질량 분광법에 앞서 강력한 프로테옴 정제를 위한 유기 용매 기반 단백질 침전

이러한 프로토콜은 용매 기반 침전을 통해 단백질의 순도와 회수를 최대화하도록 설계되었습니다. 바이알에서 침전을 수행하는 몇 가지 트릭과 스핀 카트리지 형식의 반자동 접근 방식을 보여 드리겠습니다. 또한 강수량 프로토콜을 일관되고 빠르게 최적화했습니다.

전체 프로토콜은 몇 분 밖에 걸리지 않습니다. 이러한 프로토콜은 단백질의 용매 침전이 질량분석법에 앞서 시료 전처리에 이상적임을 보여줍니다. 프로토콜은 상향식 및 하향식 프로 워크플로에 원활하게 맞습니다.

오늘 우리를 위해 시연하는 것은 Ziheng Dang과 빅토리아 밀러, 노바 스코샤 핼리팩스에있는 Proteoform Scientific의 수석 과학자입니다 90 마이크로 리터의 미립자가없는 단백질 용액을 폴리 프로필렌 마이크로 원심 분리기 튜브에 넣습니다. 그런 다음 10마이크로리터의 1몰 염화나트륨 수용액과 400마이크로리터의 아세톤을 샘플 용액에 넣고 바이알을 덮고 가볍게 두드려 용매를 결합합니다. 바이알이 그것을 배양하도록하십시오.

인큐베이션 후 최소 2분 동안 방해받지 않고 실온에서 바이알의 방향에 주목하는 샘플을 원심분리하고 실온에서 10, 000 RCF 이상에서 최소 2분 동안 스핀합니다. 원심 분리 후, 튜브의 바닥에서 눈에 보이는 흰색 펠릿이 관찰된다. 이 시점에서 튜브의 뚜껑을 풀고 튜브를 뒤집어 폐기물 용기에 상류품을 기울입니다.

종이 타월을 사용하여 바이알에서 잔류 용매를 추출하십시오. 샘플을 포함하는 SDS의 경우. 펠릿을 방해하지 않고 400 마이크로 리터의 신선한 아세톤을 조심스럽게 분배하십시오.

즉시 샘플을 실온에서 10, 000배 G 이상에서 1분간 원심융합하여 바이알을 초기 스핀과 동일한 방향으로 로터에 넣는다. 앞에서 설명한 대로 세척 용매를 계수합니다. 약 1분 동안 뚜껑을 열고 샘플을 건조시킵니다.

흄 후드에서, 펠릿 가용화 전에. 100 마이크로 리터의 단백질 용액을 폴리 프로필렌 바이알에 분배합니다. 흄 후드에 400 마이크로 리터의 메탄올과 100 마이크로 리터의 클로로포름을 첨가하십시오.

바이알과 와류를 잠시 뚜껑을 닫아 혼합합니다. 300 마이크로 리터의 물을 바이알 중앙에 직접 신속하게 분배하십시오. 바이알을 덮고 1 분 동안 방해받지 않고 벤치 상단에 앉히고, 폴리 프로필렌 바이알을 원심 분리기에 넣고 실온에서 10, 000 배 G 이상에서 5 분 동안 회전시킵니다.

바이알은 대략 45도에서 바이알까지 두 개의 용매 층과 가시적인 백색 펠릿을 갖는 것으로 관찰된다. 초기에 큰 1 밀리리터 마이크로 피펫 팁을 사용하여 균일 한 속도로 상층에서 약 700 마이크로 리터의 용매를 제거하고 나중에 바이알에서 비드를 형성 할 때까지 200 마이크로 리터 피펫 팁을 사용합니다. 400 마이크로리터의 신선한 메탄올을 바이알의 측면 아래로 용매를 분주하여 펠릿을 방해하지 않고 샘플 바이알에 추가합니다.

바이알을 덮고 바이알을 부드럽게 흔들어 용매를 함께 소용돌이치게 하여 용매층을 결합합니다. 백색 단백질 펠렛을 관찰하기 위해 로터 원심분리기에서 바이알의 배향을 관찰하기 위해 실온에서 10, 000배 G 또는 그 이상에서 최소 10분 동안 관찰하였다. 펠릿이 아래를 향하도록 바이알의 각도를 맞춥니다.

바이알의 상단 가장자리를 따라 피펫 팁을 놓고 느리지만 균일한 속도로 1밀리리터 마이크로 피펫 팁으로 상층액을 제거합니다. 약 20 마이크로 리터의 용매를 유지합니다. 흄 후드에서 잔류 용매를 건조시키십시오.

단백질을 침전시킨다. 일회용 여과 카트리지를 사용하여 플러그를 상단 여과 카트리지에 연결합니다. 90 마이크로 리터의 단백질 용액 10 마이크로 리터의 1 몰 아쿠아, 염화나트륨 및 400 마이크로 리터의 아세톤을 결합하십시오.

벤치 상단에서 최소 2분 동안 배양하고, 준비된 단백질 샘플을 여과 카트리지에 플러그가 부착된 상태로 실온에서 2, 500배 2분 동안 원심분리 G.At 하고, 카트리지를 뒤집고 나사를 풀고 카트리지 베이스에서 플러그를 제거합니다. 여과 카트리지를 깨끗한 바이알에 넣고 실온에서 500회 G에서 3분 동안 단백질 샘플을 원심분리한다. 하부 바이알로부터 용매를 통한 유동을 버린다.

여과 카트리지에 400 마이크로리터의 아세톤을 첨가하여 단백질 펠릿을 세척하고, 실온에서 또는 상부 카트리지에 용매가 남아 있지 않을 때까지 500회 G에서 3분 동안 원심분리한다. 이전에 입증 된 단백질 침전 프로토콜을 따릅니다. 단백질 펠렛의 재가용화를 위한 재가용화 프로토콜을 진행하기 직전에 2 내지 5마이크로리터의 ISO 프로판올을 멤브레인에 직접 분주하여 여과 카트리지의 베이스에 멤브레인을 적셔 단백질을 재가용화하여 물에 포름산의 80% 부피 용액을 준비합니다.

이 산성 용액을 섭씨 영하 20도에서 미리 냉각하고 침전된 단백질이 포함된 여과 카트리지를 미리 냉각합니다. 50 마이크로 리터의 차갑게 희석 된 포름산을 냉각 된 카트리지 캡에 분배하고 30 초 동안 와동시킵니다. 여과 카트리지를 섭씨 영하 20도의 냉동실에 10분 동안 다시 넣습니다.

이전 와류 및 배양 단계를 반복하십시오. 500 마이크로 리터의 최종 부피에 450 마이크로 리터의 물을 첨가하십시오. 포름산을 8%로 희석하여 카트리지를 뒤집어 나사를 풀고 카트리지 베이스에서 플러그를 제거하고 SPE 카트리지를 바이알에 부착합니다.

실온에서 800회 G.용매가 상부 카트리지에 남아 있으면 카트리지를 원심분리기로 되돌리고 스핀을 반복하여 실온에서 5분 동안 SPE 카트리지를 통해 단백질을 회전시킵니다. SPE 카트리지에 물에 0.1 %의 TFA가있는 300 마이크로 리터의 5 % 아세토 니트릴을 첨가하여 헹구고 2000 회 G.For 저 분자량 단백질 또는 소화 된 펩타이드의 경우 300 마이크로 리터를 흘려 샘플을 용리시킵니다. 2, 500 배 G.For 손상되지 않은 단백질의 경우 5 분 동안 0.1 %의 TFA를 함유 한 50 % 아세토 니트릴.

300 마이크로 리터의 75 % 아세토 니트릴과 0.1 % 트리 플루오로 고행산을 사용하여 추가 파악 단계를 추적하십시오. 두 개의 결과 추출을 결합합니다. 이 그림은 바이알 기반 또는 일회용 필터 카트리지에서 단백질 침전 후 SDS 고갈을 비교합니다.

종래의 급속 및 CMW 프로토콜과 함께 아세톤을 사용합니다. 모든 접근법은 최적의 질량 분석 분석을 허용하기 위해 SDS를 줄입니다. 이 그림은 처리된 효모 총 세포 용해물의 SDS 페이지 분석을 통해 빠른 아세톤 침전 및 CMW 침전에 따른 정량적 단백질 회수를 보여줍니다.

모든 침전 프로토콜에서 일관된 회복이 얻어졌다. 일회용 여과 카트리지에 침전되므로 응집된 단백질을 멤브레인 필터 위에 유지하면서 상청액이 포함된 SDS를 조심스럽게 피펫팅할 필요가 없습니다. 따라서 3개의 독립적인 반복실험에 걸쳐 상청액 분획에서 가시적인 밴드가 검출되지 않았습니다.

카트리지 기반 단백질 침전은 바이알 기반 침전에 비해 소 혈장의 펩신 소화 샘플의 우수한 회수율을 보여줍니다. 수율의 더 중요한 차이는 염화나트륨을 사용하는 반면 아연 용매를 사용하면 가장 높은 수율을 얻을 때 카트리지에서 나타납니다. 이 수치는 일회용 필터 카트리지에서 처리된 샘플에 대해 더 높은 펩타이드 풍부도를 반영하는 1보다 높은 비율로 각 펩타이드 샘플의 펩타이드 피크 강도를 정량화합니다.

이 그림은 세 가지 반복 샘플 준비에서 단백질당 확인된 펩타이드의 수를 비교합니다. 이 그래프에서 0.94에서 0.95까지의 상관 계수는 상향식 질량 분석을위한 샘플 준비 접근법의 높은 일관성을 보여줍니다. 따라서 일단 펠릿이 형성되면 방해를 피하고 싶습니다.

손상되지 않은 펠릿으로 보관하면 더 높은 수율을 얻을 수 있습니다. 따라서 추가 아세톤으로 펠릿을 씻는 것을 잊지 마십시오. 이것은 우리가 샘플을 가능한 한 깨끗하게 유지하는 SDS를 제거하고 최상의 질량 분석 분석을 제공한다는 것을 보장합니다.

그래서 우리는 샘플을 피펫팅하는 것보다 반전시켜 과도한 용매를 제거하는 것이 훨씬 간단하다는 것을 발견했습니다. 이렇게 하면 보다 일관된 수익률을 얻을 수 있습니다. 실온에서 아세톤 침전을 수행하면 냉동실에서 전통적인 침전보다 더 일관되고 빠른 회수가 가능합니다.