Name: 14CO2트래핑을 사용한 시험관내 에너지 기질 산화 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-23T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: 배우세요 14CO2 트래핑을 사용한 시험관 내 에너지 기질 산화 측정법을 통해 대사 질환 연구에 활용하는 방법을. 뼈 조직을 모델로 한 이 기술은 다양한 세포 유형에 적용 가능하여 대사 유연성 이해에 기여합니다.

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이 작업은 NIH 보조금 R01 AR060456 (FL)에 의해 부분적으로 지원되었습니다. 마이클 로빈슨 박사와 엘리자베스 크리즈만(필라델피아 아동 병원)에게 섬광 카운터에 대한 아낌없는 도움을 주신 것에 감사드립니다.

방사성 물질(RAM)을 사용하려면 각 기관의 지정된 안전위원회의 사전 승인이 필요합니다. 이 프로토콜에 사용되는 RAM은 펜실베니아 대학의 환경 보건 및 방사선 안전 (EHRS)의 승인을 받았습니다. 동물을 사용하려면 가정 기관의 IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee)의 사전 승인이 필요합니다. 다음 연구는 필라델피아 아동 병원의 IACUC의 승인을 받았습니다.
1. 14C 표지 기판에 대한 스톡 용액 제조
<ol><li>BSA 11g과 둘베코 인산완충식염수(DPBS) 33.1mL를 혼합하여 4mM 소혈청알부민(BSA) 원액을 만들고 BSA가 완전히 용해될 때까지 실온에서 ~3시간 동안 부드럽게 흔들어 준다. BSA 원액을 사용 전에 70°C 수조에서 가온한다.</li>
	<li>공기 건조 50 μCi 14C-올레에이트 (에탄올 중 50 μCi / μmol)를 지정된 RAM 작업 후드에서 8 시간 동안 뚜껑을 떼어 낸 바이알에 넣으세요. 312.5 μL의H2O를 첨가한 다음, 3.5 mg(11.5 μmol)의 올레산나트륨을 첨가한다. 철저히 섞으십시오.</li>
	<li>생성된 용액을 수조에서 70°C로 가온한다. 예열된 BSA 원액 0.9375 mL를 첨가하여 10 mM 핫 올레에이트 원액(표지되지 않은 올레에이트에 대한 14C-올레에이트의 1:11.5 비를 함유함)을 수득하였다. 원액을 분취하고, 장기간 사용을 위해 -20°C에서 보관한다.</li>
	<li>해동 직후에 14 C-글루코스와 14C-글루타민을 사용하십시오.</li>
</ol>2. 14개의C 표지된 기질을 함유하는 배지의 제조
참고: 매체에서 에너지 기판의 신뢰할 수 있는 농도를 보장하기 위해, 맞춤형 매체는 사용 직전에 추가된 신선한 기판과 함께 사용해야 합니다. 여기서, 글루코스, 피루베이트, 글루타민, 페놀 레드 또는 중탄산나트륨이 없는 맞춤형 최소 필수 배지(MEMα)가 사용된다. 그러나, 최적의 배지는 각 세포 유형에 대해 결정되어야 한다.
<ol><li>배지 분말 8.67 g을 정제수 1 L에 재구성한다. 2.2 g의 중탄산나트륨을 첨가하여 pH 7.4를 달성하고 0.22 μm 진공 여과를 사용하여 용액을 여과한다.</li>
	<li>신선한 성분을 첨가하여 최종 농도가 5.5 mM 포도당, 2 mM 글루타민, 1 mM 피루베이트 및 10% 소 태아 혈청(FBS)을 갖는 완전한 배지(cMEMα)를 얻었다. 지방산 산화를 촉진하기 위해 cMEMα를 100 mM L-카르니틴 및 10 μM HEPES로 추가로 보충하십시오.</li>
	<li>사용 직전에 14C 라벨이 붙은 기질을 새로 준비된 cMEMα에 첨가하여 핫 미디어를 만드십시오. 올레에이트 고온 배지를 만들기 위해, 10 mM 핫 올레에이트 원액을 cMEMα에 첨가하여 최종 농도 100 μM 올레에이트(1:100 희석, 최종 방사능 0.4 μCi/mL)를 가한다. 참고: 1:11.5의 비율로 함유된 10mM 핫 올레에이트 스톡(단계 1.3 참조)은 방사성 물질의 양을 최소화하면서 배지 내의 100 μM 총 올레에이트의 생리학적 수준을 달성하기 위해 사용된다.</li>
	<li>70°C의 수조에서 H2O 2 mL에 올레산나트륨 24.36 mg을 가하여 70°C로 예열된 4 mM BSA 원액 6 mL와 신속하게 혼합하기 전에 완전히 용해될 때까지 ∼20분 동안 10 mM 비표지된 올레에이트 스톡을 만든다. 1 h 동안 37°C 수조로 옮기고 0.22 μm 필터를 통해 여과한다. 분취량은 장기간 사용을 위해 -20°C에서 보관한다.</li>
	<li>포도당을 고온 배지로 만들려면 14C 포도당을 최종 농도 1.333 μM (1:4,125 희석, 최종 방사능 0.4 μCi / mL)에 첨가하십시오. 글루타민을 고온 배지로 만들려면 14C-글루타민을 최종 농도 2μM(1:1,000 희석, 최종 방사능 0.4μCi/mL)에 첨가합니다.</li>
	<li>글루코스 및 글루타민 핫 배지를 단계 2.4로부터의 표지되지 않은 올레에이트의 10 mM 원액으로 보충하여 올레에이트 핫 배지에서와 동일한 100 μM 올레에이트의 최종 농도를 달성한다.</li>
</ol>3. 세포의 제조
참고 : 갈변 전골 세포와 골수 대식세포가 여기에 예제로 사용됩니다. 사용자는 적절한 프로토콜에 따라 선택한 세포 유형을 준비해야합니다. 효소 활성이 상이한 로트들 사이에서 변할 수 있기 때문에 파일럿 실험에서 소화에 사용되는 콜라게나제 II의 농도를 최적화한다.
<ol><li>calvarial preosteoblasts의 분리 및 문화<ol>
<li>출생 후 3-5 일 (P3-5) 새끼를 감금하여 희생시키고 페니실린 - 스트렙토 마이신 (P / S)을 함유 한 얼음처럼 차가운 DPBS로 옮깁니다.</li>
		<li>피부와 연조직을 제거하여 갈변을 노출시킵니다. DPBS에서 주변 조직을 뒤에서 앞쪽으로 잘라내어 중간 영역을 수집합니다(그림 1A). 칼바리아의 내부 및 외부 표면을 핀셋을 사용하여 부드럽게 긁어 후속 소화시 세포를 방출하는 데 도움을줍니다.</li>
		<li>DPBS에 2mg/mL와 콜라게나제 유형 II의 4mg/mL 용액을 준비하고 각 용액을 신선한 0.22μm 필터로 여과합니다. 먼저 세척한 갈변을 2mg/mL 콜라게나제 용액으로 15분 동안 소화하고 소화액을 버립니다. 세척 된 샘플을 4 mg / mL 콜라게나제 용액에서 매번 15 분 동안 3 번 소화하여 소화 용액을 풀링하고 저장하십시오.</li>
		<li>소화 용액을 70 μm 세포 스트레이너를 통해 여과하고, 여액을 300 × g 에서 5분 동안 원심분리한다. 세포 펠릿을 10% FBS 및 P/S를 함유하는 cMEMα (단계 2.2 참조)에 재현탁시킨다.</li>
		<li>세포를 10cm 플레이트에 4 × 104 세포 /cm2로 계수하고 시드하십시오. 세포를 3일 동안 5%CO2 가 있는 37°C 배양기에서 배양하였다.</li>
		<li>세포를 37°C에서 0.25% 트립신-EDTA로 해리시킨다. 세포를 계수하고 7.5 × 105/cm2에서 10% FBS 및 P/S를 함유하는 cMEMα가 있는24-웰 세포 배양 플레이트에 시드한다. 기질 당 세포 유형 당 적어도 4 웰을 시드하고 분석 전에 세포 계수를 위해 각 세포 유형에 대해 적어도 세 개의 여분의 웰을 시드하십시오.</li>
		<li>기질 산화 분석 전에 밤새 37°C에서 세포를 배양한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>BMM의 분리 및 문화 참고: BMMs의 배양은 재조합 단백질로서 상업적으로 구입할 수 있는 대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF)를 필요로 한다. M-CSF를 발현하도록 조작된 세포주 CMG14-12로부터의 컨디셔닝 배지는 여기서 사용되는 경제적인 대안이다13.<ol>
<li>근육과 결합 조직을 제거한 후 8 주 된 마우스에서 대퇴골과 tibias를 수집하십시오. 날카로운 가위로 뼈의 양쪽 끝을 자르고 버립니다.</li>
		<li>대퇴골 하나와 경골 1개에서 골수를 10% FBS, P/S 및 10% CMG14-12 컨디셔닝 배지(BMM 배지)와 함께 cMEMα 15mL가 들어있는 23G 바늘이 장착된 주사기가 장착된 10cm 페트리 접시에 담아 내뿜습니다. 세포를 5%CO2가 있는 37°C 배양기에서 페트리 접시에서 배양한다.</li>
		<li>3일 후, 배양 배지를 버리고 DPBS로 헹구십시오. 부착된 세포를 37°C에서 5분 동안 0.25% 트립신-EDTA로 해리시킨다. 원심분리하고, 세포 펠릿을 BMM 배지에 재현탁시킨다.</li>
		<li>세포를 계수하고 3.1.6에 기재된 것과 동일한 방법으로 7.5 × 105/cm2의 24 -웰 세포 배양 플레이트에 시드한다. 분석을 시작하기 전에 BMM 배지에서 하룻밤 동안 37°C에서 배양하였다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4.CO2 트랩을 이용한 기질 산화 분석
참고: 분석 시작 전에 80-90% 합류를 달성하기 위해 각 세포 유형에 대해 적절한 시딩 밀도를 결정해야 합니다. 세포 밀도는 세포의 대사 상태에 영향을 줄 수 있습니다.
<ol><li>여분의 웰에있는 세포를 DPBS로 두 번 씻으십시오. 세포를 0.25% 트립신-EDTA로 해리시키고 DPBS에 재현탁된 20μL 세포를 20μL의 아크리딘 오렌지/프로피듐 요오드화물(AO/PI) 즉시 사용 가능한 상업용 염료 용액과 혼합합니다. 자동화된 셀 카운터를 사용하여 라이브 셀의 수를 결정하고 최종 계산을 위해 숫자를 기록합니다.</li>
	<li>분석 웰에서 세포를 DPBS로 두 번 세척하십시오. 500 μL의 고온 배지를 RAM 지정 조직 배양 후드의 각 분석 웰에 첨가한다. 플레이트를 파라필름으로 밀봉하고, 세포를 37°C에서 4시간 동안 RAM 지정 인큐베이터에서 인큐베이션한다.</li>
	<li>인큐베이션 중에 여과지를 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브의 캡 내부 영역보다 약간 큰 원형 조각으로 자르고 용지를 뚜껑에 꼭 삽입합니다(그림 1B). 각 튜브에 200μL의 1M 과염소산과 20μL의 수산화나트륨을 캡 내부에 장착된 여과지에 첨가한다.</li>
	<li>세포를 배양한 후, 각 웰로부터 400 μL의 배양 배지를 준비된 튜브로 옮기고 즉시 캡을 닫는다. 튜브를 실온에서 1 시간 동안 튜브 랙에 두십시오.</li>
	<li>인큐베이션 중에 각 튜브에 섬광 바이알을 설치하고 4mL의 섬광 유체로 채 웁니다. 여과지의 각 조각을 섬광 바이알로 옮기고 실온에서 30 분 동안 인큐베이션하십시오.</li>
	<li>조직 배양 후드, 수조( 14C-oleate 제제에 사용됨), 냉장고, 인큐베이터, 싱크대, 접지 및 기타 RAM 오염 가능성에 대한 작업 공간에 대해 닦아 테스트를 수행합니다. 종이 물티슈를 섬광액이 들어있는 섬광 바이알에 넣으십시오.</li>
	<li>섬광 계수기를 사용하여 섬광 바이알에서 14C방사능을 측정하십시오. 판독 결과를 기록한다. 필요한 경우 방사선 안전 지침에 따라 작업 환경을 오염시킵니다.</li>
</ol>5. 데이터 분석
주: 각 기질이 CO2를 방출하기 위해 완전히 산화된다고 가정하면, 기질 산화율은 포획된CO2 방사능으로부터 계산될 수 있다.
<ol><li>Eq(1) 및 상이한 기판에 대해 표 1에 제시된 X, Y 및 Z 값을 사용하여 기질 산화 율을 계산한다. 기질 산화율 (μmol/cell/h) = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63568/63568eq01.jpg">   (1)<ol>
<li>각 반응 웰에 대한 분당 총 붕해(DPM)를 계산한다. X의 경우, 총 반응 매질의 0.5 mL 밖으로CO2 포획에 사용되는 반응 매질의 0.4 mL로부터의 DPM 값(섬광 카운터 판독)을 사용한다. 따라서, 각 반응 웰로부터의 총 DPM은 X× 1.25이다.</li>
		<li>총 DPM을 2,220,000배로 나누어 μCi로 변환합니다.</li>
		<li>μCi의 방사능을 14개의C 표지된 분자의 수로 변환한다. μCi 값을 각 표지된 기질의 특정 활성(Y)으로 나눈다. 다음의 Y 값을 사용하십시오 (표 1): 14C-글루코오스: 300 mCi/mmol; 14 C- 글루타민 : 200 mCi / mmol; 14 C- 올레 에이트 : 50 mCi / mmol.</li>
		<li>후자를 핫 투 토탈 희석 인자 (Z)와 곱하여 산화 된 14C표지 분자로부터 산화 된 분자의 총 수를 계산하십시오. 다음의 Z 값을 사용하십시오 (표 1): 글루코스: 4,125; 글루타민: 1,000; 올레 에이트 : 12.5.</li>
		<li>생성된 생성물을 셀 수(cell#)와 4(반응 시간 4 h)로 나누어 세포당 기질 산화율을 결정한다. 분석 시작 시 병렬 웰에서 결정된 세포#를 사용하십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

이 프로토콜은 주요 에너지 기판의 산화 속도를 결정하는 데 사용하기 쉬운 방법을 제공합니다. 중앙 우물을 포함하고 고무 마개14,15,16으로 덮인 플라스크를 사용하는 다른 프로토콜에 대한 간단한 대안입니다. 여기서 예시적인 연구가 세포 배양과 함께 수행되지만, 상기 방법은 앞서 기술된 바와 같이 무손상 미토콘드리아를 함유하는 조직 외식편 또는 조직 균질물에 대해 용이하게 적응될 수 있다(17).
이 프로토콜에서 고려해야 할 몇 가지 주요 단계는 시약의 준비 및 14CO2포획을 위한 튜브의 셋업을 포함한다. 올레에이트를 BSA에 적절히 컨쥬게이션시키는 것은 유리 지방산(FFA)이 세포막을 손상시키는 것을 방지하고 신진대사를 위해 세포...

진핵생물의 산화적 인산화(OXPHOS)는 미토콘드리아 내부에서 영양분이 분해되어 산소 소비를 통해 ATP 형태로 화학 에너지를 방출하는 과정입니다.  트리카르복실산(TCA) 사이클을 통해 미토콘드리아 내부의 다양한 기질의 이화작용은 직접 ATP 분자를 거의 생성하지 않지만, 오히려 전자 운반체인 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드(NAD+) 및 플라빈 아데닌 디뉴클레오타이드(FAD+)의 환원을 통해 에너지를 저장한다. 환원된 담체는 이어서 미토콘드리아의 내막에 위치한 ETC에 의해 산화되어 막을 가로질러 양성자 농도 구배를 생성한다. 양성자는 결국 ATP 신타제를 통해 미토콘드리아 매트릭스로 다시 구배를 흘러 ATP를 생성합니다. OXPHOS는 에너지 기질로부터 ATP를 생산하는 가장 효율적인 수단이며 일반적으로 호기성 환경에서 선호됩니다. 이전에, 호기성 글리코분해-산소가 존재하는 동안 글루코스로부터의 락테이트의 생산-병리생리학적, 종종 암 세포의 특징인 것으로 생각되었다. 점점 더 많은 수의 정상적인 세포 유형이 아직 완전히 해독되지 않은 이유로 호기성 글리코 분해를 사용한다는 것이 발견되고 있습니다.
대사 유연성은 세포 또는 유기체가 변화하는 에너지 요구와 사용 가능한 연료 원에 적응할 수있는 능력입니다. 예를 들어, 골격근의 에너지 수요는 주로 정상 상태에서 OXPHOS에 의해 충족되지만 고강도 운동 중 혐기성 당분해에 의해 충족됩니다1. 운동 기간이 증가함에 따라 포도당과 지방산 산화는 전반적인 에너지 생산에 더 많은 기여를합니다 2. 그러나, 기질 사용은 기질이 산화 동안 적대적으로 경쟁하기 때문에 가용성에만 의존하지 않는다. 가장 주목할 만하게, 지방산 산화는 랜들 효과3로 알려진 현상으로 골격근에 의한 글루코스 이용을 억제하는 것으로 나타났다. 상호 효과는 후속 연구 4,5에 의해 입증되었다. 또한, 많은 질병들은 기질 선호도의 변화 및 세포에서의 대사 유연성의 발달과 관련된다. 예를 들어, 지방산 산화는 정상 대조군 피험자6에 비해 II형 당뇨병 환자의 골격근에서 감소된다. 질병 설정의 대사 변화는 병인에 기여할 수 있기 때문에 집중적 인 조사의 대상입니다.
골격 세포 유형의 에너지 대사는 상대적으로 과소 연구되었지만 최근 몇 년 동안 주목을 받고 있습니다7. 이전의 연구는 호기성 당분해가 calvarial 조골 세포에서 지배적 인 에너지 경로이며, TCA 사이클을 통한 포도당 산화가 파골세포 형성 8,9에서 중요한 역할을한다는 것을 보여주었습니다. 다른 사람들은 조골 세포10의 에너지 원으로서 지방산에 대한 증거를 제공했습니다. 글루타민 이화작용은 또한 선조(11,12)로부터의 조골세포 분화를 지지하는 것으로 나타났다. 그러나, 다양한 골격 세포 유형에 의한 기질 이용에 대한 포괄적인 이해는 여전히 부족하다. 또한, 세포 분화 동안 또는 병리학적 신호에 반응하여 세포 대사의 변화는 연료 기질 이용을 변화시킬 것으로 예상된다. 이하에 기재된 것은 시험관내에서 기질 산화를 검정하기 위한 사용하기 쉬운 프로토콜이다.

<table><tbody><tr><td>0.22 & 마이크로; m 필터</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLGVM33RS</td><td>BSA 용액</td></tr><tr><td>0.25% 트립신-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td>세포 배양 플레이트에서 세포 해리</td></tr><tr><td>1.5 mL Eppendorf 튜브</td><td>PR1MA</td><td>PR MCT17 RB</td><td>반응 배양에 사용</td></tr><tr><td>10cm 플레이트</td><td>TPP</td><td>93100</td><td>세포 배양에 사용</td></tr><tr><td>10 mL 주사기</td><td>BD</td><td>302995</td><td>긴 뼈에서 골수를 씻어내는 데 사용</td></tr><tr><td>10% FBS</td><td>Atlanta biologicals</td><td>S11550</td><td>세포 배양 배지 준비</td></tr><tr><td>14C-Glucose</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC042X050UC</td><td>뜨거운 매체를 만드는 데 사용됩니다</td></tr><tr><td>14C-glutamine</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC451050UC</td><td>뜨거운 매체를 만드는 데 사용됩니다</td></tr><tr><td>14C-oleate</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC317050UC</td><td>뜨거운 매체를 만드는 데 사용</td></tr><tr><td>23 G 바늘</td><td>BD</td><td>305120</td><td>긴 뼈에서 골수를 씻어내는 데 사용</td></tr><tr><td>24 웰 플레이트</td><td>TPP</td><td>92024</td><td>세포 배양에 사용</td></tr><tr><td>70 &mu; m cell strainers</td><td>MIDSCI</td><td>70CELL</td><td>cavarial digestion 중 상등액을 여과하는 데 사용</td></tr><tr><td>Acridine Orange/Propidium Iodide (AO/PI) dye</td><td>Nexcelom Biosciences</td><td>CS2-0106</td><td>종자 밀도를 결정하기 위해 살아있는 세포를 염색</td></tr><tr><td>Bovine Serum Ablumin</td><td>Proliant Biologicals</td><td>68700</td><td>지방산 접합에 사용</td></tr><tr><td>Cellometer Auto 2000</td><td>Nexcelom Biosciences</td><td></td><td>생존 가능한 세포의 수 결정</td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Thermo Fisher</td><td>Legend Micro 21R</td><td>세포 펠렛화에 사용</td></tr><tr><td>콜라겐분해효소 II형</td><td>Worthington</td><td>LS004176</td><td>조직에서 세포 해리</td></tr><tr><td>맞춤형 MEM 알파</td><td>GIBCO</td><td>SKU: ME 18459P1</td><td>맞춤형 핫 미디어를 만드는 데 사용</td></tr><tr><td>Dulbecco의 인산염 완충 식염수</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td>시약을 용해 및 희석하고 배양 접시를 세척하는 데 사용됩니다</td></tr><tr><td>Filter Paper</td><td>Millipore-Sigma</td><td>WHA1001090</td><td>Traps CO2 with sodium hydroxide</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>g7528</td><td>세포</td></tr><tr>배양 중 맞춤형 매체<td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td>트랩 CO2</td></tr>를 만드는 데 사용 L<tr><td>-카르니틴</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0283</td><td>지방산 산화를 위해 보충됨</td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>g3126</td><td>맞춤형 배지</td></tr><tr><td>MEM alpha</td><td>Thermo</td><td>A10490</td><td>세포 배양 배지</td></tr>를 만드는 데 사용 <tr><td>Parafilm</td><td>Pecheney 플라스틱 포장</td><td>PM998</td><td>세포 배양 접시를 밀봉하는 데 사용</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140122</td><td>세포 배양 오염 방지</td></tr><tr><td>과염소산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244252,</td><td>대사 분석 중 CO2 방출</td></tr><tr><td>Pyruvate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>p5280</td><td>맞춤형 매체를 만드는 데 사용</td></tr><tr><td>섬광 카운터</td><td>Beckman Coulter</td><td>LS6500</td><td>여과지에서 방사능 측정</td></tr><tr><td>섬광 유체</td><td>MP Biomedicals</td><td>882453</td><td>RAM에서 방출되는 에너지를 흡수하고 섬광으로 다시 방출</td></tr><tr><td>섬광 바이알</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-337-1</td><td>섬광 유체용 반응 용기</td></tr><tr><td>탄산나트륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td> 중간 수산화나트륨<td>용 균형 버퍼</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>58045</td><td>메타보일C 분석 중 CO2 트랩</td></tr><tr><td>올레산나트륨</td><td>SANTA CRUZ</td><td>SC-215879</td><td>BSA 공액 지방산 준비</td></tr><tr><td>진공 여과 1000</td><td>TPP</td><td>99950</td><td>필터 cMEM&alpha;</td></tr></tbody></table>

14co2트래핑을 사용한 시험관내 에너지 기질 산화 평가

Assessing Energy Substrate Oxidation In Vitro with 14CO2 Trapping

미토콘드리아는 에너지 항상성을 유지하기 위해 아데노신 삼인산염(ATP)을 생성하는 트리카르복실산(TCA) 사이클 및 전자 수송 사슬(ETC)을 위한 기계장치를 호스트한다. 포도당, 지방산 및 아미노산은 대부분의 체세포에서 미토콘드리아 호흡을 촉진하는 주요 에너지 기질입니다. 증거는 상이한 세포 유형이 특정 기질에 대해 뚜렷한 선호도를 가질 수 있음을 보여준다. 그러나, 골격 내의 다양한 세포에 의한 기질 활용은 구체적으로 연구되지 않았다. 더욱이, 세포 대사가 생리학적 및 병리생리학적 변화에 적응함에 따라, 골격 세포에서의 기질 의존성에 대한 직접적인 평가는 뼈 질환의 발병기전에 대한 중요한 통찰을 제공할 수 있다.
다음 프로토콜은 산화 인산화 후 기질 분자로부터 이산화탄소가 방출되는 원리에 기초한다. 방사성으로 표지된 탄소 원자(14C)를 함유하는 기질을 사용함으로써, 이 방법은 세포 배양물에서 기질 산화의 속도에 대한 민감하고 사용하기 쉬운 검정을 제공한다. 일차 calvarial preosteoblasts 대 골수 유래 대식세포 (BMMs)를 사용한 사례 연구는 두 세포 유형 사이의 주요 기질의 다른 활용을 보여줍니다.

이 예에서,CO2 포획 방법은 각각 시험관내 조골세포 또는 파골세포 분화에 자주 사용되는 BMMs와 일차 갈변 전조골세포에 의한 기질 산화를 비교하기 위해 사용된다. 일차 세포가 계대배양되고 cMEMα에서 하룻밤 동안 배양된 후, 이들은 전형적으로 합류의 80-90%에 도달하고 그들의 특징적인 형태학을 나타낸다. calvarial preosteoblasts는 BMMs보다 현저하게 더 큽니다 (그림 2). 각 세포 유형은 다음 단계 4.1 내지 4.7에 의해 글루코스, 글루타민 및 올레에이트에 대한 산화 검정을 실시한다. 결과는 Eq (1)을 사용하여 분석한다.
결과는 각 기질에 대한 산화율이 BMM보다 칼바리알 전조아세포에서 유의하게 더 높으며, 조골세포 전에서 OXPHOS에 의한 더 큰 에너지 생산을 나타낼 가능성이 있음을 보여준다(<strong class="...

이 프로토콜은 시험관내에서 14CO2생산을 추적함으로써 기질 산화를 검사하는 사용하기 쉬운 방법을 기술한다.

14CO2트래핑을 사용한 시험관내 에너지 기질 산화 평가

Mitochondria host the machinery for the tricarboxylic acid (TCA) cycle and electron transport&#160;chain (ETC), which generate adenosine triphosphate ...

상이한 에너지 기질의 사용은 세포 유형 특이적 및 질병 지시 둘 다이다. 특정 기질의 소비를 측정하면 정상적인 생물학과 병리학 모두에 빛을 비출 수 있습니다. 이 기술은 특수 장비가 필요하지 않으며 확장하기 쉽습니다.또한 이전에 게시 된 방법보다 사용하기가 더 쉽습니다. 기질 산화율의 변화를 이해하면 대사 장애에 대한식이 및 약리학 적 개입의 개발을 허용 할 것입니다. 비록 뼈 조직으로 입증되었지만, 이 기술은 대사 이동의 원인과 결과에 대한 이해를 제공하는 모든 세포 유형에서 대사 유연성을 연구하기 위해 쉽게 맞춤화된다.출생 후 삼 내지 오일 동안 새끼를 희생시킨 후, 페니실린 스트렙토마이신 이중 항생제 용액을 함유하는 얼음 차가운 D PBS로 옮긴다. 피부와 연조직을 제거하여 갈변을 노출시킵니다. D PBS에서 주위 조직을 뒤에서 앞쪽으로 절단하여 중간 영역을 수집한다.칼바리아의 내부 및 외부 표면을 핀셋을 사용하여 부드럽게 긁어 후속 소화시 세포를 방출하는 데 도움을줍니다. 콜라게나제 유형 2의 밀리리터 용액 당 2 및 4 밀리그램을 D PBS로 준비하고 각 용액을 신선한 0.22 마이크로미터 필터로 여과한다. 먼저, 세척 된 갈변을 밀리리터 콜라게나제 용액 당 두 밀리그램으로 15 분 동안 소화 한 다음 소화 용액을 버립니다.다음으로, 깨끗한 샘플을 매번 15분 동안 밀리리터 콜라게나제 용액 세 개당 네 밀리그램으로 소화한다. 그런 다음 소화 용액을 당겨 저장하십시오. 소화액을 70 마이크로미터 세포 스트레이너를 통해 여과하고 여액을 300 RCF에서 5분 동안 원심분리한다.세포 펠릿을 10%FBS 및 페니실린 스트렙토마이신 이중 항생제 용액을 함유하는 완전한 MEM 알파 배지에 재현탁시킨다. 세포를 계수하고 10 센티미터 플레이트에 시드하십시오. 세포를 섭씨 37도 배양기에서 3 일 동안 5 % 이산화탄소로 배양하십시오.그런 다음 섭씨 37도에서 세포를 0.25 트립신 EDTA와 해리시킵니다. 소화 후, 세포를 계수하고 10%FBS 및 페니실린 스트렙토마이신 이중 항생제 용액을 함유하는 완전한 MEM 알파 배지로 24웰 세포 배양 플레이트에 시드한다. 기질 당 세포 유형 당 적어도 네 개의 웰을 시드하고, 사전 분석 계수를 위해 각 세포 유형에 대해 적어도 세 개의 여분의 웰을 시드한다.세포를 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양한다. 여덟 주령의 생쥐에서 근육과 결합 조직을 제거하고 대퇴골과 흉골을 수집 한 후 날카로운 가위로 뼈의 양쪽 끝을 자르고 버립니다. 하나의 대퇴골과 한 경골에서 골수를 10 % FBS 페니실린 스트렙토 마이신 이중 항생제 용액과 10 % CGM 14 12 컨디셔닝 배지가있는 완전한 MEM 알파 배지 15 밀리리터가 들어있는 23 게이지 바늘이 장착 된 주사기가 장착 된 신선한 10 센티미터 페트리 접시에 씻어 내십시오.세포를 5 % 이산화탄소로 섭씨 37도 배양기에서 페트리 접시에 배양하십시오. 사흘 후 배양 배지를 버리고 D PBS로 세포를 헹구었다. 부착 된 세포를 섭씨 37도에서 0.25 % 트립신 EDTA와 5 분 동안 해리시킵니다.원심분리 후, 세포 펠릿을 BMM 배지에 재현탁시킨다. 세포를 계수하고 이전에 기술된 절차에 따라 24 웰 세포 배양 플레이트에 시드한다. 분석을 시작하기 전에 BMM 배지에서 밤새 섭씨 37도에서 배양하였다.여분의 웰에서 세포를 D PBS로 두 번 세척한다. 세포를 0.25 % 트립신 EDTA와 해리시킵니다. 소화된 세포 20 마이크로리터를 D PBS에 재현탁시킨다.20 마이크로 리터의 아크리딘 오렌지와 프로피듐 요오드화물 염료 용액으로 자동화 된 세포 카운터로 살아있는 세포의 수를 결정하고 숫자를 기록하십시오. 분석 웰에서 세포를 D PBS로 두 번 세척한다. 500 마이크로리터의 고온 배지를 RAM 지정 조직 배양 후드의 각 분석 웰에 첨가한다.플레이트를 파라필름으로 밀봉한 후, 세포를 섭씨 37도에서 RAM 지정 인큐베이터에서 4시간 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션 중에 여과지를 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리 튜브의 캡 내부 영역보다 약간 큰 원형 조각으로 자르고 종이를 뚜껑에 꼭 삽입하십시오. 각 튜브에 1 몰 과염소산 200 마이크로 리터를 넣고 뚜껑 내부에 장착 된 여과지에 20 마이크로 리터의 수산화 나트륨을 넣으십시오.세포를 배양한 후, 각 웰에서 400 마이크로리터의 배양 배지를 준비된 튜브로 옮기고 즉시 캡을 닫는다. 튜브를 실온에서 한 시간 동안 튜브 랙에 두십시오. 인큐베이션 중 Parallelae는 각 튜브에 대한 섬광 바이알을 설치하고 네 밀리리터의 섬광 유체로 채 웁니다.여과지의 각 조각을 섬광 바이알로 옮기고 실온에서 30 분 동안 인큐베이션하십시오. 조직 배양 후드, 수조, 냉장고, 인큐베이터, 싱크대, 접지 및 기타 작업 영역에서 잠재적인 RAM 오염에 대한 닦아 테스트를 수행합니다. 종이 물티슈를 섬광액이 들어있는 섬광 바이알에 넣으십시오.섬광 계수기를 사용하여 섬광 바이알에서 탄소 14 전파 활동을 측정하고 판독 결과를 기록하십시오. 필요한 경우 방사선 안전 지침에 따라 작업 환경의 오염을 제거하십시오. 이 그림은 일차 칼바리아 예비 조골세포에 의한 기질 산화와 BMM을 비교합니다.일차 세포가 계대배양되고 완전한 MEM 알파 배지에서 하룻밤 동안 배양된 후, 이들은 전형적으로 80 내지 90%컨플루언시에 도달하고 이들의 특징적인 형태학을 나타낸다. calvarial pre osteoblasts는 BMMs보다 현저하게 더 큽니다. 기질 산화의 결과는 각 기질에 대한 산화 속도가 BMMs보다 칼바리알 예비 조골세포에서 유의하게 더 높다는 것을 보여주었고, 이는 조골 전 세포에서의 산화 인산화에 의한 더 높은 에너지 생산을 나타낼 가능성이 높다.삽입 된 세 번째 용지는 1.7 밀리리터 에빈 탑 튜브 캡보다 약간 커야합니다. 이 방법은 산소 소비와 함께 사용될 수 있으며 세포에서 산화 인산화 및 젖산 생산의 전체 속도를 결정할 수 있습니다. 이 프로토콜은 별개의 분화 단계 또는 질병 설정 동안 기질 사용을 결정하는데 사용될 수 있다.이 지식으로 우리는 신진 대사 장애에 대한 중재를 개발할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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챔버 및 플레이트 기반 호흡계를 사용하여 세포 및 조직의 생물 에너지를 평가하기위한 고해상도 호흡 측정법

형광 센서에 결합된 고분해능 호흡법은 미토콘드리아 산소 소비량과 반응성 산소 종(ROS) 생성을 결정합니다. 본 프로토콜은 투과화된 좌골 신경에서 미토콘드리아 호흡률 및 ROS 생산을 평가하는 기술을 기술한다.

고해상도 호흡 측정법에 의한 좌골 신경의 미토콘드리아 기능 평가

우리는 형질막을 선택적으로 투과시키는 프로토콜을 제시하여, 기질과 억제제의 표적 전달을 가능하게 하여 배양된 세포에서 미토콘드리아 산화 인산화(OXPHOS)를 평가하고, 일반적으로 이러한 분석을 방해하는 원형질막 수송 장벽을 극복합니다. 이 기법을 사용하여 우리는 OXPHOS 기능이 무스카린 작용제와 길항제에 의해 어떻게 조절되는지 입증했습니다.

디지토닌 투과화된 BE(2)-C 신경모세포종 세포에서 산화적 인산화 결합의 콜린성 리간드 의존 조절

배우세요 14CO2 트래핑을 사용한 시험관 내 에너지 기질 산화 측정법을 통해 대사 질환 연구에 활용하는 방법을. 뼈 조직을 모델로 한 이 기술은 다양한 세포 유형에 적용 가능하여 대사 유연성 이해에 기여합니다.

^14CO2트래핑을 사용한 시험관내 에너지 기질 산화 평가

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