Name: Sf9 정제 초공정 키네신-3 제품군 모터의 단일 분자 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: 배우세요 Sf9 박테리오바이러스 발현 시스템을 이용한 키네신-3 모터 단백질 정제 및 단일 분자 운동성 분석 방법을. 이 프로토콜은 세포 내 물질 수송 메커니즘 연구에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

V.S.와 P.S. Kristen J. Verhey 교수 (미시간 대학교, 앤아버, 미시건, 미국)와 Roop Mallik 교수 (인도 뭄바이의 인도 봄베이 공과 대학 (IITB))에게 연구 전반에 걸친 무조건적인 지원에 감사드립니다. 추신 : 프로젝트 전반에 걸쳐 그녀의 지원에 대해 Sivapriya Kirubakaran 박사에게 감사드립니다. VS는 DBT(보조금 번호: BT/PR15214/BRB/10/1449/2015 및 BT/RLF/재진입/45/2015) 및 DST-SERB(보조금 번호: ECR/2016/000913)를 통한 자금 지원을 인정합니다. PKN은 자금 조달을 위해 ICMR을 인정합니다 (보조금 번호 5 / 13 / 13 / 2019 / NCD-III). 추신 : DST (보조금 번호 : SR / WOS-A / LS-73 / 2017)의 자금 지원을 인정합니다. DJS는 IIT Gandhinagar의 친목을 인정합니다.

<ol><li>Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+motor+toolbox+for+intracellular+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The molecular motor toolbox for intracellular transport.</a> Cell. 112, 467-480 (2003).</li>
<li>Miki, H., Okada, Y., Hirokawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+kinesin+superfamily%3A+insights+into+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of the kinesin superfamily: insights into structure and function.</a> Trends in Cell Biology. 15 (9), 467-476 (2005).</li>
<li>Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+motors+in+neurons%3A+transport+mechanisms+and+roles+in+brain+function%2C+development%2C+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease.</a> Neuron. 68 (4), 610-638 (2010).</li>
<li>Hirokawa, N., Takemura, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+motors+and+mechanisms+of+directional+transport+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Molecular motors and mechanisms of directional transport in neurons.</a> Nature Reviews Neuroscience. 6 (3), 201-214 (2005).</li>
<li>Patel, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KIF13A+motors+are+regulated+by+Rab22A+to+function+as+weak+dimers+inside+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Advances%22%5BJournal%5D)">KIF13A motors are regulated by Rab22A to function as weak dimers inside the cell.</a> Scientific Advances. 7 (6), (2021).</li>
<li>Franker, M. A., Hoogenraad, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-based+transport+-+basic+mechanisms%2C+traffic+rules+and+role+in+neurological+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Science%22%5BJournal%5D)">Microtubule-based transport - basic mechanisms, traffic rules and role in neurological pathogenesis.</a> Journal of Cellular Science. 126, Pt 11 2319-2329 (2013).</li>
<li>Gunawardena, S., Anderson, E. N., White, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+transport+and+neurodegenerative+disease%3A+vesicle-motor+complex+formation+and+their+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Degernative+Neurological+and+Neuromuscular+Disease%22%5BJournal%5D)">Axonal transport and neurodegenerative disease: vesicle-motor complex formation and their regulation.</a> Degernative Neurological and Neuromuscular Disease. 4, 29-47 (2014).</li>
<li>Rath, O., Kozielski, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesins+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Kinesins and cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 12 (8), 527-539 (2012).</li>
<li>Wang, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KIF14+promotes+cell+proliferation+via+activation+of+Akt+and+is+directly+targeted+by+miR-200c+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">KIF14 promotes cell proliferation via activation of Akt and is directly targeted by miR-200c in colorectal cancer.</a> International Journal of Oncology. 53 (5), 1939-1952 (2018).</li>
<li>Guo, S. K., Shi, X. X., Wang, P. Y., Xie, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Run+length+distribution+of+dimerized+kinesin-3+molecular+motors%3A+comparison+with+dimeric+kinesin-1%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Run length distribution of dimerized kinesin-3 molecular motors: comparison with dimeric kinesin-1.</a> Scientific Reports. 9 (1), 16973(2019).</li>
<li>Scarabelli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+processivity+determinants+of+the+Kinesin-3+motor+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Mapping the processivity determinants of the Kinesin-3 motor domain.</a> Biophysical Journal. 109 (8), 1537-1540 (2015).</li>
<li>Soppina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dimerization+of+mammalian+kinesin-3+motors+results+in+superprocessive+motion%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dimerization of mammalian kinesin-3 motors results in superprocessive motion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (15), 5562-5567 (2014).</li>
<li>Soppina, V., Verhey, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+family-specific+K-loop+influences+the+microtubule+on-rate+but+not+the+superprocessivity+of+kinesin-3+motors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+Cell%22%5BJournal%5D)">The family-specific K-loop influences the microtubule on-rate but not the superprocessivity of kinesin-3 motors.</a> Molecular Biology Cell. 25 (14), 2161-2170 (2014).</li>
<li>Soppina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin-3+motors+are+fine-tuned+at+the+molecular+level+to+endow+distinct+mechanical+outputs%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Kinesin-3 motors are fine-tuned at the molecular level to endow distinct mechanical outputs.</a> BMC Biology. , (2022).</li>
<li>Korten, T., Chaudhuri, S., Tavkin, E., Braun, M., Diez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin-1+Expressed+in+insect+cells+improves+microtubule+in+vitro+gliding+performance%2C+long-term+stability+and+guiding+efficiency+in+nanostructures%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Nanobioscience%22%5BJournal%5D)">Kinesin-1 Expressed in insect cells improves microtubule in vitro gliding performance, long-term stability and guiding efficiency in nanostructures.</a> IEEE Transactions on Nanobioscience. 15 (1), 62-69 (2016).</li>
<li>Schmidt, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+expression+systems+in+the+pharmaceutical+industry%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Recombinant expression systems in the pharmaceutical industry.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 65 (4), 363-372 (2004).</li>
<li>Kurland, C., Gallant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Errors+of+heterologous+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinions+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Errors of heterologous protein expression.</a> Current Opinions in Biotechnology. 7 (5), 489-493 (1996).</li>
<li>Tao, L., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+assay+of+mitotic+motors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Purification and assay of mitotic motors.</a> Methods. 51 (2), 233-241 (2010).</li>
<li>Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baculovirus+as+versatile+vectors+for+protein+expression+in+insect+and+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells.</a> Nature Biotechnology. 23 (5), 567-575 (2005).</li>
<li>Felberbaum, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+baculovirus+expression+vector+system%3A+A+commercial+manufacturing+platform+for+viral+vaccines+and+gene+therapy+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">The baculovirus expression vector system: A commercial manufacturing platform for viral vaccines and gene therapy vectors.</a> Biotechnology Journal. 10 (5), 702-714 (2015).</li>
<li>Kumar, N., Pandey, D., Halder, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKumar%2C+N+%22Trends+in+Insect+Molecular+Biology+and+Biotechnology%22">Trends in Insect Molecular Biology and Biotechnology</a>. Kumar, D., Gong, C. , Springer International Publishing. 163-191 (2018).</li>
<li>Nagano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+fluorescent+probes+for+bioimaging+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Japan+Academy.+Series+B.+Physical+and+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Development of fluorescent probes for bioimaging applications.</a> Proceedings of the Japan Academy. Series B. Physical and Biological Sciences. 86 (8), 837-847 (2010).</li>
<li>Hassan, M., Klaunberg, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomedical+applications+of+fluorescence+imaging+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Biomedical applications of fluorescence imaging in vivo.</a> Comparative Medicine. 54 (6), 635-644 (2004).</li>
<li>Yang, Z., Samanta, S., Yan, W., Yu, B., Qu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+microscopy+for+biological+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Super-resolution microscopy for biological imaging.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 3233, 23-43 (2021).</li>
<li>Ettinger, A., Wittmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+live+cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescence live cell imaging.</a> Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).</li>
<li>Waters, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Live-cell fluorescence imaging.</a> Methods in Cell Biology. 114, 125-150 (2013).</li>
<li>Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contribution+of+reactive+oxygen+species+to+the+photobleaching+of+organic+fluorophores%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemistry+and+Photobiology%22%5BJournal%5D)">The contribution of reactive oxygen species to the photobleaching of organic fluorophores.</a> Photochemistry and Photobiology. 90 (2), 448-454 (2014).</li>
<li>Wojtovich, A. P., Foster, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+ROS+production%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of ROS production.</a> Redox Biology. 2, 368-376 (2014).</li>
<li>Cai, D., Verhey, K. J., Meyhofer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+single+Kinesin+molecules+in+the+cytoplasm+of+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Tracking single Kinesin molecules in the cytoplasm of mammalian cells.</a> Biophysical Journal. 92 (12), 4137-4144 (2007).</li>
<li>Bohm, K. J., Stracke, R., Baum, M., Zieren, M., Unger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+temperature+on+kinesin-driven+microtubule+gliding+and+kinesin+ATPase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Effect of temperature on kinesin-driven microtubule gliding and kinesin ATPase activity.</a> FEBS Letters. 466, 59-62 (2000).</li>
<li>Porter, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+microtubule+movement+produced+by+sea+urchin+egg+kinesin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of the microtubule movement produced by sea urchin egg kinesin.</a> The Journal of Biological Chemistry. 262 (6), 2794-2802 (1987).</li>
<li>Muyldermans, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanobodies%3A+natural+single-domain+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Nanobodies: natural single-domain antibodies.</a> Annual Review of Biochemistry. 82, 775-797 (2013).</li>
<li>Verma, S., Kumar, N., Verma, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+paclitaxel+on+critical+nucleation+concentration+of+tubulin+and+its+effects+thereof%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Role of paclitaxel on critical nucleation concentration of tubulin and its effects thereof.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 478 (3), 1350-1354 (2016).</li>
<li>Parness, J., Horwitz, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taxol+binds+to+polymerized+tubulin+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Taxol binds to polymerized tubulin in vitro.</a> Journal of Cell Biology. 91 (2), 479-487 (1981).</li>
<li>Schiff, P. B., Fant, J., Horwitz, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promotion+of+microtubule+assembly+in+vitro+by+taxol%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Promotion of microtubule assembly in vitro by taxol.</a> Nature. 277 (5698), 665-667 (1979).</li>
<li>Kato, T., Kageshima, A., Suzuki, F., Park, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+purification+of+human+%28pro%29renin+receptor+in+insect+cells+using+baculovirus+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Expression and purification of human (pro)renin receptor in insect cells using baculovirus expression system.</a> Protein Expression and Purification. 58 (2), 242-248 (2008).</li>
<li>Liu, F., Wu, X., Li, L., Liu, Z., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+baculovirus+expression+system+for+generation+of+virus-like+particles%3A+successes+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Use of baculovirus expression system for generation of virus-like particles: successes and challenges.</a> Protein Expression and Purification. 90 (2), 104-116 (2013).</li>
<li>Terpe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+tag+protein+fusions%3A+from+molecular+and+biochemical+fundamentals+to+commercial+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 60 (5), 523-533 (2003).</li>
<li>Huang, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomal+paclitaxel+induces+fewer+hematopoietic+and+cardiovascular+complications+than+bioequivalent+doses+of+Taxol%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">Liposomal paclitaxel induces fewer hematopoietic and cardiovascular complications than bioequivalent doses of Taxol.</a> International Journal of Oncology. 53 (3), 1105-1117 (2018).</li>
</ol>

저자는 선언 할 경쟁 재정적 이익이 없습니다.

Sf9-바쿨로바이러스 발현 시스템은 고처리량 단백질 생산을 위한 가장 다재다능하고 성공적인 방법 중 하나입니다 19,36,37. Sf9 세포의 번역후 변형 능력은 포유동물 시스템(15)과 매우 유사하다. 이 시스템을 사용할 때의 상당한 단점은 느리고 오염에 민감하다는 것입니다. 가장 중요한 단계 중 하나는 Sf9 세포에서 효율적인 감염과 성공적인 발현이며, 이는 오염 없이 Sf9 세포의 적절한 취급 및 유지가 필요합니다. 이 시스템에는 먼지가 없는 전용 공간과 온도 제어 인큐베이터 및 셰이커와 같은 기기가 필요합니다. 불규칙한 세포 배양 관행과 자란 배양의 사용은 감염 불량, 느린 성장 및 심각한 세포 사멸을 초래할 것입니다.
Sf9 세포에서 발현되는 단백질의 FLAG 태...

엄청나게 붐비는 세포 환경은 예정된 단백질과 분자를 분류하는 데 많은 문제를 제기합니다. 세포질 내 분자의 조직과 시공간 분포의 이러한 강렬한 작업량은 분자 모터와 세포 골격 트랙에 의해 촉진됩니다. 분자 모터는 ATP와 같은 에너지 통화를 가수분해하고 운동 및 힘 생성중에 해당 에너지를 활용하는 효소입니다1. 아미노산 서열 유사성에 따라 키네신은 14 개의 패밀리로 그룹화되며 이러한 유사성에도 불구하고 각 모터는 세포의 기능에 고유하게 기여합니다. Kinesin-3 제품군 모터는 소포 수송, 신호 전달, 유사분열, 핵 이동 및 발달 3,4,5를 포함한 다양한 세포 및 생리적 기능과 관련된 5개의 하위 패밀리(KIF1, KIF13, KIF14, KIF16 및 KIF28)2로 구성된 가장 큰 모터 중 하나입니다. 키네신-3 수송 기능의 손상은 많은 신경퇴행성 장애, 발달 결함 및암 질환과 관련이 있습니다6,7,8,9.
최근 연구에 따르면 키네신-3 모터는 단량체이지만 화물 유도 이량체화를 거쳐 기존 키네신10,11,12,13에 비해 빠르고 초공정 운동성을 초래합니다. 그들의 생화학 적 및 생물 물리학 적 특성화에는 많은 양의 정제 된 활성 단백질이 필요합니다. 그러나, 원핵 생물 발현 시스템에서의 이들의 생산은 아마도 호환되지 않는 단백질 합성, 접힘 및 변형 기계 14,15,16,17,18로 인해 비활성 또는 응집 된 모터를 초래했다. 이러한 한계를 우회하고 수율을 높이기 위해 여기에서 우리는 이러한 모터를 발현하고 정제하는 강력한 Sf9-baculovirus 발현 시스템을 구축했습니다.
바쿨로바이러스 발현 시스템은 Sf9 곤충 세포주를 고처리량 진핵생물 재조합 단백질 발현19,20을 위한 숙주 시스템으로 사용합니다. Baculovirus는 이종 유전자 발현 및 가용성 재조합 단백질17의 생산을 돕는 강력한 다면체 프로모터를 보유한다. 비용 효율성, 취급 안전성 및 다량의 활성 단백질 발현으로 인해 강력한 도구21이되었습니다. 관심있는 단백질을 발현하기 위해, 핵심 단계는 재조합 bacmid를 생성하는 것이다. 상업적으로 이용 가능한 bacmid 생성 키트는 비싸고 더 많은 샘플로 작업 할 것이기 때문에 우리는 bacmids에 kinesin-3 모터의 크고 작은 삽입물 모두를위한 사내 프로토콜을 개발했습니다. Sf9-정제된 키네신-3 모터는 전반사 형광(TIRF) 현미경을 사용하여 시험관 내 단일 분자 및 다중 모터 미세소관 글라이딩 특성을 특성화하는 데 사용되었습니다. 모터는 향상된 신호를 제공하고 광퇴색을 줄이기 위해 3-직렬 형광 분자(3xmCit)로 C 단자 태그가 지정됩니다. TIRF 이미징은 증가 된 신호 대 잡음비, 적은 광독성 및 커버 슬립에 가까운 매우 작은 영역의 선택적 이미징으로 인해 생체 내 및 시험관 내에서 단일 분자 수준에서 단백질 역학을 시각화하는 데 널리 사용되었습니다.
이 연구는 Sf9-바쿨로바이러스 발현 시스템과 TIRF 현미경을 사용한 모터의 체외 단일 분자 이미징 및 다중 모터 글라이딩 분석을 사용하여 키네신-3 모터의 정제에 대해 논의합니다. 전체적으로, 이 연구는 Sf9 정제된 모터의 운동성 특성이 포유류 세포 용해물로부터 제조된 모터의 그것과 동일하다는 것을 보여준다. 따라서 우리는 Sf9-baculovirus 시스템이 관심있는 모든 운동 단백질을 발현하고 정제하도록 적응할 수 있다고 믿습니다.

<table><tbody><tr><td>Sf9 배양 및 형질주입 재료</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-FLAG M2 친화성</td><td>Biolegend</td><td>651502</td><td>단백질 정제용</td></tr><tr><td>아프로티닌</td><td>시그마</td><td>A6279</td><td>단백질 정제용</td></tr><tr><td>Cellfectin</td><td>Invitrogen</td><td>10362100</td><td>Sf9 형질주입</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>D5545</td><td>운동성 분석 및 단백질 정제</td></tr><tr><td>FLAG 펩타이드</td><td>Sigma</td><td>F3290</td><td>단백질 정제 용</td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td>단백질 동결</td></tr> 용 <tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>Sf9 용해 완충액</td></tr><tr><td>IGEPAL CA 630</td><td>Sigma</td><td>I8896</td><td>용 Sf9 용해 완충액</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td>완충액 준비 용</td></tr><tr><td>단백질 정제용</td> <td>Leupeptin</td><td>Sigma</td><td>L2884</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M2670</td><td>완충액 준비용</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td>용해 완충액</td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td>단백질 정제용</td></tr><tr><td>Sf9 세포</td> Thomas <td>Pucadyil 박사(Indian Institute of Science)의 친절한 선물 Education and Research, 인도 푸네).</td><td></td><td>바큘로비르 발현 및 단백질 정제용</td></tr><tr><td>Sf9 배양 병</td><td>Thermo Scientific</td><td>4115-0125</td><td>현탁 배양용</td></tr><tr><td>Sf-900/SFM 배지 (1X)</td><td>Thermo Scientific</td><td>10902-096 -500ml</td><td>Sf9 세포 배양용</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S1888</td><td>Sf9 세포용 용해 완충액 준비</td></tr><tr><td>Unsupplemented Grace' s 매체</td><td>Thermo Scientific</td><td>11595030 -500ml</td><td>Sf9 트랜스펙션</td></tr><tr><td><강>미로튜뷸 중합 및 단일분자 분석용 materails</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A2647</td><td>운동성 및 글라이딩 분석용</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td>차단형 운동성 챔버용</td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma</td><td>C9322</td><td>용 운동성 및 글라이딩 분석</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D5879</td><td>로다민</td></tr><tr><td>EGTA</td> 용해용 <td>Sigma</td><td>3777</td><td>완충액 준비용</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td>운동성 및 글라이딩 분석용</td></tr><tr><td>포도당 산화효소</td><td>Sigma</td><td>G2133</td><td>운동성 및 글라이딩 분석용</td></tr><tr><td>GTP</td><td>Sigma</td><td>G8877</td><td>미세소관 중합용</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma</td><td>P1767</td><td>준비 PIPES 버퍼 pH 6.9</td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Sigma</td><td>P6757</td><td>준비용 운동성 및 글라이딩 분석 버퍼</td></tr><tr><td><강한>마이크로튜블 글라이딩 어세이 재료</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>26G&nbsp; 바늘</td><td>Dispovan</td><td></td><td>마이크로튜뷸 카</td></tr><tr><td>제인</td><td>시그마</td><td>C3400</td><td>용 미세소관 글라이딩 분석</td></tr><tr><td>GFP 나노바디</td><td>Sivaraj Sivaramakrishnan 박사(미국 미네소타 대학교)의 선물커버</td><td></td> <td>슬립에 모터 부착용</td></tr><tr><td>Rhodamine</td><td>Thermo Scientific</td><td>46406</td><td>라벨링 튜불린</td></tr><tr><td>현미경 및 기타 기기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.5ml, 1.5 및 2ml 마이크로 원심분리 튜브</td> <td>준비용Eppendorf</td><td></td><td>Sf9 배양 및 정제용</td></tr><tr><td>10ml&nbsp; 일회용 멸균 피펫</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Sf9 배양 및 정제용</td></tr><tr><td>10ul, 200ul, 1ml 마이크로피펫 팁</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Sf9 배양 및 정제</td></tr>용 <tr><td>15ml concal 튜브</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Sf9 배양 및 정제용</td></tr><tr><td>35mm 세포 배양 접시</td><td>Cole Palmer</td><td>15179-39</td><td>Sf9 배양</td></tr><tr><td>균형</td><td>Sartorious</td><td></td><td>0.01g-300g</td></tr><tr><td>벤치 탑 구공 진탕 인큐베이터</td><td>REMI</td><td></td><td>28oC</td></tr><tr><td>카메라</td><td>EMCCD Andor iXon Ultra 897</td><td></td><td>TIRF 이미징 및 수용</td></tr> 용 <tr><td>양면 테이프</td><td>스카치</td><td></td><td>운동성 챔버 만들기용</td></tr><tr><td>유리 커버 슬립</td><td>Fisherfinest</td><td>12-548-5A</td><td>크기; 22X30</td></tr><tr><td>유리 슬라이드</td><td>블루 스타</td><td></td><td>운동성 챔버 제작용</td></tr><tr><td>가열 블록</td><td>Neuation</td><td></td><td>용해 파라핀 왁스</td></tr><tr><td>도립 현미경</td><td>Nikon Eclipse Ti- U</td><td></td><td>단백질 발현 확인</td></tr><tr><td>레이저</td><td>488nm (100mW)</td><td></td> <td>TIRF 이미징</td></tr><tr><td>용 액체 질소</td><td></td><td></td><td>시료 동결 및 보관용</td></tr><tr><td>Microcapillary loading tip</td><td>Eppendorf</td><td>EP022491920</td><td>미세소관 전단용</td></tr><tr><td>현미경</td><td>Nikon Eclipse Ti2-E(DIC 포함)</td><td></td><td>TIRF 이미징용</td></tr><tr><td>Mini spin</td><td>Genetix, BiotechAsia Pvt.Ltd</td><td></td><td>빠른 스핀</td></tr><tr><td>대물렌즈</td><td>100X TIRF 대물렌즈(1.49NA 오일 이멀젼</td><td></td> 포함) <td>TIRF 이미징용</td></tr><tr><td>Optima UltraCentrifuge XE</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>단백질 정제용</td></tr><tr><td>파라필름</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH-meter</td><td>Corning</td><td>Coring 430</td><td>pH 조절용</td></tr><tr><td>Pipette-boy</td><td>VWR</td><td></td><td>Sf9 배양 및 정제용</td></tr><tr><td>Sorvall Legend Micro 21</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>단백질 정제용</td></tr><tr><td>Sorvall ST8R 원심분리기</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>단백질 정제</td></tr><tr><td>ThermoMixer</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>미세소관 중합용</td></tr><tr><td>초원심분리기 로터</td><td>Beckman coulter</td><td></td><td>SW60Ti 로터</td></tr><tr><td>초원심분리기 튜브</td><td>Beckman</td><td></td><td>5 mL, 개방형 Thinwall Ultra-Clear Tube, 13 x 51mm</td></tr><tr><td>Vortex mixer</td><td>Neuation</td><td></td><td>시료 mixing</td></tr><tr><td>Wax</td><td>Sigma</td><td>V001228</td><td>운동 챔버를 밀봉하기 위해</td></tr></tbody></table>

sf9 정제 초공정 키네신-3 제품군 모터의 단일 분자 분석

Single-Molecule Analysis of Sf9 Purified Superprocessive Kinesin-3 Family Motors

복잡한 세포 환경은 단일 분자 운동성 분석에 어려움을 야기합니다. 그러나 이미징 기술의 발전으로 단일 분자 연구가 개선되었으며 형광 태그 분자의 동적 거동을 감지하고 이해하는 데 엄청난 인기를 얻었습니다. 여기에서는 TIRF(전반사 형광) 현미경을 사용하여 kinesin-3 계열 모터의 체외 단일 분자 연구에 대한 자세한 방법을 설명합니다. Kinesin-3는 세포 내 화물 수송에서 세포 분열, 발달에 이르기까지 세포 및 생리적 기능에 중요한 역할을 하는 대가족입니다. 우리는 이전에 구성 활성 이량 체 키네신 -3 모터가 포유류 세포에서 모터를 발현하여 제조 된 세포 용해물을 사용하여 단일 분자 수준에서 높은 미세 소관 친화력으로 빠르고 초 프로세스 운동성을 나타낸다는 것을 보여주었습니다. 우리 실험실은 세포, 생화학 및 생물 물리학 적 접근법을 사용하여 kinesin-3 모터와 조절 메커니즘을 연구하며, 이러한 연구는 대규모로 정제 된 단백질을 요구합니다. 포유류 세포를 사용하여 이러한 모터의 발현 및 정제는 비용이 많이 들고 시간이 많이 소요되는 반면, 원핵생물 발현 시스템에서의 발현은 상당히 응집되고 비활성 단백질을 초래했습니다. 박테리아 정제 시스템과 포유류 세포 용해물의 한계를 극복하기 위해 당사는 이러한 모터를 발현하고 정제하는 강력한 Sf9-바쿨로바이러스 발현 시스템을 구축했습니다. kinesin-3 모터는 향상된 신호를 제공하고 광퇴색을 감소시키는 3-탠덤 형광 단백질(3xmCitirine 또는 3xmCit)로 C-말단 태그가 지정되어 있습니다. Sf9 정제 단백질의 시험관 내 단일 분자 및 다중 모터 글라이딩 분석은 키네신-3 모터가 포유류 세포 용해물을 사용한 이전 연구와 유사하게 빠르고 초공정적임을 보여줍니다. 이러한 분석을 사용하는 다른 응용 분야에는 모터의 올리고머 조건, 생화학 연구를 병행하는 특정 결합 파트너 및 운동 상태에 대한 자세한 지식이 포함됩니다.

Sf9-바쿨로바이러스 발현을 사용하여 활성 및 기능성 재조합 모터 단백질을 대규모로 발현하고 정제하려면 시스템이 Sf9 세포를 감염시키기 위해 코딩 서열을 안정적으로 운반하는 바이러스 입자를 생성해야 합니다. 이를 달성하기 위해, Sf9 세포를 KIF1A(1-393LZ)-3xmCit-FLAG를 코딩하는 재조합 바크미드로 형질감염시켰다. 72시간 후, 상당한 세포 집단이 확대된 세포와 핵(그림 1 및 그림 2)과 함께 녹색 형광 단백질(mCitrine)의 발현을 보였으며, 이는 바이러스 입자(P0)의 성공적인 생성을 시사합니다. 이러한 바이러스 입자는 저장 및 대규모 감염을 위한 P1 바이러스 스톡을 생성하기 위해 더 많은 부피로 신선한 Sf9 개체군을 감염시킴으로써 더욱 확장되었습니다. 키네신-3 모터의 정제를 위해, Sf9 세포의 30mL 배양물을 1mL의 P1 바이러스 입자로 감염시켰다. 감염 72시간 후, 녹색 형광 ...

이 연구는 Sf9-바쿨로바이러스 발현 시스템을 사용하여 키네신-3 계열의 구성원인 KIF1A(1-393LZ)의 정제에 대해 자세히 설명합니다. 이들 정제된 모터의 시험관내 단일분자 및 다중-모터 글라이딩 분석은 포유동물 세포 용해물로부터의 모터에 필적하는 강력한 운동성 특성을 나타냈다. 따라서, Sf9-바쿨로바이러스 시스템은 관심있는 운동 단백질을 발현하고 정제하는 것이 가능하다.

Sf9 정제 초공정 키네신-3 제품군 모터의 단일 분자 분석

A complex cellular environment poses challenges for single-molecule motility analysis. However, advancement in imaging techniques have improved ...

이 프로토콜은 Sf9 바쿨로바이러스 시스템을 사용하여 활성 분자 모터를 정제하는 간단한 방법을 제공합니다. 또한 운동 단백질의 조절 메커니즘을 연구하기 위한 단일 분자 운동성 및 다중 모터 글라이딩 분석에 대해 자세히 설명합니다. 기존의 모든 벡터 발현 Sf9 바쿨로바이러스 발현 및 단일 단계 친화성 정제는 순수하고 활동적인 운동 단백질을 이끌고 단일 분자 및 다중 모터 시스템에서 초공정 키네신의 기계론적 세부 사항을 연구할 것입니다.Kinesin 모터 외에도 이 프로토콜을 적용하여 디오닌 및 미오신 같은 다른 세포골격계 단백질의 생화학적 및 생물물리학적 특성을 연구할 수 있습니다. 프로토콜은 상세하고 따르기 쉽습니다. 몇 가지 제안은 Sf9 세포가 오염되기 쉽기 때문에 조심스럽게 다루고 프로토콜에 제공된 참고 사항을 따르는 것입니다.시각적 시연은 매우 효과적이며, 특히 이러한 분석을 수행한 적이 없는 사람들에게 중요한 단계를 따르고 이해하기 쉽습니다. 절차를 시연하는 것은 Pushpanjali Soppina와 Dipeshwari Shewale, 나와 Pradeep Naik과 함께 일하는 박사 과정 학생입니다. 시작하려면 35 밀리리터 접시에 세포를 4.5 배의 밀도로 밀리리터 당 10-5 번째 세포로 씨를 뿌립니다.24 시간 후, 1 마이크로 그램의 bacmid DNA와 100 마이크로 리터의 보충되지 않은 그레이스 배지를 튜브에 섞습니다. 다른 튜브에 6 마이크로 리터의 형질 주입 시약을 100 마이크로 리터의 보충되지 않은 Grace 's 배지와 혼합합니다. 첫 번째 튜브의 내용물을 두 번째 튜브로 조심스럽게 옮깁니다.이들을 혼합하고 혼합물을 실온에서 45 분 동안 배양한다. 보충되지 않은 Grace 배지 0.8ml를 혼합물에 첨가하십시오. 셀에서 Sf900 SFM 배지를 혼합하고 흡인합니다.준비된 형질주입 배지를 세포의 상부에 적가하고, 플레이트를 6시간 동안 인큐베이션한다. 그런 다음 형질 주입 혼합물을 조심스럽게 제거하십시오. SF900 SFM 배지 2밀리리터를 넣고 섭씨 28도에서 48시간 동안 더 배양합니다.다음으로, 도립 형광 현미경으로 운동 단백질 발현을 확인합니다. 감염된 세포로 배지를 수확하고 500G에서 5분 동안 회전합니다.상청액을 수집하고 분취량을 스냅 동결합니다. 멸균된 100밀리리터 원뿔형 플라스크에 세포가 있는 SF900 SFM 배지 10밀리리터와 P-제로 바이러스 스톡 1밀리리

single-molecule-analysis-sf9-purified-superprocessive-kinesin-3

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

이것은에서 활성 전체 길이 Kinesin를 분리하는...

Kinesin의 분리 및 정제에서 Drosophila 태아

소포 또는 세포 소기관과 같은 화물의 세포 내 수송은 편광된 미세소관을 추적하는 분자 운동 단백질에 의해 수행됩니다. 이 프로토콜은 뉴런 내부로 이동하는 개별 화물 입자의 수송 방향성과 관련 운동 단백질의 상대적 양 및 유형의 상관관계를 설명합니다.

사용 축삭화물을 이동하는 분자 모터의 구성을 특성화 &quot;화물 매핑&quot;분석

여기에서, 프로토콜은 키네신 -1-화물을 식별하기 위해 제시된다. 키네신-1 중쇄 (KIF5B)의 모터리스 돌연변이는 세포질에 집계 및화물의 응집을 유도한다. 모두 집계는 형광 현미경에서 검출된다. 유사한 전략이 다른 모터 단백질화물을 식별하기 위해 사용될 수있다.

형광 현미경을 사용 키네신 -1-화물 식별

선물이 분자 셔틀 만들려고 프로토콜 표면 준수 kinesin 모터 단백질 염색 이라는 microtubules을 추진. 표면으로 kinesins의 약한 상호 작용 그것에 그들의 뒤집을 수 있는 첨부 파일을 수 있습니다. 이 전시 하는 동적 어셈블리 및 그것의 기능을 유지 하면서 부품의 분해는 나노 시스템을 만듭니다.

Kinesins 연결 된 조립 분자 셔틀 역에 의해 구동

이 프로토콜의 목표는 DNA 종이 접기 나노 구조에 분자 모터의 앙상블을 형성하고 총 내부 반사 형광 현미경을 사용하여 앙상블 운동성을 관찰하는 것입니다.

단일 분자 관찰을 위한 DNA 종이 접기 나노 구조에 다인 및 키네신 모터 앙상블 생산

양방향 유사분열 키네신-5 Cin8은 운동성 동안 분열되고 병합되는 클러스터에 축적됩니다. 클러스터에 축적되면 Cin8의 속도와 방향성도 변경됩니다. 여기에서, 정제된 Cin8-GFP를 사용한 운동성 분석 및 Cin8의 단일 분자 및 클러스터의 모타일 특성의 분석을 위한 프로토콜이 기재되어 있다.

S. cerevisiae 세포로부터 정제된 양방향 Kinesin-5 Cin8의 단일 분자 및 클러스터의 이동성

여기에서는 시험관 내에서 미세소관 다발을 재구성하고 동시 광학 트래핑 및 전반사 형광 현미경을 사용하여 그 안에 가해지는 힘을 직접 정량화하는 프로토콜을 제시합니다. 이 분석은 활성 미세소관 네트워크 내에서 단백질 앙상블에 의해 생성된 힘과 변위의 나노스케일 수준 측정을 허용합니다.

재구성된 활성 미세소관 다발 내의 힘을 직접 측정

단일 분자 수준에서 고정밀 FRET 실험을위한 프로토콜이 여기에 제시됩니다. 또한,이 방법론은 N- 메틸 -D- 아스 파르 테이트 (NMDA) 수용체의 리간드 결합 도메인에서 3 개의 구조 상태를 확인하는데 사용될 수있다. 정확한 거리를 결정하는 것은 FRET 실험에 기반한 구조 모델을 구축하기위한 첫 번째 단계입니다.

생체 분자 구조 결정을위한 단일 분자 수준의 고정밀 FRET

단일 분자 자석 족집게 플랫폼 G-quadruplexes를 조작 하는 보고, G4 안정성과 규제의 연구에 대 한 수 있는 다양 한 단백질에 의해.

마그네틱 핀셋으로 G-quadruplexes의 단일 분자 조작

이 프로토콜에 설명 합니다 heterobifunctional 실 란 커플링 에이전트와 원자 힘 현미경 검사 법 기반 단일 분자 힘 분광학을 위한 실리콘 산화물 표면에 의해 궁 행 되는 단백질의 화학식 동원 정지는 RrgA의 상호 작용 (pilus-1 팁 adhesin의 S. 균) fibronectin 함께.

단일 분자 힘 분광학에 대 한 단백질의 화학식 동원 정지

배우세요 Sf9 박테리오바이러스 발현 시스템을 이용한 키네신-3 모터 단백질 정제 및 단일 분자 운동성 분석 방법을. 이 프로토콜은 세포 내 물질 수송 메커니즘 연구에 활용됩니다.

Sf9 정제 초공정 키네신-3 제품군 모터의 단일 분자 분석

더 많은 동영상 탐색