Name: 뇌에서 아밀로이드 피브릴 코어의 생화학 적 정제 및 프로테오믹 특성화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-28T13:50:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: 학습하세요 아밀로이드 피브릴의 생화학적 정제 및 질량분석 기반 프로테오믹스 방법을 활용하여 알츠하이머병 진단에 필수적인 아밀로이드 플라크의 구조와 구성을 정밀 분석하는 기술을.

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이 작업은 NIH 보조금 R01AG061865에서 R.J.V. 및 J.N.S.에 의해 지원되었습니다. 저자들은 노스 웨스턴 대학의 Vassar와 Savas 연구 그룹 구성원들에게 사려 깊은 토론에 감사드립니다. 우리는 또한 진심으로 박사 (들)에게 감사드립니다. Ansgar Seimer와 Ralf Langen은 사우스 캘리포니아 대학의 중요한 의견을 제시했습니다. 노스웨스턴 대학교 고급 현미경 센터에서 시료 준비 및 음성 염색 전자 현미경 이미징을 해주신 Farida Korabova 박사님께 감사드립니다.

이 프로토콜은 인간 또는 척추 동물 뇌 조직의 사용을 포함합니다. 모든 연구는 노스 웨스턴 대학의 승인 된 제도적 지침을 준수하여 수행되었습니다. 현재의 워크플로우는 APP-knock in (App NL-G-F/NL-G-F) 마우스 뇌 피질 및 해마 뇌 영역 추출물11을 사용하여 표준화되었습니다. 이 프로토콜은 생후 6-9 개월에 생쥐의 뇌 추출물에 최적화되어 있으며 남성과 여성 동물 모두에서 아밀로이드를 효과적으로 정제 할 수 있습니다.
참고: 전체 실험 절차를 더 잘 이해하려면 워크플로의 개략도에 대해서는 그림 1 을 참조하십시오.
1. 조직 수확 및 아밀로이드 정제
참고 : 이상적으로, 아밀로이드 피브릴은 갓 해부 된 뇌 영역으로부터 분리되어야합니다. 그러나이 방법은 스냅 또는 플래시 냉동 뇌 조직에서도 잘 작동합니다. 아래는 나중에 사용하기 위해 저장을위한 스냅 냉동 뇌 조직에 대한 간략한 개요입니다.
<ol><li>뇌 조직 수확 및 저장: 마우스 뇌를 해부하고 아밀로이드가 함유 된 영역 (즉, 피질 및 해마)을 신속하게 수확 한 다음 액체 질소 또는 드라이 아이스 알코올 욕조에서 스냅 냉동합니다. 참고: 스냅 동결은 조직 구성 요소의 구조적 특성을 보존하는 데 도움이 됩니다. 마우스는 이소플루란 및 자궁경부 탈구12,13에 의해 안락사된다. CO2는 뇌 프로테옴 완전성을 손상시킬 수 있기 때문에 사용하지 않는 것이 좋습니다.</li>
	<li>해부 후, 신선한 조직을 작은 블록 (예를 들어, 5 mm x 5 mm)으로 절단하고 저장하며, 이는 아밀로이드 추출 전에보다 효율적인 균질화를 용이하게하기 때문입니다. 조직을 멸균 극저온 바이알로 옮기고 뚜껑을 조이고 빠르게 물에 잠깁니다.</li>
	<li>조직을 초저온 조건(즉, -80°C 또는 액체 질소)에서 동결 유지한다. 추출이 며칠 후에 수행되어야 하는 경우, 조직을 -20°C에서 보관하고 동결 및 해동 사이클을 피한다. 추출 및 정제를 위해 준비되었을 때 젖은 얼음 위에 동결된 조직을 해동시킨다. 참고: 조직을 액체 질소와 직접 접촉하면 조직 및 단백질 손상이 발생할 수 있습니다. 알코올 목욕은 튜브 라벨에서 영구 마커를 제거 할 수 있습니다.</li>
</ol>2. SDS 불용성 물질의 농축
참고: 달리 명시되지 않는 한 얼음과 원심분리기의 모든 단계를 4°C에서 수행하십시오. 이 프로토콜에 사용되는 모든 버퍼 및 솔루션에 대한 자세한 내용은 보충 파일 1에 제공됩니다. 화학 물질 및 장비의 제조업체 및 카탈로그 번호는 재료 표에 나와 있습니다.
<ol><li>갓 해부되거나 스냅-냉동된 뇌 조직 영역(얼음 위에서 해동)으로 시작하여 6-8개의 세라믹 비드와 신선하게 준비된 빙냉 균질화 완충액(습윤 조직 덩어리 0.25-1g에 대해 1 mL)이 들어있는 2 mL 튜브에 넣었다.</li>
	<li>튜브를 비드 밀 호모게나이저로 옮기고 조직 내용물을 4000 rpm으로 분쇄하고, 각각 30 초의 두 사이클과 그 사이에 30 초 간격으로 분쇄하십시오. 참고: 또는 전동 교반기 또는 호모게나이저 시스템을 사용하여 조직을 분쇄하고 균질화할 수 있습니다.</li>
	<li>15 mL 튜브의 뇌 전체 조직 균질액 1 mL에 빙냉 균질화 완충액 9 mL를 첨가하고, 실험실 왁스 필름 스트립으로 밀봉하고, 4°C에서 하룻밤 동안 종단 간 회전시켜 견고한 가용화를 보장한다. 참고: 원치 않는 큰 세포 파편과 지질을 제거하기 위해, 다음날 아침에, 튜브를 4°C에서 800 x g 에서 10분 동안 회전시키고 신선한 튜브에 상청액을 수집한다. 나머지 펠렛을 빙냉 균질화 완충액 2 mL에 재현탁시키고, 잘 섞고, 4°C에서 10분 동안 다시 스핀하고, 두 상청액을 합한다.</li>
	<li>조직 추출물 현탁액에 고체 수크로스를 최종 농도 1.2 M로 천천히 첨가하고, 잘 혼합하고, 4°C에서 45분 동안 250,000 x g 에서 원심분리한다.</li>
	<li>피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 제거하고 버립니다. 펠렛을 1.9 M 수크로스를 함유하는 균질화 완충액 2 mL에 재현탁시켜 트리투레이션하고, 이어서 4°C에서 45분 동안 125,000 x g 에서 원심분리하였다. 참고: 버퍼 볼륨은 이전 단계에서 회수된 재료의 양에 따라 조정할 수 있습니다. 일반적으로 10 부피의 균질화 버퍼 (V / V)가이 단계에 이상적입니다.</li>
	<li>피펫을 사용하여 상단 흰색 고체층을 수집하여 신선한 튜브로 옮기고 기포를 도입하지 않고 여러 번 위아래로 피펫팅하여 얼음처럼 차가운 세척 버퍼 1mL에 가용화하십시오.</li>
	<li>최상층 외에도, 펠렛은 또한 아밀로이드 피브릴로 풍부합니다. 더 높은 수율을 얻으려면 두 분수를 결합하고 진행하십시오. 피펫을 사용하여 중간 수성층을 조심스럽게 제거하고 버립니다.</li>
	<li>합한 분획을 4°C에서 20분 동안 8000 x g 에서 원심분리한다. 상층액을 버리십시오.</li>
	<li>세척된 펠렛에 빙냉 소화 완충액 1 mL를 첨가하고, 재현탁시키고, 실온(RT)에서 3시간 동안 인큐베이션한다.</li>
	<li>4°C에서 20분 동안 8000 x g 에서 원심분리하고 피펫을 이용하여 상층액을 제거하였다.</li>
	<li>재현탁하고 소화된 펠렛을 빙냉 트리스 완충액 1 mL에 두 번 세척한다(단계 2.8과 동일).</li>
	<li>세척된 펠렛을 1% SDS 및 1.3 M 수크로스를 함유하는 가용화 완충액 1 mL에 재현탁시켜 상하로 피펫팅한다. 4°C에서 60분 동안 200,000 x g 에서 신속하게 원심분리한다. 참고: 아밀로이드 피브릴은 세제 및 변성제에 대한 내성이 높지만 세제(1% SDS)에 매우 오래 노출되면 피브릴의 무결성에 영향을 미치거나 단단히 결합된 단백질을 제거할 수 있으며 이는 후속 분석을 손상시킬 수 있습니다. 따라서, 펠렛을 재현탁시킨 직후, 원심분리를 진행한다.</li>
	<li>펠렛을 저장하고 나머지 상청액의 부피를 증가시켜 50 mM 트리스 완충액 (비율 1:0.3)을 첨가하여 수크로오스 농도를 1.3에서 1 M으로 감소시키고 4°C에서 45분 동안 200,000 x g 에서 1회 더 원심분리한다.</li>
	<li>두 펠렛을 아밀로이드 정제를 위해 0.5% SDS 및 풀을 함유하는 100 μL의 트리스 완충액에 용해시킨다. 눈에 보이는 펠릿은 작으며 불투명하고 회백색으로 나타나야 합니다(그림 2A 참조).</li>
</ol>3. 아밀로이드 정제
참고 : 두 펠렛을 결합하고 균일 한 용액을 얻을 때까지 피펫팅하여 가용화하고 아밀로이드 정제의 다음 단계를 진행하십시오.
<ol><li>펠릿에 존재하는 아밀로이드가 풍부한 물질의 완전한 가용화를 위해, 튜브를 20 사이클 동안 중간 범위 주파수에서 30 s ON 및 30 s OFF 동안 실행되는 욕조 초음파 처리 장치에서 초음파에 의해 생성 된 기계적 전단에 적용하십시오.</li>
	<li>물질을 4°C에서 30분 동안 20,000 x g 에서 즉시 원심분리하고, 펠렛을 0.5% SDS 트리스 완충액의 500 μL에 재현탁시켰다.</li>
	<li>3.1단계를 반복합니다. 및 3.2 단계. 총 다섯 번 씻을 때 네 번. 순도를 향상시키기 위해 세척 횟수를 늘릴 수 있습니다. 참고: 초음파 처리 및 세척 단계는 0.5% SDS에서 최적화되어 있는데, 더 높은 농도가 피브릴의 구조, 무결성 또는 단백질 조성에 영향을 줄 수 있기 때문입니다. 이 단계에서 SDS 농도를 증가시키는 것은 권장되지 않습니다.</li>
	<li>최종 원심분리 단계 후, 펠렛을 200 μL의 초순수로 세척하고, 4°C에서 30분 동안 20,000 x g 에서 원심분리하여 임의의 잔류 세제를 제거하였다. 정제된 아밀로이드 피브릴을 함유하는 세척된 펠릿은 반투명하게 나타나며 때로는 보기 어렵다.</li>
	<li>정제된 아밀로이드 피브릴을 함유하는 최종 펠렛을 100 μL의 초순수에 용해시킨다. 하류 처리를 위해 즉시 다음 단계로 진행하거나 추가 분석을 위해 피브릴 현탁액을 -20°C에서 저장한다. 얼어 붙은 경우 강수량을 시작하기 전에 얼음 위에서 해동하십시오.</li>
</ol>4. 메탄올 클로로포름 침전
참고: 최종 목표가 단백질 분석을 수행하는 것이라면 추가적인 비단백질성 불순물을 탈염하고 제거하는 것이 좋습니다.
<ol><li>정제된 100 μL의 아밀로이드 피브릴에 메탄올 400 μL를 1.5 mL 튜브에 첨가하고 와류 웰에 첨가한다.</li>
	<li>100 μL의 클로로포름을 튜브에 넣고 잘 와류하십시오.</li>
	<li>300 μL의 초순수와 와류를 완전히 첨가하십시오. 이것은 단백질 침전으로 인해 혼합물을 흐리게 만듭니다.</li>
	<li>RT에서 2분 동안 12,000 x g 에서 원심분리한다.</li>
	<li>단백질 플레이크를 함유하는 계면층을 방해하지 않고 수성 층(즉, 상부)을 조심스럽게 제거한다.</li>
	<li>동일한 부피의 메탄올을 다시 첨가하고, RT에서 2분 동안 12,000 x g 에서 원심분리한다.</li>
	<li>피펫을 사용하여 상층액을 버리고 RT에서 펠렛을 공기 건조하십시오. 과도한 건조를 피하십시오. 아밀로이드 분획은 과도하게 건조될 경우 재용해되기 어렵다.</li>
</ol>5. 트립신 소화
<ol><li>펠렛을 50 μL의 구아니딘 히드로클로라이드 (GuHCl) 완충액에 용해시킨다. 얼음처럼 차가운 물 욕조에서 초음파 처리하고 필요한 경우 95 °C에서 5 분 동안 가열하십시오.</li>
	<li>RT에서 45 분에서 1 시간 동안 철저히 소용돌이 치며 완전히 용해시킵니다. 이 단계 후에는 펠릿이 보이지 않으며 용액이 외관상 선명하게 보입니다.</li>
	<li>동일한 부피의 0.2% 계면활성제 용액을 첨가한다. RT에서 60분 동안 볼텍싱으로 가용화하십시오. 이 단계는 트립신 효소 활성을 향상시킵니다.</li>
	<li>500 mM 원액으로부터 1 μL의 트리스-2-카르복시에틸포스핀 (TCEP)을 첨가한다. 60분 동안 인큐베이션한다.</li>
	<li>2 μL의 500 mM 요오도아세트아미드 (IAA)를 첨가하고, 20분 동안 어둠 속에서 인큐베이션한다.</li>
	<li>IAA를 15분 동안 5μL의 TCEP 용액으로 켄칭한다.</li>
	<li>필요한 부피의 50 mM 중탄산암모늄 용액을 튜브에 첨가하여 구아니딘 농도를 1.5 M으로 감소시킨다.</li>
	<li>튜브에 1% 계면활성제 용액(단백질 1μL/50μg)을 첨가합니다.</li>
	<li>트립신 (1 μg / 100 μg의 단백질)을 첨가하고 튜브를 37 °C에서 밤새 혼합하십시오.</li>
</ol>6. 펩티드 정리
<ol><li>다음날 아침, 포름산을 첨가하여 pH를 2.0으로 낮춤으로써 소화된 펩티드 용액을 산성화시킨다.</li>
	<li>200 μL의 50% 메탄올 용액을 첨가하여 2 mL 수신기 튜브에서 C18(n-옥타데실) 스핀 컬럼을 활성화시키고 RT에서 2분 동안 1500 x g 에서 스핀한다.</li>
	<li>200 μL의 평형화 완충액을 첨가하고 동일한 조건으로 2분 동안 방사함으로써 C18 컬럼 수지 베드를 평형화시킨다. 이 단계를 반복합니다.</li>
	<li>산성화된 펩티드 용액을 C18 컬럼에 로딩하고, RT에서 2분 동안 1500 x g 에서 원심분리한다. 두 번째 흐름은 버립니다.</li>
	<li>C18 수지에 결합된 펩티드를 단계 6.3에서 행해진 바와 같이 세척 완충액 2x로 세척한다. 컬럼을 세척하기 위해 동일한 평형화 완충액을 사용한다.</li>
	<li>40 μL의 용출 완충액을 첨가하여 펩티드를 에루트한 다음, RT에서 2분 동안 1500 x g에서 원심분리하여 용출 단계를 3회 반복하여 회수된 펩티드의 수율을 증가시킨다.</li>
	<li>펩티드를 수성 용액을 증발시킴으로써 진공 농축기에서 빠르게 건조시킨다. 건조 펠릿은 MS 분석 전에 몇 주 동안 -20°C에서 저장될 수 있다.</li>
</ol>7. 펩타이드 분석을 위한 질량분석기 설정
참고: MS 매개 변수에 대해서는 보충 파일 1 (랩의 이전 간행물에서 수정됨)14를 참조하십시오.
<ol><li>MS 분석을 위해 펩티드 샘플을 로딩하기 전에, 건조된 펩티드 펠릿을 20 μL의 샘플 로딩 완충액에 용해시키고, 회수된 펩티드의 농도를 정량화하기 위해 마이크로BCA를 수행한다.</li>
	<li>용해된 펩티드를 유리 바이알에 옮기고 펩티드의 3 μg (마이크로 BCA로부터 정량화)을 UPLC 시스템 자동 샘플러 내로 로딩한다.</li>
	<li>샘플을 250nL/min의 유량으로 통풍 트랩 컬럼(C18 HPLC 컬럼, 0.075mm x 20mm)에 로드합니다.</li>
	<li>트랩 컬럼을 분석 컬럼(0.075 μm x 500 mm)과 일렬로 배열하고 2000 V의 분무 전압을 거친 전기 분무 이온화(ESI) 소스에 에미터 팁을 조립한다. 참고: 이 연구에서는 이동상이 기상으로 고전압 이온화를 받는 ESI가 수행됩니다. 이에 의해 생성된 스프레이는 가열된 모세관을 통해 MS의 진공 챔버로 향하게 된다. 진공 상태에서, 물방울의 탈용매화 및 이온의 배출은 열과 전압의 존재하에 발생합니다. 그 후, 이온들은 고전압 환경의 존재 하에 질량분석기를 향해 가속된다.</li>
	<li>2시간 수집 실행으로 샘플을 분석합니다. 이 연구는 가장 강렬한 상위 20 개 전구체 이온 선택 패러다임을 가진 데이터 의존적 수집을 사용하여 수행됩니다. 참고: 데이터 의존적 획득에서, 제한된 수의 전구체 펩티드가 MS1 스캔에서 검출되고 MS2 분석을 위한 단편화를 거친다. 그러나, 동적 배제는 고도로 풍부한 Aβ 펩티드가 단편화를 위해 생략되고 그들의 양의 과소평가를 초래하기 때문에 여기에서 문제가 된다.</li>
	<li>Aβ 펩티드의 절대 정량화를 위해, 표적화된 MS/MS 방법을 사용하여 동일한 샘플을 한 번 더 실행한다. 이 연구를 위해, APP 녹인 마우스 모델에 대한 다양한 가능한 트립틱 Aβ 펩티드에 대한 모든 m/z 비율의 완전한 목록이 제조된다( 보충 표 1 참조). 다른 그룹은 이용가능한 마우스 모델 및 관심있는 단백질로부터 생성된 가능한 펩티드 (예를 들어, AD에 대한 Aβ)에 따라 유사한 리스트를 제조해야 한다. 참고: 고도로 풍부한 펩티드의 배제를 해결하려면, Aβ 트립틱 펩티드에 상응하는 선택된 m/z 값의 리스트를 제공함으로써 표적화된 접근법을 이용하라. 이 접근법은 Aβ 펩티드의 데이터 의존적 배제의 문제를 해결하고 높은 분해능으로 상이한 단량체 (Aβ38, 40 및 42 펩티드)의 절대 양을 정량화할 수 있다.</li>
	<li>질량 분광계는 펩티드 샘플의 MS 스펙트럼을 생성하고 원시 데이터 파일을 대상 디렉토리에 저장합니다. 이 파일을 사용하여 잘 정립 된 통계 및 생물 정보학 도구를 사용하여 스펙트럼 매칭을 수행하십시오. 여러 온라인 및 오프라인 데이터베이스 검색 및 분석 도구를 사용할 수 있습니다.</li>
</ol>8. MS 데이터 분석
<ol><li>오프라인 Rawconverter 도구 (http://www.fields.scripps.edu/rawconv/)를 사용하여 MS1 및 MS2 파일을 추출하십시오.</li>
	<li>웹 기반 MS 데이터 검색 엔진에서 데이터의 식별, 정량화 및 상세한 분석을 수행합니다. 이 연구에서는 통합 프로테오믹스 파이프라인 - IP2 (브루커: http://www.integratedproteomics.com/)가 사용되었다. 참고: 다른 여러 온라인 및 오프라인 MS 데이터 분석 도구를 사용할 수 있으며 MaxQuant (https://www.maxquant.org/)와 같은 것도 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>MS1 및 MS2 파일을 업로드한 후 업데이트된 마우스 프로테옴 데이터베이스를 선택합니다. 여기서, 추가적인 앱 넉인 특이적 돌연변이를 함유하는 업데이트된 마우스 데이터베이스가 ProLuCId 및 SEQUEST 알고리즘(11)을 사용하는 펩티드의 동정을 위해 선택된다.</li>
	<li>IP2 분석 시스템에서 기본 매개변수를 선택하고 실험 요구 사항에 따라 수정합니다. 이 연구에서, 전구체에 대해 50 ppm, 단편에 대해 600 ppm의 펩티드 질량 내성이 사용된다 (IP2에 사용된 다른 파라미터에 대해서는 보충 파일 1 참조). 참고 : 연구원은 실험 목표에 따라 검색 매개 변수를 수정할 수 있습니다. 예를 들어, 번역 후 변형을 식별하기 위해, 다양한 PTM에 대한 차등 변형 값(예를 들어, 유비퀴틴화, SUMOylation, 인산화)을 추가한다.</li>
</ol>

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<li>Espay, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+protein+aggregation+as+pathogenic+in+sporadic+Parkinson+and+Alzheimer+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Revisiting protein aggregation as pathogenic in sporadic Parkinson and Alzheimer diseases.</a> Neurology. 92 (7), 329-337 (2019).</li>
<li>Fändrich, M., Schmidt, M., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+progress+in+understanding+Alzheimer%27s+%CE%B2-amyloid+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Recent progress in understanding Alzheimer's β-amyloid structures.</a> Trends in Biochemical Sciences. 36 (6), 338-345 (2011).</li>
<li>Bonnin, E. A., Fornasiero, E. F., Lange, F., Turck, C. W., Rizzoli, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoSIMS+observations+of+mouse+retinal+cells+reveal+strict+metabolic+controls+on+nitrogen+turnover%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Molecular+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">NanoSIMS observations of mouse retinal cells reveal strict metabolic controls on nitrogen turnover.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 22 (1), 1-10 (2021).</li>
<li>Michno, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Following+spatial+A%CE%B2+aggregation+dynamics+in+evolving+Alzheimer%27s+disease+pathology+by+imaging+stable+isotope+labeling+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Following spatial Aβ aggregation dynamics in evolving Alzheimer's disease pathology by imaging stable isotope labeling kinetics.</a> Science Advances. 7 (25), (2021).</li>
<li>Toyama, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+long-lived+proteins+reveals+exceptional+stability+of+essential+cellular+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of long-lived proteins reveals exceptional stability of essential cellular structures.</a> Cell. 154 (5), 971-982 (2013).</li>
<li>Bomba-Warczak, E., Edassery, S. L., Hark, T. J., Savas, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lived+mitochondrial+cristae+proteins+in+mouse+heart+and+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Long-lived mitochondrial cristae proteins in mouse heart and brain.</a> Journal of Cell Biology. 220 (9), 202005193(2021).</li>
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아밀로이드 구조 및 구성에 대한 명확한 이해를 개발하는 것은 AD 뇌 조직16,17에서 정제 된 피브릴을 추출하는 생물학적 복잡성과 실험적 한계로 인해 구조 생물 학자 및 생화학자에게 도전적입니다. 아밀로이드 피브릴은 분자 수준에서 다형성이며, 다양한 길이와 복잡성의 이종 집단을 보여줍니다18,19. 그들의 생물학적 특징과 병리학적 관련성을 더 잘 이해하기 위해, 사후 인간 및 AD 마우스 뇌 조직으로부터 수득된 다형성 아밀로이드 피브릴의 조성에 대한 철저한 특성화가 요구된다20,21. 단백질의 큰 서브세트는 Aβ42와 직접 상호작용하는 반면, 다른 것들은 큰 피브릴라 구조 또는 단백질 복합체 <s...

아밀로이드는 단백질의 다양한 패널에서 발견되는 매우 안정적인 초분자 배열이며, 그 중 일부는 병리학 적 변화를 일으 킵니다1. 세포내 또는 세포외 아밀로이드 응집체의 축적은 몇몇 신경퇴행성 질환2에서 관찰된다. 아밀로이드 응집체는 이질적이며 많은 수의 단백질 및 지질로 풍부합니다3. 최근 몇 년 동안, 아밀로이드 프로테옴에 대한 관심은 기초 및 번역 신경 과학자들 사이에서 상당한 관심을 불러 일으켰습니다. 마우스 및 사후 인간 뇌 조직에서 아밀로이드 응집체를 추출하고 정제하기 위해 몇 가지 방법이 개발되었습니다. 레이저-포획 미세해부, 면역침전, 탈세포화 및 아밀로이드 응집체의 생화학적 분리는 아밀로이드 플라크, 피브릴 및 올리고머 4,5,6,7을 추출하고 정제하기 위해 널리 사용되는 방법이다. 이러한 연구의 대부분은 반 정량적 MS를 사용하여 이러한 단단히 포장 된 피브릴라 침전물의 단백질 조성을 결정하는 데 중점을 두었습니다. 그러나, 이용가능한 결과는 일관성이 없으며, 이전에 보고된 놀랍게도 많은 수의 공동-정제 단백질들은 해석하기 어렵다.
AD 및 AD 마우스 모델 뇌에서 아밀로이드 코어 프로테옴을 기술하는 기존 문헌의 주요 한계는 정제된 물질이 관리불가능한 수의 공동정제 단백질을 함유한다는 것이다. 이 방법의 전반적인 목표는 이러한 한계를 극복하고 아밀로이드 피브릴 코어를 분리하기위한 강력한 생화학 적 정제를 개발하는 것입니다. 이 전략은 사후 AD 인간 및 마우스 뇌 조직으로부터 SDS 불용성 농축 아밀로이드 분획을 단리하기 위해 이전에 기술된 수크로오스 밀도 구배 초원심분리 기반 생화학적 방법을 이용한다(8,9). 이 방법은 기존 문헌을 기반으로하지만 초음파 처리 및 SDS 세척을 통해 느슨하게 결합 된 아밀로이드 관련 단백질의 대부분을 제거하여 고도로 정제 된 아밀로이드 피브릴을 분리합니다 (그림 1). 이 프로토콜에 의해 정제 된 피브릴은 뇌 추출물에서 분리 된 아밀로이드 피브릴의 구조 연구에서 자주 발생하는 몇 가지 기존 문제를 극복합니다. 투과 전자 현미경 (TEM)으로 이러한 피브릴의 시각화는 정제 된 물질의 무결성과 순도를 확인합니다 (그림 2). 이 연구에서, 분리된 피브릴은 트립신을 갖는 펩티드로 가용화되고 소화되고, 표지가 없는 MS 분석은 피브릴 코어를 형성하는 단백질의 동일성을 용이하게 밝힐 수 있다. 특히, 이들 단백질 중 일부는 비막 결합 소기관에서 초분자 어셈블리를 형성하는 고유 한 경향을 가지고 있습니다. 또한, 아밀로이드 베타 (Aβ) 피브릴의 분석에서 확인 된 많은 단백질은 다른 신경 퇴행성 질환과도 관련이 있으며, 이는 이러한 단백질이 다중 단백질 병증에서 중요한 역할을 할 수 있음을 시사합니다.
이 SDS / 초음파 처리 방법은 피브릴 코어의 구조를 변경하거나 방해하지 않을 것입니다. 정제된 물질은 또한 광범위한 하향식 및 상향식 프로테오믹 분석 접근법 및 추가적인 MS 기반 구조 분석 전략, 예컨대 화학적 가교결합 또는 수소-중수소 교환에 적합하다. 이 방법을 사용하는 전체 회수율은 상대적으로 높기 때문에 정제 된 물질의 마이크로 그램 ~ 밀리그램이 필요한 상세한 구조 연구에 적합합니다. 정제된 물질은 또한 cryoEM 및 원자력 현미경을 이용한 구조 연구에 적합하다. 이 프로토콜은, 포유동물의 안정한 동위원소 표지와 조합하여, 아밀로이드 구조(10)의 고체 핵 자기 공명(NMR) 연구를 촉진할 수 있다.

<table><tbody><tr><td>Acclaim PepMap 100 C18 HPLC 컬럼 0.075 mm x 20&nbsp; mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>164535</td><td>다른 제조업체의 대체 기기, 화학 물질 및 항체를 사용할 수 있습니다</td></tr>: <tr><td>Ammonium bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9830</td><td></td></tr><tr><td>anti-amyloid beta (1-16) 6E10 항체</td><td>Biolegend</td><td>803001</td><td></td></tr><tr><td>anti-amyloid beta (17-24) 4G8 항체</td><td>Biolegend</td><td>800701</td><td></td></tr><tr><td>anti-amyloid beta (N terminus 82E1) 항체</td><td>IBL America</td><td>10323</td><td></td></tr><tr><td>anti-amyloid fibril LOC 항체</td><td>&nbsp; EMD Millipore</td><td>AB2287</td><td></td></tr><tr><td>BCA 키트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor Pico Plus</td><td>Diagenode</td><td>B01020001</td><td></td></tr><tr><td>칼슘 클로라이드</td><td>시그마-알드리치</td><td>&nbsp; C1016</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐분해효소</td><td>시그마-알드리치</td><td>C0130</td><td></td></tr><tr><td>완료&nbsp; 프로테아제 억제제 칵테일</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11697498001</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EN0521</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>구아니딘 염산염</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4505</td><td></td></tr><tr><td>HyperSep C18 카트리지</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>60108-302</td><td></td></tr><tr><td>통합 단백질체학 파이프라인 - IP2&nbsp;</td><td>http://www.integratedproteomics.com/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Iodoacetamide (IAA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>K54 조직 균질화 시스템 모터</td><td>Cole Parmer</td><td>Glas-Col 099C</td><td></td></tr><tr><td>MaxQuant</td><td>https://www.maxquant.org/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Micro BCA 키트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>Nanoviper 75 &mu; 남 x 50&nbsp; cm</td><td>Thermo Scientific</td><td>164942</td><td></td></tr><tr><td>Optima L-90K 초원심분리기</td><td>Beckman Coulter</td><td>BR-8101P-E</td><td></td></tr><tr><td>Orbitrap Fusion Tribrid질량분석기</td><td>Thermo Scientific</td><td>IQLAAEGAAPfadbmbcx</td><td></td></tr><tr><td>Pierce C18 스핀 컬럼</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89870</td><td></td></tr><tr><td>Precellys 24 조직 균질화 장치</td><td>Bertin Instruments</td><td>P000062-PEVO0-A</td><td></td></tr><tr><td>ProteaseMAX(TM) 계면활성제 트립신 인핸서</td><td>Promega</td><td>V2072</td><td></td></tr><tr><td>RawConverter</td><td>http://www.fields.scripps.edu/rawconv/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>아지드화나트륨</td><td>VWR</td><td>97064-646</td><td></td></tr><tr><td>도데실황산나트륨(SDS)</td><td>시그마-알드리치</td><td>74255</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend Micro 21R 마이크로 원심분리기</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>75002446</tr><tr><td>속도 진공 농축기</td><td>Labconco</td><td>7315021</td><td></td></tr><tr><td>Tris-2-carboxyethylphosphine (TCEP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4706-2G</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15568025</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin Gold-Mass Spec grade</td><td>Promega</td><td>V5280</td><td></td></tr><tr><td>UltiMate 3000 RSLCnano System</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td>ULTIM3000RSLCNANO</tr></tbody></table>

뇌에서 아밀로이드 피브릴 코어의 생화학 적 정제 및 프로테오믹 특성화

Biochemical Purification and Proteomic Characterization of Amyloid Fibril Cores from the Brain

단백질성 섬유소 내포물은 다수의 신경 퇴행성 질환의 주요 병리학적 특징이다. 알츠하이머 병 (AD)의 초기 단계에서 아밀로이드 베타 펩티드는 세포외 공간에서 프로토 피브릴을 형성하며, 이는 점차 성장하고 큰 아밀로이드 플라크로 성숙하는 씨앗 역할을합니다. 이러한 기본적인 이해에도 불구하고, 뇌의 아밀로이드 피브릴 구조, 조성 및 증착 패턴에 대한 현재의 지식은 제한적입니다. 한 가지 주요 장벽은 뇌 추출물에서 고도로 정제 된 아밀로이드 피브릴을 분리 할 수 없다는 것입니다. 친화성 정제 및 레이저 포획 미세해부-기반 접근법은 이전에 아밀로이드를 분리하기 위해 사용되어 왔지만 회수될 수 있는 소량의 물질에 의해 제한된다. 이 새롭고 강력한 프로토콜은 수크로오스 밀도 구배 초원심분리 및 초음파처리를 통한 소듐 도데실 설페이트 (SDS) 가용화를 사용하여 아밀로이드 플라크 코어의 생화학 적 정제를 설명하고 AD 환자 및 AD 모델 뇌 조직으로부터 고순도 피브릴을 산출합니다. 질량 분광법 (MS)-기반 정제된 물질의 상향식 프로테오믹 분석은 아밀로이드 피브릴의 거의 모든 일차 단백질 성분을 확인하기 위한 강력한 전략을 나타낸다. 아밀로이드 코로나에서 단백질에 대한 이전의 프로테오믹 연구는 예기치 않게 크고 기능적으로 다양한 단백질 모음을 밝혀 냈습니다. 주목할 만하게, 정제 전략을 정제한 후, 공동정제 단백질의 수가 10배 이상 감소하였고, 이는 단리된 SDS 불용성 물질의 고순도를 나타낸다. 음성 염색 및 면역-금 전자 현미경 검사는 이들 제제의 순도의 확인을 허용하였다. 이들 단백질을 아밀로이드 내포물로의 침착에 기여하는 공간적, 생물학적 특성을 이해하기 위해서는 더 많은 연구가 필요하다. 종합하면,이 분석 전략은 아밀로이드 생물학에 대한 이해를 높이기 위해 좋은 위치에 있습니다.

여기서, 변형된 수크로오스 밀도 구배 초원심분리 정제 방법을 이용한 아밀로이드 피브릴의 분리 및 정제를 위한 상세한 방법이 요약되어 있다( 도 1 참조). 이 방법의 혁신은 수조 초음파 처리 시스템을 사용한 초음파 처리 기반 세척 단계와 SDS 가용화 단계를 포함하는 것이며, 이는 고밀도의 깨끗한 피브릴과 공동 정제하는 아밀로이드 피브릴에서 느슨하게 관련된 많은 단백질을 제거합니다. 초음파 처리 단계는 높은 전단력을 생성하고 피브릴을 교반하여 소수성을 느슨하게하고 SDS 용해성 느슨하게 관련된 단백질을 SDS 세척 버퍼로 방출합니다. 차례로, 소량의 매우 순수한 아밀로이드 피브릴 코어가 회수됩니다. 도 2A에 도시된 바와 같이, 초기에 불투명하게 나타나는 가시적 펠릿(아마도 불순물로 인해)은 농축 후에 보여질 수 있다; 그러나 초음파 처리 및 여러 SDS 세척 후 펠릿은 반투명하게 변하고 거의 보이지 않습니다. 정제된 아밀...

질량 분광법 기반 프로테오믹 분석을 통한 이 생화학적 정제 방법은 아밀로이드 피브릴 코어의 강력한 특성화를 용이하게 하며, 이는 알츠하이머병 예방을 위한 표적의 식별을 가속화할 수 있다.

Proteinaceous fibrillar inclusions are key pathological hallmarks of multiple neurodegenerative diseases. In the early stages of Alzheimer&#39;s disease ...

아밀로이드 플라크는 알츠하이머 병의 진단에 필요합니다. 그러나 그들은 충분하지 않습니다. 이 사실에도 불구하고, 그들은 부분적으로 그들의 내용을 특성화하는 데 어려움을 겪기 때문에 수수께끼로 남아 있습니다.우리의 프로토콜은 고순도에서 아밀로이드 피브릴을 분리하는 데 매우 효율적이며 구조 및 구성의 미세한 세부 사항을 이해하는 데 매우 적합합니다. 아밀로이드 플라크의 단백질 함량을 알면 축적을 지연, 간섭 또는 예방할 수있는 치료 개입의 표적을 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다. 따라서 질병 발병을 지연시킵니다.이 방법은 퇴화 된 뇌 조직 및 다른 단백질 경로의 단백질 응집체에서 단백질 침전물을 추출하는 데 매우 적합합니다. 갓 해부되거나 스냅 냉동 된 뇌 조직 영역을 갓 준비된 얼음 냉간 균질화 버퍼에 여섯 ~ 여덟 개의 세라믹 비드가 들어있는 두 밀리리터 튜브에 배치하여 시작하십시오. 그 후 비드 밀 호모게나이저를 이용하여 4, 000 rpm에서 30초 온 및 오프 펄스의 두 사이클로 조직을 분쇄한다.이제 9 밀리리터의 얼음 차가운 균질화 버퍼를 1 밀리리터의 뇌 조직 균질 물과 15 밀리리터 튜브에 추가하고 실험실 왁스 필름 스트립으로 밀봉하십시오. 견고한 가용화를 보장하려면 튜브를 섭씨 네 도에서 밤새 회전시키십시오. 다음날, 고체 수크로스를 조직 추출물 현탁액에 첨가하여 1.2 몰의 최종 농도로 한다.잘 섞고 원심분리기는 섭씨 4도에서 45분 동안 250, 000 x g를 가졌다. 상청액을 폐기한 후, 펠렛을 섭씨 4도에서 45분 동안 125, 000 x g에서 분쇄하고 원심분리하여 1.9몰 수크로스를 함유하는 균질화 완충액 2밀리리터에 재현탁시킨다. 원심분리 후 상단 백색 고체층을 신선한 튜브로 옮기고 얼음 냉간 세척 완충액 한 밀리리터를 가용화하여 여러 번 위아래로 펫팅합니다.펠릿은 또한 아밀로이드 피브릴로 풍부하기 때문에, 수성 중간층을 버리고 펠릿을 더 높은 수율을 위해 최상층과 결합시킨다. 합한 분획을 섭씨 4도에서 20분 동안 8, 000 x g에서 원심분리한다. 상청액을 폐기한 후, 펠렛을 얼음 냉 소화 완충액 한 밀리리터에 재현탁시키고, 볼텍스 상에서 세 시간 동안 실온에서 인큐베이션한다.샘플을 다시 원심분리하고, 펠렛을 얼음 차가운 트리스 완충액 한 밀리리터에서 두 번 세척한 다음, 다시 원심분리한다. 두 번째 세척 후, 펠렛을 상하로 피펫팅하여 가용화 완충액 한 밀리리터에 재현탁시키고, 섭씨 4도에서 60분 동안 200, 000 x g에서 튜브를 신속하게 원심분리한다. 펠렛을 저장하고, 이어서 상청액에 50 밀리몰 트리스 완충액을 첨가함으로써 수크로오스 농도를 1.3 몰에서 1몰로 감소시킨다.상청액을 다시 원심분리한 다음, 0.5%SDS를 함유하는 펠릿 및 100 마이크로리터의 트리스 완충액을 모두 용해시킨다. 아밀로이드 정제를 위해, 20 사이클 동안 욕조 초음파 처리 장치에서 초음파를 사용하여 아밀로이드가 풍부한 펠릿을 가용화 한 다음 즉시 섭씨 4도에서 30 분 동안 20, 000 x g에서 물질을 원심분리합니다. 펠렛을 0.5%SDS Tris 완충액의 500 마이크로리터에 재현탁시키고 네 번 더 세척을 반복하고, 최종 원심분리 단계 후, 펠렛을 200 마이크로리터의 초순수로 세척하고 섭씨 4도에서 30분 동안 원심분리 20, 000 x g로 세척하여 남아있는 세제를 제거하였다.정제된 아밀로이드 피브릴을 함유하는 최종 펠렛을 100 마이크로리터의 초순수에 용해시킨다. 정제된 100 마이크로리터의 아밀로이드 피브릴을 400 마이크로리터의 메탄올에 녹이고 잘 와류시킨다. 그런 다음 100 마이크로 리터의 클로로포름과 와류를 다시 섞으십시오.다음으로 300 마이크로 리터의 초순수와 와류를 철저히 첨가하십시오. 실온에서 2분 동안 12, 000 x g에서 원심분리한 후, 단백질 플레이크를 함유하는 계면층을 방해하지 않고 상부 수성층을 조심스럽게 제거하고 동일한 부피의 메탄올을 다시 첨가한다. 원심분리를 반복하고, 상층액을 버리고 펠렛을 공기 건조시킨다.소화를 위해 펠렛을 50 마이크로 리터의 구아니딘 염산염 완충액에 녹이고 얼음 차가운 물 욕조에서 초음파 처리하십시오. 그런 다음 실온에서 45 분에서 한 시간 동안 완전히 와류하고 0.2 % 계면 활성제 용액 50 마이크로 리터를 넣고 다시 60 분 동안 와류하십시오. 다음으로, 500 밀리몰 TCEP의 한 마이크로리터를 첨가하고, 60분 동안 인큐베이션한다.그런 다음 500 밀리몰의 요오도아세트아미드 2 마이크로리터를 첨가하고 어둠 속에서 20분 동안 배양한다. 인큐베이션 후, 요오도아세트아미드를 5마이크로리터의 TCEP 용액으로 15분 동안 켄칭한다. 다음으로, 필요한 부피의 50 밀리몰 암모늄 중탄산염 용액을 튜브에 첨가하여 구아니딘 농도를 1.5 몰로 줄입니다.또한 튜브에 1 % 계면 활성제 용액을 첨가하십시오. 그런 다음 트립신을 넣고 튜브를 섭씨 37도에서 밤새 혼합하십시오. 다음날, 소화된 펩티드 용액에 포름산을 첨가하여 pH를 2.0으로 낮춘 다음, 200 마이크로리터의 50%메탄올 용액을 첨가하고, 실온에서 2분 동안 1500 x g에서 방사함으로써 C18 스핀 컬럼을 활성화시킨다.다음에, 200 마이크로리터의 평형화 완충액을 첨가하고, 2분 동안 다시 방사함으로써 C18 컬럼 수지 베드를 평형화시킨다. 평형화 후, 산성화된 펩티드 용액을 C18 컬럼에 로딩하고, 실온에서 2분 동안 1500 x g에서 원심분리한다. 흐름을 다시 로드하고, 열을 회전하고, 두 번째 흐름을 버립니다.그런 다음 C18 수지에 결합된 펩티드를 세척 완충액으로 두 번 세척한다. 40 마이크로리터의 용출 완충액을 첨가하고 컬럼을 원심분리하여 펩티드를 세 번 에루팅한다. 펩티드를 수성 용액을 증발시킴으로써 진공 농축기에서 빠르게 건조시킨다.건조 펠릿은 MS 분석 전에 몇 주 동안 섭씨 20도에서 저장할 수 있습니다. 정제된 아밀로이드의 콩고 레드 염색은 SDS 가용성 분획과 비교하여 아밀로이드 피브릴의 농축을 문서화한다. SDS 가용성 분획은 아밀로이드의 존재를 나타내지 않았다.정제된 피브릴의 구조는 거의 순수한 아밀로이드 피브릴의 존재를 확인하였다. 또한, 면역금 표지는 아밀로이드 베타-42 펩티드의 존재를 확인하였다. 항-아밀로이드 베타-42 및 항-피브릴 항체를 사용한 염색은 피브릴에서 아밀로이드 베타-42 펩티드의 상대적 풍부함을 보여주었다.정제된 아밀로이드 분획은 대략 250개의 단백질의 존재를 보인 반면, 초음파 처리 및 SDS 세척 전에 수집된 분획은 2, 500개 이상의 단백질을 함유하였다. 피브릴 코어는 비막 결합 소기관 및 초분자 복합체와 관련된 단백질의 풍부함을 나타냈다. 아밀로이드는 낮은 풍부 종이며, 아마도 뇌 조직의 밀리그램 당 몇 피코그램에서 몇 마이크로 그램까지입니다.따라서 레이어, 팔레트를 집어 들거나 상청액을 버리는 동안 매우 조심해야합니다. 이 기술의 개발로 이제 초기 아밀로이드 종자와 관련된 단백질을 더 자신있게 식별하고 구조를 특성화하며 치료 개입을 목표로 삼을 수 있습니다. 따라서이 치명적인 질병의 발병을 예방하십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

우리는 명확히 인간 대뇌 피질 homogenates, SDS - PAGE로 단백질 분리, 항원 검색 및 Aβ 펩타이드에 대한 항체와 immunoblotting의 준비를위한 기술을 설명합니다. 이 프로토콜을 사용하여, 우리는 지속적으로 알츠하이머의 병리 현상과 인간의 대뇌 피질 조직에서 monomeric 및 multimeric Aβ를 감지합니다.

인간의 두피 조직에서 Aβ Multimers의 SDS-PAGE/Immunoblot 감지는 항원 에피토프 검색을 사용 Homogenates

APP 세포 도메인 (AICD)의 대규모 정화하기위한 방법이 설명되어 있습니다. 우리는 또한 유도하는 방법을...

아밀로이드 전구체 단백질 세포 내 도메인의 정화 및 집계

이 비디오는 비아밀로이드 단백질의 밀도 구배 원심분리 및 분해를 사용하여 마우스 뇌 조직 추출물에서 아밀로이드 원섬유를 분리하는 프로토콜을 보여줍니다.

뇌 조직 추출물에서 아밀로이드 섬유의 분리

인간과 쥐의 뇌 조직을위한 요소 / 티오 / SDS 버퍼를 사용하는 일반적인 단백질 추출 프로토콜은 허용 2D-DIGE 미니 2DE의 면역 블롯에 의해 그들의 연속 특성에 의한 단백질의 indentification. 이 방법은 인간의 조직 검사 및 실험 모델에서 더 많은 재현성 및 신뢰성있는 결과를 얻기 위해 하나를 할 수 있습니다.

합의 뇌 유래 단백질, 2D-DIGE 미니 2DE 면역 블롯을 모두 사용하여 인간과 쥐과 뇌 프로테옴 연구를 위해 추출 프로토콜

여기에서는 사후 인간 뇌 조직에서 점점 더 불용성/응집된 알파-시누클레인(α-syn)을 분리하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 세제 강도가 증가하는 완충액과 고속 초원심분리 기술을 통해 병든 조직과 그렇지 않은 조직에서 α-syn 응집의 다양한 특성을 검사할 수 있습니다.

파킨슨 뇌에서, 수용성 알파 시누 클레인의 순차 추출

여기에서 우리는 올리고머 형성이 가능한 고순도 아밀로이드 베타 42(Aβ42) 및 아밀로이드 베타 40(Aβ40) 펩타이드를 생성하는 맞춤형 HPLC 정제 프로토콜을 보고합니다. 아밀로이드 베타는 알츠하이머병과 관련된 응집이 잘 되는 소수성 펩타이드입니다. 펩타이드의 아밀로이드 생성 특성은 정제를 어렵게 만듭니다.

맞춤형 HPLC 정화 프로토콜 즉, 올리고머 형성 할 수있는 수율 고순도 아밀로이드 베타 42과 아밀로이드 베타 펩티드 (40),

인간의 사후 뇌에서 세제 불용 성 단백질의 농축에 대 한 약식된 분류 프로토콜 설명 되어 있습니다.

인간의 사후 뇌에서 세제 불용 성 단백질의 농축

매트릭스 보조 레이저 탈 착/이온화 기반 이미징 질량 분석기 (MALDI-IMS)와 분자 이미징 생물 학적 샘플에서 여러 analytes의 동시 매핑을 수 있습니다. 여기, 선물이 Alzheimer의 질병과 MALDI IMS를 사용 하 여 대뇌 아 밀 로이드 angiopathy 샘플의 뇌 조직에 감지 및 아 밀 로이드 β 단백질의 시각화에 대 한 프로토콜.

매트릭스 보조 레이저 탈 착/이온화 질량 분석 이미징와 인간의 뇌에서 아 밀 로이드 β 예금의 시각화

여기에 제시 된 분석 섬유 소 혈전 구조에 베타-아 밀 로이드의 효과 개별적으로 또는 조합에서 사용할 수 있는 두 가지 방법이 있습니다. 생체 외에서 섬유 소 혈전, 만드는 뒤에 병 탁도 및 스캐닝 전자 현미경 검사 법 방법 포함 된 프로토콜이입니다.

분광학 그리고 스캐닝 전자 현미경 검사 법에 의해 섬유 소 혈전 구조에 β 아 밀 로이드 유도 비정상의 분석

여기에 제공된 것은 다른 조직과 뇌의 다양한 영역에서 분리된 미토콘드리아를 가진 다른 펩티드 및 단백질의 네이티브 형태, 프리피릴라 및 성숙한 아밀로이드 섬유사이의 상호작용을 조사하기 위한 프로토콜이다.

아밀로이드 피브릴스뇌 미토콘드리아의 상호 작용 및 막 관과화

본 연구는 GFAP와 그 병을 유발하는 돌연변이를 생화학적으로 특성화하기 위한 실험적 방법을 개략적으로 제시하며, 필라멘트 조립, 응집, 번역 후 변형에 중점을 둡니다. 고순도 GFAP 단백질을 분석하여 알렉산더병 기전에 대한 통찰을 밝혀내어 잠재적 치료 표적 연구와 GFAP 돌연변이 및 관련 질환 이해에 대한 틀을 제공하였습니다.

교세포섬유산성 단백질 및 그 질병 관련 변이체의 생화학적 분석에 대한 실험적 접근법

학습하세요 아밀로이드 피브릴의 생화학적 정제 및 질량분석 기반 프로테오믹스 방법을 활용하여 알츠하이머병 진단에 필수적인 아밀로이드 플라크의 구조와 구성을 정밀 분석하는 기술을.

뇌에서 아밀로이드 피브릴 코어의 생화학 적 정제 및 프로테오믹 특성화

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