Name: 성인형 미만성 침윤성 신경교종의 미세환경 특성화를 위한 디지털 공간 프로파일링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-13T12:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: 배우세요 디지털 공간 프로파일링(DSP)을 활용한 성인형 미만성 침윤성 신경교종의 미세환경 특성화 방법입니다. 이 기술은 종양 영역별 단백질 발현을 정량화하여 침윤 및 성장 관련 바이오마커를 식별합니다.

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저자는 다트머스 히치콕 건강 시스템의 병리학 및 실험실 의학과에서 임상 유전체학 및 첨단 기술 연구소의 지원을 인정합니다. 저자는 또한 NCI 암 센터 지원 보조금 5P30 CA023108-37과 함께 다트머스 암 센터의 병리학 공유 리소스를 인정합니다.

아래에 설명 된 프로토콜은 Dartmouth-Hitchcock Human Research Ethics Committee의 지침을 따릅니다. 이 연구에 조직 샘플이 포함 된 환자로부터 정보에 입각 한 동의를 얻었습니다. 이 프로토콜에 사용되는 모든 재료, 시약, 장비 및 소프트웨어와 관련된 자세한 내용은 재료 표 섹션을 참조하십시오.
1. 슬라이드 준비17
<ol><li>인간 성인형 미만성 침윤성 신경교종에서 포르말린 고정, 파라핀 포매 조직을 회수하거나 준비합니다. 참고: 이 실험에서는 교모세포종 환자 3명의 파라핀 포매 생검 블록을 사용했습니다.</li>
	<li>조직 마이크로어레이(TMA) 블록을 만듭니다. 각 생검에서 여러 개의 2mm 코어를 가져와 단일 TMA 블록에 넣습니다(그림 1, 상단). TMA 블록에서 4μm의 섹션을 절단하고 유리 슬라이드에 장착합니다. 각 슬라이드를 슬라이드 홀더 개스킷 안에 놓습니다. 슬라이드를 60°C에서 30분 동안 배양합니다.</li>
</ol>2. 반자동 IHC 시스템 준비 및 소프트웨어 구성(슬라이드 로딩 및 실행용)17
<ol><li>시약을 설정합니다. 시약 설정 버튼을 클릭합니다. 설정 탭에서 추가를 클릭합니다.<ol><li>이름 필드에 이름을 입력하여 세척 버퍼를 등록합니다. 유형 필드에서 보조를 선택합니다. 저장을 클릭합니다.</li>
		<li>위와 동일한 단계를 반복하되(해당되는 경우 수정됨, 예: 이름 필드에서) 유형 필드에서 1차 항체를 선택하여 차단 용액을 등록합니다. 기본 염색 프로토콜 및 기본 HIER 프로토콜의 드롭다운 상자에서 원하는 프로토콜을 선택합니다. 원하는 경우 기본 효소 프로토콜 옵션을 선택합니다(이 상자는 현재 프로토콜에서 비어 있음). 저장을 클릭합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>바코드가 부착된 시약 용기 트레이로 구성된 검출 시스템을 등록합니다. 바코드를 스캔합니다.<ol><li>연구 시약 시스템 추가 창에서 시 약 시스템 세부 정보를 입력하기 시작합니다. 감지 시스템의 이름을 입력합니다.</li>
		<li>만료 날짜를 입력합니다. 시약 차트의 첫 번째 행을 강조 표시하고 새 30mL 시약 용기의 바코드를 스캔하면 바코드가 행 1을 채웁니다.</li>
		<li>컨테이너를 감지 시스템의 위치 1에 놓습니다. 시약 열의 드롭다운 상자에서 세척 버퍼의 이름을 선택하고 추가를 클릭합니다. 이 단계를 반복하여 블로킹 솔루션을 포함하여 후속 행에 추가 시약을 추가합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>IHC에 대한 단백질 프로토콜을 설정합니다. 프로토콜 설정을 클릭합니다. 원하는 프로토콜에 해당하는 행을 강조 표시하고 복사를 클릭합니다. 이름을 입력하고 프로토콜 속성 편집 창에서 다른 관련 필드를 입력합니다.<ol><li>세척 단계 표시 상자를 선택합니다. Inc(분) 및 디스펜스타입 필드가 각 시약에 대해 올바른지 확인합니다(블로킹 용액의 경우 10분, 세척 버퍼의 경우 0분, 각 디스펜스타입의 경우 150μL). 저장을 클릭합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>연구를 준비하십시오. 위치 1의 용기를 세척 버퍼로 채 웁니다. 슬라이드당 150μL와 5mL의 데드 볼륨을 채웁니다. 뚜껑을 열어 두십시오. 블로킹 솔루션으로 채워야 하는 위치 2의 컨테이너에 대해 이 단계를 반복합니다. 이 용기에는 슬라이드당 150μL와 350μL의 데드 볼륨이 있어야 합니다.<ol><li>시약 용기 트레이를 기계에 로드합니다. 시스템이 컨테이너 인식 및 볼륨 확인 조치를 수행하도록 허용합니다. 슬라이드 설정 |를 클릭합니다. 스터디 추가. 스터디 ID와 스터디 이름을 입력하고 분주 용량 | 에서 150 μL를 선택합니다. 준비 프로토콜 드롭다운에서 원하는 프로토콜(베이크 및 디왁스 제안). 연구를 강조 표시하고 슬라이드 추가를 클릭합니다.</li>
		<li>분배 부피 |에서 조직 유형 | 150 μL의 테스트 조직 선택 염색 모드 드롭다운 상자의 단일 및 루틴. 프로세스 선택(현재 연구의 경우 IHC) | 마커 필드의 드롭다운 상자에 있는 차단 솔루션 이름 | 프로토콜 탭의 염색 필드에 있는 IHC DSP 프로토콜 | *준비를 위해 베이킹 및 디왁스 | *HIER용 ER20로 1분 HIER. 효소 필드를 비워 둡니다.</li>
		<li>모든 슬라이드에 대해 이 과정을 반복합니다. 완료되면 닫기 를 클릭하고 레이블 인쇄를 클릭합니다. 현재 스터디에 대해 아직 인쇄되지 않은 모든 슬라이드 레이블을 선택하고 인쇄를 클릭합니다. 슬라이드 상단에 레이블을 부착합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>슬라이드를 로드하고 실행합니다. 슬라이드를 슬라이드 트레이에 올려 샘플과 라벨이 위를 향하도록 합니다. 슬라이드 위에 표지 타일 을 놓고 슬라이드의 아래쪽 탭 방향이 되도록 합니다. 슬라이드 트레이를 기기에 로드합니다.<ol><li>LED 버튼을 눌러 트레이를 내리고 기기가 슬라이드 스캔 및 인식을 시작할 수 있도록 합니다. 시작 버튼을 클릭하여 실험을 시작합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>실험을 마칩니다. LED 버튼이 녹색으로 깜박이면 실행 완료를 나타냅니다. 기기에서 트레이를 제거하고 각 슬라이드에서 커버 타일을 조심스럽게 들어 올립니다. 슬라이드를 1x 인산염 완충 식염수(PBS)에 넣고 과도한 완충액을 제거한 다음 소수성 펜으로 각 조직 섹션의 윤곽을 그리며 소수성 장벽을 만듭니다.</li>
</ol>3. 항체 배양 및 핵 염색17
<ol><li>관심 항원을 국소화할 항체 패널을 선택합니다(이 실험에 사용된 항체에 대해서는 표 1 참조). 참고: 각 항체는 이미 이를 고유하게 식별하는 UV 광절단 세그먼트(PC-oligo)가 있는 DNA 올리고뉴클레오티드에 접합되었습니다(인덱싱 올리고, 그림 2).</li>
	<li>각 슬라이드에 대해 패널에 각 항체 8μL(1:40 희석)를 추가하여 작동하는 항체-PC-올리고 용액을 만듭니다. 블로킹 시약을 희석제로 사용하여 각 슬라이드에 대한 최종 부피 200μL에 도달합니다. 4°C에서 밤새 배양합니다(그림 3, 단계 1). 참고: 형태학 마커, 생물학적 염료 또는 형광 표지된 항체도 이 단계에서 용액에 첨가할 수 있습니다.</li>
	<li>다음날 슬라이드를 코플린 병에 넣고 3x TBS-T에서 10 x 1 분 동안 씻습니다. 실온에서 30 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드에 후위사를 적용한 다음 1x TBS-T에서 2 x 5 분.</li>
	<li>실온에서 15분 동안 SYTO13 핵 염색(1x TBS에 1:10으로 희석)을 추가합니다. 1x TBS-T로 2x를 씻은 다음 슬라이드를 1x TBS-T에 보관하십시오.</li>
</ol>4. DSP 기기의 형광 시각화, ROI 식별 및 UV 광분해17
<ol><li>제어 센터의 데이터 수집 위로 마우스를 가져간 후 새로 만들기/계속 실행을 선택합니다.</li>
	<li>슬라이드를 슬라이드 홀더에 놓고 레이블이 사용자를 향하도록 합니다. 슬라이드 트레이 cl을 내립니다.amp 길쭉한 창에 조직이 보이도록 합니다. 버퍼 S 6mL를 추가합니다. </li>
	<li>제어 센터의 지시를 따릅니다. X 및 Y 슬라이더로 여러 축 사이를 확대하여 스캔할 영역을 표시합니다. 스캔을 선택합니다. 정의된 전체 대상 영역이 이미징될 때까지 스캔을 계속합니다.</li>
	<li>20x 이미지를 생성합니다. ROI를 자동 또는 수동으로 정의합니다(그림 3, 2단계). 이 프로토콜을 따르려면 각 조직 코어에 대해 동일한 크기의 원형 ROI(직경 250μm) 3개를 선택합니다(그림 4, 하단). 참고: ROI는 크기와 모양이 사용자 지정할 수 있습니다. 각 섹션 내에서 여러 ROI를 선택할 수 있습니다. 이 실험에서는 순환 ROI를 수동으로 정의합니다.</li>
	<li>스캔 작업 영역 종료 버튼을 클릭하여 ROI를 승인합니다. UV 광선이 항체에서 올리고를 절단할 때까지 기다립니다.</li>
	<li>기기 청소 프로세스가 완료되면 새 데이터 수집을 선택하여 현재 슬라이드 또는 플레이트를 계속 진행합니다. 그렇지 않으면 슬라이드 및 마이크로플레이트 제거를 선택합니다.</li>
	<li>제어 센터의 오른쪽 하단에 있는 플레이트 아이콘 영역을 두 번 클릭하여 플레이트 마무리 창을 엽니다. 하이브리드화(Hyb) 코드 팩 로트 번호(#)를 알고 있는 경우 번호를 입력하고 업데이트를 클릭합니다(이 단계에서는 선택 사항). 완료를 클릭합니다.</li>
	<li>프롬프트에 따라 슬라이드 홀더와 수집 플레이트를 분리합니다. 슬라이드를 TBS-T에 저장합니다. 슬라이드를 오랫동안 사용하지 않을 경우 수성 매체와 커버 슬립으로 덮으십시오.</li>
</ol>5. 단백질 판독17
<ol><li>투과성 씰을 사용하고 상단이 열린 상태에서 열 순환기에서 65 ° C에서 흡인물을 건조시킵니다. 7μL의 디에틸 피로카보네이트 처리된 물을 넣고 혼합합니다. RT에서 10 분 동안 배양 한 다음 빠르게 스핀 다운합니다.</li>
	<li>표 2에서 적절한 프로브 R 및 프로브 U 방정식을 선택하여 프로브/버퍼 믹스 생성을 안내합니다. 본 실험에서 혼성화에 필요한 Hyb Code의 개수를 기준으로 하기 수학식 1을 적용한다. 빠르게 믹스 앤 스핀 다운. # Hyb 코드 프로브 R 워킹 풀 프로브 U 워킹 풀 하이브리드화 버퍼 n = _______ (n × 8 μL) = _____ μL + (n × 8 μL) = ______ μL + (n × 80 μL) = _____ μL (1)</li>
	<li>사용할 각 Hyb 코드 팩에 84μL의 프로브/버퍼 혼합물을 추가합니다. 플릭하여 믹스하고 스핀다운합니다. 새로운 96웰 하이브리드화 플레이트에서 각 Hyb 코드 마스터 믹스 8μL를 표시된 행의 모든 12웰에 추가합니다.</li>
	<li>7 μL를 DSP 수집 플레이트에서 하이브리드화 플레이트의 해당 웰로 옮깁니다. 부드럽게 섞는다. 열 밀봉하고 빠른 회전을 수행하십시오. 이어서, 67°C에서 밤새 배양한다. 얼음 위에서 접시를 식히고 빠른 회전을 수행하십시오.</li>
	<li>각 웰의 hyb 제품을 스트립 튜브에 모으고 각 웰을 5x 부드럽게 파이프하여 혼합합니다. 스트립 튜브를 덮고 스핀 다운하십시오. 풀링되지 않은 나머지 hyb 제품은 -80°C에서 동결합니다. 스트립 튜브를 분석 시스템에 로드합니다.</li>
	<li>CDF 파일을 USB 드라이브에 저장한 다음 DSP 기기에서 디지털 분석기로 데이터를 전송합니다. 다음 단계를 수행하여 설정을 완료합니다.<ol><li>소모품과 풀링된 샘플을 준비 스테이션에 로드합니다. 화면에서 처리 시작을 누릅니다. 고감도를 선택하고 다음을 선택합니다. 샘플이 | 있는 웰 수에 대해 모두 선택을 누릅니다. 마침 | 다음 이메일 알림 | 스타트.</li>
		<li>준비 스테이션이 완료되면 카트리지를 밀봉하고 디지털 분석기로 옮깁니다. 계산 시작을 누르고 스테이지 위치를 선택한 다음 기존 CDF 파일 로드를 누르고 이전에 업로드한 파일을 선택합니다. 완료를 누르고 스테이지 위치를 다시 선택한 다음 완료를 누릅니다| 프로그램 실행을 시작합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>리포터 카운트 변환 파일의 압축 파일을 분석 시스템에서 USB 드라이브에 저장한 다음 드라이브를 DSP 기기에 삽입합니다. DSP 제어 센터에서 데이터 수집 위로 마우스를 가져간 다음 업로드 횟수를 클릭합니다. 관련 압축 파일을 선택합니다.</li>
</ol>6. 데이터 분석17
<ol><li>DSP 제어 센터에서 레코드를 클릭합니다. 대기열에서 스캔을 보려면 선택한 스캔을 대기열에 추가를 선택합니다| 내 분석 대기열. 제어 센터의 데이터 분석 옵션 위로 마우스를 가져간 후 대기열에서 새 스터디를 선택합니다.</li>
	<li>작업 표시줄 옵션에서 QC를 선택합니다. 기본값으로 계속하거나 원하는 경우 조정합니다. QC 실행을 선택하고 결과 표를 검토합니다. QC 실행을 클릭하여 계속 진행하고 새 데이터 세트를 만들고 값을 포지티브 하이브리드화 컨트롤로 정규화합니다.</li>
	<li>새 태그를 XLSX 파일로 가져옵니다. 검사 창에서 주석 관리를 선택한 다음, 템플릿을 다운로드하고, 태그를 삽입하고, 파일을 가져옵니다.</li>
	<li>선택 사항 : QC를 실행 한 후 다른 도구 모음 옵션을 사용하여 데이터를 추가로 조정하십시오. 시각화 창의 도구를 사용하여 변환된 데이터를 플로팅합니다.</li>
	<li>매개변수의 회색 드롭다운 상자를 탐색하여 시각화 창에서 각 플롯을 작성합니다. 플롯 내에서 특정 영역을 선택하여 스캔 창에서 강조 표시된 해당 세그먼트를 시각화하고 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 태그 또는 그룹을 생성합니다. 데이터 세트 요약 내에서 정규화, 스케일링 및 분석 및 표시를 위한 기타 옵션의 플롯을 검토합니다.</li>
	<li>저장할 아이콘을 선택하여 시각화를 저장합니다. 요약 아래에 이미 저장된 시각화를 검토합니다. 내보내기(.svg) 단추를 선택하여 시각화를 .svg 형식으로 내보냅니다. 시각화의 기반이 되는 데이터를 내보내기(.xlsx) 버튼을 클릭하여 내보냅니다. 두 번째 창의 데이터 세트 이름 위에 커서를 놓고 내보내기 아이콘을 클릭하여 특정 데이터 세트에 포함된 모든 데이터를 내보냅니다.</li>
</ol>

<ol><li>Pedersen, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migratory+patterns+of+lac-z+transfected+human+glioma+cells+in+the+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Migratory patterns of lac-z transfected human glioma cells in the rat brain.</a> International Journal of Cancer. 62 (6), 767-771 (1995).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasion+of+white+matter+tracts+by+glioma+stem+cells+is+regulated+by+a+NOTCH1-SOX2+positive-feedback+loop%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Invasion of white matter tracts by glioma stem cells is regulated by a NOTCH1-SOX2 positive-feedback loop.</a> Nature Neuroscience. 22 (1), 91-105 (2019).</li>
<li>Iwadate, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-mesenchymal+transition+in+glioblastoma+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Letters%22%5BJournal%5D)">Epithelial-mesenchymal transition in glioblastoma progression.</a> Oncology Letters. 11 (3), 1615-1620 (2016).</li>
<li>Tao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomics+and+prognosis+analysis+of+epithelial-mesenchymal+transition+in+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Genomics and prognosis analysis of epithelial-mesenchymal transition in glioma.</a> Frontiers in Oncology. 10, 183(2020).</li>
<li>Cuddapah, V. A., Robel, S., Watkins, S., Sontheimer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neurocentric+perspective+on+glioma+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A neurocentric perspective on glioma invasion.</a> Nature Reviews Neuroscience. 15 (7), 455-465 (2014).</li>
<li>Barthel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioma%3A+molecular+signature+and+crossroads+with+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+and+Metastasis+Reviews%22%5BJournal%5D)">Glioma: molecular signature and crossroads with tumor microenvironment.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 1 (1), 53-75 (2021).</li>
<li>Ziegler, D. S., Kung, A. L., Kieran, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-apoptosis+mechanisms+in+malignant+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Anti-apoptosis mechanisms in malignant gliomas.</a> Journal of Clinical Oncology. 26 (3), 493-500 (2008).</li>
<li>Berghoff, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+death+ligand+1+expression+and+tumor-infiltrating+lymphocytes+in+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Oncology%22%5BJournal%5D)">Programmed death ligand 1 expression and tumor-infiltrating lymphocytes in glioblastoma.</a> Neuro-Oncology. 17 (8), 1064-1075 (2015).</li>
<li>Merritt, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+digital+spatial+profiling+of+proteins+and+RNA+in+fixed+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue.</a> Nature Biotechnology. 38 (5), 586-599 (2020).</li>
<li>Van, T. M., Blank, C. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+user%27s+perspective+on+GeoMxTM+digital+spatial+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Immuno-Oncology+Technology%22%5BJournal%5D)">A user's perspective on GeoMxTM digital spatial profiling.</a> Immuno-Oncology Technology. 1, 11-18 (2019).</li>
<li>Garcia-Pardo, M., Calles, A. ROS-1 NSCLC therapy resistance mechanism. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGarcia-Pardo%2C+M+%22Precision+Cancer+Medicine%22">Precision Cancer Medicine</a>. , Online (2021).</li>
<li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+spatial+profiling+of+individual+glomeruli+from+patients+with+anti-neutrophil+cytoplasmic+autoantibody-associated+glomerulonephritis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Digital spatial profiling of individual glomeruli from patients with anti-neutrophil cytoplasmic autoantibody-associated glomerulonephritis.</a> Frontiers in Immunology. 13, 831253(2022).</li>
<li>Bergholtz, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Best+practices+for+spatial+profiling+for+breast+cancer+research+with+the+GeoMx+digital+spatial+profiler%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Best practices for spatial profiling for breast cancer research with the GeoMx digital spatial profiler.</a> Cancers. 13 (17), 4456(2021).</li>
<li>Brady, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inter-+and+intra-tumor+heterogeneity+of+metastatic+prostate+cancer+determined+by+digital+spatial+gene+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Inter- and intra-tumor heterogeneity of metastatic prostate cancer determined by digital spatial gene expression profiling.</a> Nature Communications. 12 (1), 1426(2021).</li>
<li>Kulasinghe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+multiplexed+digital+spatial+profiling+of+the+tumor+microenvironment+of+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Highly multiplexed digital spatial profiling of the tumor microenvironment of head and neck squamous cell carcinoma patients.</a> Frontiers in Oncology. 10, 607349(2021).</li>
<li>Wang, D. Y. -T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Case+study%3A+Digital+spatial+profiling+of+metastatic+clear+cell+carcinoma+reveals+intra-tumor+heterogeneity+in+epithelial-mesenchymal+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Case study: Digital spatial profiling of metastatic clear cell carcinoma reveals intra-tumor heterogeneity in epithelial-mesenchymal gradient.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>GeoMx DSP. Automated slide preparation user manual. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22GeoMx+DSP%22">GeoMx DSP</a>. , nanoString Technologies. Seattle, Washington. (2022).</li>
<li>Allam, M., Cai, S., Coskun, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+bioimaging+of+single-cell+spatial+profiles+for+precision+cancer+diagnostics+and+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Precision+Oncology%22%5BJournal%5D)">Multiplex bioimaging of single-cell spatial profiles for precision cancer diagnostics and therapeutics.</a> NPJ Precision Oncology. 4, 11(2020).</li>
<li>Wolchok, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overall+survival+with+combined+nivolumab+and+ipilimumab+in+advanced+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Overall survival with combined nivolumab and ipilimumab in advanced melanoma.</a> New England Journal of Medicine. 377 (14), 1345-1356 (2017).</li>
<li>Blank, C. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neoadjuvant+versus+adjuvant+ipilimumab+plus+nivolumab+in+macroscopic+stage+III+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Neoadjuvant versus adjuvant ipilimumab plus nivolumab in macroscopic stage III melanoma.</a> Nature Medicine. 24 (11), 1655-1661 (2018).</li>
<li>Matthews, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-enriched+hyaluronan+binding+%28BEHAB%29%2Fbrevican+cleavage+in+a+glioma+cell+line+is+mediated+by+a+disintegrin+and+metalloproteinase+with+thrombospondin+motifs+%28ADAMTS%29+family+member%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Brain-enriched hyaluronan binding (BEHAB)/brevican cleavage in a glioma cell line is mediated by a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs (ADAMTS) family member.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (30), 22695-22703 (2000).</li>
<li>Paganetti, P. A., Caroni, P., Schwab, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma+infiltration+into+central+nervous+system+tissue+in+vitro%3A+involvement+of+a+metalloprotease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma infiltration into central nervous system tissue in vitro: involvement of a metalloprotease.</a> Journal of Cell Biology. 107, 2281-2291 (1988).</li>
<li>Beliën, A. T., Paganetti, P. A., Schwab, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-type+1+matrix+metalloprotease+%28MT1-MMP%29+enables+invasive+migration+of+glioma+cells+in+central+nervous+system+white+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Membrane-type 1 matrix metalloprotease (MT1-MMP) enables invasive migration of glioma cells in central nervous system white matter.</a> Journal of Cell Biology. 144 (2), 373-384 (1999).</li>
<li>Coulie, P. G., Vanden Eynde, B. J., vander Bruggen, P., Boon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+antigens+recognized+by+T+lymphocytes%3A+At+the+core+of+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumour antigens recognized by T lymphocytes: At the core of cancer immunotherapy.</a> Nature Reviews Cancer. 14 (2), 135-146 (2014).</li>
<li>Finn, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccines+for+cancer+prevention%3A+a+practical+and+feasible+approach+to+the+cancer+epidemic%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">Vaccines for cancer prevention: a practical and feasible approach to the cancer epidemic.</a> Cancer Immunology Research. 2 (8), 708-713 (2014).</li>
<li>Sharma, P., Allison, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+immune+checkpoint+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The future of immune checkpoint therapy.</a> Science. 348 (6230), 56-61 (2015).</li>
<li>Chen, L., Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-PD-1%2FPD-L1+therapy+of+human+cancer%3A+past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Anti-PD-1/PD-L1 therapy of human cancer: past, present, and future.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (9), 3384-3391 (2015).</li>
<li>Cai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioma-Associated+stromal+cells+stimulate+glioma+malignancy+by+regulating+the+tumor+immune+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Glioma-Associated stromal cells stimulate glioma malignancy by regulating the tumor immune microenvironment.</a> Frontiers in Oncology. 11, 672928(2021).</li>
<li>Ishii,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological+characterization+of+the+tumorigenic+%26%2334%3Bperi-necrotic+niche%26%2334%3B+harboring+quiescent+stem-like+tumor+cells+in+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Histological characterization of the tumorigenic &#34;peri-necrotic niche&#34; harboring quiescent stem-like tumor cells in glioblastoma.</a> PLoS One. 11 (1), 0147366(2016).</li>
<li>Lewis, C. E., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+role+of+macrophages+in+different+tumor+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Distinct role of macrophages in different tumor microenvironments.</a> Cancer Research. 66 (2), 605-612 (2006).</li>
<li>NanoString. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CosMx+Spatial+Molecular+Imager%3A+True+Single-Cell+In+Situ+Solution%5BTitle%5D)+AND+%22NanoString%22%5BJournal%5D)">CosMx Spatial Molecular Imager: True Single-Cell In Situ Solution.</a> NanoString. , (2022).</li>
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저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

신경교종의 공격성에 잠재적으로 영향을 미칠 수 있는 단백질의 다양성과 이러한 단백질 중 일부가 발견되지 않은 상태로 남아 있다는 개념을 감안할 때 고처리량 단백질 정량 방법은 이상적인 기술적 접근 방식입니다. 또한 종양학 샘플의 공간 데이터가 종종 차등 발현18과 상관 관계가 있다는 점을 감안할 때 공간 프로파일링을 단백질 정량화 접근 방식에 통합하면 보다 효과적인 분석이 가능합니다.
DSP의 고처리량 접근 방식은 또한 산탄총과 같은 접근 방식으로 사용할 수 있으며, 이는 질병의 잠재적인 새로운 바이오마커 및 치료에 대한 반응을 발견하는 데 이상적입니다. 흑색종에 대한 두 연구에서 DSP는 이필리무맙 및 니볼루맙 대 니볼루맙 단독 요법19 과의 병용 요법과 이필리무맙 및 니볼루맙을 사용한 신보조 병용 요법과 표준 보조 요법20에 대한 반응을 평가하는 데...

확산 성 신경 교종은 성인에서 가장 흔한 유형의 악성 뇌종양이며 항상 치명적입니다. 신경 교종 세포가 뇌에서 광범위하게 이동하는 경향은 주요 치료 과제입니다. 그들이 확산되는 메커니즘에는 직접 이주와 확인되지 않은 침략이 포함됩니다. 침습성 신경교종 세포는 백질 관1을 따라 향성과 이동을 나타내는 것으로 나타났으며, 최근 연구에서는 이러한 관의 탈수초화를 활성 원발성 특징2으로 암시합니다. 침습은 상피에서 중간엽으로의 전이에 의해 매개되며, 여기서 신경교종 세포는 세포외 기질 단백질 및 세포 부착 분자를 코딩하는 유전자의 발현을 감소시키고, 이동을 증폭하고, 종양 미세 환경을 통한 전파를 촉진함으로써 중간엽 특성을 획득한다 3,4,5.
분자 수준에서 세포 안정성을 부여하고 면역 원성 성분과의 인터페이스를 부여하는 여러 단백질의 파괴가 입증되었습니다6. 침윤성 신경교종은 항-세포사멸(예를 들어, PTEN) 특성을 갖는 단백질의 억제를 겪는 것으로 알려져 있다7. 또한 숙주 면역 반응의 회피를 촉진하는 단백질(예: PD1/PDL1)을 과발현합니다8. 이러한 복잡한 경로의 조절 장애는 종양 유발성을 향상시키고 악성 가능성을 증가시킵니다.
침습성 신경교종 샘플 내에서 목표는 세포 성장, 생존 및 증식에 중요한 단백질의 차등 발현과 침습성 및 비침습적 구성 요소 간의 미세 환경 구조적 무결성을 평가하는 것이었습니다. 또한, 우리는 활성 면역원성 역할을 하는 단백질의 차등 조절을 연구하여 손상된 숙주 면역 방어가 신경교종의 증식 및 침습 잠재력을 향상시킬 수 있는 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하고자 했습니다. 이것은 면역 마커와 악성 종양의 조절 장애 동인이 면역 요법의 표적이 될 수 있음을 보여주는 최근의 광범위한 연구를 고려할 때 특히 관련이 있습니다. 면역감시 및 반응성에 관여하는 많은 단백질 중에서 실행 가능한 치료 표적을 식별하려면 매우 민감하고 포괄적인 접근 방식이 필요합니다.
연구할 수 있는 다양한 후보 단백질을 감안할 때, 우리는 면역조직화학과 유사하지만 데이터 처리 효율성이 향상된 방법을 모색했습니다. 암 생물학 분야에서 DSP는 단백질체학 분석 및 정량화를 위한 대체 도구에 비해 중요한 이점을 가진 강력한 기술로 부상했습니다. DSP의 특징은 시료 내 여러 단백질을 동시에 연구할 수 있는 고처리량 멀티플렉싱 기능으로, 면역조직화학(IHC)9,10과 같은 표준이지만 낮은 플렉스 기술과 중요한 차이점을 나타냅니다. DSP의 멀티플렉스 기능은 DSP와 IHC를 비교한 연구에서 입증된 바와 같이 정량적 및 분석 도구로서의 충실도를 손상시키지 않습니다. 예를 들어 비소세포 폐암 표본의 단백질체학적 정량화에 사용되는 경우, DSP는 IHC11과 유사한 결과를 갖는 것으로 나타났다. 또한 DSP는 사용자가 단백질체 분석을 수행할 영역을 수동으로 정의할 수 있는 사용자 지정 가능한 지역 사양을 제공합니다. 이것은 전체 섹션 멀티플렉스 방법10,12에 비해 이점을 제공합니다. 따라서 DSP는 단일 처리 라운드에서 여러 관심 영역에 걸쳐 여러 단백질 표적을 조사하여 여러 계층의 분석을 제공합니다.
DSP는 여러 가지 병리학 적 환경에서 적용됩니다. DSP는 공간적 변이가 세포 형질전환 및 차등 단백질 발현과 상관관계가 있을 수 있기 때문에 종양학적 분석에서 특히 유리합니다. 예를 들어, DSP는 유방암의 단백질체학 프로파일을 인접한 종양 미세환경과 비교하는데 사용되었다. 이것은 이 종양의 자연사와 그 진행, 그리고 치료13에 대한 잠재적 반응을 이해하는 데 중요한 의미를 담고 있습니다. DSP의 다양성을 보여주는 추가 컨텍스트에는 전립선암14에서 단백질 다양성의 공간 정량화, 두경부 편평 세포 암종에서 면역 세포 마커 발현과 질병 진행의 연관성15, 전이성과 원발성 투명 세포 난소암을 구별하는 단백질 발현의 상피-중간엽 구배의 입증16 . DSP를 구현함으로써 우리는 종양 발생 및 신경교종의 침습에 영향을 미칠 수 있는 단백질의 공간 지형을 특성화합니다.

<table><tbody><tr><td>BOND 연구 검출 시스템</td><td>Leica Biosystems, Wetzlar, Germany</td><td>DS9455</td><td>시약 트레이에 열린 용기를 포함하는 개방형 검출 시스템</td></tr><tr><td>BOND Wash</td><td>Leica Biosystems, Wetzlar, Germany</td><td>AR950</td><td>고정 조직 세척용 10X 농축 완충액</td></tr><tr><td>Buffer W</td><td>NanoString, Seattle, WA</td><td>연락처 회사</td><td>차단 시약</td></tr><tr><td>Cy3 접합 키트</td><td>Abcam, Cambridge, UK</td><td>AB188287</td><td>Cy3 형광 항체 접합 키트</td></tr><tr><td>GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP)</td><td>NanoString, Seattle, WA</td><td>연락처 회사</td><td>단백질 및 RNA 표적 이미징 및 특성화 시스템</td></tr><tr><td>GeoMx DSP Instrument BufferKit</td><td>NanoString, Seattle, WA</td><td>100471</td><td>GeoMX DSP용 버퍼 키트(샘플 처리 및 준비용 버퍼 포함)</td></tr><tr><td>GeoMx Hyb 코드 Pack_Protein</td><td>NanoString, Seattle, WA</td><td>121300401</td><td>GeoMX DSP experiemtns 실행을 위한 컨트롤</td></tr><tr><td>GeoMx 면역 세포 패널(Imm 세포 Pro_Hs)</td><td>NanoString, Seattle, WA</td><td>121300101</td><td>인간 면역 세포 및 면역 종양 표적을 대상으로 하는 단백질 모듈</td></tr><tr><td>GeoMx Pan-Tumor Panel (Pan-Tumor_Hs)</td><td>NanoString, Seattle, WA</td><td>121300105</td><td>여러 인간 종양 유형 및 상피-중간엽 전이 마커를 대상으로 하는 단백질 모듈</td></tr><tr><td>GeoMx 단백질 슬라이드 준비 FFPE</td><td>NanoString, 시애틀, 워싱턴</td><td>121300308</td><td>GeoMX DSP 단백질 분석을 위한 시료 전처리 시약</td></tr><tr><td>LEICA Bond RX</td><td>Leica Biosystems, Wetzlar, Germany</td><td>연락처 회사</td><td>완전 자동화된 IHC 염색기</td></tr><tr><td>Master Kit--12 반응</td><td>NanoString, Seattle, WA</td><td></td><td>100052 nCounter 분석 시스템과 함께 사용하기 위한 재료 및 시약</td></tr><tr><td>nCounter 분석 시스템</td><td>NanoString, Seattle, WA</td><td>연락처 회사</td><td>다중 표적 발현 정량화를 위한 자동화 시스템(GeoMx DSP와 함께 사용)</td></tr><tr><td>TMA Master II</td><td>3DHistech Ltd., Budapest, Hungary</td><td></td><td>조직 마이크로어레이 블록을 생성하기 위해</td></tr></tbody></table>

성인형 미만성 침윤성 신경교종의 미세환경 특성화를 위한 디지털 공간 프로파일링

Digital Spatial Profiling for Characterization of the Microenvironment in Adult-Type Diffusely Infiltrating Glioma

확산 침윤성 신경 교종은 종양 확산의 침윤성 특성으로 인해 높은 이환율 및 사망률과 관련이 있습니다. 그들은 형태학적으로 복잡한 종양으로, 종양 자체와 이질적인 미세 환경 모두에서 높은 수준의 단백질체 가변성을 가지고 있습니다. 이러한 종양의 악성 잠재력은 세포 안정성을 유지하고 미세 환경의 구조적 완전성을 보존하는 과정을 포함하여 여러 주요 경로에 관여하는 단백질의 조절 장애에 의해 향상됩니다. 수많은 벌크 및 단일 세포 신경교종 분석이 있었지만 이러한 단백질체 데이터의 공간적 계층화가 상대적으로 부족합니다. 내인성 종양, 침습성 가장자리 및 미세 환경 간의 종양 발생 인자와 면역 세포 집단의 공간적 분포의 차이를 이해하면 종양 증식 및 전파의 기본 메커니즘에 대한 귀중한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 디지털 공간 프로파일링(DSP)은 이러한 중요한 다층 분석의 토대를 형성할 수 있는 강력한 기술입니다.
DSP는 조직 표본의 사용자 지정 공간 영역 내에서 단백질 발현을 효율적으로 정량화하는 방법입니다. DSP는 구별 영역 내 및 여러 단백질의 차별적 발현을 연구하는 데 이상적이며 여러 수준의 정량적 및 정성 분석이 가능합니다. DSP 프로토콜은 체계적이고 사용자 친화적이어서 단백질체 데이터의 맞춤형 공간 분석이 가능합니다. 이 실험에서 조직 마이크로 어레이는 보관 된 교 모세포종 코어 생검으로 구성됩니다. 다음으로, 항체 패널이 선택되어 샘플 내에서 관심 단백질을 표적으로 합니다. UV 광절단 가능한 DNA 올리고뉴클레오티드에 전접합된 항체는 밤새 조직 샘플과 함께 배양됩니다. 항체의 형광 현미경 시각화에서 단백질 발현을 정량화할 관심 영역(ROI)이 샘플과 함께 정의됩니다. 그런 다음 UV 광선이 각 ROI로 향하여 DNA 올리고뉴클레오티드를 절단합니다. 올리고뉴클레오티드는 각 ROI 내에서 미세 흡기 및 계수되어 공간 기준으로 해당 단백질을 정량화합니다.

도 4 는 교모세포종의 샘플에 대해 수행된 DSP 실험으로부터의 대표적인 결과를 나타낸다. DSP 소프트웨어를 사용하여 데이터를 시각적으로 캡처하는 방법 중 하나를 보여주는 히트 맵이 제공됩니다. 행은 단백질 표적을 나타내며 각 열은 관심 영역에 해당합니다. 파란색에서 빨간색의 색상 범위는 각각 낮은 표현에서 높은 표현을 나타냅니다. 행 내 색상의 가변성은 지역 단백질 이질성을 반영하고 차등 단백질 발현과의 가능한 공간적 연관성을 시사합니다. 예를 들어, 본 실험에서 S100 및 CD56은 신경 마커이기 때문에 보편적으로 높습니다.
변동성이 가장 큰 마커에는 B7-H3, Ki-67, CD44 및 피브로넥틴이 포함되었습니다. 이러한 마커는 각각 종양 증식, 이동 및 전이와 중요한 연관성을 가지고 있습니다. 따라서 악성 코어, 악성 침범 및 비 악성 조직의 샘플 사이에 지역적 변동성을 나타내는 것이 합리적입니다. 수치 데이터 표현...

단백질체 조절 장애는 확산 침윤성 신경교종의 확산에 중요한 역할을 하지만 몇 가지 관련 단백질은 아직 확인되지 않았습니다. 디지털 공간 처리(DSP)는 침윤성 신경교종의 침습 및 이동에 기여할 수 있는 후보 단백질의 차등 발현을 특성화하기 위한 효율적인 고처리량 접근 방식을 제공합니다.

Diffusely infiltrating gliomas are associated with high morbidity and mortality due to the infiltrative nature of tumor spread. They are morphologically ...

디지털 공간 프로파일링(DSP)은 공간적으로 계층화된 단백질 정량화를 위한 효율적인 방법을 제공합니다. 이를 구현하면 종양과 미세 환경의 별개 영역에서 단백질 발현을 특성화 할 수 있습니다. DSP의 주요 기능은 높은 처리량의 데이터 처리를 가능하게 하는 멀티플렉싱 기능입니다.사용자 지정된 관심 영역을 정의하는 기능은 데이터 분석에 공간 차원을 추가로 제공합니다. DSP는 공간적으로 정량화하는 단백질 또는 RNA 발현이 병리학적 또는 생리학적 과정을 밝히는 데 도움이 될 수 있는 모든 샘플에 적용될 수 있습니다. 이것은 특히 지역 표적 변동성이 악성 성장 또는 침습과 관련이있을 수있는 종양학과 관련이 있습니다.이 절차를 시연하는 것은 조직 공학자 인 Scott Palisoul과 게놈 기술자 인 Rachael Barney입니다. 슬라이드를 준비하려면 먼저 각 생검에서 여러 개의 2mm 코어를 가져와 단일 조직 마이크로 어레이 블록에 넣습니다. 블록에서 4 미크론 섹션을 잘라 유리 슬라이드에 장착하십시오.각 슬라이드를 슬라이드 홀더 개스킷 안에 넣고 섭씨 60도에서 30분 동안 배양합니다. 반자동 IHC 시스템에서 슬라이드 당 150 마이크로 리터의 세척 버퍼와 5 밀리리터의 데드 볼륨으로 위치 1의 용기를 채우고 뚜껑을 열어 둡니다. 용기의 위치 2에 동일한 양의 차단 용액을 채 웁니다.시약 용기 트레이를 기계에 로드합니다. 프로세스 IHC를 선택한 다음 마커 필드의 드롭다운 상자에서 차단 솔루션 이름을 선택합니다. 모든 슬라이드에 대해 완료되면 닫기를 클릭합니다.그런 다음 레이블 인쇄를 클릭하고 모든 슬라이드 레이블이 아직 인쇄되지 않음을 선택하고 인쇄를 클릭합니다. 슬라이드 상단에 레이블을 부착합니다. 슬라이드를 슬라이드 트레이에 올려 샘플과 라벨이 위를 향하도록 합니다.LED 버튼을 눌러 트레이를 내리고 기기가 슬라이드 스캔 및 인식을 시작하도록 합니다. 시작 버튼을 클릭하여 실험을 시작합니다. 주행이 완료되면 녹색으로 깜박이면 LED 버튼을 누릅니다.기기에서 트레이를 제거하고 각 슬라이드에서 커버 타일을 조심스럽게 들어 올립니다. 슬라이드를 1X 인산염 완충 식염수에 넣습니다. 과도한 완충액을 제거하고 소수성 펜으로 각 조직 섹션의 윤곽을 그리며 소수성 장벽을 만듭니다.슬라이드 당 각 항체의 8 마이크로리터를 첨가하고 버퍼 W를 사용하여 200 마이크로리터의 최종 부피에 도달함으로써 항체 PC 올리고 용액을 만든다. 이어서, 항체 PC 올리고 용액을 슬라이드에 적용하고, 슬라이드를 섭씨 4도에서 밤새 배양한다. 배양 후 슬라이드를 가습 트레이에 넣고 1X TBST에서 10분 동안 세 번 세척합니다.실온에서 30분 동안 4%파라포름알데히드에 사후 고정한 후 1X TBST에서 5분 동안 두 번 세척합니다. 실온에서 15분 동안 SYTO 13 핵 염색을 첨가한 다음, 1X TBST로 2회 세척하였다. 제어 센터의 데이터 수집 위에 마우스를 놓고 새로 만들기 또는 계속 실행을 선택합니다.레이블이 사용자를 향하도록 슬라이드 홀더에 슬라이드를 놓습니다. 슬라이드 트레이 cl을 내립니다.amp 길쭉한 창에서 조직이 보이도록 합니다. 6밀리리터의 버퍼 S를 추가합니다.제어 센터의 지시를 따릅니다.x 및 y 슬라이더로 여러 축 사이를 확대하여 스캔할 영역을 표시합니다. 스캔(Scan)을 선택하고 정의된 전체 대상 영역이 이미징될 때까지 스캔을 진행합니다. 20 번 이미지를 생성합니다.각 조직 코어에 대해 직경이 250마이크로미터인 동일한 크기의 원형 ROI 3개를 선택하여 ROI를 정의합니다. 스캔 작업 영역 종료 버튼을 클릭하여 ROI를 승인합니다. 그런 다음 UV 광선이 항체에서 올리고를 절단할 때까지 기다립니다.장비 청소 프로세스를 완료한 후 새 데이터 수집을 선택하여 현재 슬라이드 또는 플레이트를 계속 진행합니다. 플레이트 아이콘 영역을 두 번 클릭하여 완성된 플레이트 창을 엽니다. 하이브리드화 코드 팩 로트 번호를 입력하고 업데이트를 클릭합니다.그런 다음 완료를 클릭하십시오. 프롬프트에 따라 슬라이드 홀더와 수집 플레이트를 분리합니다. 슬라이드를 TBST에 보관하거나 수성 매체로 덮고 장기 보관을 위해 슬립을 덮으십시오.투과성 씰을 사용하여 플레이트를 밀봉하고 상단이 열린 상태에서 열 순환기에서 섭씨 65도에서 흡인물을 건조시킵니다. 7마이크로리터의 디에틸 피로카보네이트 처리된 물을 넣고 혼합합니다. 실온에서 10 분 동안 배양 한 다음 빠르게 회전시킵니다.텍스트 프로토콜에 설명된 대로 방정식을 적용하는 적절한 프로브 R 및 프로브 U 방정식을 선택하여 프로브 버퍼 믹스를 준비합니다. 84마이크로리터의 프로브 버퍼 혼합물을 각 하이브리드화 코드 팩에 추가합니다. 새로운 96웰 하이브리드화 플레이트에서 각 하이브리드화 코드 마스터 믹스 8마이크로리터를 표시된 행의 12웰 모두에 추가합니다.7 마이크로리터를 DSP 수집 플레이트로부터 하이브리드화 플레이트의 상응하는 웰로 옮긴다. 가열 밀봉하고 플레이트를 회전시킨 다음 섭씨 67도에서 밤새 배양합니다. 배양 후, 얼음 위에서 플레이트를 식히고 빠른 회전을 수행하십시오.각 웰의 하이브리드화 제품을 스트립 튜브에 모으고 각 웰을 5회 부드럽게 피펫팅합니다. 스핀다운하고 스트립 튜브를 분석 시스템에 로드합니다. DSP 기기에서 CDF 파일을 USB 드라이브에 저장하고 데이터를 디지털 분석기로 전송합니다.화면에서 처리 시작을 누릅니다. 고감도를 선택하고 다음을 선택합니다. 샘플이 있는 웰 수에 대해 모두 선택을 누른 다음 Finish(마침)를 누른 후 이메일 알림에서 다음을 누릅니다.그런 다음 시작을 클릭하십시오. 준비 스테이션이 완료되면 카트리지를 밀봉하고 디지털 분석기로 옮깁니다. 계산 시작을 누릅니다.스테이지 위치를 선택합니다. 기존 CDF 파일 로드를 누르고 이전에 업로드한 파일을 선택합니다. 완료를 누릅니다.스테이지 위치를 다시 선택하고 완료를 누른 다음 시작을 눌러 프로그램을 실행합니다. 리포터 카운트 변환 파일의 ZIP 파일을 분석 시스템에서 USB 드라이브로 저장합니다. 드라이브를 DSP 시스템에 삽입합니다.DSP 제어 센터에서 데이터 수집 위로 마우스를 가져간 다음 계정 업로드를 클릭합니다. 관련 ZIP 파일을 선택합니다. DSP 제어 센터에서 레코드를 클릭합니다.대기열에서 스캔을 보려면 선택한 스캔을 대기열에 추가, 내 분석 대기열을 차례로 선택합니다. 제어 센터의 데이터 분석 옵션 위로 마우스를 가져가 대기열에서 새 스터디를 선택합니다. 교모세포종 샘플에 대해 DSP 실험을 수행하였고, 그 결과를 히트맵으로 시각화하였다.행은 단백질 표적을 나타내며 각 열은 관심 영역에 해당합니다. 표현 수준은 낮은 표현을 나타내는 파란색에서 높은 표현을 나타내는 빨간색까지 다양한 색상 범위로 표시됩니다. 행 내 색상의 가변성은 지역 단백질 이질성을 반영하며 차등 단백질 발현과의 가능한 공간적 연관성을 시사합니다.이 실험에서 S100과 CD-56은 신경 마커이기 때문에 보편적으로 높았습니다. 가장 가변성이 높은 마커에는 B7-H3, KI-67, CD-44 및 피브로넥틴이 포함되며, 이들은 종양 증식, 이동 및 전이와 관련된 것으로 알려져 있습니다. 광범위한 후보 대상 중에서 DSP는 상당한 지역적 차이를 보이는 대상을 식별할 수 있습니다.이것은 변동성 및 질병과의 관련성과 관련된 요인을 조사하기위한 토대를 마련합니다.

digital-spatial-profiling-for-characterization-microenvironment-adult

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

이 프로토콜은 chromogenic immunohistochemistry 및 ImageJ를 사용하여 glioblastoma 환자 절제술에서 종양 microenvironment 구성 요소를 정량적으로 식별하기 위해 개발되었습니다.

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Neurospheres 3D 문화로 성장 glioma 생물학을 공부 하는 강력한 도구를 구성 합니다. 여기 선물이 immunohistochemistry 파라핀 포함 통해 glioma neurospheres의 3 차원 구조를 유지 하면서 수행 하는 프로토콜. 이 메서드는 stemness 등 신경 분화 glioma neurosphere 속성의 특성을 수 있습니다.

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신경교종 암 세포 이동에 대한 신경교암 억제제의 효과는 히스톤 탈아세틸라제(HDAC) 억제제를 이용한 3차원(3D) 침입 분석에 대한 고해상도 공초점 현미경검사법을 특징으로 한다.

고분해능 공초점 현미경검사법에 의한 3D 종양 스페로이드 침습에 대한 Migrastatic 억제제의 특성화

레이저 미세 해부 (LMD)는 신경교종 이질성과 침략을 중재하는 통로를 밝히기 위하여 이용될 수 있는 민감하고 높게 재현가능한 기술입니다. 여기에서, 우리는 전사성 분석에 선행된 레이저 LMD를 사용하여 신경교종 조직에서 이산 지역을 격리하기 위하여 최적화된 프로토콜을 기술합니다.

종양 내 이질성, 온코스트림 및 침략의 공간 및 분자 특성화를 위한 신경교종 소구역의 레이저 캡처 미세 분해

여기서는 패턴 뉴런에서 교모세포종(GBM) 마이그레이션을 분석하기 위해 사용하기 쉬운 공동 배양 분석을 제시합니다. 우리는 뉴런에 GBM 세포 마이그레이션의 쉬운 정량화를 위한 FiJi 소프트웨어에 있는 매크로를 개발하고, 뉴런이 GBM 세포 침습 용량을 수정한다는 것을 관찰했습니다.

이동 및 세포 상호 작용을 연구하기 위해 패턴 뉴런에 교모 세포 종 줄기 와 같은 세포의 공동 배양

이 연구는 소아 미만성 정중선 신경아교종 세포주에 적용되는 생3D 세포 면역세포화학 프로토콜을 제시하며, 3D 세포 침습 및 이동과 같은 동적 과정에서 원형질막에서 단백질의 발현을 실시간으로 연구하는 데 유용합니다.

소아 미만성 정중선 신경아교종의 Live-3D-Cell Immunocytochemistry Assays

이 작업은 3D 뇌종양 모델, 즉 시험관 내 배양, 생체 내 모델 및 생체 내 쥐 모델에서 구현하기 위한 유연한 상호 디지털화 전극의 개발을 설명합니다. 제안된 방법은 상이한 수준의 복잡성에서 종양에 대한 펄스 전기장의 효과를 평가하기 위해 사용될 수 있다.

교모세포종의 펄스 전기장 치료를 위한 유연한 유기 전자 장치

간질액 흐름을 포함하는 침습적 전면부에서 신경교종 종양 미세환경을 복제하는 방법을 제시합니다. 이 모델은 유체 압력 헤드를 적용할 수 있는 조직 배양 삽입물에 포함된 히알루론산-콜라겐 I 하이드로겔입니다. 침입을 정량화할 수 있으며 세포를 분리하거나 용해할 수 있습니다.

간질 흐름이 있는 침습적 신경교종 미세환경의 광중합 가능한 히알루론산-콜라겐 모델

IDH1 돌연변이 미만성 저등급 신경교종은 배양이 어려운 희귀 종양입니다. IDH1 돌연변이 단백질 발현을 보존하고 수개월 동안 배양을 유지하는 간단한 비효소 외식 방법을 소개합니다. 중요한 것은 이 기술이 동결 보존된 종양에 작용하여 신경교종 연구에 귀중한 자원을 제공한다는 것입니다.

IDH1 돌연변이 미만성 저등급 신경교종의 외식 배양을 위한 프로토콜

여기에서 우리는 세포외 플럭스 분석을 통해 3차원(3D) 신경아교종 스페로이드와 이미징 기반 정규화를 통합하는 대사 프로파일링 플랫폼을 구축합니다. 이 접근법을 통해 약물 치료에 대한 종양 대사 반응을 보다 정확하게 평가할 수 있으며 잠재적인 내성 메커니즘에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다.

약물 스크리닝을 위한 3차원 뇌종양 스페로이드의 대사 프로파일링의 발전

배우세요 디지털 공간 프로파일링(DSP)을 활용한 성인형 미만성 침윤성 신경교종의 미세환경 특성화 방법입니다. 이 기술은 종양 영역별 단백질 발현을 정량화하여 침윤 및 성장 관련 바이오마커를 식별합니다.

성인형 미만성 침윤성 신경교종의 미세환경 특성화를 위한 디지털 공간 프로파일링

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