Name: Theilers 쥐 뇌척수염 바이러스를 이용한 감염성 병인의 간질 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-23T12:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 33 s
Description: 배우세요 Theiler's 쥐 뇌척수염 바이러스를 이용한 감염성 간질 모델링 방법을 C57BL/6 마우스에서. 중추신경계 감염 후 발작 기전과 항간질 치료제 효능 평가에 활용됩니다.

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SB는 FU Berlin의 시작 보조금으로 지원됩니다. KSW는 R37 NS065434 및 ALSAM 재단의 지원을 받습니다. LAB은 D-SPAN 어워드 1F99NS125773-01의 지원을 받습니다. Theiler 바이러스와 현미경 지원을 위한 University of Utah Cell Imaging Core Facility를 제공해 주신 Robert Fujinami 박사에게 감사드립니다.

설명된 모든 절차는 해당 당국의 승인을 받았습니다. 동물은 "실험실 동물의 관리 및 사용 가이드"(National Research Council)의 권장 사항과 공중 보건 서비스 정책 및 유타 대학교의 기관 동물 관리 및 사용 위원회, 동물 프로토콜(번호: 21-11009, 약리학 및 독성학과) 및 Freie Universität Berlin(프로토콜: G0015/21, LAGeSo Berlin, Institute of Pharmacology and Toxicology)를 각각 참조한다. 도 3 및 도 5 에 나타낸 결과는 33.9-42502-04-11/0516 및 33.9-42502-04-15/1892 (LAVES Oldenburg, Dept. of Pharmacology, Toxicology, and Pharmacy, University of Veterinary Medicine Hannover)에 따라 승인되었다.
1. 연구 설계를위한 고려 사항 및 준비
<ol><li>바이러스<ol><li>Daniel의 TMEV 균주는 유타 대학의 Robert Fujinami가 친절하게 제공했습니다. 원래는 하버드 식민지20의 마우스에서 분리되었습니다. TMEV를 취급하기 전에 각 국가의 생물학적 제제에 대한 특정 분류 및 규정을 찾아보고 규정 준수를 보장하기 위해 기관 생물 안전 담당자와 논의하십시오. 전형적으로, TMEV는 균주 및 유전자 변형에 따라 BSL 2로 분류된다. 대부분의 동물에서 발작을 유도하는 데 필요한 표준 용량은 3 x 105 플라크 형성 단위 (PFU)입니다. 참고: 예를 들어 형질전환 마우스를 사용하는 경우 용량을 조정해야 할 수 있습니다. 전반적으로, 2 x 104 PFU와 2.44 x 107 PFU 사이의 역가가 성공적으로 발작을 유도하는 데 사용되었습니다. 대조군 동물은 멸균 PBS를 받고 발작을 경험하지 않습니다. 이 바이러스는 인간을 감염시키지 않습니다. 그러나 실험자는 PPE(실험복, 장갑, 보안경)를 항상 착용해야 하며, 쥐 사체와 침구는 폐기 전에 고압증기멸균을 해야 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>마리<ol><li>발작을 유도하고 조사하기 위해서는 다른 마우스 균주(예: SJL/J, FVB/N 또는 Balb/c 마우스)가 반드시 발작을 나타내는 것은 아니므로 B6J 마우스를 사용한다5. 암컷 마우스와 수컷 마우스의 급성 발작 빈도는 차이가 없다5. 청소년에서 성인 마우스(5-6주령부터 시작)에 대한 실험을 수행합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>다이어트<ol><li>식이 요법은 질병 중증도에서 실험실 간 변동성의 한 원인으로 결정되었습니다. 따라서 식단을 변동22의 잠재적 요인으로 고려하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>그룹 크기<ol><li>이 모델에서 모든 동물이 급성 또는 만성 발작을 일으키는 것은 아니므로 복합 테스트를 위해 약 20마리의 마우스/그룹을 사용하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>동물 복지<ol><li>현지 IACUC 가이드라인에 의해 결정된 관찰 시간(예: 48시간) 후 마우스가 연구 화합물의 감염 또는 투여로 인해 심각한 부작용(예: 혼수, 그루밍 불량, 과도한 발적 및 상처로부터의 화농성 분비물)을 나타내는 경우 마우스를 인도적으로 안락사시킵니다.</li>
		<li>감염 기간 동안 극심한 체중 감소(&gt;20%)를 보이는 마우스를 인도적으로 안락사시킵니다.</li>
		<li>동물이 제대로 먹지 않으면 소아용 전해질 용액 또는 이와 유사한 것을 적신 보충 펠릿에 접근할 수 있도록 하십시오.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 바이러스 접종
<ol><li>주사 주사기의 살균<ol><li>인슐린 주사기의 캡을 제거합니다. 폴리에틸렌 튜브를 바늘 주위에 고리로 추가하여 2.5mm의 적절한 사출 깊이를 보장합니다. 주사기를 에탄올에 30분 동안 담그십시오. 주사기를 자외선 아래에 30분 동안 두십시오.</li>
		<li>캡을 바늘에 다시 끼우십시오. 주사기를 멸균 파우치에 싸서 테이프로 닫습니다. 준비 날짜가 적힌 라벨.</li>
	</ol></li>
	<li>바이러스 주입<ol><li>-80°C 냉동고에서 Daniel의 TMEV 균주 분취량을 가져옵니다. 바이러스를 해동하고 얼음 위에 보관하십시오. 바이러스를 해동하고 다시 얼리지 마십시오. 바이러스 현탁액(20μL의 PBS 또는 DMEM 배양 배지에 희석된 3 x 105 PFU)을 주사기에 넣습니다. 주의: 이 바이러스는 생쥐에게는 전염되지만 사람에게는 전염되지 않습니다.</li>
		<li>소독제로 벤치를 청소하고 흄 흡수기 아래에서 작업하십시오. 바이러스 접종은 멸균이 아니지만 가능한 한 깨끗합니다.</li>
		<li>마우스를 마취 유도실로 옮기고 산소에 2% 이소플루란을 사용하여 마취를 유도합니다. 수술 내성에 도달하는 데 몇 분이 걸립니다. 동물의 호흡과 마취 깊이에 따라 농도를 조정하십시오.</li>
		<li>후드 아래의 마취 상자에서 마취 된 마우스를 옮깁니다. 예를 들어 발가락 꼬집음으로 수술 내성을 확인하십시오. 전체 절차는 30 초 이내에 수행되므로 동물은 주사 중에 이소 플루 란을 흡입 할 필요가 없습니다. 각막의 건조를 방지하기 위해 눈 연고를 첨가하십시오.</li>
		<li>알코올 패드로 동물의 머리를 청소하십시오. 주사 부위가 위쪽을 향하도록 마우스의 머리를 약간 왼쪽으로 기울입니다.</li>
		<li>피부를 약간 뒤로 당기고 바늘을 머리에 삽입하고 우반구의 측두엽 (오른쪽 눈의 후방 및 내측)에 2.5mm 깊이까지 20μL를 피질 내 주사합니다.</li>
		<li>모든 동물에서 동일한 반구에서 일방적으로 주사를 수행하십시오. 눈과 귀를 두정엽 피질의 위치에 대한 랜드 마크로 사용하십시오. 배치는 이전에 조직학적으로 확인되었습니다. 그림 1을 참조하십시오. 브레그마와 관련된 정위 주입에 따른 주입 좌표는 -2.0(AP)입니다. +3.0 (ML); −1.5 (DV)입니다.</li>
		<li>주사기를 5-15초 동안 그대로 두십시오. 주사로 인한 누출이 있거나 기포가 보이면 기록하십시오.이 경우 새 주사기를 준비하십시오. 주사기를 조심스럽게 빼낼 때 약간 돌립니다. 마취 상태에서 건조를 방지하기 위해 눈 연고를 바르십시오.</li>
		<li>선택 사항: 현지 절차에 따라 꼬리나 귀에 동물을 코딩합니다(선택 사항이지만 동물이 의식을 잃기 때문에 쉽습니다).</li>
		<li>동물을 마취에서 회복하는 동안 가열 패드(35-40 °C)를 반쯤 켜거나 반쯤 떼어낸 새 케이지로 옮깁니다. 흉골 누운 자세를 유지하기에 충분한 의식을 회복 할 때까지 동물을 방치하지 마십시오. 참고: 동물은 회복 후 다시 집단 사육될 수 있습니다(감염된 동물은 모의 감염된 동물과 혼합되지 않음). 감염된 마우스는 감염되지 않은 마우스와 같은 방에 보관해서는 안됩니다.</li>
		<li>처음 7일 동안 생쥐의 체중을 추적하여 감염 후 체중이 감소하고 추가 먹이가 필요할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63673/63673fig01.jpg"> 그림 1: TMEV 주입 절차의 개략도. 왼쪽에서 오른쪽으로: 오른쪽 두정엽 피질 주사의 경우 바늘을 눈과 반대쪽 귀 사이의 가상선의 약간 측면으로 주입합니다. 깊이 조절을 위한 칼라는 노란색으로 표시되어 있습니다. 주사관은 화살표로 표시된 관상 동맥 뇌 섹션에서 볼 수 있습니다. 주입 부위는 화살표 위에 주어진 좌표에 해당합니다. 오른쪽 이미지는 해마 형성의 CA1 내에서 Theiler 바이러스 (보라색)의 분포를 보여줍니다. 그림은 biorender.com 를 사용하여 준비되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63673/63673fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
3. 화합물 테스트
<ol><li>화합물 제조<ol><li>제형 지침을 검토하십시오. 권장 사항 또는 제공된 지침에 따라 차량 솔루션을 준비하십시오. 예를 들어, 항 경련제 레비 티라 세탐 (LEV)에 대한 절차가 제시됩니다. LEV는 350mg/kg의 용량에서 발작 부담을 차량 수준의 30%-40%로 줄입니다. 이 연구에 사용된 비히클은 0.5% 메틸셀룰로스입니다.</li>
		<li>화합물에 따라 복용량을 계산하십시오. 계산에 따라 약물의 무게를 잰다. 1kg의 마우스를 치료하려면 350mg의 LEV를 측정하십시오.</li>
		<li>제형 지침(예: 초음파 처리, 비히클 부형제 등)의 지시에 따라 적절한 부피의 비히클 용액으로 저장 용액을 준비합니다. 마우스의 주입 부피 0.01mL/g을 고려할 때 1kg의 주입 부피는 10mL와 350mg의 LEV가 되어 용액은 35mg/mL가 됩니다19. 계산 및 용량(mg/kg) 및 부피(mL)를 보고합니다. 참고: 예시적인 프로토콜은 보충 자료 2의 1페이지에서 찾을 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>복합 투여<ol><li>케이지를 비히클 또는 화합물 그룹으로 랜덤화합니다. 간질 발병 기전에 대한 연구 또는 검증 목적으로 모의 감염된 마우스를 사용하지만 일상적인 약물 스크리닝에는 사용하지 마십시오.</li>
		<li>온도, 습도, 시간 등과 같은 환경 조건을 보고합니다.</li>
		<li>화합물과 비히클 용액으로 용액을 소용돌이. 주사기에서 비히클 또는 화합물을 흡인하고 혼합을 방지하기 위해 주사기의 색상으로 구분합니다.</li>
		<li>동물의 무게를 잰다. B6J 마우스가 3일째 파이(둥글지 않음)에 &gt;18g인지 확인합니다. 가중치를 보고합니다.</li>
		<li>화합물을 투여한다 (예를 들어, 복강내 주사 또는 다른 적절한 경로에 의해). 관리 시간과 경로를 작성하십시오.</li>
		<li>화합물 투여 후, 특히 첫 번째 주사 후 임의의 행동 변화에 대해 동물을 모니터링한다. 발작이 발생하면 라신 척도23에 따라 발작 강도를 보고합니다. 3.2단계를 참조하십시오. 참고: 화합물 투여를 위한 예시적인 프로토콜은 보충 자료 1, 3페이지에서 찾을 수 있는 반면, 투여 중 관찰된 발작은 보충 자료 1, 4-5페이지에 기록됩니다.</li>
	</ol></li>
	<li>취급 유발 발작의 발작 모니터링<ol><li>치료에 눈이 먼 실험자가 이 절차를 수행합니다. 모든 케이지를 벤치로 가져 오십시오. 가벼운 단계에서 매일 2 번 발작을 관찰하십시오.</li>
		<li>수정된 라신 척도23에 의한 발작 활동 점수: 0 = 행동의 변화 없음, 1 = 입 및 얼굴 움직임, 2 = 머리 끄덕임, 3 = 편측 앞다리 간대, 4 = 양육을 동반한 양측 앞다리 간대, 5 = 자세 긴장도 상실을 동반한 전신 긴장 간대 활동, 때때로 점프, 6 = 장기간 및 과도한 점프 및 과잉 행동. 발작의 횟수와 강도를보고하십시오.</li>
		<li>케이지를 가로질러 펜을 밀어 약간의 소음을 냅니다.</li>
		<li>각 동물을 다른 상자로 옮겼다가 다시 옮깁니다.</li>
		<li>케이지를 너무 세게 흔들어 동물이 케이지의 측면이나 상단에 부딪혀 신체적 부상을 입을 위험이 없도록 주의하면서 앞뒤로 케이지를 부드럽게 흔듭니다.</li>
		<li>케이지의 모든 동물에게 발작을 모니터링하십시오. 마우스가 발작을 일으킨다면 언제든지 홈 케이지로 다시 옮기고 소음이나 취급에 의한 추가 발작 자극없이 발작 수준을 기록하십시오.</li>
		<li>자발적으로 또는 부드럽게 케이지를 흔든 후에 붙잡히지 않은 동물의 경우, 더 강렬한 취급으로 발작을 유발하십시오 : 꼬리를 왼쪽에서 오른쪽으로 뒤집어 조심스럽게 뒤집습니다. 참고: 발작이 있는 동물은 과흥분성이 있으며 불안할 수 있습니다.</li>
		<li>발작 행동에 대해 각 동물을 다시 관찰하십시오. 후속 케이지에 대해 이 과정을 반복합니다. 참고: 발작 모니터링을 위한 예시적인 프로토콜은 보충 자료 1, 6-7페이지에서 찾을 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>복합 효과에 대한 데이터 보고서<ol><li>반복 측정(RM) ANOVA를 사용하여 일일 체중을 분석합니다.</li>
		<li>데이터의 그래픽 표현을 위해 일일 누적 발작 부담 값을 사용합니다. 효능 데이터(라신 3-5기 발작이 없는 동물의 수)를 각 그룹에서 보호되는 수/테스트된 수(일반적으로 N = 20)로 제시합니다. 그러므로, Fisher's exact test를 사용하여 반응(압착 또는 비점유)에 대한 비히클 및 약물 치료 그룹 간의 데이터를 비교한다. 참고: 2단계 이하의 발작이 있고 보호되지 않은 동물이 3-5단계의 발작이 있는 경우 동물은 발작으로부터 "보호된" 것으로 간주됩니다.</li>
		<li>내약성 데이터를 행동 장애 또는 독성 영향이 있는 동물의 수/각 그룹에서 테스트한 수와 유사하게 분석합니다. 사망을 포함한 모든 부작용에 유의하십시오.</li>
		<li>비히클에 주입 된 마우스의 50 % 미만이 급격히 점유되면 데이터를 고려하지 마십시오.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Kim, J. E., Cho, K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pilocarpine+model+of+temporal+lobe+epilepsy+and+EEG+monitoring+using+radiotelemetry+system+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The pilocarpine model of temporal lobe epilepsy and EEG monitoring using radiotelemetry system in mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), e56831(2018).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).</li>
<li>Tu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free-floating+immunostaining+of+mouse+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Free-floating immunostaining of mouse brains.</a> Journal of Visualized Experiments. (176), e62876(2021).</li>
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저자는 경쟁하는 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

이것은 급성 및 만성 발작 발달을 조사할 수 있는 간질에 대한 최초의 감염 기반 설치류 모델입니다. 간질의 가장 흔한 원인 중 하나에 대한 질병 예방 또는 변형을 위한 약물 표적 및 새로운 화합물을 식별하는 데 도움이 될 것입니다.
전술한 바와 같이, TMEV-처리된 마우스의 적절한 비율이 취급-유도된 발작을 나타내도록 하기 위해 배치 및 바이러스 역가에 대한 신중한 고려가 필요할 수 있다. 동물이 평소보다 발작이 적은 경우 N = 20 마리의 동물 배치를 사용하여 바이러스 효율을 확인하십시오. 활성이 감소하면 (50 % 미만) 새로운 부분 표본을 만들고 N = 20 마리의 동물로 테스트 할 때입니다. 새로운 부분 표본이 더 효율적이지 않으면 바이러스의 새로운 배치를 정제해야합니다. 일부 형질전환 마우스 라인의 경우 더 낮은 바이러스 역가를 사용해야 할 수도 있습니다. 따라서 바이러스 역가는 예비 실험 후 필요에 따라 희석해야 합니다. B6 마우스에서 이용 가능한 대부분의 데이터는 Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, USA 또는 Charles River, Sulzfeld, Germany)에서 유래했습니다. 그러나, Harlan(Eystrup, Germany)으로부터 얻은 B6 마우스에서도 유사한 발작률이 확인되었다8. B6 배경을 가진 형질전환 동물의 발작률은 야생형 B6 마우스와 비슷하지만 유전적 변화가 바이러스 침입, 염증 반응 또는 신경변성에 영향을 미치는 경우 다를 수 있다21. 급성 발작은 자발적으로 관찰되지만 취급 및 소음에 의해 유발되므로 발작률을 비교할 때 모든 동물을 유사한 방식으로 처리하는 것이 가장 중요합니다. 1일 2회 취급 세션은 이전에 높은 발작 부담을 제공했으며 감염후 3-7일 동안 발작을 나타내는 마우스의 비율이 더 높았습니다 6,8,19. 발작 부담을 증가시키기 위해 추가 처리 세션(1일 및 2일)을 사용할 수도 있습니다. 또한, 자연 발작이 발생하지 않도록 각 취급 세션 전에 동물을 관찰 할 수 있습니다. 예를 들어, 시끄러운 실험실 환경은 발작을 일으킬 수 있으며, 이로 인해 동물은 테스트 시간 동안 취급으로 인한 발작에 불응 할 수 있습니다.
TMEV 감염은 대부분의 마우스에서 취급 유발 발작을 일으키지만 일부 동물이 이 치료에 내성이 있는 이유는 알려져 있지 않습니다. 상술한 바와 같이, 전자적 발작(관련 행동이 최소화되거나 전혀 없음)이 발생할 수 있으며 수반되는 EEG 기록 없이는 정상적으로 정량화되지 않습니다. 또한 주사 위치의 작은 차이가 뇌의 바이러스 효과 감소를 촉진 할 수도 있습니다. 그러나 피질 및 선조체 감염후 발작이 보고되었습니다 5,6,8,9 해마에 대한 바이러스의 친화성으로 인해. 이 모델에서의 약물 스크리닝 연구의 경우, 발작의 감소(예를 들어, 발작 부담의 50% 감소)를 확인하기 위해, 각 그룹에 대해 더 많은 수의 동물이 필요하다 (예를 들어, N=20). 또한, 이 모델에서 발작 행동의 가변성은 상당한 발작 감소를 식별하기 위해 약물 대 비히클 효과의 더 큰 차이를 필요로 합니다. 따라서 이 모델의 한 가지 제한 사항은 더 큰 그룹 크기에 대한 요구 사항입니다. 그럼에도 불구하고, 충분한 그룹 크기는 또한 이 모델19에서 항발작 및 항염증 효과의 식별을 허용한다.
이 모델에서 관찰 가능한 발작의 대부분은 급성 감염 기간 동안 발생합니다. TMEV로 치료한 마우스에서 관찰된 해마 변성, 면역 세포 활성화 및 인지 장애의 발생에도 불구하고, 치료받은 동물의 극히 일부만이 결국 만성적이고 자발적인 발작을 일으킵니다. 이 낮은 전체 발작 부담은 이 모델에서 자발적인 발작을 적절하게 연구하기 위해 많은 수의 감염된 마우스를 필요로 하며, 이는 많은 프로젝트의 범위와 능력을 벗어납니다. 깊이 전극 이식 및 EEG 모니터링은 또한 실험 동물에 대한 부담을 증가시킬 것입니다. 깊이 전극은 자발적인 발작 활동을 식별하는 데 도움이 될 수 있지만 감염 후 해마 해부학의 변화는 일관된 전극 배치를 어렵게 만들 수 있습니다.
간질에 대한 새로운 치료법을 식별하는 것이 시급하기 때문에 항경련 효능에 대한 빠른 스크리닝 방법으로 사용할 수 있는 모델의 개발이 필요합니다. 이 모델은 이러한 긴급한 요청을 처리하는 기능을 제공합니다. 또한, 정위 수술이 필요하지 않다는 사실은 항발작 화합물 조사에 적합하고 수행하기 쉬운 모델입니다.

바이러스 성 뇌염의 빈번한 결과 중 하나는 간질 발작입니다. 많은 바이러스 감염은 감염의 급성기에 증상 발작을 유발합니다. 이러한 발작의 위험은 일반 대중에서 20 % 이상 증가합니다 1,2,3. 감염에서 살아남은 환자는 감염 후 수개월에서 수년 내에 만성 간질 발병 위험이 4%-20% 증가한다 1,4. Theiler's murine encephalomyelitis virus(TMEV)는 바이러스성 뇌염의 마우스 모델에서 급성 및 만성 발작을 연구하기에 적합한 바이러스로 확인되었다 5,6,7. TMEV는 Picornaviridae 계통의 외피가 없는 포지티브 센스 단일 가닥 RNA 바이러스이며 전통적으로 SJL 마우스의 척수에서 탈수초화를 연구하는 데 사용되어 왔으며, C57BL/6(B6) 마우스는 감염 후 바이러스를 빠르게 제거할 수 있는 능력이 있기 때문에 보호됩니다. 그러나, TMEV는 감염 후 첫 주 (pi) 이내에 수컷 및 암컷 B6 마우스의 50%-75%에서 급성 발작을 유도하는 반면, 약 25%-40%는 pi 2,5,6,8,9에서 몇 주에서 몇 달 동안 만성 간질이 발생합니다. 발작 외에도, 마우스는 또한 신경 변성 및 gliosis를 갖는 간질 해마의 일반적인 조직 병리학을 나타낸다 5,6,8,10,11,12. 또한, TMEV에 감염된 B6 마우스는 학습 및 기억에 대한 행동 테스트에서 유의하게 더 나쁜 성능을 보이며 간질이 있는 임상 환자에서도 볼 수 있는 인지 동반이환이 있습니다13,14,15.
전통적으로 간질 및 발작 모델은 발작을 유도하기 위해 화학 경련 물질 또는 전기 자극을 사용합니다. 그러나, 이들 모델은 구조적 타당성이 결여되어 있으며, 종종 임상환자에서 볼 수 있는 것보다 더 심각한 발작과 뇌손상을 나타낸다16. 모든 연구 질문에 적합한 모델은 없습니다17. TMEV 모델을 사용하는 것은 CNS 감염 후 발작 발생의 소인 요인을 연구하거나 화합물이 항발작 효율에 대해 스크리닝되는 경우 특히 흥미로울 것입니다.
TMEV 모델이 국제적으로 여러 실험실에서 확립되고 사용되었기 때문에 저자는 모델을 성공적으로 구현할 수 있는 많은 세부 사항(예: 다양한 바이러스 및 마우스 균주의 특이성)을 확인했습니다. 가장 신뢰할 수 있는 발작 유도는 TMEV 및 B6J 마우스 2,5,6,8,9의 Daniel's 균주를 사용하여 생성되었습니다. 이 모델은 현재 NINDS(National Institute of Neurological Disorders and Stroke)에서 간질 및 발작에 대한 신약을 식별하는 플랫폼으로 사용되고 있습니다18,19. 이 논문에는 다른 연구자들이 이 바이러스성 뇌염 모델을 활용하여 질병 메커니즘에 대한 이해를 높이고 약물 테스트를 수행할 수 있도록 하는 바이러스 유도 및 임상 모니터링에 대한 자세한 프로토콜이 포함되어 있습니다.
다음 프로토콜은 이 모델에서 화합물 테스트를 위해 설계된 연구를 반영하지만 수많은 다른 유형의 연구를 수행할 수 있습니다. 마우스는 주사 전에 우반구의 측두엽 영역(오른쪽 눈의 후방 및 내측)에 Daniel's strain TMEV를 주사하기 전에 잠시 마취됩니다. 연구 질문에 따라 감염되지 않은 대조군 동물이 필요한 경우 마우스는 TMEV 대신 멸균 인산염 완충 식염수(PBS, pH 7.4, KH2PO4[1.06mM], NaCl[155.17mM] 및 Na2HPO4·7H2O[2.97mM])를 받습니다. TMEV에 감염된 마우스에 대한 이전 경험에 따르면 취급 유발 발작은 감염 후 3일과 7일 사이에 발생합니다. 실험 화합물의 주입 빈도, 경로 및 테스트 시간은 특성에 따라 다릅니다. 다음 주 월요일-금요일에 3-7일 발작 모니터링을 수행할 수 있는 금요일에 바이러스 접종을 수행하는 것이 좋습니다. 발작 모니터링 주간 동안, 실험 화합물은 화합물의 동역학 또는 작용 메카니즘에 의해 달리 제시되지 않는 한 1일 2회(적어도 4시간 간격) 투여될 수 있다. 치료 중 발작 모니터링은 이전에 결정된 시점에서 수행될 수 있다. 주입 및 관찰 시간은 개별 화합물에 따라 다릅니다. 동물에게 시험 화합물 또는 약물 화합물 대신 비히클을 주사한다. 이 두 그룹은 실험 그룹과 유사하게 취급하고 관찰할 수 있습니다. 실험 동안, 마우스를 다루고 발작을 채점하는 한 사람은 치료에 대해 눈이 멀어야 한다.

<table><tbody><tr><td>흡수성 종이</td><td>-</td><td>-</td><td>모든</td></tr><tr><td>분석 저울</td><td>Mettler Toledo (Columbus, OH, U.S.A.)</td><td>30216542</td><td>0. 1 mg&ndash; 220 그램&nbsp;</td></tr><tr><td>Animal balance</td><td>Ohaus (미국 뉴저지주 파시파니)</td><td>STX2202</td><td>0.01 g&ndash; 2200 그램&nbsp;</td></tr><tr><td>BD Lo-Dose U-100 인슐린 주사기</td><td>BD (캐나다 온타리오주 미시소거)&nbsp;</td><td>BD329461</td><td>영구 BD Micro-Fine IV 바늘이 있는 Lo-Dose 멸균 주사기 -</td></tr><tr><td>Robert Fujinami(유타 대학교)가 친절하게 제공한</td> <td>1mL Daniel's TMEV 균주</td><td>-</td><td>3 x 105 플라크 형성 단위 부분 표본소독</td></tr><tr><td>제, 예: VennoVet 1 super</td><td>Menno Chemie Vertriebsgesellschaft GmbH, 독일</td><td>-</td><td>알코올</td></tr> <tr>5% 이하로 캠퍼스 수의사가 권장)<td>Fisherbrand 미디엄 멸균 알코올 준비 패드 C7&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific(미국 매사추세츠주 월섬)</td><td>22-363-750</td><td></td></tr><tr><td>Fluriso</td><td>VETone (Boise, ID, U.S.A)</td><td></td>502017 <td>이소플루란 250 mL, 2%&ndash; 5%</td></tr><tr><td>흄 흡수제&nbsp;</td><td>Labconco (미국 미주리주 캔자스시티)</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>일반 보호 일회용 SMS 화이트 랩 코트&nbsp; &nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific(미국 매사추세츠주 월섬)</td><td>17-100-810A</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad 프리즘 버전 9&nbsp;</td><td>(라호야, 캘리포니아, 미국)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>얼음 양동이</td><td>-</td><td>-</td><td>모든</td></tr><tr><td>Microsoft Excel Microsoft&nbsp;</td><td>(미국 워싱턴주 레드몬드)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>마이크로소프트 워드: 마이크로소프트&nbsp;</td><td>(미국 워싱턴주 레드몬드)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>마우스 케이지</td><td>-</td><td>-</td><td>최소 5마리의 마우스를 담고 있는 모든 마우스 케이지</td></tr><tr><td>PrecisionGlide 바늘&nbsp;</td><td>BD (Mississauga, ON, Canada)</td><td>329652</td><td>BD 슬립 팁 PrecisionGlide 바늘 인슐린 주사기 - 26 G x 3/8 - 0.45 mm x 10 mm</td></tr><tr><td>자체 밀봉 살균 파우치&nbsp;</td><td>Fisher Scientific (미국 뉴욕주 햄프턴)</td><td>NC9241087&nbsp;</td><td>12.6 x 25.5 cm</td></tr><tr><td>소형 유리 플라스크</td><td>-</td><td>-</td><td>any, volume 25 mL</td></tr><tr><td>sterile PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific(미국 매사추세츠주 월섬)</td><td></td><td></td>10010056</tr><tr><td>용액의 부피에 따른</td><td>교반 막대</td><td>Carl Roth GmbH & CO. KG</td><td>X171.1</td> 크기</tr><tr><td>교반 플레이트</td><td>Carl Roth GmbH & CO. KG</td><td>AAN2.1</td><td></td></tr><tr><td>Syringe Luer-Lok</td><td>BD (Mississauga, ON, Canada)</td><td>309628</td><td>1 mL 주사기 전용</td></tr><tr><td>초음파 세척기, 히터/기계식 타이머</td><td>Cole-Parmer (Vernon Hills, IL, U.S.A.)</td><td>EW-08895-23</td><td>목욕 초음파 발생기 - 0.5 갤런, 115 V</td></tr><tr><td>차량 솔루션</td><td>-</td><td>-</td><td>복합 차량에 따라</td></tr><tr><td>다름 Vortex REAX&nbsp;</td><td>Heidolph Instruments GmbH & Co. KG, 독일</td><td>541-10000-00</td><td></td></tr></tbody></table>

theiler's 쥐 뇌척수염 바이러스를 이용한 감염성 병인의 간질 모델

A Model for Epilepsy of Infectious Etiology using Theiler's Murine Encephalomyelitis Virus

간질의 주요 원인 중 하나는 중추 신경계 (CNS)의 감염입니다. 이러한 감염에서 살아남은 환자의 약 8 %가 결과적으로 간질을 앓고 있으며, 경제적으로 덜 발달 된 국가에서는 그 비율이 훨씬 높습니다. 이 작업은 감염 병인의 간질을 모델링하고 이를 새로운 항발작 화합물 테스트를 위한 플랫폼으로 사용하는 개요를 제공합니다. C57BL/6 마우스에서 Theiler의 쥐 뇌척수염 바이러스(TMEV)의 비정위 뇌내 주사에 의한 간질 유도 프로토콜이 제시되며, 이는 인간 환자에서 바이러스성 뇌염 및 후속 간질의 초기 및 만성 임상 증상의 많은 부분을 복제합니다. 발작 활성을 모니터링하고 새로운 화합물의 잠재적인 항발작 효과를 검출하기 위한 뇌염 동안 마우스의 임상적 평가가 설명된다. 또한, 바이러스성 뇌염 및 해마 손상 및 신경염증과 같은 발작의 조직병리학적 결과뿐만 아니라 자발적인 간질 발작과 같은 장기적인 결과가 나타납니다. TMEV 모델은 CNS 감염의 결과로 간질 발병 메커니즘을 조사할 수 있는 최초의 번역, 감염 중심, 실험 플랫폼 중 하나입니다. 따라서 CNS 감염 후 간질 발병 위험이 있는 환자에 대한 잠재적인 치료 표적 및 화합물을 식별하는 역할도 합니다.

급성 발작에 대한 복합 효과 행동 발작은 약물 주사(DI) 중 또는 후속 AM/PM 발작 처리/모니터링 세션 중에 발생하는 경우 기록됩니다. 취급 발작 중에 관찰된 발작은 LEV(2mg/kg)에 대해 그림 350 에 표시된 히트 맵으로 표시될 수 있습니다. 발작 부담의 분석을 위해, 비히클-처리된 그룹에 대한 최종(7일째) 누적 발작 부담 값의 평균을 취하고, Mann-Whitney U 시험에 의해 화합물 처리군과 비교한다 (발작 부담 값은 주사후 관찰에서 수집된 것을 포함한다). 복합 효능의 경우, Fisher의 정확 검정은 비히클 투여군과 약물 투여군 간에 효능에 통계적 차이가 있는지 여부를 결정합니다. 유사하게, 내약성 데이터는 Fisher의 정확 검정으로 분석됩니다. 체중 분석은 반복 측정 ANOVA에 의해 수행되어 실험 과정 동안의 변화뿐만 아니라 화합물 처리 마우스와 비히클 처리 마우스 간의 차이를 결정합니다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63673/63673fig02.jpg"> 그림 2: 비히클(0.5% 메틸셀룰로오스) 또는 LEV(350mg/kg)로 테스트한 후 행동 발작의 히트 맵. 취급 및 발작 관찰 1시간 전에 1일 2회 주사가 발생했습니다. 약물 주사(DI) 중 또는 후속 AM/PM 발작 처리/모니터링 세션 중에 발생한 경우 행동 발작을 기록했습니다. LEV(350mg/kg)는 5일 관찰 기간 동안 취급 세션 동안 관찰된 발작(차량 발작 부담의 35.9%)을 유의하게 감소시킵니다. 히트 맵은 발작 단계 1-3을 녹색으로, 4단계를 노란색으로, 5단계를 주황색으로 표시하여 생성됩니다. 이 새로운 그림은 게시된 데이터 세트19에서 생성되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63673/63673fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
만성 간질 첫 주 파이에 보고된 발작 부담 외에도 연구 및 가설에 따라 유용할 수 있는 몇 가지 판독값이 있습니다. 동물을 장기간 보관하면 감염된 동물의 하위 집합이 몇 주 동안 자발적인 간질 발작을 일으키며, 이는 급성 발작보다 덜 자주 발생하므로 EEG 기록이 필요합니다. 생쥐의 EEG를 기록하기 위해서는 전극을 정위 수술로 이식해야 합니다(24). 도 3 은 TMEV8에 감염된 마우스에서 EEG 기록에 의한 만성기의 다양한 간질 사건을 보여준다.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63673/63673fig03.jpg"> 그림 3: 마우스에서 DA 바이러스 감염 후 만성기(14주 pi)의 전형적인 EEG 흔적. (A-C) 행동 운동 상관 관계가 없는 대표적인 EEG 사건, 즉 (A) 단일 스파이크, (B) 스파이크 클러스터, (C) 및 전기, 아마도 국소 발작. (D-F) 행동 상관 관계가 있는 대표적인 EEG 이벤트. D에 묘사된 마우스는 근간대성 경련(움직임 인공물과 함께 "M"으로 표시), 고정관념의 움직임(마우스가 머리를 바닥에 평평하게 눌렀을 때 "헤드 프레스"로 표시됨) 또는 행동 정지와 함께 발작과 유사한 사건을 겪었습니다. "Scr"은 긁힘의 움직임 아티팩트를 설명하고, (E) 및 (F)는 전신 경련 발작 동안 전형적인 EEG 변화를 보여줍니다: (E) 지속 시간이 22초 및 1Hz인 라신 3기 발작 및 (F) 지속 시간이 34초 및 5.4Hz인 5기 발작. 이 그림은8 이전에 출판되었으며 엘스비어의 허가를 받아 재 인쇄되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63673/63673fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
조직학 간질과 발작은 일반적으로 환자의 해마 병리를 동반하기 때문에 실험 모델에서 요약되며, 대부분의 실험실에서는 해마 변화 또는 잠재적 인 항 발작 치료가 병리학에 미치는 영향도 분석합니다. 일반적으로 분석되는 매개변수에는 해마 신경변성 및 수축뿐만 아니라 특정 면역 세포 집단에 대한 표지에 의한 염증이 포함됩니다. 이러한 분석을 위해, 실험이 끝날 때, 호흡 정지가 발생하고 심장 박동이 현저하게 느려지거나 부정맥이 나타날 때까지 마우스를 심하게 마취한다. PBS의 심내 관류에 이어 4% 파라포름알데히드(PFA)25 로 혈액을 제거하여 조직을 고정합니다. 그런 다음 조직을 냉동 절개술 및 (면역) 염색26에 의해 처리한 후 현미경 분석이 수행된다.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63673/63673fig04.jpg"> 그림 4: 간질 TMEV에 감염된 마우스의 해마 변성. (A,B) 크레실 바이올렛 염색 관상 절편은 (A) 대조군(PBS) 마우스에서 정상적인 세포 구조를 나타내고 파이 2개월에 (B) TMEV 마우스에서 해마 변성을 보여줍니다. 참고: 외측 심실의 확대, 폐막의 붕괴, 피라미드 세포층의 얇아짐. (C) 이러한 손상의 정량화는 TMEV 마우스(N=7) 대 PBS 마우스(N=6; 데이터는 SEM± 평균; p &lt; 0.001; 스튜던트 t-검정). (D,E) NeuN 라벨링은 파이 6개월에 채취한 절편에서 신경 세포 손실의 크기를 추가로 보여줍니다. 화살표는 완전한 피라미드 세포 손실이 있는 영역을 나타냅니다. (E) 치상회는 간질 마우스에서도 비교적 손상되지 않은 것으로 보입니다. 스케일 바 = (A,B) 2mm; (D,E) 0.5mm. 이 그림은6 이전에 출판되었으며 Oxford University Press의 허가를 받아 재 인쇄되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63673/63673fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63673/63673fig05.jpg"> 도 5: 감염 후 7일째 급성 뇌염으로 인한 T 세포 침윤의 상이한 중증도의 대표적인 현미경 사진. 동측 등쪽 해마를 포함하는 직렬 절편을 T-림프구에 라벨링하기 위해 CD3에 대한 항체로 염색했습니다. (A,D) 모의 감염된 동물에서 나타난 것처럼 T 세포 침윤이 없는 정상적인 해마. (비, 이) 중등도의 T 세포 침윤은 대다수의 TMEV 감염된 마우스에서 볼 수 있다. (씨, 에프) T 림프구의 심각한 침윤은 감염된 마우스의 일부에서만 나타났습니다. 이 그림은8 이전에 출판되었으며 엘스비어의 허가를 받아 재 인쇄되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63673/63673fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 1: 보충 파일은 TMEV 모델에서 화합물 테스트에 사용되는 형식으로 구성됩니다. 1페이지는 실험 설정에 대한 개요를 제공합니다. 화합물, 비히클 및 화합물 용액 제조에 대한 정보는 1-2페이지에 기록되어 있습니다. 복합 적용은 3페이지에 기록되어 있습니다. 4-5페이지의 스코어링 시트는 화합물 주입을 수행하는 실험자가 관찰하고 정량화한 발작을 기록하는 데 사용됩니다. 4페이지에서는 각각 5마리의 쥐 중 케이지 1-4에 대한 데이터를 수집할 수 있으며, 5페이지에서는 우리 손에서 화합물 테스트를 위한 표준 동물 수인 케이지 5-8을 기록할 수 있습니다. 6-7페이지의 채점 시트는 모든 화합물 주입 후 1시간 동안 관찰, 취급 및 부드러운 케이지 흔들기를 수행하는 맹검 관찰자가 사용합니다. 다시 말하지만, 발작 점수는 이러한 예시적인 점수 시트에서 총 8개의 케이지에 대해 기록될 수 있습니다. 마지막 페이지 8은 다른 관찰이나 메모를 기록하는 데 사용할 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63673/Suppl.%20File%201.zip" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

C57BL/6 마우스에서 Theiler's murine encephalomyelitis virus(TMEV)에 의한 뇌내 감염은 인간 환자에서 바이러스성 뇌염 및 후속 간질의 초기 및 만성 임상 증상의 많은 부분을 복제합니다. 이 논문은 TMEV 모델의 바이러스 감염, 증상 및 조직병리학에 대해 설명합니다.

Theiler's 쥐 뇌척수염 바이러스를 이용한 감염성 병인의 간질 모델

One of the main causes of epilepsy is an infection of the central nervous system (CNS); approximately 8% of patients who survive such an infection develop ...

TMEV 모델은 CNS 감염의 결과로 발작 발달 메커니즘을 조사할 수 있는 최초의 실험 플랫폼 중 하나입니다. 중추 신경계 감염은 간질의 위험을 크게 증가시킵니다. 이러한 모델은 위험에 처한 환자에 대한 잠재적인 치료 표적 및 화합물을 식별하는 데 도움이 됩니다.실험자는 생쥐 작업에 대한 교육을 받아야합니다. 바이러스 주입은 충분한 정밀도와 루틴을 달성하기 위해 죽은 동물에 염료를 주입하여 매우 잘 연습할 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 제 연구실의 대학원생 인 Laura Bell이 될 것입니다.시작하려면 인슐린 주사기의 캡을 제거하고 폴리에틸렌 튜브를 바늘 주위에 고리로 추가하여 2.5mm의 적절한 주입 깊이를 보장합니다. 그런 다음 주사기를 에탄올에 30분 동안 담그고 주사기를 UV 광선 아래에 30분 동안 두십시오. 그런 다음 캡을 바늘에 다시 끼우고 주사기를 멸균 파우치에 싸십시오.파우치를 테이프로 감아 닫고 준비 날짜를 적습니다. 바이러스 주입을 수행하려면 섭씨 영하 80도 냉동고에서 TMEV의 Daniels 균주 분취량을 가져옵니다. 바이러스를 해동하고 얼음 위에 보관하십시오.그런 다음 주사기에 바이러스 현탁액을 넣으십시오. 그런 다음 소독제로 벤치를 청소하고 흄 흡수기 아래에서 작업하십시오. 후드 아래의 마취 상자에서 마취 된 마우스를 옮기고 발가락 핀치를 수행하여 수술 내성을 확인합니다.그런 다음 알코올 패드로 동물의 머리를 닦고 주사 부위가 위쪽을 향하도록 마우스의 머리를 약간 왼쪽으로 기울입니다. 피부를 약간 뒤로 당기고 바늘을 머리에 삽입하십시오. 다음으로, 우반구의 측두엽 영역에서 2.5 밀리미터의 깊이까지 20 마이크로 리터를 intracordically 주입한다.주사기를 5-15초 동안 그대로 두고 주사로 인한 누출이 있는지 또는 기포가 보이면 새 주사기를 준비합니다. 주사기를 조심스럽게 빼낼 때 약간 돌립니다. 그런 다음 동물을 마취에서 회복하는 동안 가열 패드를 반쯤 떼어 놓은 새 케이지로 옮깁니다.그리고 흉골 누운 자세를 유지하기에 충분한 의식을 회복 할 때까지 동물을 방치하지 마십시오. 먼저, 모든 케이지를 벤치로 가져 와서 가벼운 단계에서 하루에 두 번 발작을 관찰하십시오. 수정된 경주 척도로 발작 활동의 점수를 매기고 발작의 횟수와 강도를 보고합니다.그런 다음 새장을 가로질러 펜을 밀어 약간의 소음을 내고 각 동물을 다른 상자로 옮겼다가 다시 옮깁니다. 자발적으로 또는 케이지를 부드럽게 흔든 후 포착되지 않은 동물의 경우 꼬리를 왼쪽에서 오른쪽으로 뒤집어 조심스럽게 뒤집으면서 더 강렬한 취급으로 발작을 유발합니다. 발작 행동에 대해 각 동물을 다시 관찰하고 후속 케이지에 대해 이 과정을 반복합니다.약물 주사 중 또는 후속 발작 처리 모니터링 세션 중에 발생한 경우 행동 발작이 기록되었습니다. 관찰된 데이터는 발작 단계를 다양한 색상으로 묘사하여 생성된 히트 맵으로 제시되었습니다. EEG를 기록함으로써 TMEV 감염 후 몇 달 동안 만성 단계에서 다양한 간질 사건을 확인할 수 있습니다.해마 변성 및 간질 TMEV 감염 마우스의 정량화는 대조군에 비해 TMEV 마우스의 해마 면적의 현저한 감소 및 그에 상응하는 심실 면적의 증가를 보여줍니다. 면역조직학적 분석은 염증 세포의 존재와 같은 다양한 매개변수에 대한 정보를 제공할 수 있습니다. 이 경우, 해마를 함유하는 절편을 T 림프구를 표지하는 항체로 염색하였다.모의-감염된 동물은 T-세포 침윤을 나타내지 않는 반면, TMEV-감염된 마우스의 대다수에서 중간 정도의 침윤이 나타났다. 감염된 마우스의 일부는 T 림프구의 심각한 침윤을 나타낸다. 모든 동물이 각 관찰 기간 동안 발작을 일으키는 것은 아닙니다.또한 발작 발생률이 가장 높은 것은 접종 후 5 일과 6 일에 발생합니다. 우리는 TMEV 모델을 사용하여 감염 유발 발작에 대한 새로운 항발작 약물의 효능을 테스트합니다. 동반이환 행동 변화 및 전기생리학적 변화를 조사하는 분석법도 평가할 수 있습니다.TMEV 모델은 간질 연구 커뮤니티에 측두엽 간질의 첫 번째 CNS 감염 유발 모델을 제공하여 감염 후 간질 생성의 기본 메커니즘을 조사할 수 있도록 했습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오는 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질과 불활성화된 결핵균의 조합을 주입하여 마우스 모델에서 실험적 자가면역 뇌척수염을 유도하는 방법을 보여줍니다. 이 모델을 통해 연구원들은 질병 메커니즘을 연구하고 치료 개입을 테스트할 수 있습니다.

마우스 모델에서 실험적 자가면역 뇌척수염 유도

이 동영상은 뇌로 이동하는 자가반응성 T세포를 활성화하기 위해 미엘린 유래 펩타이드에 보조제를 주입하여 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)을 유발하는 방법을 보여줍니다. 백일해 독소는 혈액 뇌 장벽 투과성을 증가시켜 이러한 T 세포와 다른 면역 세포가 뇌로 들어갈 수 있도록 하기 위해 투여됩니다. 이러한 면역 세포는 탈수초화를 일으켜 신경 전달 장애와 EAE 발병을 유발합니다.

마우스 모델에서 실험적 자가면역 뇌척수염의 발생

이 비디오는 CNS에 감염된 마우스 모델의 생성을 보여줍니다. 젖먹이 새끼는 두개골 내 및 복강 내 바이러스를 주입합니다. 바이러스가 퍼져 중추신경계를 감염시켜 신경 세포 사멸과 염증을 일으킵니다. 새끼는 질병이 진행됨에 따라 감염 증상을 평가합니다.

중추신경계 감염이 있는 쥐 모델의 생성

이 비디오에서는 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)을 사용하여 다발성 경화증의 마우스 모델을 구축합니다. 마우스에 뉴런 펩타이드와 보조제가 포함된 에멀젼을 주입하여 자가반응성 T세포를 활성화하는 면역 반응을 유발합니다. 그 다음에는 백일해 독소(PTX)를 주입하여 혈액뇌장벽 투과성을 높여 자가반응성 T세포가 뇌에 침투할 수 있도록 합니다. 이 침투는 궁극적으로 수초성 손상을 초래하는 신호 폭포를 시작하여 다발성 경화증의 탈수초성 상태를 모방합니다.

이 비디오는 Theiler's Murine Encephalomyelitis Virus(TMEV)에 감염된 쥐에서 취급 유발 발작의 유도를 보여줍니다. 과흥분성 뉴런을 가진 감염된 쥐는 외부의 물리적 자극에 노출됩니다. 이러한 노출은 스트레스를 유발하여 뉴런의 비정상적인 전기 활동을 유발하여 발작을 일으킵니다.

마우스 모델에서 취급 유도 발작

이 원고는 다양한 질병 단계에서 각각 유세포 분석 및 정량적 PCR을 사용하여 림프절, 비장, 혈액 및 척수의 면역 세포 분포 및 mRNA 사이토카인 수치를 평가하는 방법과 함께 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE) 모델의 유도 및 채점 방법을 설명합니다.

다양한 조직에서 면역 세포의 질병에 의존하는 유통의 마우스 및 평가에 실험자가 면역 뇌척수염의 유도

이 원고 조직의 pilocarpine 주입 상태 epilepticus를 유도 및 무선 원격 비디오 및 뇌 파 시스템을 사용 하 여 라이브 동물에 자발적인 재발 성 발작을 모니터링 방법을 설명 합니다. 이 프로토콜은 만성 간 질, epileptogenesis, 그리고 급성 발작의 pathophysiologic 메커니즘을 공부에 대 한 이용하실 수 있습니다.

측 두 엽 간 질 및 뇌 파 마우스에 Radiotelemetry 시스템을 사용 하 여 모니터링 Pilocarpine 모델

여기에서, 우리는 신경병의 발달을 표시하기 위하여 중추 신경계 감염의 면역적격 ICR (암 연구 연구소) 뮤린 모형을 만들기위한 프로토콜을 제시합니다. 동일한 질병 점수에 의한 급성 바이러스 성 뇌질환 모니터링은 생체 내에서 뎅기열 바이러스 유발 신경병증을 나타내는 데 수행될 수 있었다.

뎅기열 바이러스 유발 급성 바이러스 뇌염 같은 질병의 뮤린 모델

이 체계적인 프로토콜은 반복적인 가벼운 외상성 뇌 손상 후에 외상 후 간질의 새로운 동물 모델을 설명합니다. 첫 번째 부분은 수정된 체중 감소 모델을 사용하여 외상성 뇌 손상 유도 단계를 자세히 설명합니다. 두 번째 부분은 단일 및 다중 채널 뇌전도 데이터 수집 시스템에 대한 수술 접근 방식에 대한 지침을 제공합니다.

반복적 확산 외상성 뇌 손상의 마우스 모델에서 외상 후 간질 유도

이 보고서는 형질전환 VGAT-Cre 마우스의 전기적 점화를 기반으로 측두엽 간질 모델을 생성하는 방법을 설명합니다. 점화된 VGAT-Cre 마우스는 간질의 원인을 파악하고 새로운 치료법을 스크리닝하는 데 유용할 수 있습니다.

측두엽 간질에 대한 모델을 생성하기 위해 전기적으로 점화되는 VGAT-Cre 마우스를 위한 전극의 준비 및 이식

편도체는 측두엽 간질에서 중요한 역할을 하며, 이 간질은 이 구조에서 유래하고 전파됩니다. 이 기사는 기록 및 자극 기능을 모두 갖춘 심부 뇌 전극의 제조에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 편도체에서 유래하는 내측 측두엽 간질 모델을 소개합니다.

양극성 전극을 사용하여 편도체의 전기적 점화에 의한 측두엽 간질 마우스 모델 생성

배우세요 Theiler's 쥐 뇌척수염 바이러스를 이용한 감염성 간질 모델링 방법을 C57BL/6 마우스에서. 중추신경계 감염 후 발작 기전과 항간질 치료제 효능 평가에 활용됩니다.

Theiler's 쥐 뇌척수염 바이러스를 이용한 감염성 병인의 간질 모델

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