Name: 혈관 반응을 조사하기 위한 폐동맥 및 평활근 세포의 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-08T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: 배우세요 쥐 폐동맥과 혈관 평활근 세포를 분리하여 오가노 배스 기법으로 혈관 이완 반응을 연구하는 방법을. 이 기법은 폐고혈압 등 혈관 질환의 약리학적 연구에 활용됩니다.

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저자는 태국 국립 연구위원회, 화학 혁신 우수 센터 (PERCH-CIC), 국제 연구 네트워크 (IRN61W0005)가 재정 지원을 제공하고 Naresuan University의 생리학 학부 의학과가 연구 시설 지원을 제공했음을 인정하고자합니다.

이 연구에서 수행 된 실험은 Naresuan University 동물 관리 및 사용위원회 (NUACUC)의 윤리위원회, 프로토콜 번호 NU-AE620921, 과학적 목적을위한 동물의 관리 및 사용에 대한 승인을 받았습니다.
1. 생리적 용액의 조성
<ol><li>다음과 같이 최종 농도를 달성하기 위해 증류수에 화학물질을 용해시켜 크렙스 용액을 제형화한다: 122 mM NaCl, 10 mM HEPES, 5 mM KCl, 0.5 mM KH2PO4, 0.5mM NaHPO4, 1 mM MgCl2, 1.8 mM CaCl2, 및 11 mM 글루코스8. 사용하기 전에 용액의 pH를 1M NaOH로 7.3으로 조정하고 37°C로 예열합니다.</li>
	<li>1.1단계에서 언급한 것과 유사하게 차가운 Krebs 용액을 준비합니다. 단계 2에 기재된 바와 같이 IPA의 격리 매체로서 사용하기 위해.</li>
</ol>2. 폐내 동맥 분리 (IPA)
<ol><li>8주 된 수컷 Wistar 쥐를 티오펜탈 나트륨(100mg/kg)을 복강 주사하여 마취합니다9. 발에 고정 된 집게를 사용하여 깊은 수면에서 고통스러운 자극에 대한 쥐의 반응을 확인한 다음 2.2 단계에서 안락사시키기 전에 쥐가 발 풀백 반응이 없는지 확인하십시오.</li>
	<li>쥐의 중간 흉부와 심장 단자를 가위 (크기 14cm)로 자릅니다. 그런 다음 가위 (크기 14cm)로 폐의 뿌리를 찾으십시오. 가위로 절단하여 폐 전체를 수확하고 차가운 Krebs 용액10,11에 담그십시오.</li>
	<li>가위 (크기 11cm)로 폐의 단일 엽을 자르고 폐의 내측 / 뿌리가 위를 향하도록 페트리 접시 (크기 9cm)에 놓습니다 (그림 2A, B). 정맥, 기관지 및 동맥의 정렬을 위에서 아래로 관찰하고 식별합니다(그림 2B).</li>
	<li>가위 (크기 11cm)로 기관지를 세로로 자릅니다. 그런 다음 집게(크기 11cm)를 사용하여 기관지 끝을 잡습니다. 부드럽게 해부하고 폐에서 기관지와 정맥을 제거하십시오. IPA는 항상 기관지 아래에 해부학 적으로 정렬되어 있습니다.</li>
	<li>그 후 주요 IPA를 시각화 할 수 있습니다 (그림 2C). 집게(크기 11cm)를 사용하여 IPA의 끝을 잡고 가위(크기 11cm)로 폐 조직에서 조심스럽게 해부합니다.</li>
	<li>분리된 IPA를 장기 수조 어셈블리가 설정될 때까지 차가운 크렙스 용액에 보관하십시오(pH 7.3 및 온도 4°C)1 1.</li>
</ol>3. 혈관 평활근 세포 (VSMC)의 분리
<ol><li>앞서 2단계에서 설명한 대로 IPA를 분리합니다. 가위 (크기 11cm)로 IPA의 주요 가지를 세로로 자르고 작은 스트립 (2mm)으로 자릅니다 (그림 3A).</li>
	<li>IPA 스트립을 110 mM NaCl, 5 mM KCl, 0.5 mM KH2PO4, 0.5 mMNaH2PO4, 10 mM NaHCO3, 10 mM Hepes,0.03 mM 페놀 레드, 10 mM 타우린, 0.5 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 11 mM 글루코스, 및 0.16 mMCaCl2를 함유하는 해리 매질 (DM)10,12에 침지시키고, 1 M NaOH로 pH를 7.0으로 조정한다. 스트립을 1 mg/mL 파파인, 0.04% 소 혈청 알부민(BSA) 및 0.4 mM 1,4-디티오트레이톨(DTT)을 함유하는 DM에서 4°C에서 1시간 동안 배양하고, 37°C에서 15분 동안 추가로 배양한다. DM에 1mg/mL 콜라게나제 유형 1A를 추가하고 37°C에서 5분 동안 추가로 배양합니다. 참고: DM은 세포 생존율을 보존하는 데 사용되는 솔루션입니다. 파파인과 콜라게나제 유형 1A는 세포 외 기질 단백질을 분해하여 단일 세포를 분리하는 효소입니다. BSA는 저장 및 효소 반응 동안 효소의 안정화에 사용되는 혈청 알부민 단백질입니다. DTT는 세포 분리 과정에서 효소의 활성을 안정화하고 촉진하는 데 사용되는 환원제입니다. 타우린은 세포막과 세포 완전성을 안정화시키는데 사용되는 아미노 황산이다.</li>
	<li>조직을 신선한 DM으로 옮기고 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 부드러운 분쇄로 분산시킵니다(그림 3B). 분리된 VSMC가 현미경으로 목욕 용액에서 보일 때까지 계속 분쇄합니다(그림 3C). 참고: 새로 분리된 VSMC는 약리학적 제제에 의한 조절, 패치 클램프 전기생리학적 분석, 칼슘 이미징 등과 같은 다양한 실험 조사와 함께 혈관 생리학/병태생리학을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나, 본 연구는 장기 목욕 기술을 이용한 분리 된 IPA의 혈관 이완에만 초점을 맞추고 있습니다.</li>
</ol>4. 오르간 목욕 기술
<ol><li>앞서 2단계에서 설명한 대로 IPA를 분리합니다. IPA의 주요 가지를 ~2mm 길이의 고리로 자릅니다(그림 2D)13.</li>
	<li>IPA 링을 두 개의 직경 40μm 스테인리스 스틸 와이어(그림 2E)11,13,14에 끼워 오르간 수조 챔버(그림 4)에 부착합니다.</li>
	<li>IPA 링으로 장착된 스테인리스 스틸 와이어를 데이터 수집 장치 및 데이터 기록 및 분석에 적합한 생리학적 소프트웨어가 설치된 컴퓨터 시스템에 연결된 등척성 힘 변환기에 연결한 다음 IPA 링의 장력을 1g11로 부드럽게 올립니다.</li>
	<li>용기 세그먼트가 45g의 휴지 장력에서 약 1분 동안 평형을 이루도록 합니다. 평형 기간 동안 Krebs 용액이 15분마다 정기적으로 교체되는지 확인하십시오. 이러한 평형 기간 후에, 47.4 mM NaCl, 80 mM KCl, 10 mM Hepes, 0.5 mMKH2PO4, 0.5 mM NaHPO4, 1.8 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 및 11 mM 글루코스 10,11을 함유하는 높은 세포외 K+ (80 mM) 용액에 대한 혈관 수축을 측정함으로써 혈관의 생존력을 시험한다.</li>
	<li>페닐에 프린 (PE, 1 x 10-5 M)으로 사전 계약 된 고리에서 아세틸 콜린 (1 x 10-5 M)에 대한 이완 반응을 계산하여 내피의 유무를 평가하십시오 (혈관 수축은 PE를 추가 한 후 1 시간 동안 안정적으로 유지됨). 고리가 70% 이상의 이완을 위해 정량화되는 경우 내피가 손상되지 않은 것으로 간주하십시오(그림 5A). 이완이 10% 미만인 경우 고리를 내피 탈질13으로 간주합니다(그림 5B). 작은 와이어로 혈관 내부를 부드럽게 문질러 내피를 기계적으로 제거하여 탈질을 유도합니다.</li>
	<li>시험 실험의 시작 전에 30분 동안 동맥 고리를 다시 평형화시킨다.</li>
</ol>5. 식물 추출물에 대한 혈관 이완제 반응
<ol><li>PE (1 x 10-5 M)로 IPA 링을 사전 계약하여 식물 추출물의 이완 효과를 조사하십시오.</li>
	<li>그런 다음 식물 추출물(1-1,000μg/mL)을 내피 원형 고리와 내피 탈질 고리에 누적하여 조심스럽게 추가하여 혈관 이완을 유도하고(그림 6A, B) 농도 의존적 반응 곡선을 얻습니다(그림 6C).</li>
	<li>용매로 사용되는 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)의 효과도 음성 대조군으로 작용하도록 유사하게 평가되는지 확인하십시오 (그림 6C).</li>
</ol>6. 식물 추출물이 내피를 통해 혈관이완을 유도하는 기전
<ol><li>내피 산화 질소 합성 효소 (eNOS), 시클로 옥시 게나 제 (COX) 13 및 내피 유래 과분극 인자 (EDHF) 경로를 통해 식물 추출물의 혈관 이완제 작용 메커니즘을 평가하여 내피 온전한 IPA 고리를 다음 억제제와 함께 30 분 동안 배양합니다 (그림 7A) : 1 x 10-4 M NG- 니트로 -L- 아르기닌 메틸 에스테르 (L-NAME, eNOS 억제제) 9, 1 x 10-5 M 인도 메타 신 (COX 억제제) 9, 또는 1 x 10-7 M AP로 IPA의 수축을 유도하기 전에 1 x 10-7 M 아파민 (작은 칼슘 활성화 칼륨 채널 차단제) 및 1 x 10-7 M charybdotoxin (중간 및 큰 전도도 칼슘 활성화 칼륨 채널 차단제)의 조합.</li>
	<li>그런 다음 PE로 수축 안정화 된 후 식물 추출물의 누적 농도 (0.1-1,000 μg / mL)를 추가합니다.</li>
	<li>억제제가 없는 IPA 고리의 반응과 비교하여 억제제가 있는 상태에서 IPA 고리의 이완 백분율로서 식물 추출물의 효과를 제시하고(그림 7B-D) 농도-반응 곡선을 구축합니다.</li>
</ol>7. 혈관 평활근 K+ 채널을 통한 식물 추출물 유발 혈관 이완 메커니즘
<ol><li>전압 게이트 칼륨 채널(KV)의 차단제 인 1 x 10-3 M 4- 아미노 피리딘 (4-AP) (그림 8A), 1 x 10-5 M 글리 벤 클라 미드, ATP 민감성 칼륨 채널 (KATP) 차단제 또는 1 x 10-7 M 이베리오톡신, 큰 전도도Ca 2+ 활성화 K + 채널 (KCA)의 차단제, 1 x 10-5 M PE로 IPA의 수축을 유도하기 전에.</li>
	<li>그런 다음 식물 추출물의 누적 농도를 추가합니다.</li>
	<li>식물 추출물의 효과를 억제제가 없는 IPA 고리와 비교하여 억제제를 사용한 IPA 고리의 이완 백분율로 제시하고(그림 8B-D) 농도-반응 곡선을 구성합니다.</li>
</ol>8. VSMCs에서 세포외 칼슘(Ca2+) 유입 억제를 통한 식물 추출물 유발 혈관 이완의 메커니즘
<ol><li>1mM 에틸렌 글리콜-비스(2-아미노에틸에테르)-N,N,N',N'-테트라아세트산(EGTA)을 포함하는 Ca2+-free Krebs 용액에서 30분 동안 내피 탈질 IPA 고리를 사전 배양합니다(그림 9A).</li>
	<li>그런 다음 목욕 용액을Ca2 + free-80mM K+ 용액으로 10분 동안 교체하여 VSMC를 탈분극한 다음 VOCC를 엽니다(그림 9A).</li>
	<li>누적 적으로CaCl2 (0.01-10 mM)를 추가하여 IPA의 혈관 수축을 유도하고 농도-반응 곡선을 구축합니다 (그림 9A).</li>
	<li>동일한 IPA 고리에서이 프로토콜을 반복하되 식물 추출물 또는 1 μM 니카 디핀 (L 형Ca 2 + 채널 차단제)을Ca2+ 함유 80 mM K + 용액 중 10 분 동안 미리 배양 한 후 CaCl28을 누적 첨가합니다.</li>
	<li>마지막으로, 수축 반응을 대조군CaCl2 챌린지에 의해 이전에 유도된 최대 수축과 비교한다(그림 9B).</li>
</ol>9. 근형질 세망(SR)에서 세포내 칼슘(Ca2+) 방출 억제를 통한 식물 추출물 유도 혈관 이완 메커니즘
<ol><li>내피 탈질 IPA 링을 80mM K+ 용액에 약 5분 동안 노출시켜 VSMC를 탈분극하고 VOCC를 열고 궁극적으로 SR에Ca 2+ 로딩을 생성합니다(그림 10A).</li>
	<li>10분 동안 목욕 용액을 1mM EGTA가 포함된 Ca2+가 없는 Krebs 용액으로 교체합니다(그림 10A).</li>
	<li>그런 다음 포스포리파아제 C/IP3 경로를 활성화하여 궁극적으로 SR에서Ca2+를 방출하고 IPA의 일시적인 수축을 유발하는 1 x 10-5M PE로 IPA 링에 도전합니다(그림 10A).</li>
	<li>동일한 프로토콜을 반복하여 PE에 대한 일시적인 수축을 확인합니다.</li>
	<li>약 5분 동안 80mM K+ 용액으로 IPA 링에 다시 도전한 다음 목욕 용액을 식물 추출물이 있거나 없는 1mM EGTA를 포함하는 Ca2+ 프리 Krebs 용액으로 10분 동안 교체합니다.</li>
	<li>다시 1 x 10-5 M PE로 IPA 링에 도전하십시오.</li>
	<li>PE에 의해 유도된 IPA 수축을 식물 추출물이 있는 상태와 없는 상태 사이에 비교합니다(그림 10B).</li>
</ol>10. 통계 분석
<ol><li>결과를 평균± SEM으로 표현합니다. 스튜던트 t-검정을 사용하여 이러한 값을 비교하거나 분산 분석(ANOVA)으로 분석한 후 적절한 통계 소프트웨어를 사용하여 Tukey-Kramer 사후 검정을 수행합니다. p < 0.05에서의 차이가 통계적으로 유의하다고 생각하십시오. 여기서, n=6마리의 래트/실험 프로토콜이 있었다. 알림: 혈관 수축 및 혈관 이완의 기록은 컴퓨터에 설치된 적절한 소프트웨어로 평가할 수 있습니다. 예를 들어, 도 5A 는 혈관이 수축을 일으키는 PE에 의해 자극될 때, 이것은 원래 추적의 증가된 장력으로부터 관찰될 수 있음을 보여준다. 추적은 20-30 분 안에 안정화되며 이는 100 % 수축으로 간주됩니다. 그 후, ACh는 혈관을 자극하여 이완을 일으키며, 이는 원래 추적의 장력 감소에서 관찰 할 수 있습니다. 따라서, 감소된 장력은 100% 수축에 대한 백분율로 계산된다.</li>
</ol>

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</ol>

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이 원고에서는 쥐 IPA와 VSMC를 분리하는 기술을 설명합니다. 시험관 내에서 IPA의 혈관 반응을 조사하기 위해 여러 실험 프로토콜이 사용되었으며, 이는 식물 추출물에 의해 유도된 IPA 혈관 이완의 약리학적 효과 및 기계론적 기초를 특성화하는 데 사용될 수 있습니다.
식물 추출물의 내피 의존성 혈관 확장 작용과 관련하여 L-NAME (eNOS), 인도 메타 신 (COX) 및 아파민 + 차리 브도 톡신 (EDHF)과 같은 다양한 차단제가 사용되었습니다. 대표적인 데이터는 양성 결과(즉, eNOS 또는 EDHF 억제제의 존재 하에서 혈관 확장제 반응의 현저한 감소)와 음성 결과(즉, COX 억제제의 존재 하에 혈관 확장제 반응의 변화 없음)를 모두 보여주었으며, 이는 식물 추출물이 eNOS 및 EDHF 내피 경로를 통해 작용함을 시사합니다. 식물 추출물에 의해 유도 된 내피 비 혈관 이완제 효과는 K + 채널, 세포 외Ca2 + 유입 및 SR...

폐 혈관 구조는 저압 혈관 시스템으로, 주요 기능은 산소가 제거 된 혈액을 폐의 가스 교환 영역으로 전달하는 것입니다. 폐의 폐동맥은 기관지 나무와 평행 한 가지로 배열되어 궁극적으로 여러 폐포에 걸쳐 연속적이고 마지막으로 정맥과 정맥으로 모이는 광범위한 모세 혈관 네트워크를 형성합니다. 폐동맥의 혈관 색조는 내피와 혈관 평활근 세포 (VSMC) 사이의 상호 작용을 포함하는 여러 요인에 의해 제어됩니다1.
이 연구에서 우리는 폐내 동맥 (IPA)의 내피 의존성 및 독립적 인 혈관 이완에 중점을 둡니다. 내피 의존성 혈관 이완과 관련하여 내피 세포 표면에서 발생하는 다양한 메커니즘은 세포 내Ca2+ 농도를 증가시킬 수 있으며(예: 아세틸콜린[ACh]는 무스카린 수용체[M3]와 결합), 산화질소(NO), 프로스타사이클린(PGl2) 및 내피 유래 과분극 인자(EDHF)의 형성을 유도할 수 있습니다(그림 1 ). NO는 내피 산화 질소 합성 효소 (eNOS)2에 의해 L- 아르기닌에서 합성 된 주요 내피 유래 이완 인자이며, 내피 세포에서 VSMC로 해리되고 (그림 1) 가용성 구아 닐릴 사이 클라 제 (sGC) 효소를 자극합니다. 이 효소는 구아노신 삼인산(GTP)을 고리형 구아노신 모노포스페이트(cGMP)로 변화시켜 단백질 키나아제 G(PKG)를 활성화하고 세포질Ca 2+ 수준을 감소시켜 혈관 이완을 유발합니다(그림 1). PGl2는 시클로옥시게나제(COX) 경로 3,4를 통해 내피 세포에 의해 합성된다. VSMC의 프로스타사이클린 수용체(IP)와 결합하여 아데닐릴 사이클라제(AC) 효소를 자극한 다음 아데노신 삼인산(ATP)을 고리형 아데노신 모노포스페이트(cAMP)로 전환합니다(그림 1)3,4. cAMP는 단백질 키나아제 A (PKA)를 활성화시켜 세포질Ca 2+ 수준을 감소시키고 혈관 이완5을 유발합니다 (그림 1). EDHF 경로는 또한 다양한 내피 매개체 및 전기적 사건을 통해 내피 의존성 혈관 이완에 참여합니다. EDHF 경로의 활성화는 VSMC의 과분극을 유도하여 전압 작동 Ca 2+ 채널 (VOCC)을 폐쇄하고 세포 내Ca 2+ 수준을 감소시키고 혈관 이완을 유도합니다6. 내피 비 의존성 혈관 이완은 세포 내Ca2+ 수준의 감소, 미오신 경쇄 키나아제 (MLCK)의 억제, 미오신 경쇄 포스파타제 (MLCP)의 활성화 및 VSMC의 수축 기계에 대한Ca 2+ 민감도의 감소와 같은 여러 메커니즘을 통해 VSMC에서 직접 발생합니다. 이 연구에서는 다양한 K+ 채널의 개방, VOCC의 봉쇄 및 근형질 세망7에서 Ca2+ 방출 억제로 인한 혈관 이완에 중점을 두어 세포 내Ca2+ 수준을 감소시켜 VSMC 미오신 경쇄 인산화 및 미오신 - 액틴 결합 또는 교차 다리 형성을 각각 감소시키고, 궁극적으로 혈관 이완을 초래합니다.
분리 된 IPA에서 혈관 수축 및 혈관 이완 측정을 평가하는 기술은 설치류에 대해 잘 확립되어 있지만 데이터는 실험 프로토콜에 따라 다릅니다. 본 연구는 신경 신호, 호르몬, 사이토 카인, 혈압 등과 같은 생체 내 혈관 반응을 조절하는 외부 요인이없는 상태에서 만들어진 시험관 내 래트 IPA 제제의 혈관 반응성을 평가하는 데 사용되는 방법을 설명합니다.
우리는 IPA의 혈관 반응성을 연구하기 위한 예로서 식물 추출물을 사용하는 여러 실험 프로토콜을 사용했습니다. 다양한 차단제 (그림 1)를 사용하여 식물 추출물에 의해 유도 된 내피 의존성 및 비 의존성 혈관 이완 메커니즘을 확인했습니다. 그럼에도 불구하고, 다양한 폐 병리의 치료에 사용되는 약물, 추출물 또는 식물 화학 물질에 대한 IPA의 혈관 반응을 평가하기 위해 동일한 프로토콜을 적용 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>1,4-디티오트레이톨(DTT)</td><td>시그마-알드리치</td><td>D0632 CAS NO. 348-12-3</td><td></td></tr><tr><td>4-아미노피리딘(4-AP)</td><td>알드리치 화학</td><td>A78403 CAS NO. 504-24-5</td><td></td></tr><tr><td>아세틸콜린</td><td>시그마-알드리치</td><td>A6625 CAS NO. 60-31-1</td><td></td></tr><tr><td>아파민</td><td>시그마-알드리치</td><td>A9459 CAS 번호 24345-16-2</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 (BSA)</td> <td>시그마 - 알드리치</td><td>A2153 < / > CAS 번호 9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>칼슘 choride</td><td>Ajax Finechem</td><td>AJA960 CAS 번호 1707055184</td><td></td></tr><tr><td>Charybdotoxin</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>C7802 CAS 번호 95751-30-7</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 분해 효소 유형 1A</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>C9891 CAS 번호 9001-12-1</td><td>클로스트 리듐 히스톨리티쿰</td></tr><tr><td>D (+) - 포도당 일 수화물</td><td>Millipore Corporation</td><td>K50876942 924 CAS NO. 14431-43-7</td><td></td></tr><tr><td>디메틸 설폭 시드 (DMSO)</td> <td>시그마 - 알드리치</td><td>D4540 CAS 번호 67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌 글리콜 -비스 (2- 아미노 에틸 에테르) -N, N, N', N'- 테트라 아세트산 (EGTA)</td> <td>시그마 - 알드리치</td><td>E3889 CAS 번호 67-42-5</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884 CAS NO. 60-00-4</td><td></td></tr><tr><td>겸자 11cm.</td><td>녹슬지 않는 Dumoxel</td> <td>겸</td><td></td></tr>자 <tr><td>14cm.</td><td>Rustless Dumoxel-Glibenclamide</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6039 CAS NO. 16673-34-0</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 프로그램</td><td>소프트웨어 버전 5.0 (San Diego, CA, USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375 CAS NO. 7365-45-9</td><td></td></tr><tr><td>Iberiotoxin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5904 CAS NO. 1002546960</td><td>재조합 Mesobuthus tamulus</td></tr><tr><td>Indomethacin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7378 CAS NO. 53-86-1</td><td></td></tr><tr><td>Labchart 프로그램</td><td>소프트웨어 버전 7.0 (AD Instrument, Castle Hill, Australia).</td><td></td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘</td><td>Ajax Finechem</td><td>296 CAS NO. 1506254995</td><td></td></tr><tr><td>남성 Wistar 쥐</td><td>Nomura Siam International Co. Ltd., 방콕, 태국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NG-니트로 -L- 아르기닌 메틸 에스테르 (L-NAME)</td> <td>시그마 -알드리치</td><td>N5751 CAS 번호 51298-62-5</td><td></td></tr><tr><td>니카르 디핀</td><td>시그마 < /</td><td>> CAS 번호 54527-84-3</td><td></td></tr><tr><td>오르간 목욕 15mL.</td><td>-</td><td>-</td><td>연구자들의 특정 순서</td></tr><tr><td>: Papain</td><td>: Sigma-Aldrich</td><td>P4762 CAS NO. 9001-73-4</td><td>FromPapaya Latex</td></tr><tr><td>Phenal red</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5530 CAS NO. 34487-61-1</td><td></td></tr><tr><td>Phenylephrine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6126 CAS NO. 61-76-7</td><td></td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>Kemaus</td><td>KA383 CAS NO. 7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>칼륨 이수소 인산</td>염 <td>Aldrich 화학</td><td>EC231-913-4 CAS NO. 7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>S+A2:E36odium chloride</td><td>Kemaus</td><td>KA465 CAS NO. 7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>가위 11cm.</td><td>스폴 스테인리스</td> <td>-</td><td></td></tr> <tr><td>가위 14cm</td><td>스폴 스테인리스</td> <td>-</td><td></td></tr> <tr><td>중탄산 나트륨</td><td>Ajax Finechem</td><td>475 CAS 번호 912466</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 디 하이드로 겐 포스페이</td>트 <td>Aldrich Chemical</td><td>33,198-8 CAS NO. 7558-80-7</td><td></td></tr><tr><td>수산화 나트륨</td><td>Ajax</td><td>482 CAS 번호 1506196602</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 티오펜탈</td><td>Anesthal JPN3010002<</td><td>br / > CAS NO. 1C 314/47</td><td></td></tr><tr><td>타우린</td><td>시그마-알드리치</td><td>T0625 CAS 번호 107-35-7</td><td></td></tr><tr><td>수조 WBU 45</td><td>Memmert</td><td>2766 CAS 번호 -</td><td></td></tr></tbody></table>

혈관 반응을 조사하기 위한 폐동맥 및 평활근 세포의 분리

Isolation of Intrapulmonary Artery and Smooth Muscle Cells to Investigate Vascular Responses

쥐 폐에서 분리 된 폐내 동맥 (IPA) 및 혈관 평활근 세포 (VSMC)는 혈관 수축 및 혈관 이완의 기본 메커니즘을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. IPA 및 VSMC를 분리 한 후 신경 신호, 호르몬, 사이토 카인 등과 같은 외인성 요인이없는 경우 생리 학적 및 병리학 적 조건에서 혈관 반응의 특성을 평가할 수 있습니다. 따라서 IPA 및 VSMC는 약리학 적 약제에 의한 조절, 패치 클램프 전기 생리 학적 분석, 칼슘 이미징 등과 같은 다양한 실험 조사와 함께 혈관 생리학 / 병태 생리학을 연구하기위한 우수한 모델 역할을합니다. 여기에서는 장기 목욕 설정에서 혈관 반응을 조사하기 위해 IPA를 분리하는 기술을 사용했습니다. IPA 세그먼트는 강내 와이어를 통해 장기 목욕 챔버에 장착되고 다양한 약리학 적 약제에 의해 자극되었습니다. IPA 혈관 색조의 변화(즉, 혈관 수축 및 혈관 이완)를 등척성 힘 변환기 및 생리학적 데이터 분석 소프트웨어 프로그램을 사용하여 기록하였다. 우리는 식물 화학 또는 합성 약물의 약리학 적 활성을 연구하기 위해 혈관 이완 / 혈관 수축 메커니즘을 조사하는 데 적용 할 수있는 몇 가지 실험 프로토콜을 구현했습니다. 이 프로토콜은 또한 폐동맥 고혈압을 포함한 다양한 질병을 조절하는 약물의 역할을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. IPA 모델을 통해 약물의 약력학 파라미터를 평가하는 데 중요한 농도-반응 곡선을 조사할 수 있습니다.

본 연구의 프로토콜은 단리된 IPA 제제의 혈관 반응에서 관찰되는 생리적 현상을 측정하기 위한 최적의 실험 조건을 결정하기 위해 개발되었다. 파일럿 실험은 다음과 같이 식물 추출물의 혈관 효과 및 혈관 이완 작용의 기계론적 기초에 대한 이해를 돕기 위해 잠재적인 결과를 설명하기 위해 수행되었습니다.
식물 추출물의 혈관 이완 효과 그림 6A, B에서 볼 수 있듯이 내피 손상되지 않은 IPA (E +)에서 식물 추출물은 혈관 이완의 농도 의존적 반응을 유도했습니다 (EC50 = 66.88 μg / mL, 그림 6C). 내피 (E-)의 박멸은 EC 50의 2.2 배 증가에 반영된 바와 같이 식물 추출물에 의해 유도 된 혈관 이완 (p &lt; 0.01)을 크게 감소 시켰습니다 ...

동맥 폐 순환의 혈관 반응은 폐내 동맥 (IPA) 및 혈관 평활근 세포 (VSMC)를 사용하여 탐색 할 수 있습니다. 본 연구는 IPA의 분리와 생리적 자극에 대한 반응으로 혈관 이완을 조사하는 데 사용되는 프로토콜을 자세히 설명합니다.

The intrapulmonary artery (IPA) and vascular smooth muscle cells (VSMCs) isolated from rat lungs can be used to study the underlying mechanisms of ...

이 연구는 쥐의 폐동맥과 혈관 평활근 세포를 분리하는 방법을 설명합니다. 폐내 동맥의 혈관 반응을 조사하기 위해 장기 목욕 기술을 사용하는 것과 같은 여러 실험 프로토콜이 사용되었습니다. 폐동맥 및 혈관 평활근 세포는 혈관 생리학 및 병태생리학을 연구하는 훌륭한 모델입니다.이 기술의 적응은 모든 약물, 추출물 또는 식물 화학 물질의 혈관 반응을 평가할 수 있습니다. 분리된 폐내 동맥 링을 장기 욕조에 장착하면 분리된 폐내 동맥을 사용하여 폐 고혈압을 포함한 다양한 질병을 조절하는 약물의 역할을 평가할 수 있습니다. 실험 프로토콜은 기술적으로 실현 가능하지만 중요한 단계는 복잡하고 성공을 위해 필수적이므로 시각적 데모가 있으면 더 쉽게 이해하고 따를 수 있습니다.절차를 시연하는 것은 나레수안 대학교 의과대학 생리학과 심혈관 연구 단위 실험실의 생리학 석사 학위 학생인 Kittiwoot To-on입니다. 11cm 가위로 폐의 단일 엽을 자르고 폐의 내측 또는 뿌리가 위쪽을 향하도록 9cm 페트리 접시에 놓습니다. 정맥, 기관지 및 동맥의 정렬을 위에서 아래로 관찰하고 식별합니다.가위로 기관지를 세로로 자릅니다. 그런 다음 11 센티미터의 집게를 사용하여 기관지 끝을 잡습니다. 부드럽게 해부하고 폐에서 기관지와 정맥을 제거하십시오.집게를 사용하여 폐내 동맥의 끝을 잡고 가위로 폐 조직에서 조심스럽게 해부하십시오. 장기 욕조 어셈블리가 설정 될 때까지 격리 된 폐내 동맥을 차가운 Krebs 용액에 보관하십시오. 폐내 동맥을 분리 한 후 11cm 가위로 폐내 동맥의 주요 가지를 세로로 자르고 2mm 스트립으로 자릅니다.폐내 동맥 스트립을 DM에 담근 다음 밀리리터 파파인당 1밀리그램, 0.04%BSA 및 0.4밀리몰 DTT를 포함하는 DM에서 섭씨 4도에서 1시간 동안 스트립을 배양합니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 15 분 동안 배양하십시오. DM에 콜라게나제 유형 IA의 밀리리터 당 1 밀리그램을 첨가하고, 다시 섭씨 37도에서 5 분 동안 배양한다.조직을 신선한 DM으로 옮기고 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 부드러운 분쇄로 분산시킵니다. 분리된 혈관 평활근 세포가 현미경으로 목욕 용액에서 보일 때까지 계속 마찰을 빚습니다. 앞에서 설명한 것처럼 폐내 동맥을 분리하고 폐내 동맥의 주요 가지를 약 2mm 길이의 고리로 자릅니다.장기 목욕 챔버의 폐내 동맥 링을 직경 40마이크로미터 스테인리스 스틸 와이어 2개에 끼워 부착합니다. 폐동맥 링이 장착된 스테인리스 스틸 와이어를 데이터 수집 장치 및 데이터 기록 및 분석에 적합한 생리학적 소프트웨어가 설치된 컴퓨터 시스템에 연결된 등척성 힘 변환기에 연결합니다. 그런 다음 폐내 동맥 링의 장력을 1 그램으로 부드럽게 올립니다.용기 세그먼트가 1g의 휴식 장력에서 약 45분 동안 평형을 이루도록 합니다. 평형 기간 동안 Krebs 솔루션이 15분마다 정기적으로 변경되는지 확인하십시오. 평형 후, 높은 세포 외 칼륨 용액에 대한 혈관 수축을 측정하여 혈관의 생존력을 테스트하십시오.PE로 사전 계약된 고리에서 아세틸콜린에 대한 이완 반응을 계산하여 내피의 유무를 평가합니다. 혈관내부를 작은 철사로 부드럽게 문질러 내피를 기계적으로 제거하여 탈질을 유도합니다. 그런 다음 시험 실험 시작 전에 30 분 동안 동맥 고리를 평형화하십시오. PE로 폐동맥 고리를 전수축시켜 식물 추출물의 이완 효과를 조사하십시오. 그런 다음 식물 추출물 밀리리터당 0.1 내지 1000마이크로그램을 내피 온전한 고리 및 내피 탈질 고리에 누적하여 혈관 이완을 유도하고 농도 의존적 반응 곡선을 획득한다.용매로서 사용되는 효과적인 DMSO가 또한 음성 대조군으로서 작용하도록 유사하게 평가되는지 확인한다. 텍스트 원고에 언급 된대로 식물 추출물의 혈관 이완 작용 메커니즘을 평가하십시오. 그런 다음 PE로 수축 안정화 된 후 식물 추출물의 누적 농도를 첨가하십시오.억제제가 없는 폐동맥 고리의 반응과 비교하여 억제제가 있는 상태에서 폐동맥 고리의 이완 백분율로서 식물 추출물의 효과를 제시하고 농도 반응 곡선을 구성합니다. 내피 손상되지 않은 폐내 동맥에서 식물 추출물은 혈관 이완의 농도 의존적 반응을 유도했습니다. 내피의 박멸은 EC50의 2.2배 증가에 의해 반영된 바와 같이 식물 추출물에 의해 유도된 혈관 이완을 근본적으로 감소시켰고, eNOS 및 EDHF의 억제는 식물 추출물에 대한 혈관 이완제 반응을 분명히 감소시켰다.이로 인해 농도 반응 곡선이 오른쪽으로 이동하고 Emax 값을 변경하지 않고 EC50이 증가했습니다. 반대로, Indomethacin은 식물 추출물에 대한 혈관 이완제 반응에 영향을 미치지 않았다. 내피 탈질 폐내 동맥 고리에서 칼슘 활성화 칼륨 채널 차단제는 식물 추출물에 대한 혈관 이완제 반응을 감소시켰다.전압 게이트 또는 ATP에 민감한 칼륨 채널의 차단제는 편차를 나타내지 않았습니다. 식물 추출물을 사용한 예비 배양은 염화칼슘 유도 수축을 억제하였다. 칼슘이 없는 크렙스 용액과 PE로 사전 배양된 내피 탈질된 폐내 동맥 고리는 일시적인 수축을 일으켰습니다.비히클과 비교하여, 식물 추출물은 PE에 의해 유도된 수축을 상당히 감소시켰다. 시술 중에는 정맥, 기관지 및 동맥을 조기에 명확하게 식별해야 합니다. 동맥을 절단하거나 손상시키면 길이가 줄어들고 혈관 반응에 영향을 미칩니다. 이 기술은 폐동맥 고혈압과 같은 폐 혈관 질환 치료를위한 프로토 타입으로 사용될 수있는 화합물을 조사하는 데 적용될 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

우리는 원시 그대로의 미세 혈관 내피 세포의 칼슘 신호를 시각화하고 조작하기위한 준비를 제시한다. 내피 튜브 갓 골격 근육 주위의 세포 내와 사이에 생체 형태와 동적 신호의 유지 공급 마우스 저항 동맥에서입니다. 내피 튜브는 다른 조직 및 기관의 미세 혈관으로부터 제조 될 수있다.

마우스 저항 동맥의 미세 혈관 내피 튜브의 분리

우리는 따라서 신생아 평활근 세포의 수축과 이완에 관련된 신호 전달 경로의 더 나은 연구를 허용, 소설과 P7 등의 어린 쥐에서 폐 혈관 평활근 세포의 일차 배양 (PASMC)를 분리하는 재생 기술을 개발했습니다.

신생아 쥐의 폐 동맥 평활근 세포의 분리

저산소 폐 혈관 수축 (HPV)은 폐포 저산소증 폐 관류가 환기와 일치하는 중요한 생리학적 현상이다. HPV에 기여하는 주요 혈관 세그먼트는 인트라 아시나르 동맥입니다. 여기서, 우리는 직경 20-100 μm의 뮤린 폐 혈관의 HPV의 분석을 위한 우리의 프로토콜을 기술합니다.

Murine 정밀 절단 폐 슬라이스를 사용하여 폐 내 동맥의 저산소 폐 혈관 수축의 비디오 형태 측정 분석

대동맥의 병리학은 심각한 이환율과 사망률을 유발할 수 있으므로 질병 진행 및 잠재적 치료법에 대한 연구가 필요합니다. 여기에서는 심혈관 질환에 대한 연구자의 연구를 돕기 위해 쥐 대동맥을 분리하고 절제하는 프로토콜을 제시합니다.

분리 및 설치류 대동맥 절제; 심혈관 질환의 연구에 다목적 기술

이 프로토콜의 목적은 관상 동맥에서 뮤린 주 혈관 평활근 세포의 분리 및 배양 방법 (혈관 평활근 세포)을 보여주는 것이다. 혈관 평활근 세포가 분리되고 나면, 이들은 많은 표준 배양 기술에 사용될 수있다.

쥐 관상 동맥 혈관 평활근 세포의 분리

우리는 IRF5 억제성 펩타이드로 처리된 C57Bl/6J 대조군 마우스, 타이트-스킨 마우스 및 타이트-스킨 마우스에서 심장 세포외 기질의 분리를 설명합니다. 또한 C57Bl/6J에서 분리된 혈관, IRF5 억제성 펩타이드로 처리된 타이트-스킨 마우스 및 타이트-스킨 마우스에 대한 혈관 확장 연구를 설명합니다.

격리 혈관 혈관 확장 타이트 피부 마우스의 세포 외 기질의 분리

이 원고는 arterioles, electrophysiological 칼슘 이미징 및 압력 myography 연구에 사용 될 수 있는 쥐 망막에서의 격리에 대 한 간단한 프로토콜을 설명 합니다.

Ex Vivo 세포 생리학 연구에 대 한 망막 Arterioles의 절연

이 논문은 원발성, 환자 특이적 인간 대동맥 평활근 세포 및 진피 섬유아세포의 분리 및 배양을 위한 explant 배양 기반 방법을 기술한다. 또한, 세포 수축 및 후속 분석을 측정하기위한 새로운 방법이 제시되며, 이는 이들 세포의 환자 별 차이를 연구하는 데 사용될 수 있습니다.

일차 환자 특이적 대동맥 평활근 세포 및 체외에서 반정량적 실시간 수축 측정의 분리

본 프로토콜은 전기생리학적 연구에 적합한 성체, 청소년, 유충 및 배아 제브라피쉬(Danio rerio)로부터 생존가능한 심장 및 혈관 평활근 세포의 급성 단리를 기술한다.

전기 생리 학적 연구를위한 성체, 청소년, 애벌레 및 배아 제브라 피쉬에서 심장 및 혈관 평활근 세포 분리

본 프로토콜은 거의 생체내 환경에서 기도 및 폐 내 동맥 평활근 수축성을 평가하기 위해 마우스 정밀 절단된 폐 절편을 준비 및 활용하는 것을 기술한다.

정밀 절단 폐 슬라이스를 활용하여 기도 및 폐 동맥 평활근의 수축 조절 연구

이 프로토콜은 쥐 폐 정맥의 현미경 유도 분리 및 면역형광 염색을 보여줍니다. 좌심방, 폐정맥 및 해당 폐가 포함된 조직 샘플을 준비하고 심장 Troponin T 및 Connexin 43에 대해 염색합니다.

쥐 폐 정맥에서 심근 슬리브의 미세 해부 및 면역형광 염색

배우세요 쥐 폐동맥과 혈관 평활근 세포를 분리하여 오가노 배스 기법으로 혈관 이완 반응을 연구하는 방법을. 이 기법은 폐고혈압 등 혈관 질환의 약리학적 연구에 활용됩니다.

혈관 반응을 조사하기 위한 폐동맥 및 평활근 세포의 분리

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