Name: 동결열 용해 및 등압 담체를 사용한 질량분석법 분석을 위한 단일 세포 단백질체학 준비 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-09T12:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 13 s
Description: 배우세요 SCoPE2 단일 세포 단백질체학 방법으로 수천 개의 단백질을 정량 분석하는 기술입니다. 포유류 세포의 단백질체 이질성을 밝혀내어 암 및 면역학 연구에 활용할 수 있습니다.

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이 출판물에 자금을 지원한 2021년 가을 NSF I-Corps 프로그램(노스이스턴 대학교 사이트) 상을 인정하고 싶습니다.

<ol><li>Symmons, O., Raj, A. <a target="_blank" href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27259209/">What's luck got to do with it: single cells, multiple fates, and biological nondeterminism.</a> Molecular Cell. 62 (5), 788-802 (2016).</li>
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<li>Huffman, R. G., Chen, A., Specht, H., Slavov, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DO-MS%3A+Data-driven+optimization+of+mass+spectrometry+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">DO-MS: Data-driven optimization of mass spectrometry methods.</a> Journal of Proteome Research. 18 (6), 2493-2500 (2019).</li>
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</ol>

저자는 이해 상충이 없습니다.

SCoPE2에 의한 단일 세포의 성공적인 준비 및 분석의 열쇠 중 하나는 캐리어 및 기준 채널의 준비입니다. 제안된 담체 크기는 100 내지 200 셀이고; 그러나, 특정 단일-세포 실험에 필요한 세포의 수는 다른 곳에서 논의된 바와 같은 원리들에 기초하여 결정될 수 있다(21). 제안된 크기의 경우 384웰 플레이트당 최소 ~11,275개의 셀이 필요하므로 각 세트에서 200셀 캐리어 및 5셀 참조가 가능합니다. 원하는 세포 집단이 제한 요소가 아닌 경우 더 많은 세포를 분리하고 실수의 경우 단순히 추가 물질을 갖는 것이 유리할 수 있습니다(이 프로토콜에서 수행된 것처럼 11,275개 세포 대신 22,000개 세포 분리). 원하는 플레이트의 수에 필요한 캐리어 및 기준의 양은 펩타이드 식별 또는 정량화가 배치 간에 다를 수 있는 배치 간 변동을 최소화하기 위해 단일 배치로 준비되어야 합니다.
단일 셀을 384웰 플레이트의 웰로 분리하기 전에 플레이트 레이아웃의 설계를 고려하는 것이 중요합니다. 각 384웰 플레이트 내에서 양성 및 음성 대조군을 모두 구현하는 것이 좋습니다. 음성 대조군은 세포가 추가되지 않았지만 단일 세포 웰과 동일한 시약 추가 및 절차를 거치는 웰입니다. 양성 대조군은 단일 세포 대신 2-5 cells/μL로 희석된 세포 용해물이 첨가된 웰입니다. 이는 단일 셀 격리 방법이 잘 검증되지 않은 경우 구현하는 데 특히 중요합니다. 각각의 384-웰 플레이트는 이상적으로 단일 세포 및 대조군의 무작위 분포를 가져야 한다(예를 들어, 단지 한 행에 음성 또는 양성 대조군이 없음). 각 플레이트는 한 플레이트에서 하나의 세포 유형을 분리하고 두 번째 플레이트에서 두 번째 세포 유형을 분리하는 대신 관심 있는 모든 세포 집단의 균등한 분포를 가져야 합니다. 이렇게 하면 배치 효과를 관심 있는 셀 유형과 연결하는 것을 방지할 수 있습니다. 또한 분석을 위해 하나 이상의 384웰 플레이트가 필요한 경우 가능하면 분리 단계를 며칠에 걸쳐 분산하는 대신 단일 세션에서 세포를 분리하는 것이 좋습니다.
단일 세포 및 담체/기준 모두의 용해는 동결-열 사이클(23)을 통해 물에서 일어난다. 대부분의 프로테아제는 이 단계 동안 변성될 것으로 예상됩니다. 그런 다음 트립신은 변성 단계 직후에 고농도로 첨가되며, 이는 가장 풍부한 세포 프로테아제보다 훨씬 더 높은 농도입니다. 대량 작용에 의해, 프로테아제 활성의 대부분의 생성물은 트립신 때문일 것이다.
시스테인 잔기의 환원/알킬화는 트립신 소화 전에 이 프로토콜에서 수행되지 않습니다. 시스테인 함유 펩타이드는 인간 프로테옴에서 트립신 펩타이드의 약 10%를 차지합니다. 우리는 환원/알킬화가 없는 접근법을 사용하여 더 적은 수의 시스테인 함유 펩타이드를 관찰합니다. 이 단계는 소화 직후 TMT(NHS-에스테르 화학)에 의한 라벨링과 호환되지 않는 시약을 사용합니다.
이 TMT 라벨링 전략에서, 담체 및 참조는 각각 126 및 127N으로 표지되는 반면, 단일 셀 및 대조군 웰은 128C 내지 135N으로 표지된다. 기준 뒤의 두 라벨인 127C 및 128N은 단일 세포보다 펩타이드 물질이 훨씬 더 풍부한 캐리어 및 기준 채널에서 발생하는 동위원소 교차 오염으로 인해 사용되지 않습니다. 총 세트당 12개의 TMT 채널이 있어 TMTpro-16plex로 단일 셀 또는 제어 웰을 라벨링하는 데 사용할 수 있으며, TMTpro-18plex를 사용하여 세트당 14개의 TMT 채널이 있습니다.
이 프로토콜을 사용하여 단일 세포 단백질체학 측정을 수행하기 위한 프로토콜의 중요한 단계에는 캐리어 준비, 단일 세포 분리, 용해, 분해, 바코드 라벨링 및 적절한 질량 분석 파라미터가 포함됩니다. 이러한 단계는 이 문서에 요약되어 있으며 17,21,25의 다른 곳에서 광범위하게 자세히 설명되어 있습니다. 각 단계에는 DO-MS에 해당하는 플롯 또는 플롯 세트가 있어 품질 관리가 용이합니다. 예를 들어, 담체의 성공적인 생성의 경우, 확인된 펩티드의 수, 표지 효율 및 절단 속도의 백분율을 나타내는 플롯은 그의 성공적인 제제의 검증을 허용한다. 대표적인 DO-MS 보고가 이 간행물에 포함되어 있고, 원본 데이터(16)에 대해 http://scope2.slavovlab.net/ 에서 볼 수 있다. 이러한 DO-MS 보고서를 통해 더 긴 LC 구배, 다른 소화 효소 또는 대체 화학 바코드와 같이 저자가 아직 조사하지 않은 방향으로 방법의 최적화를 평가할 수 있습니다.
현재, 데이터 의존적 획득 알고리즘에 의한 펩타이드의 연속 분석은 합리적인 길이의 LC 실행에서 분석할 수 있는 펩타이드의 수를 제한합니다. 이는 부분적으로 신뢰할 수 있는 단일 세포 정량화를 위한 충분한 이온의 성공적인 획득에 필요한 더 긴 충전 시간 때문입니다21. 담체 사용에 대한 본질적인 한계는 단일 세포의 소화 및 표지 효율에 대한 직접적인 평가가 부족하다는 것이다. 현재 이러한 제한에 대한 한 가지 해결책은 단일 세포와 함께 처리된 더 큰 샘플에 대해 품질 관리를 수행하는 것입니다.
우리는 여러 분석기로 질량분석기를 구축하는 것과 같이 단일 세포 단백질체학을 개선할 수 있는 여러 기회를 제안했습니다. 현재의 방법은 상업적으로 이용 가능한 시약 및 장비를 사용하여 하루에 약 100 세포의 속도로 단일 포유류 세포에서 수천 개의 단백질을 정량화 할 수 있습니다. SCoPE-MS 접근법의 2세대인 SCoPE2는 단위 시간당 분석 가능한 세포 수, 단위 시간당 분석 가능한 단백질 수, 샘플 준비에 필요한 시간, 시약 및 장비의 접근성, 단일 세포당 전체 준비 및 분석 비용 측면에서 이전 제품에 비해 크게 개선되었습니다. 막-결합된 단백질은 우레아 용해23과 비교하여 나타낸 바와 같이 동결열 용해 및 프로테아제 소화를 사용하여 접근가능하다. 상기 방법은 풍부도16과 관련하여 프로테옴의 상위 1/3로부터 많은 단백질을 확인한다. 변형된 단백질형이 프로테옴의 상위 3분의 1에 있고 변형된 펩타이드가 질량 분석 가능하면(이온화는 양호하고 변형되지 않은 펩타이드와 질량 차이가 있음) 이 프로토콜에 복종할 가능성이 더 높습니다. 이 방법은 분화, 노화 또는 면역 학적 반응 (즉, 식균 작용)과 같이 세포간에 의미있는 이질성이있는 생물학적 시스템에 유익하게 적용될 수 있습니다.

단일 세포 분석은 대량 측정 1,2,3으로 식별 할 수없는 생물학적 시스템 내의 이질성 수준을 연구하는 데 널리 사용됩니다. 이러한 세포 다양성은 암세포 치료 내성 4,5,6에서 당뇨병 7,8,9,10의 세포 간 이질성에 이르기까지 완전한 생물학적 과정에 대한 이해를 증진시킬 수있는 기능적 결과를 가질 수 있습니다. 많은 연구가 유전 적 또는 전사체 수준을 측정하여 단일 세포의 핵산을 측정하는 데 초점을 맞추고 세포 유형 및 상태의 분류를 가능하게했습니다. 그러나, 핵산 공간에서의 이러한 진보는 전사 후 조절(11)의 지식 격차를 메울 수 없으며, 이는 단일 세포(12,13,14,15)에서 유사하게 고처리량 단백질 측정의 필요성을 야기한다.
당사는 포유류 시스템의 엄격하고 강력한 단일 세포 단백질체학에 대한 요구를 해결하기 위해 SCoPE216,17을 개발했습니다. 이는 멀티플렉스 방법으로, 시간19,20에서 하나의 셀을 분석하는 표지가 없는 mthod와 달리 병렬로 많은 세포를 라벨링하고 분석하여 처리량을 증가시킬 수 있습니다. 샘플 준비 방법론, 질량 분석 접근법 및 후속 데이터 분석 단계를 통해 단일 세포당 수백에서 수천 개의 단백질을 정확하게 정량화할 수 있습니다. 이 방법은 관심있는 단일 세포 집단과 생물학적으로 유사한 세포의 작은 벌크 샘플 (일반적으로 25-200)인 등압 담체(21)를 통해 단일 세포의 질량 분석법을 가능하게합니다. 이 캐리어 재료는 탠덤 질량 태그 (TMT 라벨)를 사용하여 동일한 재료 및 단일 셀의 기준 채널이있는 세트로 다중화됩니다. 캐리어 채널은 표면적에 대한 샘플 손실을 줄이고 성공적인 펩타이드 식별을 위한 이온 백본 단편을 제공합니다. 벌크로 준비된 후 각 단일 셀 세트에 대해 5-10 셀 당량으로 희석되는 기준 채널은 분석의 기술적 변동성을 제어하는 데 도움이 됩니다. 특히, 이 기준은 이온 샘플링 및 이온화 효율과 같은 LC-MS/MS 관련 효과로 인한 변동성의 정규화를 허용합니다. 보통, 기준 및 캐리어 채널은 동일한 세포 집단으로부터 이루어진다.
이 샘플 준비 프로토콜은 SCoPE-MS22를 기반으로 여러 시너지 개선을 통해 구축된 2세대 분석법입니다. 개선 사항에는 MS 단백질체학 제제의 일반적인 단계인 샘플 세척을 피하는 세포 용해 방법이 포함됩니다. 동결 열 용해 방법인 mPOP(최소 단백질체 시료 준비)23을 사용합니다. 이 방법은 바이알이 아닌 더 작은 부피와 멀티웰 플레이트에서 단일 세포의 용해를 가능하게 하여 열 순환기에 의한 더 높은 처리 속도와 자동화를 촉진했습니다. 전체적으로 이 방법은 SCoPE-MS16,24에 비해 단일 셀당 비용을 낮추고 정량적 정확도를 높였습니다.
이 프로토콜은 TMTpro 18-plex 등압 라벨을 사용하여 캐리어 및 기준 채널을 준비하는 방법을 포함하여 단백질체 분석을 위해 단일 세포를 준비하는 방법을 설명합니다. 단일 세포 현탁액에 있고 384-웰 플레이트로 분리될 수 있는 포유류 세포는 이 프로토콜에 적합할 가능성이 높습니다. 또한 R Shiny 앱인 DO-MS25에서 생성된 여러 품질 관리 플롯을 표시하는 성공적인 단일 셀 세트의 대표적인 결과가 포함되어 있습니다. 다른 공개된 소프트웨어 도구(26,27) 및 실험 지침(17,21)은 이 프로토콜의 채택을 개선하였다. 이 시각적 가이드가 연구자들이 단일 세포 단백질체학 실험을 수행하는 데 도움이 되기를 바랍니다.

<table><tbody><tr><td>384웰 플레이트, 표준 PCR 플레이트Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>AB1384</td><td>폴리프로필렌 플레이트를 대체해야 하는 경우 사용해야 합니다. 대체하는 경우, SCoPE2 준비 전에 다른 플레이트의 잠재적인 폴리머 오염 수준을 평가해야 합니다.</td></tr><tr><td>아세토니트릴(완충액 제조용), Optima LC-MS/MS 등급</td><td>Fisher Scientific</td><td>A955-1</td><td>이 아세토니트릴은 모든 완충액, 즉 SCoPE2 세트를 결합할 때 캐리어 및 참조를 통과한 후 웰을 통과하는 데 사용되는 50% 아세토니트릴에 사용됩니다. 주의: 아세토니트릴은 가연성 액체입니다. 피부, 눈, 호흡기 및 중추 신경계를 자극할 수 있습니다. 개인 보호 장비를 반드시 착용하십시오. 화학 흄 후드 아래에서 다루십시오.</td></tr><tr><td>아세토니트릴(TMT 제조용), 무수, 99.8%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>271004-100ML</td><td>이 아세토니트릴은 제조업체 농도에서 TMT 라벨을 재현탁하는 데 사용됩니다. 주의: 아세토니트릴은 가연성 액체입니다. 피부, 눈, 호흡기 및 중추 신경계를 자극할 수 있습니다. 개인 보호 장비를 반드시 착용하십시오. 화학 흄 후드 아래에서 다루십시오.</td></tr><tr><td>접착제 PCR 플레이트 호일</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB0626</td><td></td></tr><tr><td>자동시료주입기 바이알 나사산 캡</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C5000-51B</td><td></td></tr><tr><td>자동시료주입기 바이알 스피너(즉, myFuge 5)</td><td>MTC Bio</td><td>C2595</td><td>이 모델에는 속도 제어 기능이 없습니다. 단순히 자동 시료 주입기 바이알의 바닥에 액체를 여과하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>벤조나아제 뉴클레아제 Sigma</td><td>Aldrich</td><td>E1014-25KU</td><td></td></tr><tr><td>투명 유리 나사산 바이알, 9mm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>60180-509</td><td></td></tr><tr><td>포름산, 피어스, LC-MS/MS 등급</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>85178</td><td>주의: 포름산은 가연성 액체입니다. 심각한 눈 손상이나 피부 화상을 유발할 수 있습니다. 개인 보호 장비를 반드시 착용하십시오. 환기가 잘 되는 곳에서 취급하십시오.</td></tr><tr><td>유리 오토샘플러 인서트, 9mm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C4010-630</td><td></td></tr><tr><td>하이드록실아민(HA), 50% 중량/부피</td><td>Sigma Aldrich</td><td>467804-50ML</td><td>주의: 하이드록실아민은 피부 자극을 유발할 수 있습니다. 개인 보호 장비를 반드시 착용하십시오.</td></tr><tr><td>Mantis 미세유체 칩, 소량 3PFE 칩</td><td>Formulatrix</td><td>MCLVPR2</td><td>이 칩은 Mantis 미세유체 액체 처리기와 함께 사용하여 유기 용액을 분배하기 위한 것입니다. 이는 TMT 라벨을 분배하는 데 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Mantis 미세유체 칩, 저용량 실리콘 칩</td><td>Formulatrix</td><td>MCLVS12</td><td>이 칩은 Mantis 미세유체 액체 처리기와 함께 사용하여 수용액을 분배하기 위한 것입니다. TMT 라벨을 분배하는 데 사용할 수 없습니다.</td></tr><tr><td>Mantis 미세유체 액체 처리기</td><td>Formulatrix</td><td></td><td>액체 처리기를 대체할 수 있습니다. 그러나 시스템이 100% 아세토니트릴과 호환되는지(TMT 라벨의 경우와 같이) 시스템이 폴리머 오염 또는 기타 유형의 오염을 샘플에 도입하지 않는지 확인하는 것이 중요합니다.</td></tr><tr><td>자동 플레이트 처리를 위한 넓은 원뿔형 핀이 있는 Mantis PCR 플레이트 어댑터</td><td>Formulatrix</td><td>232400</td><td></td></tr><tr><td>MassPREP 펩타이드 혼합물</td><td>Waters</td><td>186002337</td><td>9개의 비트립틱 펩타이</td></tr>드 <tr><td>PCR 튜브 스피너 혼합물(즉, 0.2mL 튜브용 16자리 마이크로 원심분리기)</td><td>USA Scientific</td><td>2621-0016</td><td>이 모델에는 속도 제어 기능이 없습니다. 그것은 단순히 튜브의 바닥에 액체를 모으는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>PCR 튜브: TempAssure 0.2 mL PCR 8-튜브 스트립</td><td>USA Scientific</td><td>1402-3900</td><td>대체하는 경우 SCoPE2 준비 전에 다른 플레이트의 잠재적 폴리머 오염 수준을 평가해야 합니다.</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS), 10x, pH 7.4, RNase-free</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>플레이트 스피너(즉, PlateFuge 마이크로 원심분리기)</td><td>벤치마크 과학</td><td>모델 C2000</td><td>이 모델에는 속도 제어 기능이 없습니다. 그것은 단순히 우물의 바닥에 액체를 모으는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>Thermal Cycler(즉, 384웰 모듈이 있는 C1000 Touch)</td><td>Biorad</td><td>1851138</td><td></td></tr><tr><td>TMTpro 16plex 라벨 시약 세트, 1 x 5 mg</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A44520</td><td></td></tr><tr><td>트리에틸암모늄 바이카보네이트(TEAB), 1 M, pH 8.5</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7408100ML</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin Gold 질량분석기 등급</td><td>Promega</td><td>V5280</td><td>이것은 트립신의 순도가 매우 높다는 것입니다. 다른 트립신 시약은 순도 수준이 다를 수 있습니다. 긍정적인 SCoPE2 결과를 얻으려면 순도 수준이 중요합니다. 주의: 트립신은 피부, 호흡기 및 눈 자극을 유발할 수 있습니다. 개인 보호 장비를 반드시 착용하십시오. 화학 흄 후드 아래에서 다루십시오.</td></tr><tr><td>Vortex(아날로그 와류 믹서)</td><td>VWR</td><td>모델 58816-121</td><td></td></tr><tr><td>수조 초음파 발생기(즉, 디지털 타이머가 있는 2.8L 초음파 세척기)</td><td>VWR</td><td>97043964</td><td></td></tr><tr><td>물, Optima LC-MS/MS 등급</td><td>Fisher Scientific</td><td>W6-1</td><td>희석 또는 제조가 필요한 모든 용액은 질량 분석 등급의 물로 만드는 것이 좋습니다. 모든 희석 및/또는 마스터 믹스는 새로 만들어야 합니다. 낮은 등급의 물로 인한 오염은 펩타이드 검출 및 단일 세포 데이터 품질에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다.</td></tr></tbody></table>

동결열 용해 및 등압 담체를 사용한 질량분석법 분석을 위한 단일 세포 단백질체학 준비

Single-Cell Proteomics Preparation for Mass Spectrometry Analysis Using Freeze-Heat Lysis and an Isobaric Carrier

단일 세포 단백질체학 분석에는 민감하고 정량적으로 정확하며 널리 접근 가능하고 강력한 분석법이 필요합니다. 이러한 요구 사항을 충족하기 위해 단일 세포 단백질체학(SCoPE2) 프로토콜은 제한된 샘플에서 단일 세포 수준까지 수백에서 수천 개의 단백질을 정량화하는 2세대 방법으로 개발되었습니다. 이 방법을 사용한 실험은 질량 분석기 기기 시간 10 일 만에 1,500 개의 단일 포유류 세포 (세포 당 500-1,000 개의 단백질)에서 3,000 개 이상의 단백질을 정량화하는 데 성공했습니다. SCoPE2는 세포 용해를 위한 동결-열 주기를 활용하여 단일 세포를 세척할 필요가 없으며 결과적으로 시료 손실을 줄이는 동시에 시료 준비를 가속화하고 자동화를 단순화합니다. 또한이 방법은 단백질 식별을 돕고 샘플 손실을 줄이는 등압 캐리어를 사용합니다.
이 비디오 프로토콜은 널리 접근할 수 있는 장비와 시약만 사용하여 자동화된 단일 세포 단백질 분석을 채택할 수 있도록 자세한 지침을 제공합니다. 자사는 수확에서 주입, 액체 크로마토그래피-탠덤 질량분석법(LC-MS/MS) 분석에 이르기까지 단백질체학 분석을 위한 단일 세포 준비 절차의 중요한 단계를 보여줍니다. 또한 시청자는 등압 담체를 사용한 실험 설계의 원칙, 등압 담체 및 단일 세포 제제 모두에 대한 품질 관리, 접근 방식의 한계에 대한 논의와 함께 대표 결과를 안내합니다.

프로토콜의 긍정적인 결과는 프로토콜의 여러 중요한 단계가 성공적으로 수행되었는지 확인하는 것을 수반합니다. 여기에는 캐리어 준비, 단일 세포 분리, 용해, 분해, 바코드 라벨링 및 MS 파라미터 최적화가 포함됩니다. DO-MS 플롯을 사용하면 프로토콜의 각 중요 단계 완료를 쉽게 평가할 수 있습니다. 일반적으로 25 및 200 셀의 양 (세트당)에 해당하는 성공적으로 준비된 담체는 잘 소화되고 잘 표지됩니다. DO-MS의 플롯을 통해 샘플의 강도(수량 추정), 분해 효율(이상적으로는 &lt;25% 이질) 및 라벨링 효율(&gt;99%여야 함)을 정량화할 수 있습니다. 가장 중요한 것은 완전히 표지되지 않은 담체 샘플이 단일 세포용 바코드와의 교차 반응을 허용하고 단일 세포 펩타이드의 정량화에 가짜 신호를 추가할 수 있다는 것입니다.
음성 대조군 웰에는 모든 실험 시약이 포함되지만 세포가 없습니다. 이를 통해 배경 잡음을 평가할 수 있을 뿐만 아니라 빈 우물의 대표적인 신호를 제공하여 세포 분리 효율을 결정할 수 있습니다. DO-MS 보고서는 세포 분리 및 배경 잡음의 성공을 결정하기 위해 단일 셀 웰과 함께 제어 웰의 측정된 신호를 평가하는 플롯을 제공합니다. 추가적으로, 정량의 품질은 SCoPE2 파이프라인(GitHub: github.com/SlavovLab/SCoPE2 에서 이용 가능) 또는 SCP 바이오컨덕터 패키지29를 사용하여 평가할 수 있다.
단일 세포의 소화 및 표지 효율은 담체와 같이 직접 분석되지 않을 수 있지만, DO-MS는 다시 소화 및 표지 효율의 추정을 허용하는 플롯을 제공한다. 단일 세포의 준비와 함께 100-200 세포의 대조군을 포함함으로써(즉, 모든 동일한 시약 첨가를 받음), 해당 대조군에 대한 소화 및 라벨링 효율을 평가할 수 있으며, 함께 준비된 단일 세포에 의해 공유되는 것으로 가정할 수 있습니다. 불량한 소화는 완전히 절단된 펩타이드에 대한 잘못 절단된 펩타이드의 강도의 높은 비율로 나타납니다(그림 1).
세트에서 고려해야 할 또 다른 요소는 누락된 데이터의 비율과 각 TMT 채널의 리포터 이온 강도 중앙값입니다(그림 2). 단일 세포가 성공적으로 준비되면 세포 및 양성 대조군당 누락된 데이터의 양은 음성 대조군 샘플보다 훨씬 적습니다. 마찬가지로, 전구체의 중간 강도는 음성 대조군보다 단일 세포 및 양성 대조군에서 훨씬 더 높습니다. MS 파라미터의 최적화는 다른 곳(21)에서 광범위하게 논의되었으며, 최적 파라미터는 DO-MS 또는 SCP 컴패니언25, 27과 같은 툴을 사용하여 결정될 수 있다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63802/63802fig01.jpg"> 그림 1: 캐리어 준비 품질 관리. DO-MS 플롯은 (A) TMT로 표지하는 부위에서 성공적으로 준비된 담체의 표지 효율: 라이신의 측쇄 및 펩티드 N-말단의 1차 아민, 및 (B) 트립신 절단의 아미노산 잔기에서의 소화 효율을 묘사합니다. 약어 : TMT = 탠덤 질량 태그. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63802/63802fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63802/63802fig02.jpg"> 그림 2: 단일 세포 준비 품질 관리. DO-MS는 (A) 단일 세포(C5-10), 대조군(C13,16), 캐리어(C1) 및 기준(C2)에서 누락된 데이터의 비율과 (B) 단일 세포 및 대조군의 강도를 보여줍니다. C3, C4, C11, C12 및 C15에 대응하는 태그(127C, 128N, 131C, 132N, 133N, 및 133C)는 이 특정 세트에서 사용되지 않는다. 양성 대조군은 펩타이드로 대량으로 처리 된 세포 물질로 구성되며, 라벨링 전에 2-5 cells / μL 수준으로 희석됩니다. 음성 대조군은 단일 세포를 추가하지 않고 단일 세포에 사용되는 모든 준비 단계를 잘 실시하는 것으로 구성됩니다. 약어 : TMT = 탠덤 질량 태그. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63802/63802fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

이 프로토콜에서는 수동 및 자동 피펫팅 옵션과 함께 상용 시약 및 장비를 사용하여 질량분석 법을 통해 단일 세포 단백질체학 분석을 위해 포유류 세포를 준비하는 방법을 설명합니다.

Single-cell proteomics analysis requires sensitive, quantitatively accurate, widely accessible, and robust methods. To meet these requirements, the ...

SCoPE2는 항체 없이 수천 개의 단일 포유류 세포에서 수천 개의 단백질을 정량화할 수 있습니다. 이 프로토콜은 대량 분석에서는 볼 수 없는 단백질체 이질성을 발견하는 데 도움이 될 수 있습니다. SCoPE2 접근법을 사용하는 단일 세포 단백질체학은 피펫에서 액체 취급 로봇에 이르기까지 다양한 리소스를 보유한 연구자들이 접근할 수 있도록 설계되었습니다.SCoPE2는 동일한 집단의 단일 세포 간에 단백질이 어떻게 존재비에서 차이가 있는지에 대한 통찰력을 제공함으로써 암 및 면역학을 포함한 많은 연구 분야에 광범위하게 적용할 수 있습니다. 시작하려면 분류된 단일 셀이 있는 384웰 플레이트를 열 순환기에 넣고 섭씨 90도에서 10분 동안 가열한 다음 섭씨 12도에서 냉각하여 세포 용해 절차를 시작합니다. 벤치탑 플레이트 스피너에서 섭씨 18도에서 22도의 플레이트를 잠시 회전시킵니다.섭씨 18도에서 22도까지 수조 초음파 처리기에서 5분 동안 플레이트를 초음파 처리합니다. 그런 다음 얼음 위에 놓습니다. 트립신 분해를 진행하려면 100 마이크로 리터의 마스터 믹스를 준비하고 액체 처리기를 사용하여 384 웰 플레이트의 각 웰에 0.2 마이크로 리터의 마스터 믹스를 추가합니다.플레이트를 밀봉하고 5초 동안 소용돌이한 다음 벤치탑 플레이트 스피너에서 섭씨 18도에서 22도의 스핀다운합니다. 뚜껑 온도를 섭씨 52도로 설정한 상태에서 384웰 플레이트를 섭씨 37도에서 3시간 동안 가열합니다. 탠덤 질량 태깅 반응을 설정하려면 섭씨 영하 80도의 냉동고에서 탠덤 질량 태그의 85밀리몰 스톡을 꺼냅니다.튜브를 열기 전에 튜브를 실온으로 데우고 라벨을 무수 아세토 니트릴에서 22 밀리몰로 희석하십시오. 이 라벨링 전략을 사용하여 액체 분주 로봇 또는 수동 피펫을 사용하여 384웰 플레이트의 각 웰에 0.5마이크로리터의 희석된 탠덤 질량 태그를 추가합니다. 플레이트를 밀봉하고 5초 동안 소용돌이한 다음 벤치탑 플레이트 스피너에서 섭씨 18도에서 22도의 스핀다운합니다.라벨링 반응을 섭씨 18도에서 22도에서 1시간 동안 진행시키십시오. 탠덤 질량 태깅 반응의 담금질을 위해 액체 처리기를 사용하여 HPLC 등급 물에 희석한 0.5% 하이드록실아민 0.2마이크로리터를 384웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 플레이트를 밀봉하고 5초 동안 소용돌이치고 벤치탑 플레이트 스피너에서 스핀다운한 후 플레이트를 섭씨 18도에서 22도까지 30분 동안 유지합니다.LC-MS 분석 준비는 영하 80도의 냉동고에서 결합된 담체 또는 표준 물질을 제거함으로써 시작됩니다. 각각의 세트에 대해, 1 마이크로리터의 담체 및 기준 물질을 제1 웰 내로 피펫팅하고, 단일 세트의 일부가 될 것이다. 첫 번째 웰에서 후속 웰까지 전체 부피를 피펫팅합니다.단일 세트에 포함된 모든 웰이 최종 웰에 결합될 때까지 한 웰에서 다음 웰로 전체 부피를 계속 피펫팅합니다. 각 세트에 대해 각 세트에 포함될 첫 번째 단일 셀 웰에 대해 HPLC 등급 물에 희석된 50% 아세토니트릴 5마이크로리터를 추가합니다. 첫 번째 웰에서 후속 웰까지 전체 부피를 피펫팅합니다.단일 세트에 포함된 모든 웰이 최종 웰에서 결합될 때까지 한 셀에서 다음 셀로 전체 부피를 계속 피펫팅합니다. 이제 각 세트를 자동 시료 주입기 유리 삽입물로 옮깁니다. 모든 세트가 결합되어 유리 삽입물에 넣으면 샘플을 건조시킵니다.LC-MS-MS 분석 전에 각 세트에 1.2 마이크로 리터의 0.1 % 포름산을 추가하여 표지 된 펩타이드를 재현 탁시킵니다. 자동 시료 주입기 삽입물을 유리 자동 시료 주입기 바이알에 넣고 각 시료를 캡으로 닫습니다. 각 바이알을 5초 동안 소용돌이하여 재현탁이 완료되었는지 확인한 다음 바이알 스피너에서 섭씨 18도에서 22도의 스핀다운을 합니다.각 샘플이 측면에 튀지 않고 인서트 바닥에 있는지 확인하십시오. 바이알을 자동 시료 주입기 트레이에 넣고 각 세트에 대해 LC-MS-MS 분석을 위해 1마이크로리터 샘플을 주입합니다. 단일 세포의 분해 및 표지 효율은 담체와 같이 직접 분석되지 않을 수 있지만 DO-MS 소프트웨어는 분해 및 표지 효율을 추정하는 플롯을 제공합니다.불쌍한 소화는 잘못 절단 된 펩타이드와 완전히 절단 된 펩타이드의 강도의 높은 비율로 나타납니다. 세트에서 고려해야 할 또 다른 요소는 각 탠덤 질량 태깅 채널에서 리포터 이온 강도 중앙값에서 누락된 데이터의 비율입니다. 단일 세포가 성공적으로 준비되면 세포 및 양성 대조군당 누락된 데이터가 음성 대조군 샘플보다 훨씬 낮습니다.LC-MS-MS 시료 전처리 중 신중한 액체 취급은 펩타이드의 최대 회수에 매우 중요합니다. 웰당 약 100 피코그램 내지 100 나노그램의 작은 샘플은 등압 담체를 사용하여 단백질체학 분석을 위해 제조될 수 있다. SCoPE2는 전 세계 연구자들이 일반적인 시약과 상용 장비만 사용하여 단일 세포 단백질체학 측정에 액세스할 수 있도록 합니다.로봇 액체 취급에 의한 수동 처리 또는 고처리량 자동화가 가능합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

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