동결열 용해 및 등압 담체를 사용한 질량분석법 분석을 위한 단일 세포 단백질체학 준비

SCoPE2는 항체 없이 수천 개의 단일 포유류 세포에서 수천 개의 단백질을 정량화할 수 있습니다. 이 프로토콜은 대량 분석에서는 볼 수 없는 단백질체 이질성을 발견하는 데 도움이 될 수 있습니다. SCoPE2 접근법을 사용하는 단일 세포 단백질체학은 피펫에서 액체 취급 로봇에 이르기까지 다양한 리소스를 보유한 연구자들이 접근할 수 있도록 설계되었습니다.

SCoPE2는 동일한 집단의 단일 세포 간에 단백질이 어떻게 존재비에서 차이가 있는지에 대한 통찰력을 제공함으로써 암 및 면역학을 포함한 많은 연구 분야에 광범위하게 적용할 수 있습니다. 시작하려면 분류된 단일 셀이 있는 384웰 플레이트를 열 순환기에 넣고 섭씨 90도에서 10분 동안 가열한 다음 섭씨 12도에서 냉각하여 세포 용해 절차를 시작합니다. 벤치탑 플레이트 스피너에서 섭씨 18도에서 22도의 플레이트를 잠시 회전시킵니다.

섭씨 18도에서 22도까지 수조 초음파 처리기에서 5분 동안 플레이트를 초음파 처리합니다. 그런 다음 얼음 위에 놓습니다. 트립신 분해를 진행하려면 100 마이크로 리터의 마스터 믹스를 준비하고 액체 처리기를 사용하여 384 웰 플레이트의 각 웰에 0.2 마이크로 리터의 마스터 믹스를 추가합니다.

플레이트를 밀봉하고 5초 동안 소용돌이한 다음 벤치탑 플레이트 스피너에서 섭씨 18도에서 22도의 스핀다운합니다. 뚜껑 온도를 섭씨 52도로 설정한 상태에서 384웰 플레이트를 섭씨 37도에서 3시간 동안 가열합니다. 탠덤 질량 태깅 반응을 설정하려면 섭씨 영하 80도의 냉동고에서 탠덤 질량 태그의 85밀리몰 스톡을 꺼냅니다.

튜브를 열기 전에 튜브를 실온으로 데우고 라벨을 무수 아세토 니트릴에서 22 밀리몰로 희석하십시오. 이 라벨링 전략을 사용하여 액체 분주 로봇 또는 수동 피펫을 사용하여 384웰 플레이트의 각 웰에 0.5마이크로리터의 희석된 탠덤 질량 태그를 추가합니다. 플레이트를 밀봉하고 5초 동안 소용돌이한 다음 벤치탑 플레이트 스피너에서 섭씨 18도에서 22도의 스핀다운합니다.

라벨링 반응을 섭씨 18도에서 22도에서 1시간 동안 진행시키십시오. 탠덤 질량 태깅 반응의 담금질을 위해 액체 처리기를 사용하여 HPLC 등급 물에 희석한 0.5% 하이드록실아민 0.2마이크로리터를 384웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 플레이트를 밀봉하고 5초 동안 소용돌이치고 벤치탑 플레이트 스피너에서 스핀다운한 후 플레이트를 섭씨 18도에서 22도까지 30분 동안 유지합니다.

LC-MS 분석 준비는 영하 80도의 냉동고에서 결합된 담체 또는 표준 물질을 제거함으로써 시작됩니다. 각각의 세트에 대해, 1 마이크로리터의 담체 및 기준 물질을 제1 웰 내로 피펫팅하고, 단일 세트의 일부가 될 것이다. 첫 번째 웰에서 후속 웰까지 전체 부피를 피펫팅합니다.

단일 세트에 포함된 모든 웰이 최종 웰에 결합될 때까지 한 웰에서 다음 웰로 전체 부피를 계속 피펫팅합니다. 각 세트에 대해 각 세트에 포함될 첫 번째 단일 셀 웰에 대해 HPLC 등급 물에 희석된 50% 아세토니트릴 5마이크로리터를 추가합니다. 첫 번째 웰에서 후속 웰까지 전체 부피를 피펫팅합니다.

단일 세트에 포함된 모든 웰이 최종 웰에서 결합될 때까지 한 셀에서 다음 셀로 전체 부피를 계속 피펫팅합니다. 이제 각 세트를 자동 시료 주입기 유리 삽입물로 옮깁니다. 모든 세트가 결합되어 유리 삽입물에 넣으면 샘플을 건조시킵니다.

LC-MS-MS 분석 전에 각 세트에 1.2 마이크로 리터의 0.1 % 포름산을 추가하여 표지 된 펩타이드를 재현 탁시킵니다. 자동 시료 주입기 삽입물을 유리 자동 시료 주입기 바이알에 넣고 각 시료를 캡으로 닫습니다. 각 바이알을 5초 동안 소용돌이하여 재현탁이 완료되었는지 확인한 다음 바이알 스피너에서 섭씨 18도에서 22도의 스핀다운을 합니다.

각 샘플이 측면에 튀지 않고 인서트 바닥에 있는지 확인하십시오. 바이알을 자동 시료 주입기 트레이에 넣고 각 세트에 대해 LC-MS-MS 분석을 위해 1마이크로리터 샘플을 주입합니다. 단일 세포의 분해 및 표지 효율은 담체와 같이 직접 분석되지 않을 수 있지만 DO-MS 소프트웨어는 분해 및 표지 효율을 추정하는 플롯을 제공합니다.

불쌍한 소화는 잘못 절단 된 펩타이드와 완전히 절단 된 펩타이드의 강도의 높은 비율로 나타납니다. 세트에서 고려해야 할 또 다른 요소는 각 탠덤 질량 태깅 채널에서 리포터 이온 강도 중앙값에서 누락된 데이터의 비율입니다. 단일 세포가 성공적으로 준비되면 세포 및 양성 대조군당 누락된 데이터가 음성 대조군 샘플보다 훨씬 낮습니다.

LC-MS-MS 시료 전처리 중 신중한 액체 취급은 펩타이드의 최대 회수에 매우 중요합니다. 웰당 약 100 피코그램 내지 100 나노그램의 작은 샘플은 등압 담체를 사용하여 단백질체학 분석을 위해 제조될 수 있다. SCoPE2는 전 세계 연구자들이 일반적인 시약과 상용 장비만 사용하여 단일 세포 단백질체학 측정에 액세스할 수 있도록 합니다.

로봇 액체 취급에 의한 수동 처리 또는 고처리량 자동화가 가능합니다.