필드 이펙트 바이오센싱 기술을 이용한 분자 샤페론 Hsp90과 클라이언트 단백질 키나제 Cdc37 사이의 생체분자 상호작용 탐구

FEB는 라벨이 없고 비용 효율적인 ________ 상호작용 감지 플랫폼으로, 빠르고 정확한 측정을 제공합니다. 이 방법은 알려지거나 알려지지 않은 상호 작용의 검증과 생체 분자 상호 작용의 잠재적 억제제를 테스트하는 쉬운 방법을 제공합니다. FEB의 가장 큰 장점은 개방형 핸드 피펫팅 플랫폼으로 실험 전반에 걸쳐 사용자를 게이트하는 자동화 된 사용자 친화적 인 소프트웨어로, 사용자가 거의 또는 전혀 교육없이 작업 할 수 있도록합니다.

FEB 기술은 또한 의약품의 다양한 분야, 소분자, 펩티드 및 단백질의 생체 분자 분석, 시험관 내 생물학적 활성을 생체 내 효능으로 쉽게 번역하여 약물 검증을 제공합니다. 초보자이기 때문에 신뢰할 수있는 KD 값을 얻기 위해 실험을 최적화하기 위해 올바른 분석 물질 농도를 선택하는 데 어려움을 겪을 수 있습니다. 칩 기능화 프로세스와 적절한 버퍼 교환에주의를 기울이는 것이 좋습니다.

동일한 부피의 EDC와 sulfo-NHS 용액을 위아래로 피펫팅하여 혼합하여 시작하십시오. 회사에서 공급하는 바이오 센서 칩을 뚜껑이 달린 유리 페트리 접시에 넣으십시오. 칩 활성화와 관련된 모든 기능화 단계는 페트리 접시 내에서 수행하는 것이 좋습니다.

50 마이크로리터의 원몰 MES 버퍼를 바이오센서 칩에 바릅니다. 실온에서 일분 동안 인큐베이션한다. 그런 다음 버퍼를 흡인하고 50 마이크로 리터의 EDC sulfo-NHS 용액을 센서 칩에 즉시 적용하십시오.

페트리 접시를 덮고 실온에서 15 분 동안 배양하십시오. EDC sulfo-NHS 용액을 칩으로부터 흡인하고 50 마이크로리터의 원몰 MES 버퍼를 적용한다. MES 버퍼를 흡인하고 50 마이크로리터의 1X PBS로 칩을 두 번 헹구었다.

칩으로부터 PBS를 흡인하고 표적 분자 Hsp90을 첨가한다. 유리 페트리 접시를 덮고 실온에서 30분 동안 인큐베이션한다. 이어서, 표적 분자를 함유하는 용액을 흡인하고, 50 마이크로리터의 1X PBS로 3회 헹구었다.

칩으로부터 1X PBS 용액을 흡인하고 50 마이크로리터의 켄칭 용액을 첨가한다. 유리 페트리 접시를 덮고 실온에서 15 분 동안 배양하십시오. 칩에서 하나의 용액을 담금질하고 담금질 두 용액의 50 마이크로 리터를 첨가하십시오.

유리 페트리 접시를 덮고 실온에서 15 분 동안 배양하십시오. 그 후, 칩으로부터 두 용액을 담금질하고 센서에 마지막 PBS 액적을 남기고 50 마이크로리터의 1X PBS를 사용하여 칩을 5회 헹구었다. 원하는 농도 범위에서 Cdc37에 대한 분석물 희석 시리즈를 준비하십시오.

신뢰할 수 있는 해리 상수 또는 KD 값을 얻기 위해 적어도 여덟 개의 상이한 분석물 농도를 포함하도록 실험을 설계하고, 교정 및 표적 단백질에 사용되는 동일한 완충액에서 이들 상이한 희석물을 준비한다. 칩을 기기에 조심스럽게 놓습니다. 소프트웨어가 켜져 있고 LED 표시등이 녹색으로 바뀌는지 확인하십시오.

그런 다음 자동화 된 소프트웨어에서 실험 실행 모듈을 누르고 재생 또는 기타 원하는 프로토콜로 10 점을 선택하십시오. 작업자 이름, 실험 이름, 날짜, 재생성 버퍼, 고정화된 대상 및 분석물과 같은 세부 정보를 솔루션에 입력합니다. 소프트웨어에 표시된 실험 시작 단추를 누르고 자동화된 소프트웨어에 표시된 지침을 따릅니다.

계측기 교정을 수행하려면 칩에서 남은 PBS 용액을 흡인하고 교정 버퍼 50 마이크로리터를 적용합니다. 계속 버튼을 누르고 교정 단계가 완료될 때까지 다섯 분 동안 기다립니다. 이 소프트웨어는 교정 단계에 대해 결정된 끝점을 후속 조치에 대한 경고 경보와 함께 표시합니다.

다음으로, 칩으로부터 교정 버퍼를 흡인하고 가장 낮은 분석물 농도의 50 마이크로리터를 적용하여 분석물 회합을 수행한다. 계속 단추를 누르고 연결 단계가 완료될 때까지 다섯 분 동안 기다립니다. 소프트웨어는 진행하기 위해 경고 경보와 함께 연관 단계의 끝점을 표시합니다.

분석물 해리를 수행하려면 칩에서 분석물 용액을 흡인하고 해리 버퍼 50 마이크로리터를 적용합니다. 계속 단추를 누릅니다. 해리 단계 지속 시간 후, 소프트웨어는 해리 단계의 끝점을 경고 경보와 함께 표시합니다.

다음으로, 칩으로부터 해리 용액을 흡인하고 50 마이크로리터의 재생 버퍼를 적용하여 칩 재생을 수행한다. 그런 다음 계속 단추를 누릅니다. 재생성 단계는 일반적으로 완료하는 데 약 30초가 걸립니다.

그 후, 소프트웨어는 후속 조치를 취할 경고 경보와 함께 재생 단계의 끝점을 표시합니다. 마지막으로, 칩을 세척하기 위해, 칩으로부터 재생 용액을 흡인하고, 세척 완충액 50 마이크로리터를 적용한다. 칩에서 용액을 흡인하고 이것을 다섯 번 반복하십시오.

세척 버퍼의 마지막 방울을 칩에 두십시오. 그런 다음 계속 버튼을 누르고 소프트웨어 디스플레이에서 세척 단계 지속 시간이 완료 될 때까지 30 초 동안 기다리십시오. 사용된 각 분석물 농도에 대해 단계를 반복합니다.

교정, 분석물 결합, 해리, 재생 및 세척의 다섯 단계는 한 사이클을 구성합니다. 실험이 끝날 때 자동화된 분석 소프트웨어에서 분석 단추를 누릅니다. 모든 실험 포인트가 포함된 표시 창이 나타납니다.

규정된 프로토콜에 사용된 분석물 농도가 올바른지 확인하십시오. 분석 실행 단추를 눌러 KD 값을 자동으로 생성합니다. 이 소프트웨어는 평형에서의 해리 상수가 계산되는 해당 I-반응에 대해 분석물 농도를 플로팅하여 언덕 적합 플롯을 생성합니다.

표적 단백질 Hsp90을 칩에 고정화시키고, 첫 번째 실험을 위해, 25 나노몰 내지 5, 000 나노몰에 이르는 분석물 단백질 Cdc37을 10 농도로 제조하였다. 실험 하나에서 생성 된 데이터 파일이 여기에 표시되었습니다. 실시간으로 모니터링되는 실험 데이터가 여기에 표시됩니다.

Y축은 바이오센서 유닛의 I-응답에 해당하고, X축은 실험에서 분석물질의 상이한 시점 및 농도에 대응한다. 여기에 표시된 그래픽 이미지는 자동화된 분석 소프트웨어에서 생성된 언덕 적합 플롯을 나타냅니다. Y축은 바이오센서 유닛의 I-응답에 해당하고, X축은 실험에서 다른 분석물 농도에 대응한다.

여기에 표시된 그래픽 이미지는 통계 분석 소프트웨어를 사용하여 생성된 연관 플롯을 나타냅니다. Y축은 연관 단계의 끝에서 I-응답에 대응하고, X축은 분석물 Cdc37의 상이한 농도에 대응한다. 실험 2에서, 0.4 나노몰 내지 200 나노몰 범위의 상이한 농도 세트가 사용되었고, 생성된 데이터 파일이 여기에 도시되어 있다.

그래픽 이미지는 Hsp90 및 Cdc37 상호 작용의 ITC 서모그램을 나타냅니다. 여기에 표시된 것은 298.15 켈빈에서 Hsp90에 Cdc37의 연속 주입으로 인해 얻은 상응하는 열 진화 곡선입니다. 여기서 사용되는 차동 전력은 시간의 함수입니다.

이 그림의 통합 데이터 포인트는 Hsp90 대 Cdc37의 Mueller 비율 대비 해당 정규화된 열을 지정합니다. 여기에 사용 된 개방 피펫팅 접근법은 사용자가 손으로 피펫팅의 기본 숙달을 필요로하므로 팁으로 바이오 센서를 만지지 않도록해야합니다. 스텝 타이밍의 재현성은 전적으로 사용자에 따라 달라집니다.

연구원이 두 생체 분자 간의 상호 작용을 특성화하면 FEB 시스템을 사용하여 특정 생체 분자 상호 작용을 목표로하는 잠재적 인 억제제 또는 조절제를 설계하여 스크리닝 실험을 수행 할 수 있습니다. 이 절차는 단백질 간의 알려진 새로운 상호 작용뿐만 아니라 약물 및 펩타이드를 포함한 소분자를 식별, 검증 및 정량화하는 데 사용할 수 있습니다.