Drosophila의 유충에서 냄새 기반 행동의 고해상도 측정

안녕하세요, 제 이름은 Matt Lui입니다. 저는 록펠러 대학의 레슬리 샐(Leslie Sal) 연구실에서 박사 후 연구원으로 일하고 있습니다. 그리고 오늘 저는 유충 화학주성을 연구하기 위해 우리가 진행하고 있는 실험에 대해 말씀드리

우리가 관심을 갖고 있는 문제는 매우 간단합니다. 실제로 이 설정에 표시되어 있습니다. 나는 방금 이 아그로스 표면에 조셉 애벌레 그룹을 옮겼습니다.

이 환경은 상당히 적대적이며 그들은 굶어 죽을 뻔 한다. 어떻게든 이 동물들은 가장 가까운 먹이 공급원으로 가는 길을 찾아야 할 것이고 여기에 유충을 유인할 바나나 냄새를 내뿜는 것이 있습니다. 이 환경은 화학주성 거동을 연구하기에 이상적이지 않으므로 첫 번째 개선은 바나나를 화학 물질로 대체하는 것입니다.

이 화학 물질은 이소 아세테이트이며 바나나에 주로 함유 된 맛 중 하나입니다. 이것은 우리의 인공 향료이며 이것을 사용함으로써 우리는 후각 자극을 훨씬 더 잘 제어할 수 있습니다. 다음 개선 사항은 폐쇄 된 환경을 사용하고 다른 분포의 변동을 방지하는 것입니다.

여기 우리가 실험실에서 꽤 오랫동안 사용해온 분석법이 있습니다. 이것은 바닥에 garro의 표면이있는 페트리 접시입니다. Agarro는 수분을 유지하기 때문에 유충에서 화학 공격에 이상적입니다.

플레이트의 양면에는 테프론으로 만들어진 다른 캡이 있으며 이제 우리가 할 일은 한쪽에는 아세테이트 또는 이삼 아세테이트를 소개하고 다른 쪽에는 주문이 없는 것입니다. 이 작업이 완료되면 아이디어는 석유 접시를 닫고 테오도르가 확산될 때까지 잠시 기다린 다음 접시를 여는 것입니다. 여기에 동물을 소개하면 일정 시간 동안 동물을 움직이게합니다.

이 분석은 접시의 한쪽 면에 theodor를 도입하면 상당히 빠르게 설정되고 테스트 기간 동안 안정적으로 유지되는 기울기를 갖게 된다는 가정에 의존합니다. 이제 가장 큰 문제는 아무도 구배가 플레이트에 존재한다는 것을 입증한 적이 없다는 것입니다. theodor를 첨가 한 후 매우 빠르게 gradient가 매우 얕아지거나 gradient가 설정되는 데 몇 분이 필요할 수 있습니다.

이것은 물론 사용중인 theodor의 증기압에 주로 의존합니다. 두 번째 문제는 실험 중에 정량화된 것과 관련이 있습니다. 동물이 여기에서 시작하여 X를 선택하고 3분 후에 이 엔드 플레이트에서 빨간색 X를 찾는다고 상상해 보십시오. 이제 두 가지 가능한 접근 방식이 있습니다.

당신이 할 수 있는 한 가지는 3분 또는 5분이라는 특정 시간이 지난 후에만 동물의 최종 위치를 기록하는 것입니다. 그런 다음 캡처할 수 있는 유일한 정보는 시작 위치이며, 시간이 지남에 따라 동물의 행동에 대해 좋은 해상도를 갖는 것이 중요하다고 생각합니다. 예를 들어, 동물은 여기와 같이 시작 위치에서 끝 위치로 거의 이동하지 않았을 수도 있고, 상당한 시간 동안 테오도르 주변 지역을 매우 잘 방문했다가 시험이 끝나기 전에 되돌려 놓았을 수도 있습니다.

이 두 상황에서 우리가 도출할 수 있는 결론은 매우 다릅니다. 한 경우에는 동물이 자극에 반응하지 않았을 수 있지만 다른 경우에는 확실히 반응했을 수 있습니다. 우리가 달성하려는 두 가지 개선 사항은 첫 번째로, 경기장에서 다른 경사도의 모양과 안정성을 제어하는 것입니다.

둘째, 동물의 행동을 실시간으로 추적하고 이 모든 정보를 보관하십시오. 다음 시퀀스에서 Sylvia는 주문 희석을 준비하는 방법을 소개할 것입니다. 제 이름은 S ti입니다.

저는 VA 실험실에서 재료 lui를 연구하는 연구 조교입니다. 오늘은 동물을 추적하는 데 사용하는 챔버 시스템의 재료를 준비하는 방법을 보여 드리겠습니다. 챔버 시스템의 주요 문제는 공기 중에 분산된 냄새를 사용한다는 것입니다.

예를 들어, 우리가 사용하는 아그로스 플레이트가 평평하지 않은 경우 실험 사이에 변동과 농도가 발생하여 시스템에 노이즈가 발생할 수 있습니다. 그래서 시스템의 소음을 줄이기 위해 작은 팁을 보여 드리고 알려 드리겠습니다. 따라서 냄새 희석을 준비하기 위한 재료는 유리병이며, 관심 있는 냄새의 분취액과 함께 광 반응성 냄새를 사용하는 경우 어두운 유리를 사용하는 것이 좋습니다.

이 부분 표본을 준비하기 위한 유리 피펫과 적절한 기계적 피펫 보조제. 그런 다음 파라핀 오일 피펫 팁, 표준 피펫 맨 및 희석을 위한 작은 바이알. 다시 한 번 말하지만, 이러한 것들은 유리여야 하며 가급적이면 어둡게 해야 하며, 정확한 측정을 수행하고 실험 간 소음을 줄이기 위해 계량 저울이 필요합니다.

냄새는 휘발성이 높고 일부는 독성이 있기 때문에 후드 내에서 수행됩니다. 냄새 희석을 복구하는 첫 번째 단계는 희석할 냄새를 분량하는 것입니다. 정확한 희석액을 준비하고 실험 간 변동을 최소화하려면 모든 것을 계량해야 합니다.

따라서 라벨링으로 시작하여 에틸 부티레이트의 1몰 농도를 만듭니다. 먼저 파라핀 오일을 준비합니다. 파라핀 오일은 점성이 매우 높기 때문에 기포가 발생하지 않고 파라핀 오일을 빨아들일 수 있을 만큼만 피펫 팁을 파라핀 오일에 최대한 적게 담그는 것이 중요합니다.

그런 다음 병 측면에 있는 여분의 파렌 오일을 닦아내는 것이 좋습니다. 다시 한 번 말하지만, 파렌 오일은 점성이 있기 때문에 바이알에 천천히 배출하는 것이 매우 중요합니다. 파라 오일을 병에 피펫으로 넣은 후에는 팁 바닥에 더 많은 오일이 모일 수 있으므로 팁을 즉시 버리지 마십시오.

추가할 파렌 오일의 부피와 무게를 이미 측정한 곳에서 희석을 시작하기 전에 계산 시트를 준비한 다음 무게와 함께 냄새에 대해서도 동일한 작업을 수행하는 것이 좋습니다. 그렇게 하면 가지고 있는 저울, 필요한 모든 파라핀 오일, 모든 냄새를 확인할 수 있습니다. 필요한 경우 파렌 오일을 더 붓고 적절한 체중이 될 때까지 다시 측정합니다.

올바른 파렌 오일 무게가 되면 동일한 원리를 사용하여 냄새 첨가만 하면 됩니다. 좋습니다. 여기에서는 추적을 위해 유충을 준비하는 방법을 보여 드리겠습니다.

우리는 보통 6일 된 애벌레를 사용합니다. 우리는 그들이 우리 소프트웨어에 의해 쉽게 집어 올릴 수있을만큼 충분히 크고 유충이 추적에 사용하기에는 너무 오래되었는지 여부를 알 수 있을 만큼 여전히 매우 활동적이기 때문에 벽을 기어오르는 유충이 있는지 확인하기만 하면 되기 때문에 이 작업을 수행합니다. 벽을 기어오르는 유충이 있다면 너무 늙어서 특별히 활동적이지 않을 것입니다.

유충을 준비하는 첫 번째 단계는 15%자당에 담그는 것입니다. 우리가 15% 자당을 사용하는 이유는 유충이 이 용액에서 보이드가 되고 대신 음식이 부분적으로 용해되거나 바닥으로 떨어지기 때문입니다. 당신은 자당을 충분히 부어서 그것이 대략, 나는 당신의 병이나 유리병의 꼭대기에서 1인치도 안

그런 다음 주걱을 취합니다. 당신은 이미 유충이 떠다니는 것을 볼 수 있으며 음식을 파고드는 동물을 쫓아내기 위해 음식을 부드럽게 파고 음식에서 분리하기 위해 약간 휘젓은 다음 몇 분 동안 그대로 두십시오. 음식과 유충이 적절하게 분리되면 미리 표시된 페트리 접시를 가져다가 신호음 부분에 붓습니다.

페트리 접시의 윗부분을 물로 채우고 추적된 유충의 용기로 사용하여 추적한 유충과 추적하지 않은 유충을 분리할 수 있습니다. 이제 유충을 페트리 접시에 부었으므로 유충이 자당에 적응하고 굶주린 상태에 도달할 때까지 30분을 기다려야 합니다. 이것은 유충이 적응하는 30분 동안 추적 설정에서 더 잘 행동한다는 것을 의미합니다.

자당은 추적을 위해 플레이트를 준비하기에 좋은 순간입니다. 이것은 96개의 웰 플레이트의 상단입니다. 별도로 구매하실 수 있으며 이미 가열된 3%aros 솔루션입니다.

우리는 유충이 땅을 파는 것을 방지하기 때문에 3%를 사용하지만, 유충이 그 위를 걸을 수 있고 각 접시 상단에서 가습 상태를 유지할 수 있을 만큼 밀도가 높습니다. 25mils의 아그로를 피펫팅하고 싶습니다. 젤 내부에 큰 기포가 형성되지 않도록 하는 것이 중요합니다.

플레이트를 평평한 표면에 놓는 것도 중요하며, 그렇지 않으면 경사면에 있는 젤이 발생하여 유충의 행동에 영향을 줄 수 있습니다. 아로스가 굳은 후, 우리는 뚜껑을 쌓아 소란 랩으로 싸서 마르지 않도록 합니다. 이렇게 하면 며칠 동안 추적할 수 있는 양호한 상태를 유지할 수 있습니다.

이 순서에서, 저는 앞서 말씀드린 휘발유 접시 분석법과 약간 다른 행동 분석을 제시할 것입니다. 필요한 것은 96 웰 플레이트의 리드와 농업 층을 포함하는 리드입니다. 분석은 3개의 뚜껑으로 구성되어 쌓

첫 번째 립에는 비어 있는 것이 없으며 시스템이 있는 표면에서 시스템을 분리하는 데만 사용됩니다. 두 번째 레이어에는 Diego 농업 표면이 포함되어 있습니다. 여기에 동물들이 표면에 놓일 것이고 이제 다음에 보여 드리겠지만 접시에 오도르를 소개합니다.

적재할 때마다 새롭고 새 뚜껑을 사용하는 것이 중요합니다. 이는 한 실험에서 다른 실험으로 인한 오염을 방지하기 위한 것입니다. 다른 희석도 필요합니다.

우리는 일반적으로 염료를 사용하여 odor를 넣지 않지만 여기서는 설명을 위해 사용하겠습니다. 이것은 테오도르의 높은 농도입니다. 이것은 매우 희석되었지만 내 목표는 선을 따라 그라디언트를 만드는 것입니다.

이 줄을 말하고 왼쪽에서 오른쪽으로 집중력을 높이기를 원합니다. 이를 달성하기 위해 농도를 높이면서 응축 링에 배치 된 여러 방울의 주문을 사용할 것입니다. 나는 말단에 놓일 가장 높은 농도부터 시작합니다.

링에 분산시키는 것이 중요합니다. 이제 첫 번째 농도에 비해 두 번 희석 된 다음 농도를 진행하고이 고리에 놓습니다. 그래서 저기 아뇨, 저는 6개의 물방울이 있습니다.

첫 번째는 1의 농도를 포함합니다. 두 번째 농도는 0.5로 첫 번째 농도보다 두 배 낮습니다. 세 번째는 농도, 0.25 등입니다.

그래서 우리는 선을 따라 기하학적 시리즈를 가지고 있습니다. 다음 단계는 AAL 표면에서 이 뚜껑을 뒤집는 것으로 구성되며 이제 표면 장력에 의해 모든 물방울이 뚜껑 상단에 매달려 있습니다. 우리는 플레이트의 모든 농도를 측정하기 위해 적외선 분광법을 기반으로 한 기술을 고안합니다.

이 기술을 적용함으로써 우리는 여기에서 데오도란트 라인을 따라 기하학적 계열이 있는 경우 여기에서 볼 수 있듯이 접시의 너비를 따라 기하급수적으로 증가하는 길이를 따라 테오도르의 농도로 끝난다는 것을 보여줄 수 있었습니다. 우리는 냄새 라인 바로 아래에서 정점을 찍은 프로필을 가지고 있습니다. 그라디언트의 실제 형상은 다음과 같습니다.

공기 중의 농도를 고려하면 좋은 점은 기하학적 구조가 최소 15 분 동안 안정적임을 보여줄 수 있었다는 것입니다. 상단 뚜껑이 도입되면 그라디언트가 설정될 때까지 30초 동안 기다립니다. 그런 다음 경기장에서 동물을 소개합니다.

동물은 위치 3과 4 사이의 다른 쪽 끝 선 아래에 도입되며, 우리는 작은 핀을 사용하여 자당 용액에서 농업 표면으로 유충을 옮깁니다. 이동은 손톱 머리 주위에서 유충을 낚시하여 이루어집니다. 우리는 빨리 뚜껑을 열고 유충은 agarro의 표면에 퇴적됩니다.

그런 다음 뚜껑을 닫습니다. 뚜껑이 열려 있는 시간을 최소화하는 것이 중요합니다. 다음으로, 3분 또는 5분 동안 동물의 움직임을 기록합니다.

실제 녹음이 이루어집니다. 이 추적 설정을 사용하면 컴퓨터에 연결된 카메라가 있습니다. 우리가 사용하는 이미지 추적 소프트웨어는 동물의 움직임에 대한 정보를 수집하고 디지털 파일로 저장하기 위해 Nordis의 Aton vision입니다.

이제 우리는 행동 실험을 시작하려고 합니다. 우리는 aro 층이있는 뚜껑을 가지고 있습니다. 우리는 희석제를 가지고 있습니다.

디에고는 첫 번째 뚜껑에 붙어 있습니다. 적재하기 전에 theodor, 각 바이알을 와류로 만드는 것이 중요합니다. 우리는 왼쪽에 가장 작은 희석액과 오른쪽에 있는 가장 높은 희석액을 사용합니다.

6개의 물방울이 모두 동시에 플레이트에 적재됩니다. 냄새 손실을 피하기 위해 여기에서 다중 채널 Pipeter 6 dip을 사용하고 있으며, 각 희석 샘플에서 10 마이크로 리터의 냄새를 취하고 동시에 theodor를 로드합니다. 적재 시 뚜껑은 이제 아그로스 표면에서 뒤집힙니다.

그라디언트는 이전에 보여드린 것처럼 지난 30초 동안 플레이트에 생성되었습니다. 이제 디에고 표면에 있는 동물을 소개해 보겠습니다. 동물이 소개되자마자 녹음을 시작합니다.

그 동물은 여기 있고 그 움직임은 지금 추적되고 있습니다. 보시다시피 동물은 냄새 라인을 따라 구배의 가장 높은 농도 지점으로 향하고 있습니다. 농도는 지수 모양으로 왼쪽에서 오른쪽으로 증가한다는 것을 기억하십시오.

보시다시피 동작의 방향은 지속적으로 수정됩니다. 자극과 관련하여 동물은 이제 구배의 가장 높은 농도 점에 도달했으며 플레이트에서 제거합니다. 같은 개체를 두 번 직접 추적하지 않도록 동물을 다른 접시에 버립니다.

새로운 유충을 소개하고 새로운 녹음을 시작한 후 추적을 위해 따르는 규칙은 다음과 같습니다. 우리는 동물이 플레이트의 가장 높은 농도 열에 도달하자마자 추적을 중지합니다. 또한 동물이 벽에 부딪히면 간섭을 피하기 위해 추적이 중단됩니다.

우리가 다룬 첫 번째 질문은 상당히 할 수 있다는 것이었습니다. 우리가 알고 싶었던 것은 동물이 특정 농도에서 테오도르 냄새를 맡을 수 있는지 여부였습니다. 이러한 테스트를 하기 위해 우리가 일반적으로 하는 것은 여러 가지 냄새를 갖는 대신 하나의 냄새 유발원을 갖는 것입니다.

이를 통해 theodor end droplet의 농도를 변경할 때 1의 자유도를 가질 수 있습니다. 예를 들어, 여기 높은 농도의 물방울이 있고 여기 낮은 농도의 물방울이 있습니다. 우리가 일반적으로 하는 일은 디에고 표면에 있는 동물을 테오도르 물방울 바로 아래에 소개하고 동물이 자신의 존재를 감지하고 근처에 머물 수 있는지 여부를 확인하는 것입니다.

이제 우리의 분석을 좀 더 발전된 방식으로 사용하고자 합니다. 한 방울의 질서가 있고 여기에 매우 부과된 여러 궤적을 기록하고 그 중 세 개가 있다고 상상해 보십시오. 이 녹색 트랙을 생성하는 한 명의 개인이 있습니다.

중앙이 덜한 주황색 트랙이 있고, 그 다음에는 이 분홍색 궤적이 있는데, 이는 분명히 소스 주위를 빙빙 도는 동물을 나타냅니다. 궤적에 대한 세부 사항에 대해 시작해야 할 정보가 많다고 생각합니다. 이러한 이유로 우리는 궤적을 일련의 소유로 matlab에 가져오고 분석 후 matlab으로 분석을 수행합니다.

다음은 소스까지의 거리이며 아마도 시간의 함수일 것입니다. 이전에 표시된 세 개의 궤적에 대해 소스에서 매우 가깝게 유지되는 녹색 궤적이 있습니다. 주황색 궤적이 있는데, 이 궤적은 훨씬 더 많은 노이즈를 표시합니다.

그리고 이 보라색 궤적이 있는데, 흥미롭게도 동물이 근원을 떠나 멀리 머물러 있다는 것을 보여주었는데, 이는 아마도 최적 농도에 해당했을 것입니다. 여기 당신은 냄새를 맡을 수 없는 동물인 10가지 궤적의 그림을 볼 수 있습니다. 이들은 돌연변이 또는 3 개의 B 돌연변이이며, 이는 비 엘러입니다.

보시다시피, 이 모든 궤적은 동물들이 냄새의 원인을 감지하지 못하고 그냥 내버려 두었다는 것을 보여줍니다. 이제 별 대비로, 우리는 여기에서 흰색 탭 동물에 대한 10개의 연속 궤적을 기록했습니다. 이 동물들은 물론 냄새를 맡을 수 있으며, 보시다시피 모두 데오도란트 소스 바로 아래에 축적됩니다.

방금 제시된 20개의 궤적은 사실 동물의 정체를 모른 채 습득된 것이다. 이는 당사 분석의 효율성과 신뢰성을 보여줍니다. 일부 돌연변이가 지수 그라디언트를 사용하여 여기에서 냄새를 맡을 수 있는지 여부를 결정할 때 우리는 여러 트랙을 생성하고 동물이 다른 쪽 자극을 얼마나 잘 따를 수 있는지 감지하고자 합니다.

이제 개별적으로 기록된 15개의 궤적을 보여드리려고 하는데, 보시다시피 동물들은 다른 쪽 끝선 아래의 자극을 따라가는 일을 훌륭하게 수행합니다. 이제 간단한 컨트롤을 진행하려고 합니다. 기하급수적 구배에 있는 동물들이 그 선을 따랐던 것은 그 농도에 관계없이 어떤 자극이 있었기 때문이고, 단지 동물들이 직진했을 뿐이다.

그래서 그들이 실제로 농도 또는 농도와 관련된 것을 계산하고 그것을 사용하여 움직임을 지시하고 있음을 보여주기 위해 우리는 이제 지붕 꼭대기에 가까운 이 기하학을 가지고 있습니다. 유충은 평소와 같이 여기에 소개되며, 우리가 기대하는 것은 그들이 선을 따라 이동한 다음 이 시점 이후에 농도가 떨어지는 것을 감지하고 다시 돌아올 것이라는 것입니다. 그래서 우리는 5 마리의 동물을 대상으로 실험을 수행했습니다.

우리는 궤적을 수집했고 이제 이 슬라이드에 겹쳐서 표현하고 있습니다. 보시다시피 동물들은 여기에서 시작하여 선을 따라 이동한 다음 가장 높은 농도에 해당하는 지역을 탐험하고 주로 그곳에 머무릅니다. 이는 단일 소스 분석을 사용하여 실시간으로 다른 농도를 계산할 수 있음을 강력하게 시사합니다.

우리는 주로 하나의 큰 질문을 할 수 있었습니다. 동물의 냄새는 다중 소스 장치를 사용하여 특정 농도의 냄새를 감지할 수 있습니까? 우리는 그라디언트의 모양을 변경하고 동물이 이 정보를 사용할 수 있는지 여부를 결정하는 데 더 많은 유연성을 가지고 있습니다.

간단한 실험을 통해 이 아이디어를 설명하고자 합니다. 지금까지 설정한 그라디언트에서는 렌즈를 따라 기하급수적인 모양을 가졌습니다. 이제 문제는 렌즈를 따라 농도가 선형적으로 증가하여 al에 더 도전하면 여전히 다른 쪽 선 아래에서 길을 찾을 수 있습니까?

이 그래프는 두 가지 유형의 그래디언트를 나타냅니다. 우리는 지수 그라디언트를 보라색으로, 선형 그라디언트를 녹색으로 테스트했습니다. 이것은 선형 그라디언트이며, 저는 isam acetate 희석 파렌 오일의 다양한 농도를 쓸 것입니다.

이것은 산술 시리즈입니다. 우리는 확립될 선형 구배를 가지고 있으며 보시다시피 경사는 사지의 농도도 0.5이지만 0.03까지 올라가는 여기의 지수 구배에 비해 상당히 얕습니다. 문제는 navi가 그러한 얕은 기울기에 직면했을 때 화학 공격을 할 수 있습니까?

여기서, 지수 구배(exponential gradient)와 선형 구배(linear gradient)를 위해 6개의 액적에 사용된 아세테이트의 실제 농도입니다. 보시다시피, 선형 구배에 대해 두 경우 모두 가장 높은 농도가 동일하더라도 여기에서 가장 낮은 농도는 상당히 높습니다. 우리는 선형 그라디언트로 실험을 수행했으며, 여기에는 야생형 동물의 15가지 궤적이 표시되었으며, 이 동물들이 선형 그라디언트를 감지하고 데오도란트 라인을 따라 이 신호를 따를 수 있었다는 것이 매우 분명하다고 생각합니다.

그래서 저는 우리의 요점이 분명하다고 생각합니다. 여기서 마무리하기 전에 이 추적 설정에 대한 향후 방향에 대해 간략하게 말씀드리고자 합니다. 이 추적 설정을 사용하면 예를 들어 더 크고 더 오랜 기간 동안 유충의 복잡한 행동을 보는 것과 같은 많은 흥미로운 작업을 수행할 수 있지만 몇 가지 제한 사항이 있습니다.

예를 들어, 접시의 크기가 제한되어 있으므로 추적할 수 있는 시간과 볼 수 있는 복잡한 동작이 제한됩니다. 따라서 플레이트가 더 크거나 플레이트의 경계에 전혀 제약을 받지 않는 시스템을 개발할 수 있다면 좋을 것입니다. 또 다른 문제는 현재 우리가 가지고 있는 소프트웨어로는 한 마리 이상의 동물을 동시에 추적하기 어려워 개체군 행동을 실시간으로 관찰할 수 없다는 것입니다.

이 설정을 통해 테스트할 수 없는 행동의 또 다른 흥미로운 측면은 우주에서 유충의 실제 3차원 움직임입니다. 동물을 추적하다 보면, 예를 들어 동물이 냄새 방울에 도달했을 때 머리를 들거나 머리를 휘젓고 다니며 농도의 변화를 감지하는 것을 볼 수 있습니다. 아마도 이것은 지금 우리의 특정 설정에서는 불가능할 수 있으므로 이것을 할 수 있는 것을 개발하는 것이 좋을 것입니다.