Name: 초파리 광수용체에서 광안료 수준을 측정하기 위한 전기생리학적 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-02T12:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: 배우세요 Drosophila 광수용체의 전기생리학적 특성 분석 방법을 통한 시각 돌연변이 유전자 스크리닝 기술입니다. 이 프로토콜은 광전도 단백질의 미세한 변화를 감지하여 새로운 시각 메커니즘을 발견할 수 있습니다.

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이 연구는 이스라엘 과학 재단 (ISF)과 미국 - 이스라엘 이중 국가 과학 재단 (BSF)의 보조금으로 지원되었습니다. 왁스 필라멘트 히터 건설에 대해 Anatoly Shapochnikov 씨에게 감사드립니다.

1. 일렉트로레티노그램을 사용하여 강도 반응 관계, 장기간의 탈분극 후전위(PDA) 및 초기 수용체 전위(ERP) 측정
<ol><li>D. 멜라노가스터 준비에 적합한 양육 조건<ol>
<li>D. melanogaster 는 24 °C의 온도와 12 시간의 어두운/밝은 주기로 유지되는 인큐베이터에서 음식이 들어있는 표준 노란색 옥수수가 들어있는 병에서 날아갑니다.</li>
		<li>실험 전에 적어도 24 시간 전에 비행 병을 어둠 속에 보관하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>일반 설정<ol>
<li>1mm x 0.58mm(O.D x I.D) 섬유로 채워진 보로실리케이트 유리 모세혈관을 잡아당겨 기록 피펫을 준비합니다(그림 6L, O). 피펫의 저항은 5-10 MΩ이어야합니다. 임의의 적합한 풀러가 사용될 수 있다.</li>
		<li>두 개의 은선을AgCl2로 코팅하고 맞춤형 5V 전원 공급 장치에 연결된 3M KCl 솔루션에 0.25mm 은선을 삽입합니다.</li>
		<li>코팅된 각 은선을 전극 홀더에 삽입합니다(그림 6N).</li>
		<li>길쭉한 팁 주사기를 사용하여 여과된 링거 용액( 표 1 참조)으로 유리 모세관을 채웁니다(그림 6M).</li>
		<li>와이어 전극을 유리 모세관에 삽입합니다. 모세관 내의 용액이 은선과 접촉하고 있는지 확인하십시오.</li>
		<li>전극 홀더(그림 7P, N)를 두 개의 전극 미세 조작기에 삽입합니다(그림 7G).</li>
	</ol></li>
	<li>전기 기록을 위해 파리를 준비하는 절차 참고: 파리를 어두운 조건에서 유지하려면 다음 단계 중에 희미한 빨간색 조명 조명만 사용하십시오.<ol>
<li>플라이 슬리퍼 시스템(그림 6A, B)을 사용하여CO2 가스로 병에 있는 파리를 마취시키고 침목 용기에 부어 넣습니다.</li>
		<li>하나의 파리를 선택하고 날카로운 트위저를 사용하여 조심스럽게 날개로 잡으십시오. 나머지 파리를 페트리 접시로 덮으십시오.</li>
		<li>플라이 홀더에 플라이를 적절한 방향으로 놓고 등을 손을 향해 눕히십시오(그림 6P).</li>
		<li>납땜 인두의 전원 공급 장치를 켭니다. 전류를 ~2.25A로 설정합니다. 이 전류는 0.25mm 백금-이리듐 필라멘트를 ~55-56°C로 가열해야 합니다( 보충 파일 참조).</li>
		<li>납땜 인두에 낮은 용융 온도(~55-56°C)의 왁스 한 방울을 놓습니다(그림 6F).</li>
		<li>핀셋을 사용하여 날개에서 플라이를 들어 올리고 납땜 인두를 사용하여 날개를 플라이 홀더(그림 6I)에 고정합니다.</li>
		<li>납땜 인두를 사용하여 왁스로 플라이의 뒷면을 스탠드 표면에 연결합니다(그림 6P).</li>
		<li>납땜 인두의 끝을 다리의 결합 지점으로 내리고 왁스를 녹여 모든 다리를 함께 덮습니다(그림 6P).</li>
		<li>목 부위의 머리와 등 사이에 작은 왁스 한 방울을 놓습니다(그림 6P). 참고 : 비행 헤드가 과열되지 않도록 특별한주의를 기울이십시오. 파리가 제대로 고정되어 있고 실험 중에 움직일 수 없는지 확인하십시오. 사소한 움직임으로 인해 녹음에 아티팩트가 생성될 수 있습니다. 흉부와 복부의 기관 개구부 (호흡 입구)가 왁스로 덮여 있지 않은지 확인하십시오.</li>
		<li>플라이 홀더(그림 7Q)를 자석 블록(그림 7I)의 어두운 패러데이 케이지에 놓고 플라이가 도광체 끝에서 ~5mm가 되도록 합니다(그림 7L).</li>
		<li>마이크로 조작기를 사용하여 기록 전극(그림 7P)을 파리의 눈 위에 놓고 접지 전극(그림 7N)을 파리의 위쪽 뒤쪽 위에 놓습니다.</li>
		<li>미세 조작기를 사용하여 접지 전극을 플라이 뒤쪽에 삽입하십시오.</li>
		<li>기록 전극을 파리의 눈의 외부 주변부에 삽입하고, 바람직하게는 미세 조작기를 사용한다. 참고 : 전극을 눈에 삽입 한 후 작은 보조개가 관찰됩니다. 딤플이 사라질 때까지 눈에서 전극을 제거하지 않고 전극을 위쪽으로 당깁니다. 전극은 또한 몸통과 눈에 적용된 전극 젤리의 작은 물방울에 침지될 수 있다.</li>
	</ol></li>
	<li>강도-응답 프로토콜<ol>
<li>주황색 필터(590 에지 필터)를 고압 제논 램프 앞에 놓습니다. 중성 밀도(ND) 필터를 감쇠시키는 큰(여섯 차수의 크기) 필터를 사용합니다.</li>
		<li>어둠 속에서 60 초를 기다렸다가 5 초의 가벼운 펄스를주십시오.</li>
		<li>ND 필터를 한 단계 씩 씩 감쇠가 덜 감쇠되는 ND 필터로 교체합니다.</li>
		<li>어둠 속에서 60 초를 기다렸다가 두 번째 5 초 빛 펄스를주십시오.</li>
		<li>1.4.1.-1.4.4단계를 반복하여 덜 감쇠하는 ND 필터를 사용하여 점차적으로 광도를 높입니다(ND 필터 없이 마지막 펄스를 생성해야 함). 일련의 ND 필터를 큰 감쇠에서 시작하여 낮은 감쇠에 도달하여 적절한 방향으로 사용하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>PDA 프로토콜 (이 프로토콜은 흰 눈동자 파리에서만 수행 할 수 있음)<ol>
<li>주황색 필터 (최대 광안료를 R 상태로 변환하기 위해 590 에지 필터)를 사용하여 최대 강도의 5 초 광 펄스를 제공하십시오.</li>
		<li>주황색 필터를 광대역 청색(BP450/40nm) 필터로 교체하고 최대 강도에서 세 개의 5s 광 펄스를 제공합니다. 참고: 정상 상태 전압 응답에 도달할 때까지 긴 연속 최대 강도 청색광 펄스를 제공할 수도 있습니다.</li>
		<li>어둠 속에서 60초 동안 기다렸다가 파란색 필터를 이전 주황색 필터로 교체한 다음 60초 간격으로 두 개의 5초 빛 펄스를 제공합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>M의 광평형 스펙트럼을 측정하기위한 ERP / M 전위 프로토콜 (이 프로토콜은 흰 눈의 파리10,25에서만 수행 할 수 있음)<ol>
<li>정상 상태 전압 응답에 도달할 때까지 연속 청색(대역통과(BP) 450/40nm) 광 펄스를 주고, 이는 최대 광안료를 R 상태에서 R1-6 셀의 M 상태로 변환시킨다.</li>
		<li>좁은 (~ 20nm) 대역 통과 필터를 사용하여 350-700 nm 사이의 파장 (R1-6 세포 광안료의 알려진 흡수 스펙트럼)의 간략한 (<3ms) 강렬한 광 플래시를 제공하고 M 전위 반응의 M1 단계의 피크 진폭을 측정합니다 (이는 광평형10,25에서이 특정 파장에서의 메타 로돕신 흡수를 반영합니다). 참고: 광안료 분자의 큰 풀을 동기적으로 활성화하려면 광자 함량이 짧은 시간 내에 포장될 수 있도록 짧고 강렬한 빛의 플래시가 필요합니다. M 전위는 두 가지 성분으로 구성됩니다 : 광수용체에서 메타 로돕신의 전하 변위를 반영하는 M1 (각막 음성 상)과 라미나9,10,11에서 광수용체의 증폭 된 M1 반응을 반영하는 M2 (각막 양성 상 11,33) . 이들 성분들 각각은 식별되고 측정될 수 있다. 그러나, M1 전위는 M 레벨의 직접적인 선형 발현이기 때문에 측정하는 것이 바람직하다. M2를 사용하는 경우 온화한 카로티노이드 박탈24,25를 사용하여 진폭이 선형 범위에 있는지 확인하십시오.</li>
		<li>연속 청색(BP450/40nm) 광 펄스를 다시 주고 다른 파장의 짧은(<1ms) 강렬한 광 플래시를 제공합니다.</li>
		<li>사진 평형에서 M의 전체 흡수 스펙트럼이 커버 될 때까지이 프로토콜을 반복하십시오.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 전체 셀 전압 클램프 기록을 사용하여 R의 작용 스펙트럼과 R1-6 셀의 M 상태를 측정하기위한 ERC 프로토콜
참고: 전체 셀 전압 클램프 레코딩을 사용하기 위한 자세한 프로토콜은 Katz et al.34를 참조하십시오. M-포텐셜은 ERG를 사용하여 M 상태의 활성화를 측정하는데, 이는 R 상태의 기여가 막 커패시턴스에 의해 억제되기 때문이다. 대조적으로, ERC는 전압 클램프 기록이 멤브레인 커패시턴스의 효과를 제거하기 때문에 R (포지티브 ERC) 및 M (네거티브 ERC) 상태의 활성화를 측정합니다 (소개 참조).
<ol><li>광안료를 원하는 상태(R 또는 M)로 변환합니다. R에서 M으로 변환하려면 먼저 짧은 (<1ms) 적응 형 파란색 (BP450 / 40nm) 플래시로 파리를 조정하십시오. M에서 R로 변환하려면 짧은 적응형 주황색(OG590 에지 필터) 플래시를 제공합니다.</li>
	<li>350-700nm 사이의 파장의 짧은 광 플래시(<1ms)를 제공하고 이 특정 파장에서 M/R 흡수를 반영하는 ERC 응답의 최대 음의 또는 포지티브 진폭을 측정합니다. 참고: 광안료 분자의 큰 풀을 동기적으로 활성화하기 위해서는 짧은 시간 내에 광자 함량을 포장하기 위해 짧고 강렬한 빛의 섬광이 필요합니다. 청색 플래시에 의한 R에서 M으로의 최대 광안료 변환은 R 및 M의 흡수 스펙트럼에서 겹치기 때문에 전체 광안료 분자의 ~ 80%에 도달할 수 있다(그림 3A). 따라서 ~ 550nm 이하의 파장에서 ERC는 메타 로돕신의 반응을 반영하는 음성 상과 나머지 로돕신의 반응을 반영하는 양성 단계의 두 가지 구성 요소를 가지고 있습니다. ERC는 광도에 선형적으로 의존합니다(그림 5D). 따라서, R 및 M 상태의 스펙트럼 감도를 도출하기 위해, ERC의 각 위상은 동일한 에너지(29)에 대해 다양한 파장에서 정규화될 필요가 있다.</li>
	<li>2.1.-2.2단계를 반복합니다. 다른 파장의 플래시를 사용합니다.</li>
	<li>정규화된 포지티브 및 네거티브 ERC를 파장의 함수로 플로팅한다. 참고: 빛의 강한 섬광은 빛에 민감한 채널을 통해 엄청난 전류를 유도하여 광수용체에 대사 스트레스를 유발하며, 이는 차례로 빛에 독립적인 채널 개방을 일으킨다. ERC는 이 구성 전류에 겹쳐집니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.

초파리 광수용체 제제를 사용하는 가장 큰 장점은 접근성, 광 자극의 용이성 및 정확성, 그리고 가장 중요한 것은 분자 유전학의 힘을 적용 할 수있는 능력입니다 7. 광범위한 유전 연구는 초파리를 복잡한 생물학적 과정의 유전 적 해부를위한 매우 유용한 모델 시스템으로 확립했습니다7. 초파리 게놈의 비교적 간단한 구조 (X 및 Y 성 염색체, 2 개의 큰 상염색체 요소, 염색체 2 및 3 및 작은 점 네 번째 염색체를 포함한 4 개의 염색체로 구성됨), 성장의 용이성 및 빠른 생성 시간 (24 °C에서 ~ 2 주)은 Drosophila를 돌연변이 생성 된 개별 파리의 방대한 수의 스크리닝에 적합하게 만듭니다. 더욱이, 임의의 단리된 돌연변이의 분리 및 유지는 천연 염색체와의 재조합을 방지하는 우세한 마커 및 다중 역전을 포함하는 밸런서 염색체의 생성으로 인해 가능해진다. 이용 가능한 ...

G-단백질 결합 수용체(GPCR)인 광활성화 로돕신(R)은 7개의 막횡단 단백질(opsin)과 발색단으로 구성된다. 초파리 멜라노가스터(fruit fly)에서, 광자 흡수는 11-시스-3-OH-망막 발색단의 모든 트랜스-3-OH-망막1에 대한 이성체화를 유도하여, 로돕신의 메타로돕신으로의 형태적 변화를 촉진한다(M, 도 1A). 척추동물 로돕신과는 달리, 무척추동물 발색단의 우세한 분획은 옵신으로부터 해리되지 않으며, 생리활성 암-안정한 색소 상태 M을 초래한다. 차례로, 모든 트랜스-3-OH-망막 발색단에 의한 추가적인 광자 흡수는 발색단2,3의 이성체화를 유도하여, 11-시스-3-OH-망막 발색단과 함께 R 안료 상태를 생성한다. R 상태는 어둡고, 안정하고, 생리학적으로 비활성 광안료이다. 척추동물 광색소와 마찬가지로 발색단4의 매우 빠른 광자 재생 경로 외에도, 발색단 재생을 위한 대안적인 효소적 느린 경로가 무척추동물에 존재하며, 이 경로에서 일부 단계는 광수용체 세포(5,6)를 둘러싸고 있는 망막 세포에서 수행된다.
초파리는 무척추 동물 광수용체를 연구하기위한 모델 유기체로서 큰 이점을 수반합니다. 특히, 제제의 접근성과 분자 유전학을 적용 할 수있는 능력은 초파리를 강력한 모델 시스템7로 만들었습니다. 따라서, 일반적으로 광형질도입 및 광안료 수준을 연구하기 위한 몇 가지 생체내 및 생체외 실험 방법, 특히 확립되었다. 가장 간단한 생체 내 방법은 초파리 눈의 빛에 대한 상대적으로 큰 세포 외 기록 된 전압 반응을 이용합니다. 따라서, 광 자극은 척추동물 눈의 빛에 대한 ERG 반응보다 ∼3배 더 큰 세포외 전기망막(ERG) 기록을 사용하여 측정될 수 있는 전체 눈에서 전기 전압 반응을 불러일으킨다(8,9). 초파리 ERG 반응은 견고하고 쉽게 얻을 수 있으므로 돌연변이로 인한 광 반응의 이상을 확인하는 편리한 방법입니다. 빛에 대한 ERG 반응은 주로 광수용체, 색소 (glia) 세포 및 라미나의 이차 뉴런에서 발생합니다 (그림 1B 참조). ERG의 주요 구성 요소는 (i) 광수용체의 세포외 전압 반응, (ii) 라미나 뉴런으로부터 발생하는 광 자극의 시작과 끝에서의 "on" 및 "off" 과도 상태 (도 2A, inset, ON, OFF), (iii) 신경교세포의 느린 반응 (도 2A, inset, arrows), 및 (iv) 짧고 일시적인 반응이고, ON 과도 상태10보다 앞선 광안료 활성화 동안의 전하 변위로 인한 결과(도 2C[inset], D, E). 이 짧은 반응은 2 단계 (M1 및 M2, 그림 2C [inset])로 구성되며 수백만 개의 광안료 분자를 동시에 활성화시키는 매우 강한 광 자극에 의해서만 유도 될 수 있습니다. 청색 자극 (그림 2D, 청색 흔적) 또는 광색소 수준이 고도로 감소 된 돌연변이 (그림 2E, 적색 흔적)에서는 관찰되지 않지만 PLC 활성을 폐지하는 돌연변이에서 진폭이 약간 향상됩니다 (그림 2E, 주황색 흔적). M1 상은 광수용체에서 M의 활성화로부터 발생하는 파리의 전형적인 ERP이다. 긍정적 인 극성 (세포 내)을 갖는 M1 단계는 신호 반전 시냅스에서 정상적인 방식으로 신경 전달 물질을 방출하고 시냅스 적으로 증폭 된 M2 상을 생성하여 광수용체 탈분극에 반응하는 라미나 뉴런을 활성화시킵니다. 따라서, M1 및 M2 상 모두 M 활성화(10,11)를 반영한다.
광수용체의 탈분극은 각막 양성 "온" 과도기를 생성하며, 이는 라미나10,11의 광수용체 축색돌기와 단극성 뉴런 사이의 부호 반전 시냅스로부터 발생한다(도 1B). ERG의 느린 상승 및 붕괴는 주로 일시적인 수용체 전위 (TRP) 및 TRP 유사 (TRPL) 채널 13,14,15를 통한 광수용체 세포 (12)로부터의 K+ 유출로 인해 색소 세포의 탈분극 (도 2A, 인셋, 화살표)으로부터 발생한다. 이러한 느린 운동 성분은 광(9,10)에 대한 광수용체 반응의 세포내 또는 전체 세포 기록과 비교할 때 광수용체 반응의 파형을 크게 가릴 수 있고 왜곡시킨다. 또한, 매우 강한 조명에서, "온" 과도 상태와 선행하고 부분적으로 융합되는 추가적인 과도 응답이 관찰될 수 있다(그림 2C [inset],D,E). 이 신호는 광안료(10)의 거대한 활성화로부터 직접 기인한다.
중성 밀도 (ND) 및 컬러 필터뿐만 아니라 강력한 조명 플래시를 사용하는 여러 광 정권 프로토콜이 일반적으로 눈과 특히 광전달 캐스케이드를 조사하기 위해 개발되었습니다. 이들 프로토콜은 또한 광안료의 특성을 조사하기 위해 사용되었다.
강도-응답 프로토콜은 증가하는 광도에 대해 전체 눈의 ERG 전압 응답의 피크 진폭을 측정합니다(그림 2A,B). 이 프로토콜은 광수용체 9에대한 광수용체 세포의 민감도의 변화를 검출하는데 도움을 준다.
장기간의 탈분극 후전위(PDA) 프로토콜은 로돕신과 메타로돕신의 흡수 스펙트럼의 차이를 이용하여, 초파리에서 R의 광안료를 생리활성이고 암-안정한 중간체 M 상태2로 대량으로 전환시킬 수 있게 한다. ERG 전압 응답에서, 포화 광의 비교적 짧은 펄스가 주어지고, 그 결과 전압 응답이 기록된다. 이러한 조건 하에서, 천장(반전 전위)은 엄청난 양의 로돕신 분자(~1 x 10,8)의 퍼센트의 분율의 활성화가 천장에 도달하기에 충분하기 때문에 탈분극 신호에 의해 도달된다. 광전달 성분이 매우 풍부하게 존재하면 광전달 성분의 농도가 크게 감소하거나 미묘한 오작동이있는 돌연변이에서도 천장에 도달 할 수 있습니다. 이 상황은 이러한 돌연변이체의 분리를 배제한다. Pak et al.은 시각 돌연변이체를 분리하기 위한 신뢰성 있고 공개적인 시험을 추구하는 PDA 스크리닝7을 도입하였다. 초파리에서, PDA 반응은 광안료 전환을 허용하는 적색 스크리닝 안료를 유전적으로 제거하고, 로돕신에 의해 우선적으로 흡수되는 청색광의 적용에 의해 야기되고(도 3A), 따라서, R을 M 광안료 상태로 큰 순 전환을 초래한다. 광전달 종결은 R에서 M으로의 큰 순 변환에 의해 광안료의 수준에서 붕괴되고, 이는 차례로 광이 꺼진 후 오랫동안 지속적인 여기를 초래한다 (도 2C, 도 4A [상단]). PDA 기간 동안, 광수용체는 후속 테스트 라이트에 덜 민감하고 부분적으로 탈감작된다(불활성화). PDA는 로돕신 생물발생의 사소한 결함까지도 검출하고 장기간 흥분을 유지하기 위해 광수용체 세포의 최대 용량을 시험한다. 그것은 엄격하게 로돕신의 고농도의 존재에 의존하기 때문에, 그것은 쉽게 광전달 성분의 부족 보충에 대한 점수. 놀랍게도, PDA 스크린은 많은 새롭고 매우 중요한 시각적 돌연변이체를 산출하였다 (Pak et al.7에서 검토됨). 따라서, Pak et al.7에 의해 단리된 PDA 돌연변이체는 초파리 시각 시스템을 분석하는데 여전히 매우 유용하다.
PDA는 청색광을 포화시킴으로써 초파리에서 유도되어, 광 오프셋 후 오랫동안 지속적인 탈분극을 초래한다(그림 4A [상단]). PDA 유도 청색광을 포화시킨 후, 주변 광수용체(R1-6)는 최대 용량으로 어둠 속에서 지속적으로 활성 상태를 유지하여 포화에 도달한다. PDA 동안 추가적인 포화 청색광은 수초 동안 R1-6 세포에서 어떠한 추가적인 반응도 생성하지 않지만, PDA 상에 중첩되는 R7-8 세포에서 반응을 유도한다. 중첩된 반응은 이들 세포에서 발현된 광안료의 상이한 흡수 스펙트럼에 의해 설명된다(R7-8)16. PDA는 포화 오렌지 빛으로 M을 R로 다시 광변환함으로써 억제될 수 있다(그림 4A [상단]). 강렬한 백색광에 의해 달성 될 수없는 상황 인 광수용체 세포를 최대 활성 용량으로 가져 오는 PDA의 능력은 초파리의 시각적 돌연변이를 스크리닝하는 주요 도구 인 이유를 설명합니다. 이는 정상적인 광색소 수준17,18의 생물발생에 관여하는 단백질의 사소한 결함조차도 검출할 수 있기 때문이다. PDA 결함 돌연변이체의 두 그룹이 단리되었다: 불활성화 또는 사후전위(니나) 돌연변이체 및 불활성화는 아니지만 애프터포텐셜(ina) 돌연변이체는 아니다. 전자의 표현형은 광안료 수준의 큰 감소로부터 발생하는 PDA 및 연관된 불활성화의 결여이다(도 4A[중간]). 후자의 표현형은 정상적인 로돕신 수준을 가진 돌연변이체에서 아직 알려지지 않은 메커니즘으로 인해 불활성화를 나타내지 만 TRP 채널과 상호 작용하는 단백질이 부족하기 때문에 청색광 후 어두운 탈분극을 보이지 않습니다 (그림 4A [하단]).
PDA 는 M 활성19,20,21에 결합하고 종결시키는 레스틴(ARR2)에 비해 광안료의 양의 차이로부터 발생한다(도 1A). 초파리 광수용체에서, 광안료의 양은 ARR219의 양보다 약 5배 더 크다. 따라서, ARR2 수준은 R에서 M으로의 큰 순 광변환에 의해 생성된 모든 M 분자를 불활성화시키기에 불충분하고, 과량의 M이 어둠 속에서 지속적으로 활성화되도록 남겨둔다 17,19,20,22,23. 이 메카니즘은 돌연변이 또는 카로티노이드 박탈24,25에 의한 PDA 반응의 제거를 설명하고, 광안료 수준의 감소를 야기하지만, arrestin 수준에는 영향을 미치지 않는다. 더욱이, 이러한 설명은 또한 널 ARR2 (arr23) 돌연변이 대립유전자21의 표현형을 설명하는데, 여기서 PDA는 ~10배 조광기 청색 광 강도19,20,21에서 달성될 수 있었다(도 4B,C). PDA는 파리 광수용체의 독특한 특징이 아니며, R 상태와 다른 흡수 스펙트럼을 가진 어두운 안정한 M을 갖는 모든 테스트 된 종에서 나타나므로 R에서 M 상태로 광안료의 충분한 광변환이 가능합니다. PDA 현상학이 발견된 철저하게 조사된 종은 바나클(Balanus) 광수용체이며, 여기서 R 상태의 흡수 스펙트럼은 M 상태2보다 더 긴 파장에 있다(도 3B). 따라서, 파리의 상황과는 달리, 바나클에서는 주황색-적색광이 PDA를 유도하고, 청색광은PDA2를 억제한다.
초기 수용체 전위(ERP) 프로토콜은 R 또는 M 활성화 동안 발생하는 전하 변위를 이용한다. 시각 안료는 척추동물 및 무척추동물 막(3) 둘 다의 신호전달 구획의 표면막의 필수적인 부분이다. 따라서, 광안료 분자가 하나의 중간 상태에서 다음 상태로 변하는 활성화 과정은 전하 변위(4,26)를 수반한다. 광안료 분자가 막 커패시턴스(4)와 병렬로 전기적으로 정렬됨에 따라, 급격하게 동기화된 형태 변화는 표면 막의 빠른 분극 변화를 발생시키며, 파리에서는 횡문재라고 불리는 ~30,000-50,000 마이크로빌리의 스택으로 구성된 신호전달 구획에서 발생한다. 이 분극은 세포막이 똑같이 분극 될 때까지 세포체의 막 커패시턴스를 통해 수동적으로 방전됩니다. ERP는 전하 변위의 세포외 기록이다. 세포내 기록된 ERP는 세포막 4,27,28의 시간 상수에 의해 통합된 세포외 ERP를 나타낸다. 시각적 안료 전하 변위에 의해 활성화된 전류는 또한 전체 세포 전압 클램프 기록(29,30)(도 5A-D)에서 측정될 수 있었고, 신호의 동역학에 대한 막 커패시턴스의 영향을 최소화하는 주요 이점(초기 수용체 전류(ERC) 기록에서)을 갖는다.
프로토콜 섹션은 초파리 눈9에서 ERG 측정을 수행하는 방법 및 초파리 분리 옴마티디아31,32로부터의 전체 세포 기록에 의한 ERC 측정을 기술한다. 우리는 또한 일반적으로 광형질도입과 특히 광안료를 조사하는 데 사용되는 특정 프로토콜을 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>길쭉한 팁</td><td></td><td></td>이 있는 1mL 주사기 <td>그림 6M</td></tr><tr><td>1 거친 핀셋</td><td></td><td>Dumont #5, 표준</td><td>0.1mm x 0.06mm, 길이 110mm, Inox(그림 6H)</td></tr><tr><td>2 콘덴서 렌즈</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A/D 컨버터</td><td>Molecular Device</td><td>Digidata 1200</td><td>교체 가능: 분자 장치(예: 1440A)의 모든 digidata -그림 7C</td></tr><tr><td>증폭기</td><td>거의 완벽한 전자 제품 가능한 교체</td><td></td><td>: Warner instruments- IE251A 또는 IE-210 (헤드 스테이지와 함께 제공)- 그림 7D</td></tr><tr><td>진동 방지 표</td><td>Newport</td><td>VW-3036-OPT-01</td><td>그림 7H</td></tr><tr><td>Capillaries</td><td>Harvard Apparatus</td><td>붕규산 유리 모세관</td><td>1 mm x 0.58 mm (그림 6O)</td></tr><tr><td>Clampex</td><td>Molecular Device</td><td></td><td>Software</td></tr><tr><td>CO2 tank</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cold light source</td><td>Schott</td><td>KL1500 LCD</td><td>그림 6C</td></tr><tr><td>섬세한 와이퍼</td><td>Kimtech</td><td></td><td>Kimwipes (그림 6K)</td></tr><tr><td></td><td>모세관 O.D.에 적합한</td> 전극 홀더 <td></td><td></td> 1mm (그림 6N, 그림 7N 및 그림 7P)</tr> <tr><td>패러데이 케이지</td><td>홈 메이드</td><td></td><td>전자기 노이즈 차폐 및 블랙 프론트 커튼 (그림 7K)</td></tr><tr><td>필터 (색상)</td><td>Schott</td><td>OG590, 에지 필터</td><td>Figure 7S</td></tr><tr><td>필터 (색상)</td><td>Schott</td><td>BP450/40 nm</td><td>Figure 7S</td></tr><tr><td>필터(색상)</td><td>블레이저</td><td>550 nm</td><td>Figure 7S</td></tr><tr><td>냉광원용 필터(색상)</td><td>Schott</td><td>RG630</td><td>Figure 6C</td></tr><tr><td>필터 (열)Schott</td><td></td> <td>KG3</td><td>Figure 7S</td></tr><tr><td>필터(Neutral 밀도 필터)</td> <td>Chroma</td><td>6,5,4,3,2,1,0.5,0.3</td><td>그림 7S</td></tr><tr><td>플래시 램프 시스템</td><td>Honeywell</td><td></td><td>그림 7U</td></tr><tr><td>플라이 슬리퍼 시스템 인젝터</td><td>주입 + matic</td><td></td><td>그림 6A-B</td></tr><tr><td>램프 전원 공급 장치</td><td>PTI</td><td>LPS-220</td><td>그림 7W</td></tr><tr><td>광 감지기</td><td>가정용</td><td></td><td>광 트랜지스터 (그림 7O)</td></tr> <tr><td>광 가이드</td><td></td><td></td><td>직경 3mm, 길이 1.3m(그림 7L,M)</td></tr><tr><td>광원</td><td></td><td></td><td>고압 오존이 없는 75W 크세논 램프(50W에서 작동), 교체 가능: Cairn research- OptoLED(그림 7R)</td></tr><tr><td>저온 용융 왁스</td><td>홈 메이드</td><td></td><td>밀랍(Tm&asymp의 혼합물로 구성; 62 &도; C) 및 파라핀을 ~3:1로 하여 ~55&ndash의 용융 온도에 도달합니다. 56 > C (그림 6J)</td></tr> <tr><td>파리용 마그네틱 스탠드</td><td>홈메이드</td><td></td><td>그림 6I 및 그림 7Q</td></tr><tr><td>헤드 스테이지가 있는 미세 전극 프리앰프 시스템</td><td>거의 완벽한 전자 임피던스</td><td></td><td>테스터(그림 7G)</td></tr><tr><td>미세 조작기(기계적 거친)</td><td>Tritech Research, Narishige</td><td>M-2</td><td></td></tr><tr><td>미세 조작기(기계적 미세)</td><td>Leitz Microsystems</td><td>Leitz 기계식 Micromanipulator</td><td>Figure 7F</td></tr><tr><td>pCLAMP</td><td>분자 장치</td><td></td><td>소프트웨어</td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td></td><td></td><td>60mm</td></tr><tr><td>펄스 발생기</td><td>AMPI</td><td>Master 8</td><td>Figure 7A</td></tr><tr><td>Redux 크림 for electrocardiography</td><td>Parker Laboratories</td><td>Redux Electrolyte Cr&egrave; me</td><td></td></tr><tr><td>Shutter driver</td><td>Uniblitz, Vincent Associates</td><td>VCM-D1 단일 채널 Uni-stable</td><td>Figure 7V</td></tr><tr><td>셔터 시스템</td><td>Uniblitz, Vincent Associates</td><td>LS2 2 mm Uni-stable 셔터</td><td>Figure 7V</td></tr><tr><td>Silver Wire</td><td>Warner Instruments</td><td></td><td>0.25&ndash; 직경 1mm, 염소화 필요</td></tr><tr><td>백금-이리듐 필라멘트</td><td></td><td></td>로 구성된 납땜 인두 <td>직경 0.25mm(그림 6F)</td></tr><tr><td>입체 줌 현미경</td><td>Nikon</td><td>SMZ-2B</td><td>그림 6D</td></tr><tr><td>입체 줌 현미경</td><td>Wild</td><td>Wild M5</td><td>6, 12, 25 및 50 배율 설정(그림 7E)</td></tr><tr><td>주사기 필터</td><td>Millex</td><td></td><td>22 &micro; m PVDF 필터</td></tr><tr><td>수직 피펫 풀러</td><td>Sutter/ Narishige</td><td>모델 P-97/PP-830</td><td>원하는 대로 수직 또는 수평 풀러를 사용하십시오(그림 6L)</td></tr><tr><td>왁스 필라멘트 히터</td><td>집에서 만든</td><td></td><td>그림 S1 참조(그림 6E-G)</td></tr><tr><td>크세논 플래시 램프 시스템</td><td>Dr. Rapp OptoElectronic</td><td>JML-C2</td><td>그림 7X</td></tr></tbody></table>

초파리 광수용체에서 광안료 수준을 측정하기 위한 전기생리학적 방법

Electrophysiological Methods for Measuring Photopigment Levels in Drosophila Photoreceptors

초 파리 G-단백질-결합된 광색소 로돕신(등록상표)은 단백질(opsin)과 발색단으로 구성된다. 로돕신의 활성화 과정은 발색단의 광자 흡수 유도 이성체화에 의해 개시되고, 옵신의 형태적 변화를 촉진하고, 두 번째 어두운 안정한 광안료 상태(metarhodopsin, M)를 초래한다. 무작위 돌연변이 유발을 사용하여 이러한 이중안정한 광안료를 조사하려면 돌연변이 파리를 스크리닝하기 위한 간단하고 강력한 방법이 필요하다. 따라서, 기능성 광안료 수준의 감소를 측정하기 위한 몇몇 방법들이 설계되었다. 그러한 방법 중 하나는 광자 흡수 및 광수용체에서 발현되는 엄청난 양의 광안료 분자에 따른 광안료 내의 전하 변위를 이용한다. 초기 수용체 전위(또는 초기 수용체 전류)로 명명된 이 전기 신호는 다양한 전기생리학적 방법(예를 들어, 일렉트로레티노그램 및 전체 세포 기록)에 의해 측정되며, 기능적 광안료 수준에 선형적으로 비례한다. 이 방법의 장점은 높은 신호 대 잡음비, 광안료 수준의 직접 선형 측정, 로돕신 또는 메타로돕신 활성화에 대한 하류의 광전달 메커니즘의 독립성이다. 장기간 탈분극 후전위(PDA)라고 불리는 추가적인 전기생리학적 방법은 초파리 광안료의 이중 안정성과 플라이 R 및 M 안료 상태의 흡수-스펙트럼 차이를 이용한다. PDA는 강렬한 청색광에 의해 유도되어 포화 된 양의 로돕신을 메타 로돕신으로 변환하여 어둠 속에서 오랜 시간 동안 광 반응 종료가 실패하지만 강렬한 오렌지 빛을 사용하여 메타 로돕신에서 로돕신 변환으로 종료 될 수 있습니다. PDA는 방대한 광안료 전환을 필요로 하는 강력한 신호이기 때문에, 광안료의 생물발생에 있어서 작은 결함이라도 비정상적 PDA를 쉽게 검출할 수 있다. 실제로, 결함 있는 PDA 돌연변이체는 광형질도입에 중요한 신규한 신호전달 단백질의 동정을 이끌었다.

도 2는 ERG 기술을 사용하는 견고성 및 용이성을 예시한다. 그것은 간단한 전기 생리학 적 설정을 필요로하는 세포 외 전압 기록의 간단한 기술에 의해 사실상 손상되지 않은 파리에 기록되기 때문에 견고합니다. 견고성은 돌연변이가 광 반응을 강하게 감소시키거나 왜곡하는 경우에도 상대적으로 큰 진폭 (밀리볼트 범위)을 갖는 광 반응의 기록을 얻음으로써 나타납니다. 따라서 경험이 부족한 실험자조차도 매우 간단한 실험 설정을 사용하여 며칠 내에 의미있는 결과를 얻는 방법을 배울 수 있습니다. 광안료 수준을 측정하도록 설계된 기술의 주요 목표는 PDA(그림 2C) 및 ERP(그림 2C-E)의 매우 단순화된 방법에 의해 달성됩니다. 대안, 즉 미세분광광도측정법은 값비싼 광학 장비와 상당한 훈련과 기술이 필요합니다(<str...

우리는 전기생리학적으로 이중 안정한 광안료를 특성화하기 위한 프로토콜을 제시한다: (i) 광자-흡수 및 광수용체에서의 그들의 엄청난 양에 뒤따르는 광안료 분자 내의 전하 변위를 이용하고, (ii) 로돕신과 메타로돕신 광안료 상태의 흡수-스펙트럼 차이를 이용한다. 이들 프로토콜은 이중-안정한 광안료 시스템에 영향을 미치는 돌연변이를 스크리닝하는데 유용하다.

The Drosophila G-protein-coupled photopigment rhodopsin (R) is composed of a protein (opsin) and a chromophore. The activation process of rhodopsin is ...

이 프로토콜은 시각적으로 결함이 있는 초파리 돌연변이체의 유전자 스크리닝에 특히 적합합니다. 이는 초파리 광변환의 작은 이상, 특히 광색소 수준 및 계층 동료 관련 기능에서도 감지할 수 있기 때문입니다. 이 기술은 생체 내에서 심오하며 실행하기 쉽고 매우 견고하여 광변환 단백질 활성의 작은 변화를 감지할 수 있습니다.제 생각에는 생존력을 유지하면서 파리를 고정하는 것이 아마도이 방법의 중요한 부분 일 것입니다. 컴퓨터를 켜고 Clampex 소프트웨어를 엽니다. 앰프와 Master-8 펄스 발생기를 켠 다음 크세논 램프와 셔터 컨트롤러를 켭니다.풀러를 켜고 풀러에 유리 모세관을 놓고 당깁니다. 풀러에서 유리 모세관을 제거합니다. 길쭉한 팁 주사기를 사용하여 여과 된 링거 용액으로 유리 모세관을 채 웁니다.와이어 전극을 유리 모세관에 삽입합니다. 모세관 내의 용액이 은선과 접촉하는지 확인하십시오. 전극 홀더를 두 개의 전극 마이크로 매니퓰레이터에 삽입합니다.납땜 인두의 전원 공급 장치를 켭니다. 전류를 약 2.25암페어로 설정합니다. 이 전류는 0.25mm 백금-이리듐 필라멘트를 섭씨 약 55도에서 56도까지 가열해야 합니다.납땜 인두에 녹는 온도가 낮은 왁스 한 방울을 놓습니다. 병 안의 파리를 마취하십시오. 마취 된 파리를 침목 용기에 붓고 파리 하나를 선택하고 나머지 파리를 페트리 접시로 덮으십시오.날카로운 핀셋을 사용하여 날개로 파리를 조심스럽게 잡고 플라이 홀더에 놓습니다. 플라이 홀더에서 플라이를 옆으로 눕히고 등을 손으로 향하게 합니다. 핀셋을 사용하여 날개에서 파리를 들어 올리고 납땜 인두를 사용하여 날개를 플라이 홀더에 고정하십시오.납땜 인두를 사용하여 왁스로 플라이의 등을 스탠드 표면에 연결합니다. 납땜 인두의 끝을 다리의 연결 지점까지 내린 다음 왁스를 녹여 모든 다리를 함께 덮습니다. 목 부위의 머리와 목 사이에 작은 왁스 방울을 놓습니다.플라이 홀더를 자석 블록의 어두운 패러데이 케이지에 놓고 플라이가 라이트 가이드 끝에서 약 5mm 떨어져 있는지 확인합니다. 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 기록 전극을 파리의 눈 위에 놓고 접지 전극을 파리의 등 위쪽에 놓습니다. 그런 다음 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 접지 전극을 플라이 뒤쪽에 삽입합니다.기록 전극을 파리의 눈의 바깥 둘레에 삽입하는 것이 바람직하며, 마이크로 매니퓰레이터를 사용하는 것이 좋습니다. 패러데이 케이지를 닫고 방의 조명을 꺼서 5 분 동안 어둠에 적응할 수 있도록하십시오. 초당 500미터의 펄스 지속 시간, 60초의 펄스 간격 및 6으로 설정된 펄스 수에서 시작하는 매개변수를 입력합니다.PDA를 측정하려면 Master-8 펄스 발생기를 TRAIN 모드로 설정 한 다음 주황색 필터를 사용하여 최대 강도의 5 초 광 펄스를 제공합니다. 전압 응답을 확인하십시오. 주황색 필터를 광대역 파란색 필터로 교체하고 최대 강도로 3개의 5초 광 펄스를 제공합니다.전압 응답을 확인하십시오. 어둠 속에서 60 초 이상 기다리십시오. 파란색 필터를 이전 주황색 필터로 교체합니다.그런 다음 60 초 간격으로 두 개의 5 초 광 펄스를줍니다. 전압 응답을 확인하십시오. ERP M 전위를 측정하려면 정상 상태 전압 응답에 도달할 때까지 연속 청색광 펄스를 제공합니다.20 나노 미터 대역 통과 필터를 사용하여 350에서 700 나노 미터 사이의 파장의 짧고 강렬한 빛을 제공합니다. 그런 다음 M-전위 응답의 M1 위상의 피크 진폭을 측정하는데, 이는 광평형에서 이 특정 파장에서의 메타로돕신 흡수를 반영합니다. PDA 반응은 상이한 돌연변이 파리에 대해 평가되었다.야생형 파리는 강렬한 청색광 자극 후 장기간의 각막 음성 ERG로 나타난 어둠 속에서 포화 탈분극을 보였다. 다음 청색광은 PDA에 겹쳐진 작은 응답을 생성했으며 켜기 및 끄기 과도 현상이 없었습니다. ninaE와 같은 비정상적인 광 색소 생물 발생을 가진 돌연변이 파리에서 전압 반응은 강렬한 청색광 자극 후 기준선으로 돌아 왔으며 추가 청색광에 대한 반응은 억제되지 않았으며 정상적인 켜기 및 끄기 과도 상태를 보였습니다.파리의 야생형 ERP는 동일한 프로토콜로 얻어 지지만 PDA 중에 강렬한 녹색 플래시가 적용됩니다. 이 녹색 섬광은 ERP를 유도하고 PDA를 억제합니다. M- 전위는 파란색 조명 후 녹색 플래시에 의해 얻어졌지만 야생형 플라이에서 파란색 조명 후 파란색 플래시에 의해 얻어지지 않았습니다.이 프로토콜은 야생형, 광색소 하이포모프 돌연변이 ninaE, 및 정상 광색소 수준 norpA를 갖는 광변환 결핍 돌연변이에서 반복되었습니다. 플라이로돕신 및 메타로돕신의 상대 흡수 스펙트럼은 상이한 스펙트럼 및 광평형 스펙트럼의 측광 측정으로부터 계산되었다. 파리의 생존을 위해서는 과열을 자제하여 왁스 점도에주의를 기울이는 것이 중요합니다.이 절차는 유전 적 및 결함이있는 시각 돌연변이의 스크리닝을 통해 적합합니다. 시각적 돌연변이를 무작위로 분리하고 식별하는 방법은 초파리 광형질도입과 관련된 새로운 단백질 및 메커니즘의 발견을 용이하게 할 수 있습니다. PDA 프로토콜은 중요하고 새로운 시각적 메커니즘의 분리를 가능하게했습니다.참여는 아마도 발견되지 않았거나 그렇지 않으면 예상되지 않았을 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오는 움직이지 못하는 초파리의 눈에서 광수용체 활동의 전기생리학적 기록을 위한 프로토콜을 간략하게 설명하여 광 자극에 대한 반응으로 전압 변화를 정밀하게 측정할 수 있도록 합니다.

빛 자극에 대한 초파리 망막 광수용체의 전압 반응에 대한 전기생리학적 기록

이 비디오는 전체 세포 구성을 설정하여 초파리의 옴마티듐(ommatidium)에 있는 광수용체 뉴런의 전기 활동을 기록하는 방법을 보여줍니다. 이는 광 펄스에 의한 일시적인 수용체 전위 채널의 활성화를 강조하여 측정 가능한 양자 범프를 생성합니다.

Whole-Cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptor(초파리 광수용체의 전체 세포 전압 클램프 기록)

이 비디오는 흰눈초파리에서 장기간의 탈분극 후전위(PDA)를 조사하기 위한 실험 프로토콜을 보여줍니다. 파리의 눈은 강렬한 청색광 펄스에 노출되어 광색소 로돕신을 메타로돕신으로 변환하여 양이온 채널을 열고 막 탈분극을 유발하는 신호 폭포를 시작합니다. 청색광은 메타로돕신이 로돕신으로 재전환되는 것을 막기 때문에 양이온의 지속적인 유입은 장기간의 탈분극 후전위(PDA)로 알려진 지속적인 탈분극을 초래합니다.

초파리 광수용체(Drosophila Photoreceptor)에서 PDA(Prolonged Depolarizing Afterpotential) 조사

출처: Wagner, K. et al., eGFP 태그가 지정된 단백질을 사용하여 초파리 광수용체 세포의 막 단백질 이동을 연구합니다.J. vis. 특급 (2022). 이 동영상은 eGFP 표지된 TRPL 단백질을 사용하여 초파리 광수용체 세포에서 막 단백질 이동을 시각화하는 방법을 보여줍니다. 이미징을 위한 형질전환 파리의 준비, 광수용체 세포의 형광 이미지 캡처, 횡문막에서 상대적 eGFP 형광을 측정하여 TRPL 트래픽의 정량화에 대해 자세히 설명합니다.

Drosophila Photoreceptor Cells의 막 단백질 이동에 대한 연구

세포 내 기록의 전기 생리 기술 시연과 나비의 화합물 눈에 하나의 광 수용체 세포의 스펙트럼 감도를 결정하는 데 사용됩니다.

에서 곤충 모델에서 시각 세포 스펙트럼 감도의 결정<em&gt; 생체</em&gt; 세포 내 녹음

Sharp microelectrodes는 살아있는 초파리에서 광수용체 및 시각 중간뉴런 출력의 정확한 전기생리학적 특성을 가능하게 합니다. 여기에서는 이 방법을 사용하여 제어된 광 자극에 대한 개별 셀의 고품질 전압 응답을 기록하는 방법을 보여줍니다. 이 방법은 곤충 겹눈의 신경 정보 처리를 연구하는 데 이상적입니다.

의 기록 세포 내 전압 응답에 대한 전기 생리 방법<em&gt; 초파리</em&gt; 빛 자극에 광수와의 interneurons<em&gt; 생체</em

여기에 우리가 수와 초파리의 광 수용체의 시냅스 활성 영역의 공간적 분포를 정량화하는 방법을 보여, 유전자 인코딩 된 분자 마커 강조하고, 빛에 장시간 노출 후 자신의 변조.

의 시냅틱 변조 분석<em&gt; 노랑 초파리</em&gt; 장시간 빛에 노출 후 광수

Drosophila melanogaster photoreceptor의 전체 세포 기록은 다양한 조건 에서 자연스런 어두운 범프, 양자 범프, 빛에 대한 거시적 반응 및 전류 - 전압 관계를 측정 할 수있게합니다. D. melanogaster 유전자 조작 도구와 결합하여이 방법은 유비쿼터스 이노시톨 - 지질 신호 전달 경로와 그 표적 인 TRP 채널에 대한 연구를 가능하게합니다.

전 세포 전압 클램프 기록을위한 전기 생리 학적 방법<em&gt; Drosophila</em&gt; 광 수용체

이 작품은 디지털 이미지 분석을 사용하여 Drosophila melanogaster의 복부 색소 침착 을 빠르고 정확하게 정량화하는 방법을 제시합니다. 이 방법은 표현형 획득과 데이터 분석 사이의 절차를 합리화하고 표본 장착, 이미지 수집, 픽셀 값 추출 및 특성 측정을 포함합니다.

복부 색소 침착 정량화<em&gt; Drosophila melanogaster</em

여기에서, 광수용체 막 단백질의 국소화 및 eGFP 형광을 이용한 초파리 화합물 안구에서의 망막 변성의 평가를 위한 비침습적 방법이 기재되어 있다.

eGFP 태그 단백질을 사용하여 초파리 광수용체 세포에서 막 단백질 밀매를 연구하기

배우세요 Drosophila 광수용체의 전기생리학적 특성 분석 방법을 통한 시각 돌연변이 유전자 스크리닝 기술입니다. 이 프로토콜은 광전도 단백질의 미세한 변화를 감지하여 새로운 시각 메커니즘을 발견할 수 있습니다.

초파리 광수용체에서 광안료 수준을 측정하기 위한 전기생리학적 방법

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