+plexus+regulate+adult+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Age-dependent niche signals from the choroid plexus regulate adult neural stem cells.</a> Cell Stem Cell. 19 (5), 643-652 (2016).</li>
<li>Iliff, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impairment+of+glymphatic+pathway+function+promotes+tau+pathology+after+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Impairment of glymphatic pathway function promotes tau pathology after traumatic brain injury.</a> Journal of Neuroscience. 34 (49), 16180-16193 (2014).</li>
<li>Redzic, Z. B., Preston, J. E., Duncan, J. A., Chodobski, A., Szmydynger-Chodobska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+choroid+plexus-cerebrospinal+fluid+system%3A+From+development+to+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The choroid plexus-cerebrospinal fluid system: From development to aging.</a> Current Topics in Developmental Biology. 71, 1-52 (2005).</li>
<li>da Mesquita, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+aspects+of+meningeal+lymphatics+in+ageing+and+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional aspects of meningeal lymphatics in ageing and Alzheimer's disease.</a> Nature. 560 (7717), 185-191 (2018).</li>
<li>Schwarze, E. -W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+%28Kolmer%27s%29+epiplexus+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry%22%5BJournal%5D)">The origin of (Kolmer's) epiplexus cells.</a> Histochemistry. 44 (1), 103-104 (1975).</li>
<li>Baruch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CNS-specific+immunity+at+the+choroid+plexus+shifts+toward+destructive+Th2+inflammation+in+brain+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">CNS-specific immunity at the choroid plexus shifts toward destructive Th2 inflammation in brain aging.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (6), 2264-2269 (2013).</li>
<li>Kunis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFN-%CE%B3-dependent+activation+of+the+brain%27s+choroid+plexus+for+CNS+immune+surveillance+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">IFN-γ-dependent activation of the brain's choroid plexus for CNS immune surveillance and repair.</a> Brain. 136 (11), 3427-3440 (2013).</li>
<li>Prinz, M., Priller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+and+brain+macrophages+in+the+molecular+age%3A+From+origin+to+neuropsychiatric+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Microglia and brain macrophages in the molecular age: From origin to neuropsychiatric disease.</a> Nature Reviews Neuroscience. 15 (5), 300-312 (2014).</li>
<li>Goldmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((fate+and+dynamics+of+macrophages+at+central+nervous+system+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">fate and dynamics of macrophages at central nervous system interfaces.</a> Nature Immunology. 17 (7), 797-805 (2016).</li>
<li>Fung, I. T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+group+2+innate+lymphoid+cells+alleviates+aging-associated+cognitive+decline%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Activation of group 2 innate lymphoid cells alleviates aging-associated cognitive decline.</a> Journal of Experimental Medicine. 217 (4), (2020).</li>
<li>Kertser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corticosteroid+signaling+at+the+brain-immune+interface+impedes+coping+with+severe+psychological+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Corticosteroid signaling at the brain-immune interface impedes coping with severe psychological stress.</a> Science Advances. 5, 4111(2019).</li>
<li>Shechter, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+beneficial+M2+macrophages+to+injured+spinal+cord+is+orchestrated+by+remote+brain+choroid+plexus%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Recruitment of beneficial M2 macrophages to injured spinal cord is orchestrated by remote brain choroid plexus.</a> Immunity. 38 (3), 555-569 (2013).</li>
<li>Yang, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+brain+and+choroid+plexus+cell+types+in+severe+COVID-19%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of brain and choroid plexus cell types in severe COVID-19.</a> Nature. 595 (7868), 565-571 (2021).</li>
<li>Baruch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-1+immune+checkpoint+blockade+reduces+pathology+and+improves+memory+in+mouse+models+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">PD-1 immune checkpoint blockade reduces pathology and improves memory in mouse models of Alzheimer's disease.</a> Nature Medicine. 22 (2), 135-137 (2016).</li>
<li>Baruch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+immune+tolerance+by+targeting+Foxp3%2B+regulatory+T+cells+mitigates+Alzheimer%27s+disease+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Breaking immune tolerance by targeting Foxp3+ regulatory T cells mitigates Alzheimer's disease pathology.</a> Nature Communications. 6, 7967(2015).</li>
<li>Rodríguez-Rodríguez, N., Flores-Mendoza, G., Apostolidis, S. A., Rosetti, F., Tsokos, G. C., Crispín, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TCR-%CE%B1%2F%CE%B2+CD4+%E2%88%92+CD8+%E2%88%92+double+negative+T+cells+arise+from+CD8+%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">TCR-α/β CD4 − CD8 − double negative T cells arise from CD8 + T cells.</a> Journal of Leukocyte Biology. 108 (3), 851-857 (2020).</li>
<li>Schafflick, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+profiling+of+CNS+border+compartment+leukocytes+reveals+that+B+cells+and+their+progenitors+reside+in+non-diseased+meninges%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Single-cell profiling of CNS border compartment leukocytes reveals that B cells and their progenitors reside in non-diseased meninges.</a> Nature Neuroscience. 24 (9), 1225-1234 (2021).</li>
<li>Quintana, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNGR-1%2B+dendritic+cells+are+located+in+meningeal+membrane+and+choroid+plexus+of+the+noninjured+brain%5BTitle%5D)+AND+%22GLIA%22%5BJournal%5D)">DNGR-1+ dendritic cells are located in meningeal membrane and choroid plexus of the noninjured brain.</a> GLIA. 63 (12), 2231-2248 (2015).</li>
<li>Kabashima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomarkers+for+evaluation+of+mast+cell+and+basophil+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Biomarkers for evaluation of mast cell and basophil activation.</a> Immunological Reviews. 282 (1), 114-120 (2018).</li>
<li>Li, Q., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+and+macrophages+in+brain+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).</li>
<li>Borst, K., Dumas, A. A., Prinz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia%3A+Immune+and+non-immune+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Microglia: Immune and non-immune functions.</a> Immunity. 54 (10), 2194-2208 (2021).</li>
</ol>

저자들은 경쟁하는 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

뇌 항상성 및 질병에 대한 면역학적 기여를 이해하려는 연구는 주로 뇌 실질 내에 존재하는 세포에 초점을 맞추었고, 그럼에도 불구하고 뇌 기능에 중요한 기여자인 CP와 같은 뇌 경계를 무시했다2,3. CP에서 면역 세포 집단의 분석은 CP의 크기가 작고, 상주 면역 세포의 수가 적으며,이 조직에 대한 복잡한 접근으로 인해 어렵습니다. 총 뇌 면역 세포 (CD45+)에 대해 수행 된 유세포 측정은 CP에 상주하는 희귀 한 면역 집단의 특성화를 허용하지 않습니다. CP의 면역 조성을 높은 정밀도로 특성화하기 위해, PBS 관류 마우스로부터 해부된 CP에 대해 유세포 분석을 수행하였다. 이러한 접근법은 순환하는 CD45+ 세포 및 CP CD45-세포, 예컨대 혈관주위세포, 내피 및 상피 세포의 배제를 허용한다32. 골수성 및 T 세...

19 세기 후반 Paul Erhlich가 혈액 - 뇌 장벽을 발견 한 이래로 뇌는 다른 장기 및 혈류와 사실상 분리 된 것으로 간주되어 왔습니다. 그러나 지난 10 년 동안 뇌 기능은 장내 미생물 및 전신 면역 세포 및 신호와 같은 다양한 생물학적 요인에 의해 형성된다는 개념의 출현을 보았습니다1,2,3,4. 동시에, 수막과 맥락막 신경총(CP)과 같은 다른 뇌 경계는 불활성 장벽 조직보다는 활성 면역-뇌 교차 대화의 계면으로 확인되었다5,6,7,8.
CP는 뇌와 주변을 분리하는 경계 중 하나 인 혈액 뇌척수액 장벽을 구성합니다. 그들은 뇌의 네 개의 심실, 즉 세 번째, 네 번째 및 양쪽 측심실 각각에 위치하고 있으며 해마의 심실 하부 영역 및 세분화 된 영역과 같은 신경 발생과 관련된 영역에 인접 해 있습니다3. 구조적으로, CP는 상피 세포의 단층으로 둘러싸인 연합 된 혈액 모세 혈관의 네트워크로 구성되며, 이들은 단단하고 부착 된 접합부에 의해 상호 연결되어 있습니다9,10. CP 상피의 주요 생리적 역할은 폐대사산물 및 단백질 응집체로부터 뇌를 세척하는 뇌척수액의 생산과 호르몬 및 신경영양 인자를 포함한 다양한 신호전달 분자의 생산 및 제어된 혈액-뇌 통과를 포함한다11,12,13. CP로부터 분비된 분자는 뇌의 활동, 즉 신경발생과 미세아교세포기능14,15,16,17,18,19을 조절함으로써 뇌의 활동을 형성하며, 이는 CP를 뇌 항상성에 결정적으로 만든다. CP는 또한 다양한 면역 활동에 관여합니다. 비병리학적 조건 하에서 뇌 실질의 주요 면역 세포 유형은 미세아교세포인 반면, CP 면역 세포 집단의 다양성은 말초 기관3,7에서와 같이 광범위하며, 이는 다양한 면역 조절 및 신호전달 채널이 CP에서 작용하고 있음을 시사한다.
내피 세포와 상피 세포 사이의 공간인 CP 스트로마는 주로 염증 신호에 반응하여 전염증성 사이토카인 및 항원 제시와 관련된 분자를 발현하는 경계-관련 대식세포(BAM)에 의해 채워진다3. 대식세포의 또 다른 아형인 콜머의 상복부 세포는 CP 상피20의 정점 표면에 존재한다. CP stroma는 또한 수지상 세포, B 세포, 비만 세포, 호염기구, 호중구, 선천성 림프계 세포 및 중추 신경계 항원을 인식 할 수있는 대부분 이펙터 기억 T 세포 인 T 세포의 틈새 시장입니다7,21,22,23,24. 또한, CP에서의 면역 세포 집단의 조성물 및 활성은 전신 또는 뇌 교란시, 예를 들어, 노화 동안10,14,15,21,25, 미생물 교란7, 스트레스26, 및 질병27,28 동안 변화한다. 주목할 만하게, 이러한 변화는 간접적으로 뇌 기능, 즉 뇌 노화에서 발생하는 Th2 염증으로의 CP CD4+ T 세포의 이동이 제안되었고, 노화와 관련된 인지 저하를 형성할 수 있는 CP로부터의 면역 신호전달을 촉발시킨다14,15,21,25,29 . 따라서 CP 면역 세포의 특성을 조명하는 것은 CP 상피 생리학 및 분비에 대한 조절 기능을 더 잘 이해하고 건강 및 질병 조건에서 뇌 기능에 대한 간접적 인 영향을 해독하는 데 중요합니다.
CP는 단지 몇 개의 면역 세포만을 포함하는 작은 구조이다. 그들의 분리는 관류의 예비 단계 후에 미세 해부를 필요로한다; 혈류의 면역 세포는 그렇지 않으면 주요 오염 물질을 구성 할 것입니다. 이 프로토콜은 유세포 분석기를 사용하여 CP의 골수성 및 T 세포 서브세트를 특성화하는 것을 목표로 한다. 이 방법은 비염증성 조건 하에서 마우스 CP를 구성하는 면역 세포 집단의 약 90%를 확인하는데, 이는 면역 CP 이질성을 해부하기 위한 다른 방법을 사용하는 최근 발표된 연구에 따른다7,10,28. 이 프로토콜은 생체내에서 질병 및 다른 실험적 패러다임과 함께 CP 면역 세포 구획의 변화를 특성화하는데 적용될 수 있었다.

<table><tbody><tr><td>안티 마우스 CD16/CD32</td>, <td>BD Biosciences,</td><td>553142</td><td>유세포 분석 항체</td></tr><tr><td>, 알부민, 소</td><td>MP, Biomedicals</td><td>160069</td><td>차단 시약</td></tr>, <tr><td>APC, 안티 마우스 CX3CR1</td>, <td>BioLegend</td><td>149008</td><td>유세포 분석 항체</td></tr>, <tr><td>APC 안티 마우스 TCRb</td>, <td>BioLegend</td><td>109212</td><td>유세포 분석 항체</td></tr>, <tr><td>APC-Cy7, 안티 마우스 CD4</td><td>BioLegend</td><td>100414</td><td>유세포 분석 항체</td></tr><tr><td>APC-Cy7 안티 마우스 IA-IE</td><td>BioLegend</td><td>107628</td><td>유세포 분석 항체</td></tr><tr><td>BD FACSymphony A5 세포 분석기</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>유세포 분석 분석기</td></tr><tr><td>BV711 안티 마우스 Ly6C</td><td>BioLegend</td><td>128037</td><td>유세포 분석 항체</td></tr><tr><td>Collagenase IV</td><td>Gibco</td><td>17104-019</td><td>Enzyme to Dissociate CP Tissue</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Scientific</td><td>62248</td><td>Live/dead marker</td></tr><tr><td>EDTA</td><td></td><td></td><td>이온 킬레이터</td></tr><tr><td>미세 가위</td><td>FST</td><td>14058-11</td><td>Dissection tool</td></tr><tr><td>FITC anti-mouse CD45</td><td>BioLegend</td><td>103108</td><td>유세포 분석 항체</td></tr><tr><td>Flow controller 주입 삽입</td><td>CareFusion</td><td>RG-3-C</td><td>혈액 관류 </td></tr><tr><td>삽입 FlowJo 소프트웨어</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>분석 소프트웨어</td></tr><tr><td>겸자</td><td>FST</td><td>11018-12</td><td>해부 도구</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149-10KU</td><td>항응고제</td></tr><tr><td>Imalgene</td><td>Boehringer Ingelheim</td><td></td><td>Ketamine, 마취제</td></tr><tr><td>OneComp eBeads</td><td>Invitrogen</td><td>01-1111-42</td><td>실현 제어 비드 compensation</td></tr><tr><td>PBS-/-</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td>Buffer</td></tr><tr><td>PBS+/+</td><td>Gibco</td><td>14040-091</td><td>Buffer</td></tr><tr><td>PE anti-mouse CD8a</td><td>BioLegend</td><td>100708</td><td>유세포분석 항체</td></tr><tr><td>PE anti-mouse F4/80</td><td>BioLegend</td><td>123110</td><td>유세포분석 항체</td></tr><tr><td>PE-Dazzle 594 anti-mouse CD11b</td><td>BioLegend</td><td>101256</td><td>유세포분석 항체</td></tr><tr><td>Rompun</td><td>바이엘</td><td></td><td>자일라진, 마취</td></tr><tr><td>얇은 집게</td><td>Dumoxel 생물학</td><td>11242-40</td><td>해부 도구</td></tr><tr><td>Vetergesic</td><td>Ceva</td><td></td><td>Buprenorphin, 진통제</td></tr></tbody></table>

미세 해부된 마우스 맥락막 신경총으로부터 면역 세포의 분리 및 특성화

Isolation and Characterization of the Immune Cells from Micro-dissected Mouse Choroid Plexuses

뇌는 더 이상 고립되어 기능하는 기관으로 간주되지 않습니다. 축적 된 증거는 말초 면역 체계의 변화가 간접적으로 뇌 기능을 형성 할 수 있음을 시사합니다. 뇌와 전신 순환 사이의 계면에서, 혈액 뇌척수액 장벽을 구성하는 맥락막 신경총(CP)은 주변부와 뇌 간 통신의 핵심 부위로 강조되고 있다. CP는 뇌척수액, 신경 영양 인자 및 뇌 항상성을 형성 할 수있는 신호 전달 분자를 생산합니다. CP는 또한 활성 면역 학적 틈새 시장입니다. 생리적 조건 하에서 주로 미세아교세포에 의해 채워지는 뇌 실질과는 달리, CP 면역 세포의 이질성은 다른 말초 기관에서 발견되는 다양성을 되풀이한다. CP 면역 세포 다양성 및 활성은 노화, 스트레스 및 질병에 따라 변화하고 CP 상피의 활성을 조절하여 간접적으로 뇌 기능을 형성합니다. 이 프로토콜의 목표는 뮤린 CP를 분리하고 그들을 채우는 주요 면역 서브 세트의 약 90 %를 확인하는 것입니다. 이 방법은 CP 면역 세포를 특성화하고 주변부와 뇌 간 의사 소통을 조율하는 기능을 이해하는 도구입니다. 제안 된 프로토콜은 CP 면역 세포가 건강 및 다양한 질병 조건에서 간접적으로 뇌 기능을 조절하는 방법을 해독하는 데 도움이 될 수 있습니다.

여기에 제시된 유세포 분석 결과 골수성 및 T 세포의 주요 하위 집합 (각각 그림 1 및 그림 2)과 고도로 재현 가능한 방식으로 마우스 당 상대적 총 수가 성공적으로 밝혀졌습니다 (그림 3).
골수성 세포의 유세포 분석 결과, CP는 CD11b+ CX3CR1+ F4/80high BAM에 의해 채워져 CP에서 CD45+ 면역 세포의 거의 80%를 차지하는 것으로 나타났다. 이들 BAM은 MHC-II의 발현에 따라 두 개의 상이한 집단으로 나뉘어졌다: 이전에 발표된 데이터7에 따라 주요 그룹(CD45+ 면역 세포의 72%)을 구성한 IA-IE+ BAM</s...

이 연구는 분리 된 관류 된 마우스 뇌 맥락막 신경총에 대한 유세포 측정과 두 가지 게이팅 전략을 사용합니다. 이 프로토콜은이 뇌 구조를 채우는 주요 면역 세포 하위 집합을 식별합니다.

The brain is no longer considered as an organ functioning in isolation; accumulating evidence suggests that changes in the peripheral immune system can ...

이 프로토콜은 마우스 모델에서 다양한 맥락에서 뇌의 조절에서 맥락막 신경총과 말초 면역 세포의 역할에 관한 질문을 해결하는데 유용할 수 있다. 이 프로토콜은 마우스의 맥락막 신경총에서 독특한 면역 세포 집단에 대한 심층적 인 정량적 및 질적 분석을 가능하게합니다. 맥락막 신경총의 해부는 작은 크기와 투명한 색상으로 인해 처음에는 어려울 수 있습니다.먼저 관류되지 않은 동물에 대해 연습하는 것이 좋습니다. 시작하려면 C57 검은 여섯 마리의 마우스 등쪽에서 해부 된 뇌를 페트리 접시에 올려 놓고 접시를 쌍안 루프의 목표 아래에 놓습니다. 포셉을 사용하여 뇌를 제자리에 유지하면서 반구 사이의 중간 선을 통해 다른 한 쌍의 포셉의 두 끝을 삽입하십시오.포셉을 사용하여 캘로섬과 해마가있는 피질을 중격에서 당겨 측심실과 세 번째 심실의 일부를 노출시킵니다. 측면 맥락막 신경총을 측면 심실을 감싸고 양쪽 끝에서 불타는 긴 베일로 확인하십시오. 그런 다음 얇은 집게의 두 끝을 사용하여 측면 맥락막 신경총을 수집하십시오.해마의 후부 주름에 의해 숨겨진 삼각형 후부 부분을 수집하도록주의하십시오. 다음으로, 대측 반구의 코퍼스 캘로섬과 해마가있는 피질을 중격에서 멀리 당겨 세 번째 심실 전체와 반대쪽 측심실을 노출시킵니다. 미세한 포셉을 사용하여 세분화 된 표면 측면을 가진 짧은 구조로 확인 된 세 번째 맥락막 신경총을 수집하십시오.그런 다음 다른 측면 맥락막 신경총을 수집하십시오. 다음으로, 소뇌와 중뇌 사이에 포셉의 두 끝을 삽입하고 소뇌와 수질에서 소뇌를 분리하여 네 번째 심실을 노출시킵니다. 그런 다음 네 번째 맥락막 신경총을 측면 오른쪽 끝에서 소뇌와 수질 사이의 왼쪽 끝으로 네 번째 심실을 정렬하는 세분화 된 표면 측면이있는 긴 구상 구조로 확인하십시오.미세한 포셉을 사용하여 네 번째 맥락막 신경총을 수집하십시오. 수집된 모든 맥락막 신경총을 콜라게나제 IV로 인큐베이션한 후, 약 10회 정도 위아래로 부드럽게 피펫을 올려 해리를 마무리한다. 그런 다음 튜브를 MACS 버퍼로 1.5 밀리리터로 채워 콜라게나제 IV 활성을 정지시킨다.다음으로, 세포를 원심분리하고, 세포를 1.5 밀리리터의 MACS 완충액으로 세척하기 전에 상층액을 버린다. 적절한 보상 비드 및 항체 용액을 첨가한 후, 샘플을 30 내지 45분 동안 얼음 상에서 인큐베이션하여, 광 노출로부터 보호한다. 그런 다음 튜브를 1.5 밀리리터의 MACS 버퍼로 채우고 세포 및 보상 비드를 원심분리합니다.세포 및 보상 비드를 500 마이크로리터의 MACS 완충액에 재현탁시킨 후, 세포를 70 미크론 스트레이너를 통해 여과한다. 유세포 분석기와 소프트웨어를 켠 후 크기에 따라 세포의 전방 산란 영역 대 측면 산란 영역 및 게이트를 선택합니다. 그런 다음 전방 산란 면적 대 전방 산란 높이가있는 단일 셀에 대한 딸 게이트를 만듭니다.다음으로, DAPI 양성 세포를 제외하기 위해 DAPI 대 순방향 산란 영역을 갖는 살아있는 세포에 대한 딸 게이트를 만듭니다. 그런 다음 CD45 대 전방 산란 영역을 가진 CD45 양성 면역 세포에 대한 딸 게이트를 만듭니다. 이제 CD45 양성 세포로부터 딸 게이트를 만들고 F480 대 CD11b를 선택하여 CD11b 양성 F480 양성 및 CD11b 양성 F480 음성 집단을 확인합니다.그런 다음 CD11b 양성 F480 양성 세포에 대한 딸 게이트를 만들고 CX3CR1 대 IA-IE를 선택하여 CX3CR1 양성 IA-IE 양성 경계 관련 대식세포와 CX3CR1 양성 IA-IE 음성 대식세포를 모두 확인합니다. 다음으로, CD11b 양성 F480 양성 CX3CR1 양성 IA-IE 음성 대식세포에 대한 딸 게이트를 만들고, F480 대 CD11b를 선택하여 CD11b 높은 F480 중간체 CX3CR1 양성 IA-IE 음성 콜머의 에피플렉서스 대식세포 및 CD11b 양성 F480 고 CX3CR1 양성 IA-IE 음성 경계 관련 대식세포 둘 다를 확인한다. 그런 다음 CD11b 양성 F480 음성 집단으로부터, Ly6C 대 IA-IE에 대한 게이트.IA-IE 양성 Ly6C 음성 집단과 주로 단핵구 또는 호중구에 해당하는 IA-IE 음성 Ly6C 양성 세포를 모두 선택하십시오. 마지막으로, CD11b 양성 F480 음성 IA-IE 양성 Ly6C 음성 집단에 대한 딸 게이트를 만들고 CD11b 대 CX3CR1을 선택합니다. 그런 다음 CD11b 높은 CX3CR1 저와 CD11b 양성 CX3CR1 음성 집단 모두를 확인한다.T 세포 게이팅의 경우, 앞서 설명한 바와 같이 DAPI 양성 세포를 배제한 후, CD45 대 FSC-A를 갖는 CD45 양성 면역 세포에 대한 딸 게이트를 생성한 다음, CD45 양성 세포로부터 딸 게이트를 생성하고 TCR 베타 대 CD11b를 선택한다. CD11b 양성 골수성 세포를 배제하고 TCR 양성 CD11b 음성 T 세포 집단을 선택한다. 마지막으로, TCR 베타 양성 CD11b 음성 집단에 대한 딸 게이트를 만들고 CD4 대 CD8a를 선택하십시오.CD8 음성 및 CD4 양성 T 세포 및 CD8 양성 CD4 음성 T 세포 둘 다를 확인한다. 여기에서 입증 된 유세포 분석 결과는 골수성 및 T 세포의 주요 하위 집합과 마우스 당 상대적 총 수를 매우 재현 가능한 방식으로 성공적으로 밝혀 냈습니다. 골수성 세포의 유세포 분석 결과, 맥락막 신경총은 CD11b 양성 CX3CR1 양성 F480 고경계 관련 대식세포에 의해 채워지며, 맥락막 신경총에서 CD45 양성 면역 세포의 80%를 나타낸다는 것을 보여준다.콜머 상피 대식세포의 CD11b 높은 F480 중간체 CX3CR1 양성 IA-IE 음성 집단이 또한 확인되었다. CD11b 양성 F480 음성 면역 세포 중에서, Ly6C 음성 IA-IE 양성 세포의 두 개의 상이한 집단이 수지상 세포에 상응할 가능성이 있는 특징이 있었다. T-세포의 분석 및 게이팅 전략은 CD45 양성 CD11b 음성 TCR 베타 양성 세포의 소수 집단의 존재를 강조했다.그 중에서도, 마우스 당 약 30-50개의 CD8 음성 CD4 양성 및 CD8 양성 CD4 음성 T 세포는 생리학적 조건 하에서 맥락막 신경총을 채웠다. 모든 혈액 오염이 맥락막 신경총의 면역 성분을 흐리게 할 수 있기 때문에 관류의 품질을 조절하는 것이 중요합니다. 이 방법은 벌크 또는 단일 세포 RNA 시퀀싱과 같은 추가 분석을 위해 선택된 세포 집단의 분류에 뒤따를 수 있다.

isolation-characterization-immune-cells-from-micro-dissected-mouse

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오는 마우스 맥락막신경총에서 면역 세포를 분리하는 절차를 보여줍니다. 이 절차는 맥락막신경총의 면역 세포가 뇌 건강과 다양한 신경 질환에 어떤 영향을 미치는지 이해하기 위한 신경 면역학 연구에 사용됩니다.

Isolating Immune Cells from Mouse Choroid Plexuses

Peyer의 패치에있는 셀의 특정 subpopulations (조달청), 창자 관련 림프의 조직의 주요 유도 사이트의 면역 기능을 이해 증가 관심이 있습니다. 여기 흐름 cytometric 분석 및 immunostaining을위한 PP cryosections위한 단일 셀 준비를 PP 준비 병렬 프로토콜을 설명합니다.

림프구와 손쥐 Peyer의 패치에서 수지상 세포를 분리하고 Immunostaining

미세 아교 세포 생물학의 성공적인 조사에 하나의 키는 CNS의 조직으로부터 분리하는 동안 생체 미세 아교 immunofunction의 보존이다. 형광 이미징, 면역 세포 화학, 및 염증성 자극 지질 다당류 (LPS)와 팸 3 CSK 4 (팸)와 ELISA 다음 미세 아교 세포의 활성에 의해 평가 매우 순수하고 immunofunctional 세포 배양에 회전 흔들림 결과를 통해 미세 아교 세포를 분리.

쥐과 신생아에서 보존 면역 표현형과 기능으로 두피 소교 세포의 분리

기본 microglia murine 두뇌에서의 격리에 대 한 프로토콜 제공 됩니다. 이 기술은 신경 상황의 현재 이해를 발전에 에이즈. 조밀도 기온 변화도 원심 분리와 자력 분리 매우 순수한 샘플의 충분 한 수확량을 생산 하기 위해 결합 됩니다. 또한, 우리 microglia의 특성에 대 한 단계를 설명합니다.

특성화 및 조밀도 기온 변화도 원심 분리 하 여 마우스 기본 Microglia의 절연

세부 사항에 microglial 함수를 이해 하는 노력 microglia 성숙한 vivo에서 속성 정리 microglial 문화 모델의 부족에 의해 방해 되어 있다. 이 프로토콜 정의 매체 조건 하에서 높은 없는 성숙한 쥐 microglia의 강력한 생존을 유지 하기 위해 설계 된 절연과 문화 접근을 설명 합니다.

절연 및 동적 홍보 설치류 Microglia의 문화 Ramified 혈 청 자유로운 매체에 있는 외관

우리는 성인 마우스 뇌 반구의 다른 해부 된 영역에서 microglia의 격리를위한 프로토콜을 제공하고, 전체 길이 전사체의 깊은 단일 세포 RNA 시퀀싱을위한 반자동 라이브러리 준비를 제공합니다. 이 방법은 건강과 질병에서 microglia의 기능적 이질성을 해명하는 데 도움이됩니다.

깊은 단세포 RNA 염기서열 분석에 대한 하나의 성인 마우스 뇌 반구에서 영역 별 Microglia의 격리

이 논문은 뇌, 척수 및 수막을 포함한 중추 신경계 내에서 상주 및 말초 유래 면역 세포를 검사하기 위한 두 가지 최적화된 프로토콜을 제시합니다. 이러한 각 프로토콜은 정상 상태 및 염증 조건에서 이러한 구획을 차지하는 세포의 기능과 구성을 확인하는 데 도움이 됩니다.

면역 세포의 다운스트림 분석을 위한 중추신경계 조직 및 관련 수막 분리

맥락막 신경총(CP)은 신경과학에서 충분히 연구되지 않은 조직으로 중추신경계의 건강과 질병에 중요한 역할을 합니다. 이 프로토콜은 CP를 분리하기 위한 미세 해부 기술과 세포 구조의 전체 보기를 얻기 위한 주사 전자 현미경의 사용을 설명합니다.

Microdissection and Whole Mount Scanning Electron Microscopy Visualization of Mouse Choroid Plexus

현재까지 동일한 마우스에서 모든 주요 중추 신경계 상주 세포 유형을 동시에 분리하기 위한 프로토콜은 충족되지 않은 수요입니다. 이 프로토콜은 신경 염증 중에 복잡한 세포 네트워크를 조사하고 동시에 필요한 마우스 수를 줄이기 위해 순진하고 실험적인 자가면역 뇌척수염 마우스에 적용할 수 있는 절차를 보여줍니다.

성인 자가면역 뇌척수염 마우스에서 주요 중추 신경계 상주 세포 유형의 동시 분리

우리는 상대적으로 짧은 시간에 MACS(magnetically activated cell sorting)를 사용하여 쥐의 시상하부(또는 이에 상응하는 작은 뇌 구조)에서 미세아교세포를 분리하는 프로토콜을 설명합니다. MACS 분류된 시상하부 미세아교세포는 체외 분석에 사용할 수 있으며 in vitro 분석을 수행하기 위해 도금할 수 있습니다.

Isolation of Hypothalamic Microglia from Freshly Perfused Adult Mouse Brain by Magnetic-Activated Cell Sorting  

뇌 질환에 대한 면역 반응을 조사하기 위한 한 가지 일반적인 접근법은 면역 세포의 변화를 분석하는 것입니다. 여기에서는 쥐 뇌 조직과 두개골 골수에서 면역 세포를 분리하기 위한 두 가지 간단하고 효과적인 프로토콜이 제공됩니다.

생쥐의 뇌와 두개골에서 면역 세포 분리

학습하세요 마우스 맥락막 신경총에서 면역 세포를 분리하고 유세포 분석으로 거대식세포와 T세포를 특성화하는 방법을. 이 기술은 뇌 면역 미세환경 연구에 활용됩니다.

미세 해부된 마우스 맥락막 신경총으로부터 면역 세포의 분리 및 특성화

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