Name: 양성 RNA 바이러스 변이체를 엔지니어링하기 위한 역유전학 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 49 s
Description: 배우세요 양성RNA 바이러스 변이체 엔지니어링을 위한 역유전학 방법을 Hepatitis C 바이러스에서 활용하세요. 이 기술은 무클론 접근법으로 유전적 다양성을 도입하고 표현형 선택을 가능하게 합니다.

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이 연구에 대한 자금 지원(보조금 번호 BT/PR10906/MED/29/860/2014)은 인도 정부 생명공학부에서 제공했습니다.

<ol><li>Desselberger, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+genetics+of+rotavirus%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Reverse genetics of rotavirus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2106-2108 (2017).</li>
<li>Singh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mutagenesis+of+hepatitis+C+virus+reveals+ability+of+genome+to+overcome+detrimental+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mutagenesis of hepatitis C virus reveals ability of genome to overcome detrimental mutations.</a> Journal of Virology. 94 (3), 01327(2020).</li>
<li>Agarwal, S., Baccam, P., Aggarwal, R., Veerapu, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+synthesis+and+phenotypic+analysis+of+mutant+clouds+for+hepatitis+E+virus+genotype+1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Novel synthesis and phenotypic analysis of mutant clouds for hepatitis E virus genotype 1.</a> Journal of Virology. 92 (4), 01932(2018).</li>
<li>Edmonds, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+bacterium-free+method+for+generation+of+flavivirus+infectious+DNA+by+circular+polymerase+extension+reaction+allows+accurate+recapitulation+of+viral+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">A novel bacterium-free method for generation of flavivirus infectious DNA by circular polymerase extension reaction allows accurate recapitulation of viral heterogeneity.</a> Journal of Virology. 87 (4), 2367-2372 (2013).</li>
<li>Arumugaswami, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+functional+profiling+of+hepatitis+C+virus+genome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">High-resolution functional profiling of hepatitis C virus genome.</a> PLoS Pathogens. 4 (10), 1000182(2008).</li>
<li>Heaton, N. S., Sachs, D., Chen, C. -J., Hai, R., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mutagenesis+of+influenza+virus+reveals+unique+plasticity+of+the+hemagglutinin+and+NS1+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mutagenesis of influenza virus reveals unique plasticity of the hemagglutinin and NS1 proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20248-20253 (2013).</li>
<li>Eyre, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mutagenesis+of+dengue+virus+reveals+plasticity+of+the+NS1+protein+and+enables+generation+of+infectious+tagged+reporter+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mutagenesis of dengue virus reveals plasticity of the NS1 protein and enables generation of infectious tagged reporter viruses.</a> Journal of Virology. 91 (23), 01455(2017).</li>
<li>Cobb, R. E., Chao, R., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution%3A+Past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22AIChE+Journal.+American+Institute+of+Chemical+Engineers%22%5BJournal%5D)">Directed evolution: Past, present, and future.</a> AIChE Journal. American Institute of Chemical Engineers. 59 (5), 1432-1440 (2013).</li>
<li>Sen, S., Venkata Dasu, V., Mandal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developments+in+directed+evolution+for+improving+enzyme+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Biochemistry+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Developments in directed evolution for improving enzyme functions.</a> Applied Biochemistry and Biotechnology. 143 (3), 212-223 (2007).</li>
<li>Yuan, L., Kurek, I., English, J., Keenan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory-directed+protein+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Laboratory-directed protein evolution.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 69 (3), 373-392 (2005).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+DNA+by+agarose+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Analysis of DNA by agarose gel electrophoresis.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (1), (2019).</li>
<li>Desjardins, P., Conklin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoDrop+microvolume+quantitation+of+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids.</a> Journal of Visualized Experiments. (45), e2565(2010).</li>
<li>Rio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Denaturation+and+electrophoresis+of+RNA+with+formaldehyde%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Denaturation and electrophoresis of RNA with formaldehyde.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (2), 219-222 (2015).</li>
<li>Lindenbach, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+HCV+infectivity+produced+in+cell+culture+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Measuring HCV infectivity produced in cell culture and in vivo.</a> Methods in Molecular Biology. 510, 329-336 (2009).</li>
<li>Lei, C., Yang, J., Hu, J., Sun, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+calculation+of+TCID50+for+quantitation+of+virus+infectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Virologica+Sinica%22%5BJournal%5D)">On the calculation of TCID50 for quantitation of virus infectivity.</a> Virologica Sinica. 36 (1), 141-144 (2021).</li>
<li>Soni, S., Singh, D., Aggarwal, R., Veerapu, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+fitness+of+hepatitis+C+virus+increases+resistance+to+direct-acting+antivirals%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Enhanced fitness of hepatitis C virus increases resistance to direct-acting antivirals.</a> The Journal of General Virology. 103 (2), (2022).</li>
<li>Khan, S., Soni, S., Veerapu, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HCV+replicon+systems%3A+Workhorses+of+drug+discovery+and+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">HCV replicon systems: Workhorses of drug discovery and resistance.</a> Frontiers in Cellular Infection Microbiology. 10, 325(2020).</li>
<li>Cadwell, R. C., Joyce, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Randomization+of+genes+by+PCR+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PCR+Methods+and+Applications%22%5BJournal%5D)">Randomization of genes by PCR mutagenesis.</a> PCR Methods and Applications. 2 (1), 28-33 (1992).</li>
</ol>

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이 연구에서는 HCV 전체 게놈 라이브러리를 합성하기 위해 ep-PCR18 과 역 유전학을 통합하는 간단하고 빠른 FL-MRS 절차를 자세히 설명했으며, 이는 세포 배양 시스템에서 약물 내성 표현형 스크리닝을 위한 복제 가능한 변이체를 생성하는 데 사용할 수 있습니다. 저충실도 Taq DNA 중합효소의 사용은 전체 길이 바이러스 게놈의 PCR 증폭 중에 치환을 통합할 수 있는 ep-PCR의 전제 조건입니다. 여러 저충실도 Taq DNA 중합효소를 테스트한 결과 Platinum Taq DNA 중합효소가 높은 수율로 ~10kb 크기의 ep-PCR 산물을 생성한다는 것을 발견했습니다(데이터는 표시되지 않음). 고정된 수의 열 주기를 사용하고 입력 템플릿 양을 변경하여 전체 게놈 라이브러리에서 돌연변이의 비율을 제어하는 것이 좋습니다. FL-MRS는 전체 길이 바이러스 RNA에 대한 템플릿으로 잘못된 전체 게놈을 사용하기 때문에, RNA 합성 반응이 정의된 길이의 바이러스 전사체를 생성하도록 ...

전방 유전자 스크리닝은 관심 있는 바이러스 표현형으로 시작한 다음 게놈의 염기서열을 분석하고 원래 균주의 표현형과 비교하여 해당 표현형을 유발하는 돌연변이를 식별하려고 시도합니다. 대조적으로, 역 유전자 스크리닝에서는 표적 유전자에 무작위 돌연변이가 도입된 후 결과 표현형을 검사합니다1. 역유전학 접근법의 경우, 시험관 내 돌연변이 유발은 관심 표현형을 연속적으로 스크리닝하는 변이체 풀을 만드는 데 가장 널리 사용되는 기술입니다. 오류가 발생하기 쉬운 PCR(ep-PCR)2,3, 원형 중합효소 확장4 및 Mu-transposon 삽입 돌연변이 유발 5,6,7을 포함하여 RNA 바이러스의 게놈 전체 무작위 돌연변이 유발을 달성하기 위한 다양한 유전 도구가 보고되었습니다. 후자의 두 가지 방법은 제한된 염기서열 다양성을 가진 라이브러리를 생성하고 바이러스에 매우 치명적이며 감염성 바이러스 변이체의 회복을 심각하게 제한하는 대규모 삽입 및 결실이 도입되기 쉽습니다.
ep-PCR은 향상된 열 안정성, 기질 특이성 및 촉매 활성 8,9,10과 같은 원하는 특성을 가진 표현형을 선택하기 위한 돌연변이 효소를 생성하기 위해 단백질 공학에서 널리 사용되는 잘 알려진 강력한 돌연변이 유발 기술입니다. 이 기술은 간단한 장비가 필요하고 지루한 조작이 필요하지 않으며 상업적으로 이용 가능한 시약을 사용하고 빠르기 때문에 수행하기 쉽습니다. 또한 고품질 라이브러리를 생성합니다.
여기서는 무작위 게놈 전체 치환 돌연변이 유발 및 역유전학을 유도하는 ep-PCR을 통합하여 C형 간염 바이러스(HCV)의 완전한 게놈을 생성하는 전장 돌연변이 RNA 합성(FL-MRS)을 위한 새로운 방법을 개발했습니다. 단일 뉴클레오티드 삽입 또는 결실조차도 양성 감지 RNA 바이러스([+]ssRNA)에 매우 해롭습니다. 따라서 PCR 기반 치환 돌연변이 유발은 생존력이 우수한 전체 (+)ss RNA 바이러스 게놈의 크고 다양한 라이브러리의 반복 생성에 선호되는 방법입니다.
FL-MRS는 바이러스 cDNA 클론에 결합하는 프라이머 세트의 세심한 설계를 통해 ~10kb 게놈 길이의 모든 양성 RNA 바이러스에 적용할 수 있는 간단한 접근 방식입니다. pJFH1은 HCV 유전자형 2a를 암호화하고 바이러스 수명 주기의 모든 단계를 재현할 수 있는 감염성 cDNA 클론입니다. FL-MRS 접근법을 사용하여 무작위로 돌연변이화된 전체 게놈 라이브러리(돌연변이 라이브러리[ML])를 합성하여 돌연변이와 관련된 특성에 대한 사전 지식이 없는 복제 가능한 JFH1 변이체를 생성하는 것을 입증했습니다. 항바이러스제에 노출된 일부 바이러스 변이체는 원하는 표현형 변화로 약물 압력을 빠르게 극복했습니다. 여기에 설명된 프로토콜을 사용하면 과다한 바이러스 변이체를 생성할 수 있어 (+)ssRNA 바이러스의 진화를 연구할 수 있는 기회를 얻을 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>1kb 플러스 DNA 사다리&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>10787018</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml 원심분리기 튜브</td><td>Tarsons</td><td>500010</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 원심분리기 튜브</td><td>Tarsons</td><td>546021</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 세포 배양 접시&nbsp;</td><td>Tarsons</td><td>960010</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 원심분리기 튜브</td><td>Tarsons</td><td>546041</td><td></td></tr><tr><td>아세트산</td><td>Merck</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>Agarose&nbsp;</td><td>HiMedia</td><td>MB080</td><td></td></tr><tr><td>Agrose 젤 전기영동 유닛</td><td>BioRad</td><td>1704406</td><td></td></tr><tr><td>Biosafety Cabinet, ClassII</td><td>ESCO</td><td>AC2 4S</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>HiMedia</td><td>MB083</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5424-R</td><td></td></tr><tr><td>CFX Connect Real-Time PCR 검출 시스템</td><td>BioRad</td><td>1855201</td><td></td></tr><tr><td>클로닝 플레이트 90 mm&nbsp;</td><td>Tarson</td><td>460091</td><td></td></tr><tr><td>CO2 인큐베이터&nbsp;</td><td>New Brunswick</td><td>Galaxy 170R</td><td></td></tr><tr><td>Colibri 마이크로볼륨 분광계</td><td>Titertek-Berthold</td><td>11050140</td><td></td></tr><tr><td>DAB&nbsp; 기판&nbsp; 키트&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab94665</td><td></td></tr><tr><td>dATP 솔루션</td><td>NEB</td><td>N0440S</td><td></td></tr><tr><td>데옥시뉴클레오티드 (dNTP) 솔루션 세트</td><td>NEB</td><td>N0446</td><td></td></tr><tr><td>디에틸 피로카보네이트 (DEPC)&nbsp;</td><td>SRL 화학 물질</td><td>46791</td><td></td></tr><tr><td>디메틸 설폭 사이드 (DMSO)</td> <td>HiMedia</td><td>MB058</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 고 포도당</td><td>Lonza</td><td>BE12-604F</td><td></td></tr><tr><td>EcoR1-HF</td><td>NEB</td><td>R3101</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 테트라 나트륨 염 이수화물</td><td>HiMedia</td><td>GRM4918</td><td></td></tr><tr><td>에티듐 브로마이드</td><td>Amresco</td><td>X328</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>포름알데히드&nbsp;</td><td>Fishser Scientific</td><td>12755</td><td></td></tr><tr><td>젤 문서화 시스템</td><td>ALPHA IMAGER</td><td></td><td></td></tr><tr><td>염소 안티-마우스 IgG (H+L) 보조 항체, HRP</td><td>Thermo Fisher</td><td>A16066</td><td></td></tr><tr><td>과산화수소 30%</td><td>Merck</td><td>107209</td><td></td></tr><tr><td>도립 현미경</td><td>Nickon</td><td>&nbsp; ECLIPSE Ts2</td><td></td></tr><tr><td>LB 육수&nbsp;</td><td>HiMedia</td><td>M1245</td><td></td></tr><tr><td>리포펙타민 2000&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>116680270</td><td>transfection 시약</td></tr><tr><td>기계식 피펫 세트</td><td>Eppendorf&nbsp; &nbsp;</td><td></td><td></td>3120000909</tr><tr><td>메탄올</td><td>Merck</td><td>106009</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 팁 0.2-10 &마이크로; 엘&nbsp;</td><td>Tarsons</td><td>521000</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 팁 10 - 100 &마이크로; 엘&nbsp;</td><td>Tarsons</td><td>521010</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 팁 200-1000 &마이크로; 엘&nbsp;</td><td>Tarsons</td><td>521020</td><td></td></tr><tr><td>MOPS 버퍼&nbsp;</td><td>GeNei</td><td>3601805001730</td><td></td></tr><tr><td>Nonessential aminoacids (NEAA)</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>One Shot TOP10 Chemically Competent&nbsp;E. 대장균</td><td>Invitrogen</td><td>C404010</td><td>E.coli DH5&alpha;</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>1105-021</td><td>최소 필수 매체</td></tr><tr><td>PCR 튜브 0.2 ml</td><td>Tarsons</td><td>510051</td><td></td></tr><tr><td>Pencillin/streptomycin&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>pGEM-T Easy Vector System</td><td>Promega</td><td>A1360</td><td>T-vector DNA</td></tr><tr><td>Phosphate buffer saline (PBS)</td><td>HiMedia</td><td>TI1099</td><td></td></tr><tr><td>Phusion&nbsp; 고화질 DNA 중합효소</td><td>NEB</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>Pibrentasvir</td><td>Cayman Chemical</td><td>27546</td><td></td></tr><tr><td>피펫 컨트롤러&nbsp;</td><td>길슨&nbsp;</td><td></td><td></td>F110120</tr><tr><td>Platinum Taq DNA 중합효소&nbsp;</td><td>Thermo</td><td>10966034</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Prism GraphPad</td><td></td><td>통계 분석 소프트웨어</td></tr><tr><td>QIAamp Viral RNA Mini kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>52904</td><td>바이러스 분리 키트</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR 정제 키트</td><td>QIAGEN</td><td>28104</td><td>cokum purification kit</td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit&nbsp;</td><td>QIAGEN</td><td>74104</td><td>RNA 청소 키트</td></tr><tr><td>혈청학 피펫 25 ml</td><td>Thermo Fisher</td><td>170357N</td><td></td></tr><tr><td>혈청학 피펫 5 ml</td><td>Thermo Fisher</td><td>170355N</td><td></td></tr><tr><td>혈청학 피펫10 ml</td><td>Thermo Fisher</td><td>170356N</td><td></td></tr><tr><td>단일 가닥 RNA 마커 0.2-10 kb</td><td>Merck</td><td>R7020</td><td></td></tr><tr><td>탈지 우유&nbsp;</td><td>HiMedia</td><td>M530</td><td></td></tr><tr><td>소듐 아지드 0.1 M 용액</td><td>Merck</td><td>8591</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III 역전사효소&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>18080044</td><td>역전사</td></tr><tr><td>효소 T100 Thermal Cycler</td><td>BioRad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>T175 세포 배양 플라스크&nbsp;</td><td>Tarsons</td><td>159910</td><td></td></tr><tr><td>T25 세포 배양 플라스크&nbsp;</td><td>Tarsons</td><td>950040</td><td></td></tr><tr><td>T7 RiboMax Express 대규모 RNA 생산 시스템&nbsp;</td><td>프로메가</td><td>P1320</td><td>&nbsp; 대규모 RNA 생산 시스템&nbsp;</td></tr><tr><td>T75 세포 배양 플라스크&nbsp;</td><td>Tarsons</td><td>950050</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA 중합효소</td><td>Genetix Biotech (Puregene)</td><td>PGM040</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit</td><td>Applied Biosystems</td><td>4392653</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan RNA-to-CT&nbsp; 1단계&nbsp; 키트</td><td>Thermo Fisher</td><td>4392653</td><td>상용 qRT-PCR 키트&nbsp;</td></tr><tr><td>TOPO-XL--2 Complete PCR 클로닝 키트</td><td>Thermo Fisher</td><td>K8050-10</td><td>키트, long-PCR 제품 클로닝을 위한&nbsp;</td></tr><tr><td>Tris 기본</td><td>HiMedia</td><td>TC072</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 솔루션</td><td>HiMedia</td><td>TCL007</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>HiMedia</td><td>MB067</td><td></td></tr><tr><td>진공 집중기&nbsp;</td><td>Eppendorf, Concentrator Plus</td><td>100248</td><td></td></tr><tr><td>수조&nbsp;</td><td>그랜트</td><td>JBN-18</td><td></td></tr><tr><td>Xba1</td><td>NEB</td><td>R0145S</td><td></td></tr></tbody></table>

양성 rna 바이러스 변이체를 엔지니어링하기 위한 역유전학

Reverse Genetics to Engineer Positive-Sense RNA Virus Variants

다양한 전장 바이러스 변이체의 반복 생성을 위한 편리한 방법이 없기 때문에 RNA 바이러스의 유도 진화 연구가 방해를 받고 있습니다. 전체 RNA 게놈 오류가 발생하기 쉬운 PCR과 역유전학을 통합함으로써 무작위 게놈 전체 치환 돌연변이 유발을 유도할 수 있습니다. 우리는 이 기술을 사용하여 다양한 라이브러리를 합성하여 관심 표현형을 가진 바이러스 돌연변이를 식별하는 방법을 개발했습니다. 전장 돌연변이 RNA 합성(FL-MRS)이라고 하는 이 방법은 다음과 같은 이점을 제공합니다: (i) 매우 효율적인 원스텝 오류가 발생하기 쉬운 PCR을 통해 대규모 라이브러리를 생성할 수 있는 능력; (ii) DNA 중합효소의 충실도를 조작하여 다양한 수준의 유전적 다양성을 가진 라이브러리 그룹을 만드는 능력; (iii) 돌연변이 RNA 합성을 위한 주형으로서 직접 작용할 수 있는 전장 PCR 산물의 생성; (iv) 원하는 표현형의 바이러스 돌연변이를 스크리닝하기 위해 선택되지 않은 입력 풀로 숙주 세포에 전달될 수 있는 RNA를 생성하는 능력. 우리는 역유전학 접근법을 사용하여 FL-MRS가 C형 간염 바이러스인 JFH1 분리물의 수명 주기의 모든 단계에서 바이러스 지향 진화를 연구할 수 있는 신뢰할 수 있는 도구라는 것을 발견했습니다. 이 기술은 양성 RNA 바이러스의 발병 기전 및 항바이러스 내성에서 바이러스 유전자의 적응, 복제 및 역할을 이해하기 위해 유도 진화를 사용하는 데 매우 유용한 도구인 것으로 보입니다.

그림 1에 설명된 절차에 따라 다양한 전장 HCV 변이체를 생성하고 관심 약물 내성 표현형을 스크리닝할 수 있습니다. 전체 게놈 돌연변이 라이브러리는 그림 2와 같이 감소량(100-10ng)으로 clonal-pJFH1을 사용하여 합성되었습니다. ep-PCR 산물(돌연변이 라이브러리)의 평균 수율은 3.8-12.5ng/μL 범위였습니다. 그림 3은 클론-pJFH1 및 대표적인 돌연변이 라이브러리(클론-pJFH1 50ng를 사용하여 합성된 ML50)에서 합성된 바이러스 전사체를 보여줍니다. clonal-pJFH1은 XbaI 분해를 통해 선형화되었고, ML50은 시험관 내 전사 반응에 직접 사용되었습니다. 그림 4와 같이 ep-PCR 반응에서 입력 pJFH1이 감소함에 따라 돌연변이 라이브러...

이 프로토콜은 오류가 발생하기 쉬운 PCR과 역유전학을 사용하여 전장 돌연변이 RNA 합성을 결합하여 C형 간염 바이러스 게놈에 제어 가능한 유전적 다양성을 도입하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 표현형 선택을 위한 모델을 제공하며 10kb 길이의 양성 감지 RNA 바이러스 게놈에 사용할 수 있습니다.

양성 RNA 바이러스 변이체를 엔지니어링하기 위한 역유전학

The lack of a convenient method for the iterative generation of diverse full-length viral variants has impeded the study of directed evolution in RNA ...

여기에 설명된 프로토콜은 최대 10KB 길이의 단일 가닥 양성 RNA 바이러스 게놈의 무작위로 돌연변이화된 전체 길이 RNA 라이브러리를 생성하고 원하는 실험 조건에서 관심 표현형을 선택할 수 있습니다. 이 기술은 클로닝이 필요 없는 접근 방식을 사용하여 짧은 시간에 다양한 수준의 유전적 다양성을 가진 전장 바이러스 RNA 라이브러리를 생성할 수 있습니다. 이 기술은 라이브러리 합성을 위해 저렴하고 널리 사용 가능한 시약을 사용합니다.이 절차를 시연하는 것은 Shiv Nadar University의 생명 과학과 바이러스학 섹션 박사 과정 학생인 Shaheen Khan입니다. 시작하려면 텍스트 원고에 설명된 대로 pJFH1 템플릿이 없는 반응 성분과 함께 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하여 4세트의 실험을 위한 마스터 믹스를 준비하여 ep-PCR을 수행합니다. 마스터 믹스를 4개의 튜브로 분취합니다.100 나노그램, 50 나노그램, 25 나노그램 및 10 나노그램의 템플릿을 개별 튜브에 추가하고 반응의 총 부피를 50 마이크로 리터로 조정합니다. 순환 조건을 적용하여 97개의 36 염기 쌍 조각을 증폭합니다. 5 마이크로 리터의 PCR 산물을로드하고 0.8 % TAE 기반 아가로스 겔 전기 영동을 실행하여 1 킬로베이스 DNA 사다리의 알려진 양과 비교하여 증폭 된 ep-PCR 산물을 추정합니다.컬럼 정제 키트를 사용하여 제품을 정제합니다. 260나노미터에서 흡광도를 측정하여 정제된 생성물의 농도를 추정합니다. ep-PCR 산물을 진공 농축하여 마이크로리터당 100나노그램 이상의 산물 농도를 얻습니다.in vitro RNA 합성 반응을 설정하고 배양을 위해 섭씨 37도에 둡니다. 그런 다음 컬럼 정제 키트를 사용하여 합성된 생성물을 정제합니다. 제조업체의 권장 사항에 따라 약 1마이크로그램의 바이러스 RNA, 5마이크로몰 역전 프라이머 및 200단위의 역전사 효소를 추가하여 20마이크로리터 cDNA 합성 반응을 설정합니다.cDNA를 사용하여 텍스트 원고에 설명된 대로 반응 혼합물을 준비하고 증폭 주기를 실행합니다. 0.8% TAE 기반 아가로스 겔에 제품을 실행하여 25개의 71-염기쌍의 제품 크기를 확인한 다음 앞서 설명한 대로 컬럼 정제 키트를 사용하여 제품을 정제합니다. 40마이크로리터의 멸균수에서 용출합니다.3개의 프라임 A 돌출부를 추가하려면 0.5마이크로몰 DATP와 저충실도 Taq DNA 중합효소 1유닛을 추가하고 전체 PCR 산물을 섭씨 70도에서 30분 동안 1X PCR 완충액 및 1.5밀리몰 염화마그네슘과 함께 배양합니다. 그런 다음 컬럼 정제 키트를 사용하여 혼합물을 정제합니다. 결찰 반응을 설정하고 실온에서 3시간 동안 배양합니다.그런 다음 100 마이크로 리터의 대장균 DH5-알파를 접합 된 DNA에 첨가하고 섭씨 42도에서 35 초 동안 세포에 열 충격을 가합니다. 세포 현탁액에 LB 배지 1m리터를 넣고 섭씨 37도에서 1시간 동안 부드럽게 흔들어 배양합니다. 13, 800 RCF의 원심 분리기.상층액을 버리고 200마이크로리터의 신선한 LB 배지에 재현탁시킵니다. 형질전환된 대장균 DH5-알파 세포 100마이크로리터를 밀리리터당 50마이크로그램의 암피실린을 함유한 LB 플레이트에 담고, 섭씨 37도에서 16시간 동안 배양합니다. 암피실린 밀리리터당 50마이크로그램을 함유한 5밀리리터의 LB 배지에 25-30개의 콜로니로 구성된 미니 프렙을 설치하고 섭씨 37도에서 밤새 성장시킵니다.다음 날, 상용 키트로 플라스미드를 추출하고 모든 콜로니에 대해 200나노그램의 분리된 플라스미드, 2개의 EcoR1 단위 및 1X 제한 완충액을 사용하여 10마이크로리터 부피에서 제한 효소 분해를 수행합니다. 분해 혼합물을 섭씨 37도에서 3시간 동안 배양한 후 0.8%TAE 기반 아가로스 겔에 제품을 로드하여 플라스미드 DNA 삽입을 확인합니다. 권장 primer를 사용하여 25개의 positive clone의 plasmid에 대한 Sanger sequencing을 수행합니다.형질주입 하루 전에 세포를 분할하고 혈구분석기를 사용하여 생존 가능한 세포의 수를 계산합니다. 그런 다음 인간 간종 7.5 세포를 2 밀리리터의 완전한 DMEM에 35mm 접시에 파종하고 5 % 이산화탄소로 가습 된 인큐베이터에서 섭씨 37 도에서 16 시간 동안 세포를 배양합니다. 다음 날, 10 마이크로리터의 transfection 시약을 50 마이크로리터의 최소 필수 배지에 희석하여 전사체 지질 복합체를 준비하고, 50 마이크로리터의 최소 필수 배지에 5 마이크로그램의 바이러스 전사체를 별도로 희석합니다.두 혼합물을 실온에서 10분 동안 배양합니다. 그런 다음 단일 멸균 마이크로 원심분리기 튜브에 혼합하고 혼합물을 실온에서 30분 동안 배양합니다. 세포 배양 후 배양 배지를 제거하고 예열된 1X PBS로 세포를 두 번 세척하고 최소 필수 배지 1.5mL를 추가합니다.콤플렉스를 천천히 추가하고 균일한 분포를 위해 접시를 부드럽게 휘젓습니다. 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소로 10시간 동안 세포를 배양합니다. 그런 다음 배지를 제거하십시오.1밀리리터의 사전 예열된 1X PBS로 형질주입된 세포를 두 번 세척하고 2밀리리터의 완전한 DMEM을 추가합니다. 바이러스 RNA 분리 키트를 사용하여 140마이크로리터의 배양 상층액에서 바이러스 RNA를 분리합니다. 상용 qRT-PCR 키트를 사용하여 10마이크로리터 qRT-PCR 반응을 설정합니다.HCV RNA 정량을 위해 정방향 및 역방향 프라이머와 프로브를 사용합니다. 반응 주기를 섭씨 48도에서 20분, 섭씨 95도에서 10분, 섭씨 95도에서 15초, 섭씨 60도에서 1분 주기로 설정합니다. 반응을 실행하고 음성 컨트롤을 설정합니다.이와 동시에 바이러스 RNA를 정량화하기 위해 10배 연속적으로 희석된 알려진 HCV 전사체 복제 수를 사용하여 표준 곡선을 생성합니다. 세 번 수행하십시오. 인간 간종 7.5 세포를 96웰 플레이트에 도금하고 바이러스를 추가하기 약 16시간 전에 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 세포를 배양합니다.생물 안전 등급 II 캐비닛에서 바이러스를 10배 연속 희석합니다. 웰당 100마이크로리터의 희석된 바이러스를 추가하여 세포를 감염시키고 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소로 배양합니다. 3일 후 감염된 세포를 0.1밀리리터의 PBS로 세 번 세척하고 영하 20도에서 20분 동안 0.1밀리리터의 얼음처럼 차가운 메탄올로 세포를 고정하고 투과시킵니다.1X PBS로 우물을 세 번 세척한 다음 PBST로 1X를 세척합니다. PBST를 제거한 후 PBST에 0.2%탈지유가 함유된 1%BSA 0.1mL로 실온에서 30분 동안 세포를 차단합니다. 차단 용액을 제거하고 1X PBS에서 준비한 0.1 밀리리터의 3 % 과산화수소로 세포를 5 분 동안 처리합니다.다시 말하지만, 1X PBS로 셀을 두 번 세척하고 PBST로 1X를 세척합니다. 웰당 50마이크로리터의 항-NS5A 9E10 단클론 항체를 추가하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 1X PBS로 세 번, PBST로 한 번 우물을 씻습니다.웰당 50마이크로리터의 HRP 접합 염소 항마우스 2차 IgG를 추가하고 실온에서 30분 동안 배양한 다음 0.1밀리리터의 1X PBS로 웰을 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거합니다. 30 마이크로 리터의 DAB를 넣고 실온에서 10 분 동안 부드럽게 흔들어 접시를 배양합니다. DAB 용액을 제거하고 1X PBS로 웰을 두 번, 증류수로 한 번 세척합니다.0.03% 아지드화나트륨을 함유한 PBS 100마이크로리터를 추가합니다. 10X 대물렌즈를 사용하여 도립 광 현미경으로 각 웰을 검사합니다. 양의 우물 수를 셉니다.Reed and Muench 계산기를 사용하여 우물의 50%를 감염시키는 종말점 희석을 추정합니다. NS5A 억제제인 피브렌타스비르를 100% DMSO에 1밀리몰 농도로 용해시키고 완전 DMEM에서 10나노몰 농도로 더 희석합니다. 그런 다음 ML50 바이러스 용량으로 70% 합류에서 순진한 Huh-7.5 세포를 감염시켜 12시간 동안 세포의 50%를 감염시킨 다음 감염된 세포를 감염 후 24시간 동안 6웰 플레이트로 옮깁니다.세포를 분할한 후 16시간 후에 감염된 세포에 EC50 PIB 1개를 추가합니다. 모든 세포가 6개의 연속 통과 동안 분할된 후 3개의 약물 없는 통과 주기가 뒤따를 때마다 이 작업을 수행하고 초점 형성 분석을 사용하여 바이러스 확산을 모니터링합니다. 각 통로에서 바이러스 상청액을 채취하고 섭씨 영하 80도에서 보관합니다.18일째에 상층액에서 바이러스 RNA를 추출하고 합성된 cDNA를 추출합니다. 5마이크로리터의 희석된 cDNA를 사용하여 NS5A 유전자를 증폭합니다. 그런 다음 NS5A 염기서열분석 프라이머를 사용하여 6-8개의 양성 박테리아 플라스미드에서 NS5A 약물 내성 돌연변이를 측정합니다.전체 게놈 돌연변이 라이브러리는 클론 pJFH1을 사용하여 100에서 10 나노그램으로 감소하는 양을 사용하여 합성되었습니다. ep-PCR 산물의 평균 수율은 마이크로리터당 3.8 내지 12.5 나노그램 범위였다. 돌연변이 라이브러리에서 돌연변이의 비율은 ep-PCR 반응에서 pJFH1의 투입이 감소함에 따라 증가했습니다.템플렛의 50 nanograms를 사용하여 종합된 ML50에는 템플렛의 25 nanograms를 사용하여 종합된 ML25가 9개의 대용골을 품는 그러나, 베껴진 10, 000의 기본적인 쌍 당 4개의 대용경우가 있었다. 서열분석된 뉴클레오티드의 수 내에서 어떠한 치환도 클로날 pJFH1에서 발견되지 않았다. ML50 바이러스 변이는 클론 JFH1 바이러스에 비해 피브렌타스비르에 덜 민감했습니다.8개의 NS5A 클론 중 4개는 D7V+F28C의 조합을 가지고 있는 반면, V8A+F28C 및 F36L은 각각 하나의 클론에서 발생했다. 이 돌연변이는 NS5A의 N 말단 부위에 있었는데, 이 부위는 임상적으로 관련된 NS5A 내성 돌연변이를 품고 있는 것으로 알려져 있습니다. ep-PCR의 각 성분의 최종 농도, 특히 템플릿 양이 중요합니다.KB Extender가 없으면 ep-PCR 산물의 수율이 크게 감소합니다.

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연구

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Genetics

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