장내 미생물군 조절을 통한 대장염에 대한 Bacillus cereus 투여의 완화 효과 조사

이 프로토콜을 통해 건강에 대한 프로바이오틱스 보충의 양방향 조절 효과와 안정적이고 재현 가능한 결과를 평가할 수 있습니다. 대체 DSS 유도 대장염 모델은 무균 마우스를 프로바이오틱스의 수용체로 사용할 때 일부 실험실 제한을 피하기 위해 유사 무균 마우스를 사용하여 확립되었습니다. 이 기술에서 프로바이오틱스의 유익한 효과를 탐구하기 위해서는 만성 염증성 관련 장애의 증상을 완화하기 위한 새로운 치료 전략을 개발하기 위한 유망한 접근 방식입니다.

시작하려면 암피실린, 네오마이신 설페이트, 메트로니다졸, 반코마이신을 식수에 녹여 항생제 칵테일을 준비합니다. 완전히 용해된 후 용액을 섭씨 4도에서 보관하십시오. 항생제 칵테일 용액을 물병에 넣습니다.

항생제 용액을 빛으로부터 보호하기 위해 갈색 병을 사용하거나 알루미늄 호일로 병을 싸십시오. 마우스 케이지 위에 병을 놓습니다. 2.5% 덱스트란 황산나트륨 용액을 만들려면 2.5g의 DSS를 증류수 100밀리리터에 녹입니다.

대장염 모델 마우스 그룹에서 식수를 2.5% DSS 용액으로 대체합니다. 대장염 완화에 대한 B cereus의 긍정적인 효과를 평가하기 위해 마우스를 다음 세 그룹, 대조군, DSS 유도 대장염 모델 및 DSS 유도 마우스에 대한 프로바이오틱스 B cereus 보충에 무작위로 할당합니다. DSS 유발 대장염에 대한 B cereus의 프로바이오틱스 효과를 조절하는 장내 미생물군의 역할을 탐색하기 위해 마우스를 ABX/대조군, ABX/DSS 및 ABX/B cereus 플러스 DSS의 세 그룹으로 무작위로 할당합니다.

항생제 칵테일 투여 후 마우스의 체중을 기준 체중으로 기록합니다. 즉시 수컷 C 57 BL 6마리의 마우스를 식수에 담긴 2.5% DSS 용액으로 7일 동안 치료합니다. 900마이크로리터의 멸균 생리 식염수로 채워진 8개의 1.5밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브를 준비합니다.

100마이크로리터의 로그 성장 B cereus를 피펫팅하고 900마이크로리터의 멸균 생리 식염수에 녹입니다. 튜브를 사용하여 B cereus를 연속적으로 희석합니다. 각 희석액 40마이크로리터를 희석 비율로 라벨링된 각 LB 한천 플레이트에 플레이트합니다.

각 희석 비율에 대해 세 번 반복합니다. 플레이트를 섭씨 37도 항온 인큐베이터에서 16시간 동안 배양합니다. 계산을 위해 약 20-70개의 콜로니가 있는 플레이트를 선택하십시오.

B cereus의 정량 후, 10의 1배를 함유한 B cereus 배지 1 밀리리터를 9 CFU에 채취하여 8, 000 G에서 10분 동안 원심분리한다. 그런 다음 박테리아 세포를 멸균수로 8, 000 G에서 10분 동안 원심화하여 2회 세척하고 상층액을 제거합니다. 농축된 B cereus를 멸균 생리 식염수로 200마이크로리터당 10에서 8번째 CFU의 2배로 희석합니다.

희석액을 위아래로 반복적으로 피펫팅하여 분산된 B cereus 현탁액을 얻습니다. 위관 바늘의 바깥쪽을 70% 에탄올로 닦고 적절한 용량 적용을 유지합니다. 쥐를 제지하려면 꼬리를 잡고 핸들러의 마지막 두 손가락 사이에 꼬리 끝을 고정하여 등의 느슨한 피부를 단단히 잡습니다.

마우스를 수직 위치에 유지하십시오. 그런 다음 위관 바늘을 입을 통해 식도에 조심스럽고 부드럽게 삽입합니다. B cereus 용액을 투여하고 바늘을 부드럽게 빼낸 다음 마우스를 케이지로 되돌립니다.

매일 생쥐의 체중을 측정하고 멸균된 원심분리기 튜브에 즉시 대변 샘플을 수집합니다. 대변 잠혈 검사지로 대변 잠혈을 결정합니다. 어플리케이터 스틱에 대변 샘플 10mg을 채취합니다.

검체를 테스트 카드에 놓고 카드에 얇은 도말 것을 바릅니다. 뒷면 덮개를 열고 도말 위에 현상액을 바릅니다. 쥐를 수술대에 바로 누운 자세로 고정하고 복막강을 엽니다.

결장 전체를 수술로 분리하고 자로 길이를 측정합니다. 그런 다음 예식된 PBS로 채워진 5밀리리터 주사기로 결장을 부드럽게 세척합니다. 결장 부분의 왁스를 제거하고 수분을 공급합니다.

다음으로 결장 절편을 헤마트실린과 에오신으로 염색합니다. 두 명의 독립적인 실험자가 광학 현미경으로 샘플의 조직학적 점수를 평가하도록 하고, 헤마트실린과 에오신 염색을 통해 대장염 모델 마우스의 결장 조직이 지하 손실, 잔 세포 손상, 염증 세포 침윤 및 상피 손실을 나타내는 것으로 나타났습니다. B cereus 치료는 DSS로 인한 조직병리학적 손상을 개선했습니다.

대장염 마우스의 조직병리학적 점수는 대조군보다 유의하게 높았습니다. 그러나 B cereus 그룹의 조직병리학적 점수는 대장염 마우스보다 유의하게 낮았습니다. 마우스를 무작위로 세 그룹으로 나누었는데, ABX/대조군의 마우스에 비해 ABX/DSS군에서 체중 감소, DAI 점수 및 조직병리학 점수가 더 높았고 결장 길이가 더 짧았습니다.

체중 감소, 결장 길이, DAI 점수 및 조직병리학 점수는 ABX/DSS와 ABX/B cereus 플러스 DSS 그룹 간에 통계적으로 차이가 없었습니다. 현재 결과는 장내 미생물군이 대장염에 대한 B cereus의 긍정적인 효과에 핵심적인 역할을 한다는 것을 간접적으로 시사합니다. 가장 중요한 단계 중 하나는 생쥐의 대장염 모델링을 구성하기 위해 위관법으로 Bacillus cereus를 사용하는 것입니다.

Bacillus cereus의 치료는 DSS 유발 대장염을 제거했으며, 이는 대장염 치료를 위한 프로바이오틱스의 후속 연구의 토대를 이끌었습니다.