Name: 마이코박테리움 결핵 크기 배제 크로마토그래피를 통한 세포밖 소포 농축 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: 배우세요 Mycobacterium tuberculosis 세포밖 소포 농축을 위한 크기 배제 크로마토그래피 기법을. 이 간단하고 재현 가능한 방법은 전통적인 초원심분리 대신 사용할 수 있으며 높은 수율과 최소한의 단백질 오염을 제공합니다.

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우리는 수의학 및 생물 의학 과학 체험 상 및 대학 연구위원회 공유 연구 프로그램의 지원을 NKG에 지원하고 ATCC (상 # 2016-0550-0002)가 KMD에 자금을 지원한다는 것을 인정하고 싶습니다. 우리는 또한 Anne Simpson에게 기술 지원 및 BEI Resources, NIAID, NIH의 다음 시약을 인정하고 싶습니다 : 모노클로날 항 마이코박테리움 결핵 LpqH (유전자 Rv3763), IT-54 (시험관 내에서 생산), NR-13792, 모노클로날 항 마이코박테리움 결핵 GroES (유전자 Rv3418c), 클론 IT-3 (SA-12) (시험관 내에서 생산), NR-49223 및 모노클로날 항 마이코박테리움 결핵 LAM, 클론 CS-35 (시험관 내에서 생산), NR-13811.

콜로라도 주립 대학 기관 생물 안전위원회는 본 연구를 승인했다 (19-046B). Mycobacterium tuberculosis 의 배양과 EV가 풍부한 배양 상청액의 수확은 높은 격리 실험실에서 훈련 된 인력에 의해 수행되었습니다. 이 물질은 유효한 불활성화 방법이 수행되고, 확인되고, 제도적 생물 안전 정책에 의해 승인 된 후 높은 봉쇄 구역 밖으로 옮겨졌습니다. 프로토콜을 복제하는 동안 검증된 불활성화 또는 멸균 여과 방법이 실현 가능하지 않은 경우 다음 절차를 높은 격리 실험실에서 수행해야 합니다.
1. 조질 Mtb EV 농축액의 제조
참고: Mtb 배양 및 배양 여액 단백질(CFP)의 제조에 대한 자세한 절차는 참고문헌11,12를 참조하십시오. 박테리아 배양 배지는 올레산 알부민 덱스트로스 카탈라아제 (OADC)와 같은 EV 함유 또는 단백질 성분 및 트윈과 같은 세제를 함유 한 성장 보충제가없는 것이 좋습니다. 또한 박테리아 배양물의 품질 및 수확된 CFP를 선별하여 제한된 세포 사멸 및 용해13,14를 보장하는 것이 좋습니다.
<ol><li>인산염 완충 식염수(1x PBS)의 전체 부피 용량을 첨가하여 100 kDa 분자량 컷오프(MWCO) 원심 필터( 물질 표 참조)를 제조하였다. 4°C에서 2,800 x g 에서 5분 동안 원심분리한다. 참고: 데드스톱 부피가 없는 필터를 사용하는 경우, 시료 부피가 필터 레벨 미만으로 감소하지 않도록 주의하여 원심분리 중에 필터가 완전히 건조되도록 해야 합니다.</li>
	<li>샘플 챔버를 Mtb CFP로 최대 용량으로 채우기 전에 흐름 스루 및 임의의 나머지 PBS를 폐기한다. 부피가 한외여과 장치의 최소 부피로 감소할 때까지 4°C에서 2,800 x g 에서 원심분리한다. 필요에 따라 반복하여 전체 샘플이 충분히 감소될 때까지 단위에 CFP를 더 추가합니다. 참고: 원하는 경우 다운스트림 인증을 위해 100kDa 플로우스루(100F) 재료의 일부를 보관하십시오. 4°C에서 보관한다.</li>
	<li>농축액을 포함하는 필터 유닛에 1x PBS를 최대 최대 장치 용량까지 첨가한다. 1.2에 설명된 대로 볼륨을 줄입니다. 이 단계를 다섯 번 반복하여 완전한 세척 및 버퍼 교환을 보장하십시오.</li>
	<li>한외여과 장치 사양에 따라 100 kDa 농축된 CFP 잔류물(100R)을 회수 한다(재료 표 참조). 일단 100R이 회수되면, 적어도 세 번 최소 부피의 1x PBS로 필터를 세척하고, 100R로 세척을 풀링하여 회수를 최대화한다.</li>
	<li>제조업체의 지시에 따라 bicinchoninic assay (BCA)로 100R 물질을 정량 화하십시오 (재료 표 참조). 분석을 수행하려면, PBS 중의 샘플 1:2, 1:5 및 1:10의 여러 희석물을 사용한다. 샘플을 세 배로 테스트합니다. 참고: 원하는 경우 다운스트림 인증을 위해 100R 재료의 일부를 보관하십시오. 4°C에서 보관한다.</li>
</ol>2. CFP로부터 Mtb EV의 농축을 위한 크기 배제 크로마토그래피
참고: 다음 절차는 SEC 컬럼 및 자동 분획 수집기(AFC, 자료표 참조)와 함께 3mg의 100R Mtb CFP를 사용하는 경우에 특정합니다. 제조업체의 사양에 따라 다른 시작 농도 및 컬럼 유형에 맞게 조정할 수 있습니다. 또한 사용자는 자동 분수 수집기 사용자 설명서를 읽고 이해하는 것이 좋습니다.
<ol><li>SEC 컬럼이 실온으로 평형화되도록 허용하십시오.</li>
	<li>타워 장치 뒷면의 전원 스위치를 사용하여 AFC를 켜고 필요한 경우 주 메뉴 터치스크린에서 SETUP 을 눌러 로드 셀의 설정을 조정합니다. 로드 셀은 처음 사용할 때, 모든 소프트웨어 업데이트 후, 분수 수집 볼륨의 불일치가 감지되는 경우에만 보정해야 합니다.</li>
	<li>설정 화면에서 CALIBRATE에서 회전 목마를 선택하여 회전 목마> 정렬합니다. 13개의 작은 구멍이 AFC 타워를 향하도록 캐러셀을 삽입하고 - 및/또는 + 버튼을 눌러 유체 노즐이 플러시 위치 바로 위에 오도록 캐러셀을 조정합니다.</li>
	<li>평형화된 SEC 컬럼에서 캡을 제거합니다. SEC 컬럼을 적절한 컬럼 마운트에 밀어 AFC 타워에 조심스럽게 설치합니다. 컬럼의 무선 주파수 식별(RFID) 태그가 AFC를 향하는지 확인하고 컬럼과 밸브 사이의 연결이 안전한지 확인하십시오. 폐기물 배출구 튜브를 수집 용기에 넣으십시오.</li>
	<li>설정 화면에서 수집 일정을 선택하고 - 및/또는 + 버튼을 눌러 카운트를 13으로 설정하고 크기를 0.5 mL로 설정합니다. "버퍼 볼륨" 설정을 기본값인 2.7mL로 두고 X를 눌러 "수집 일정" 창을 닫습니다.</li>
	<li>홈 화면에서 컬렉션 시작을 선택하고 YES를 선택하여 컬렉션 매개 변수를 확인합니다. 뚜껑이 열려 있고 회전 목마 중심을 향하도록 표시된 1.7mL 마이크로 원심분리 튜브에 로드(13)를 부착하십시오.</li>
	<li>확인을 선택하여 AFC를 진행한 다음 컬럼 저장소를 장착하고 OK를 눌러 다시 전진시킵니다. YES를 눌러 컬럼을 플러시하는 옵션을 선택하고 0.2μm 필터링된 PBS의 컬럼 부피 하나를 추가하여 스토리지 버퍼를 제거합니다. 플러시가 완료되면 OK를 눌러 AFC를 진행합니다.</li>
	<li>회전 목마 덮개를 AFC 위에 놓고 OK를 누릅니다. 여과된 PBS의 컬럼 부피 0.2 μm를 제조하였다. 피펫을 사용하여 열에서 과도한 버퍼를 제거하십시오.</li>
	<li>단계 1.5에서 정량된 바와 같이 3 mg의 100R 샘플을 500 μL로 1x PBS로 가져온다. 3 mg 샘플을 컬럼 상단에 첨가하십시오. AFC를 진행하고 샘플이 프릿으로 실행되도록 합니다. 샘플이 컬럼에 완전히 들어가면, 단계 2.6에서 제조된 PBS를 저장소에 첨가한다.</li>
	<li>AFC가 먼저 보이드 볼륨을 수집한 다음 지정된 분수를 수집하는 동안 AFC의 실행을 모니터링합니다. 실행이 완료되고 회전 목마가 폐기물 위치로 돌아온 후 덮개를 제거하고 회전 목마에서 분수 튜브를 제거하십시오. 분획을 정량화 (단계 3) 및 검증 (단계 4) 전에 4°C에서 저장한다.</li>
	<li>열을 다시 사용할 경우 YES를 눌러 열을 정리하는 옵션을 선택합니다. 그렇지 않으면 NO를 누릅니다. AFC의 지침을 따릅니다. 참고: 컬럼이 세척되고 저장 버퍼가 통과되면 제거, 캡핑 및 4°C에서 저장할 수 있습니다.</li>
</ol>3. Mtb EV의 정량화
<ol><li>BCA 및 마이크로 BCA12를 사용하여 각 분획에 대한 단백질 농도를 측정하였다.<ol>
<li>3 mg의 100R Mtb CFP로부터 수집된 0.5 mL 분획의 경우, 각 샘플의 1-7번 분획을 삼중으로 희석하여 1:3으로 희석한 마이크로 BCA를 사용한다.</li>
		<li>5-13번으로 번호가 매겨진 0.5 mL 분획의 경우, 각 샘플에 대해 희석하지 않고 BCA를 삼중으로 사용한다. 참고: 분획 5-7에 대한 분석을 겹치면 모든 분획이 판독 가능한 출력을 갖도록 하는 데 도움이 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>나노입자 추적 분석(NTA)을 사용하여 각 분획에 대한 입자 농도를 정량화합니다.<ol>
<li>샘플을 1 mL의 1x PBS로 희석하여 다음의 제안된 출발 비율을 사용하여; 분획 1-3의 경우 1:100을 사용한 다음 나머지 분획에 대해서는 1:10 희석을 사용합니다.</li>
		<li>희석된 용액을 소용돌이치고, 이어서 샘플을 1 mL 일회용 주사기에 끌어당긴다. 가능한 경우 자동 주사기 펌프에 주사기를 설치하십시오.</li>
		<li>주사기 펌프를 30μL/min으로 설정하고 화면 게인이 10-12이고 카메라 레벨이 10-12인 비디오 캡처 설정을 사용합니다. 각 샘플의 초점을 조정합니다.</li>
		<li>일정한 흐름을 사용하여 각각 30 초에 최소 3 개의 비디오를 수집하십시오.</li>
		<li>소프트웨어 검색 임계값을 다섯 개로 설정하여 분석을 수행합니다. 참고: 상당한 샘플 부피를 희생하지 않고는 최신 분획 (>7)에 대한 NTA 데이터를 얻지 못할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Mtb EV의 자격
<ol><li>은으로 염색된 단백질 겔을 사용하여 각 분획의 일반적인 단백질 프로파일을 시각화한다. 참고: SDS-PAGE 및 은색 얼룩에 대한 자세한 절차는 참조15에서 찾을 수 있습니다.<ol>
<li>SDS 샘플 버퍼를 각 분획의 10 μL와 5 μg의 CFP, 100R 및 100F에 첨가한다. 100°C에서 5분 동안 끓인 다음, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE)을 위한 분자량 사다리를 갖는 4%-12% 비스-트리스 겔에 로딩한다( 표 참조).</li>
		<li>겔을 1x 2-[N-모르폴리노]에탄술폰산(MES) 실행 완충액( 물질표 참조) 및 200V 전류를 사용하여 35분 동안 실행한다.</li>
		<li>카세트로부터 겔을 제거하고 은 염색(15)을 진행한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>웨스턴 블롯에 의해 각 분획에서 EV 마커의 존재 또는 부재를 평가한다. 참고: 웨스턴 블롯팅에 대한 자세한 절차는 참조15에서 찾을 수 있습니다.<ol>
<li>단계 4.1.1-4.1.2에 설명된 대로 SDS-PAGE 겔을 실행한다.</li>
		<li>카세트로부터 겔을 제거하고, 분해된 단백질을 최소 1시간 동안 50 V 전류를 인가함으로써 0.2 μm 니트로셀룰로스 막( 물질의 표 참조)으로 옮긴다.</li>
		<li>웨스턴 블롯 분석을 수행하여 관심있는 단백질을 평가하십시오. LpqH, 리포아라비노만난(LAM) 및 GroES( 물질 표 참조)에 대한 일차 항체가 권장됩니다.</li>
		<li>풀 분수는 다운스트림 애플리케이션에 적용 가능한 마커의 존재 또는 부재에 기초한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>투과 전자 현미경 (TEM)으로 손상되지 않은 소포의 존재를 확인합니다.<ol>
<li>15 μL의 4% EM 등급 파라포름알데히드를 첨가하여 15 μL의 소낭 샘플을 고정하고 하룻밤 동안 4°C에서 보관한다.</li>
		<li>표면을 청소하고 친수성 기판을 제작하여 200 메쉬 폼바 탄소 코팅 구리 TEM 그리드를 준비하십시오. 참고: 아르곤 95%, 산소 5%, 플라즈마 전력 30%로 1분 동안 플라즈마 세척을 권장합니다.</li>
		<li>고정된 샘플 10μL를 그리드 상에 떨어뜨리고 샘플이 10분 동안 접착되도록 한 다음, 과량의 액체를 여과지로 닦아냅니다.</li>
		<li>그리드를 초순수 한 방울에 30 초 동안 떠 올린 다음 과도한 액체를 닦아냅니다.</li>
		<li>그리드를 d% EM 등급 우라닐 아세테이트 방울에 2분 동안 떨어뜨린 다음, 과량의 액체를 뽑아냅니다.</li>
		<li>그리드가 완전히 건조되도록 하십시오.</li>
		<li>100kV 또는 이와 유사한 TEM ( 재료 표 참조)을 사용하는 이미지. 참고: 다른 EV 정량 및 특성화 방법은 다운스트림 애플리케이션을 기반으로 사용해야 합니다. 세포밖 소포18 의 연구를위한 최소한의 정보는 모든 EV 연구의 엄격함과 재현성을 보장하기위한 지침을 참조해야합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

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마이코박테리움 결핵 세포밖 소포는 항원성이 높은 저장소로, 진단 도구 및 미래 백신 4,19,20 개발을 위한 매력적인 길로 제시됩니다. 역사적으로, 밀도 구배 초원심분리는 Mtb EV를 다른 용해성, 분비 물질(8)로부터 분리하는데 사용되어 왔다. 이 공정은 효과적이지만, 또한 시간이 많이 걸리고, 기술적으로 도전적이며, 결과적인 EV 제제(9,10)의 무결성에 영향을 미칠 수 있다. 제시된 프로토콜은 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)를 통해 Mtb EV 제제에 대한 대안적인 방법을 제공한다.
이 방법에는 성공을위한 몇 가지 중요한 포인트가 있습니다...

병원균에 의한 세포밖 소포(EV) 방출은 감염성 질환을 통제하기 위한 새로운 기술을 잠금 해제하는 열쇠가 될 수 있다1. Mycobacterium tuberculosis (Mtb)는 세계 인구의 약 삼분의 일을 감염시키고 매년 수백만 명의 사람들의 생명을 앗아가는 높은 결과의 병원체입니다2. Mtb에 의한 EV 생산은 감염 3,4,5의 맥락에서 이들 EVs의 생물발생 및 다양한 역할(즉, 면역자극성, 면역억제, 철분 및 영양소 획득)에서 애매하면서도 잘 문서화되어 있다. Mtb EVs의 조성을 이해하려는 노력은 면역학적 유의성의 지질 및 단백질을 함유하는 원형질막으로부터 유래된 50-150 nm 지질막-밀폐된 구체를 밝혀냈다 3,6. 박테리아 생리학에서 Mtb EVs의 역할에 대한 조사는 생존을 위한 환경 스트레스에 반응하여 박테리아 EV 조절의 중요성을 밝혀냈다 5. 숙주-병원체 상호작용 연구는 해석하기가 더 복잡하지만, 증거는 Mtb EV가 숙주의 면역 반응에 영향을 미칠 수 있고 잠재적으로 효과적인 백신 접종 성분 3,4,7로서 작용할 수 있음을 나타낸다.
지금까지 Mtb EV에 대한 대부분의 연구는 소낭 농축을위한 밀도 구배 초원심분리에 의존했습니다8. 이것은 소규모 연구에 효과적이었습니다. 그러나이 기술에는 몇 가지 기술적 및 물류 문제가 있습니다. 대체 워크플로우는 전체 세포와 큰 파편을 제거하기 위해 다단계 원심분리를 결합하고 EV를 펠릿화하는 최종 초원심분리 단계를 거칩니다. 이러한 방법론은 효율성이 다양할 수 있으며, 종종 소낭 완전성에 영향을 미치는 동시에 가용성 비소포 관련 생체분자의 낮은 수율 및 공동 정제를 초래한다(9). 또한 이 프로세스는 시간이 많이 걸리고 수동으로 집약적이며 장비 제약으로 인해 처리량이 매우 제한적입니다.
본 프로토콜은 밀도 구배 초원심분리에 대한 대안적인 기술: 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)를 기술한다. 이 방법은 환경 마이코 박테리아에 대해 입증되었으며, 현재 연구에서 Mtb10으로 외삽되었습니다. 시판되는 컬럼 및 자동 분획 콜렉터는 소포 준비의 일관성을 향상시키고 특정하고 값 비싼 장비에 대한 필요성을 줄일 수 있습니다. 또한, 밀도 구배 초원심분리에 비해 시간의 일부분으로 이 프로토콜을 완료하여, 처리량을 증가시킬 수 있다. 이 기술은 기술적으로 덜 도전적이어서 마스터하기가 더 쉬워지고 실험실 간 / 실험실 내 재현성을 높일 수 있습니다. 마지막으로, SEC는 높은 분리 효율을 가지며 부드럽고 소포의 무결성을 보존합니다.

<table><tbody><tr><td>20x MES SDS Running Buffer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NP0002</td><td></td></tr><tr><td>96웰 플레이트</td><td>Corning</td><td>15705-066</td><td></td></tr><tr><td>자동 분획 분취기</td><td>IZON Science</td><td>AFC-V1-USD</td><td></td></tr><tr><td>BenchMark Pre-stained Protein Ladder</td><td>Invitrogen</td><td>10748010</td><td></td></tr><tr><td>Benchtop 원심분리기</td><td>Beckman Coulter</td><td>Allegra 6R</td><td></td></tr><tr><td>Centricon Plus - 70 원심 필터, 100 kDa 차단</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC710008</td><td>1.1단계에서 사용되는 한외여과 장치</td></tr><tr><td>전기블로팅 시스템</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>09-528-135</td><td></td></tr><tr><td>EM 등급 파라포름알데히드</td><td>전자 현미경 Sciences</td><td>15714-S</td><td></td></tr><tr><td>Formvar/Carbon 200 mesh Cu Grids</td><td>전자 현미경 과학</td><td>FCF200H-Cu-TA</td><td></td></tr><tr><td>염소 안티 마우스 IgG H& L (알칼리성 포스파타제), 전분자, 1 mL</td><td>AbCam</td><td>ab6790</td><td>2차 항체</td></tr><tr><td>JEM-1400 투과 전자 현미경</td><td>JOEL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro BCA 단백질 분석 키트</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>마이크로플레이트 리더</td><td>BIOTEK</td><td>Epoch</td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gene Rv3814c)</td><td>BEI Resources</td><td>NR-49223</td><td>1차 항체</td></tr><tr><td>단클론 항Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763)</td><td>BEI Resources</td><td>NR-13792</td><td>1차 항체</td></tr><tr><td>Monocolonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, 클론 CS-35</td><td>BEI Resources</td><td>NR-13811</td><td>1차 항체</td></tr><tr><td>NanoClean 1070</td><td>Fischione 기기</td><td></td><td>TEM 그리드의 플라즈마 청소를 위해</td></tr><tr><td>NanoSight NTA 소프트웨어가 있는 주사기 펌프 및 컴퓨터가 장착된 Nanosight</td><td>Malvern Panalytical</td><td>NS300</td><td></td></tr><tr><td>니트로셀룰로오스 멤브레인, 롤, 0.2 &mu; m</td><td>BioRad</td><td>1620112</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris 단백질 겔</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NP0323BOX</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수, 칼슘 및 마그네슘 미포함 1X</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA 단백질 분석 키트</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac 기본 전원 공급 장치</td><td>BioRad</td><td>1645050</td><td></td></tr><tr><td>qEV Original 35 nm 5/pk</td><td>IZON Science</td><td>SP5-USD</td><td>SEC 컬럼</td></tr><tr><td>SDS 샘플 버퍼</td><td>Boster</td><td>AR1112</td><td>이 절차에서 사용된 자체 레시피, 그러나 이 제품은 동등합니다</td></tr>. <tr><td>SDS-PAGE 젤 챔버</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EI0001</td><td></td></tr><tr><td>Sigmafast BCIP/NBT</td><td>Millipore Sigma</td><td>B5655</td><td></td></tr><tr><td>Silver Stain Plus Kit</td><td>BioRad</td><td>1610449</td><td>이 절차에 사용된 사내 프로토콜이지만 이 키트는</td></tr><tr><td>Uranyl Acetate</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>22400</td><td></td></tr>과 동일합니다</tbody></table>.

마이코박테리움 결핵 크기 배제 크로마토그래피를 통한 세포밖 소포 농축

Mycobacterium tuberculosis Extracellular Vesicle Enrichment through Size Exclusion Chromatography

박테리아 감염의 맥락에서 세포 밖 소포 (EVs)의 역할은 미생물 생리학을 이해하기위한 새로운 길로 부상했습니다. 구체적으로, 결핵균 (Mtb) EVs는 숙주-병원체 상호작용 및 환경 스트레스에 대한 반응에서 역할을 한다. Mtb EV는 또한 항원성이 높으며 백신 성분으로서의 잠재력을 보여줍니다. Mtb EV를 정제하는 가장 일반적인 방법은 밀도 구배 초원심분리입니다. 이 프로세스에는 낮은 처리량, 낮은 수율, 고가의 장비에 대한 의존도, 기술적 과제 등 몇 가지 제한 사항이 있으며 결과 준비에 부정적인 영향을 줄 수 있습니다. 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)는 초원심분리의 많은 한계에 대처하는 온화한 대안 방법입니다. 이 프로토콜은 SEC가 Mtb EV 농축에 효과적이며 신속하고 확장 가능한 방식으로 수율 증가의 고품질 Mtb EV 제제를 생산한다는 것을 보여줍니다. 또한, 정량화 및 검증 절차에 의한 밀도 구배 초원심분리와의 비교는 SEC의 이점을 입증합니다. EV 수량 (나노입자 추적 분석), 표현형 (투과 전자 현미경) 및 함량 (웨스턴 블롯팅)의 평가는 Mtb EV에 맞게 조정되지만 제공된 워크 플로는 다른 마이코 박테리아에 적용될 수 있습니다.

결핵균(Mtb)으로부터 배양여액 단백질(CFP)을 농축, 정량한 다음, 물질 3 mg을 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 컬럼에 적용하였다. 단백질 및 입자 농도를 각각 BCA 및 NTA로 열거하였다. 단백질 및 입자 회수에 대한 예상 범위와 이러한 결과에 대해 수득된 정확한 값이 표 1에 보고되어 있다. 이러한 범위보다 훨씬 높은 값은 오염 또는 컬럼 무결성 문제를 나타낼 수 있습니다. 값은 한외여과 단계에서 상당히 낮은 문제점을 가리키며, 따라서 유동-스루는 성공적인 농도가 발생했는지를 결정하기 위해 출발 CFP 및 100R과 비교될 필요가 있다. 비특이적 단백질 실버-염색은 이후 분획이 더 많은 단백질을 함유하고 100R 물질과 유사하다는 것을 보여준다(그림 1).
분획의 웨스턴 블롯은 리포아라비노만난(LAM)이 분획에 걸쳐 존재한다는 것을 입증하며, 이후 분획은 더 낮은 강...

이 프로토콜은 크기 배제 크로마토그래피, 배양 상청액으로부터 Mycobacterium tuberculosis 세포밖 소포를 풍부하게하기 위한 용이하고 재현 가능한 기술을 기술한다.

The role of extracellular vesicles (EVs) in the context of bacterial infection has emerged as a new avenue for understanding microbial physiology. ...

이 프로토콜은 결핵균, Mtb EV에서 세포 외 소포를 농축하는 데 필요한 기술적 복잡성과 시간을 줄입니다. 전통적인 초원심분리 및 밀도 기반 기술에 대한 부드러운 대안을 제공합니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 수행하기 쉽고 재현성이 높다는 것입니다.최소한의 비 EV 단백질 공동 농축으로 높은 수율의 Mtb EV를 제공합니다. 절차를 시연하는 것은 우리 연구실의 전 대학원생 인 Joanie Ryan이 될 것입니다. 시작하려면 PBS의 전체 부피 용량을 추가하여 100킬로달톤 분자량 차단 원심 필터를 준비합니다.섭씨 4도에서 2, 800 배 G에서 5 분간 원심 분리합니다. 플로우스루 및 나머지 PBS를 폐기하고 샘플 챔버를 최대 용량까지 Mtb CFP로 채웁니다. 부피가 한외 여과 장치의 최소 부피로 감소 할 때까지 섭씨 4도에서 2, 800 배 G에서 원심 분리합니다.전체 샘플이 충분히 줄어들 때까지 필요에 따라 반복합니다. 농축물을 포함하는 필터 장치에 1X PBS를 총 장치 용량까지 추가합니다. 앞에서 설명한 대로 부피를 줄이고 이 단계를 5회 반복하여 세척 및 완충액 교환이 완료되도록 합니다.이어서, 한외여과 장치 규격에 따라 100-킬로달톤 농축된 CFP 잔류물 또는 100R을 회수한다. 최소 부피의 1X PBS로 필터를 최소 3회 세척하고 100R로 세척을 당겨 회수율을 최대화합니다. PBS에서 여러 희석된 샘플을 사용하고 이분법으로 100R 물질을 정량합니다.샘플을 삼중으로 테스트합니다. 크기 배제 크로마토그래피 또는 SEC 컬럼이 실온과 평형을 이루도록 합니다. 타워 장치 뒷면의 전원 스위치를 사용하여 AFC를 켜고 필요한 경우 메인 메뉴 터치 스크린에서 설정을 눌러 로드셀 설정을 조정합니다.설정 화면에서 캐러셀을 선택한 다음 보정을 선택하여 캐러셀을 정렬합니다. 13개의 작은 구멍이 위를 향하도록 캐러셀을 AFC 타워에 삽입하고 유체 노즐이 플러시 위치 바로 위에 오도록 마이너스 또는 플러스 버튼을 눌러 캐러셀을 조정합니다. 평형화된 SEC 컬럼에서 캡을 제거하고 SEC 컬럼을 적절한 컬럼 마운트에 밀어 넣습니다.AFC 타워에 조심스럽게 설치하십시오. 컬럼의 무선 주파수 식별 태그가 AFC를 향하고 컬럼과 밸브 사이의 연결이 고정되어 있는지 확인하십시오. 폐기물 배출 튜브를 수거 용기에 넣으십시오.설정 화면에서 수집 일정을 선택하고 빼기 또는 더하기 버튼을 눌러 개수를 13으로 설정하고 크기를 0.5밀리리터로 설정합니다. 버퍼 볼륨 설정을 기본값인 2.7밀리리터로 두고 수집 일정 창을 닫습니다. 홈 화면에서 수집 시작을 선택하고 Yes(예)를 선택하여 수집 매개 변수를 확인합니다.뚜껑이 열려 있고 캐러셀 중앙을 가리키도록 라벨이 부착된 1.7ml의 1.7ml급 마이크로 원심분리기 튜브 13개를 로드합니다. OK를 선택하여 AFC를 진행한 다음 컬럼 저장소를 장착하고 OK를 눌러 다시 전진합니다. 예를 눌러 컬럼을 플러시하는 옵션을 선택하고 0.2마이크로미터 필터링된 PBS의 컬럼 부피 하나를 추가하여 스토리지 버퍼를 제거합니다. 플러시가 완료되면 OK를 눌러 AFC를 진행합니다. 캐러셀 커버를 AFC 위에 놓고 OK를 누릅니다. 피펫을 사용하여 컬럼에서 과도한 버퍼를 제거합니다.100R 샘플 3mg을 1X PBS로 500마이크로리터로 가져오고 샘플을 컬럼 상단에 추가합니다. 0.2 마이크로미터 여과된 PBS의 컬럼 부피 하나를 준비한다. AFC를 진행하고 샘플이 프렛에 부딪히도록 합니다.샘플이 컬럼에 완전히 들어가면 이전에 준비한 PBS를 저장소에 추가합니다. AFC가 먼저 보이드 볼륨을 수집한 다음 지정된 분수를 수집하는 동안 AFC의 실행을 모니터링합니다. 실행이 완료되고 캐러셀이 폐기물 위치로 돌아가면 캐러셀에서 덮개와 분수 튜브를 제거합니다.100R Mtb CFP 3 밀리그램에서 수집 한 0.5 밀리미터 분획의 경우, 각 샘플의 1 내지 7 번 분획에 대해 1 : 3 희석 된 micro-BCA를 사용하여 단백질 농도를 삼중으로 측정합니다. 5에서 13까지 번호가 매겨진 0.5 밀리리터 분획의 경우 각 샘플에 대해 희석하지 않은 BCA를 삼중으로 사용하십시오. SDS 샘플 버퍼를 각 분획의 10 마이크로리터와 5 마이크로그램의 CFP 및 100R에 첨가한다.섭씨 100도에서 5 분간 끓입니다. 그런 다음 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 PAGE를 위한 분자량 사다리가 있는 4-12%Bis-Tris 겔에 로드합니다. 1X MES 실행 버퍼와 200V 전류를 사용하여 SDS-PAGE 젤을 35분 동안 실행합니다.카세트에서 젤을 제거하고 최소 1 시간 동안 50 볼트 전류를 적용하여 분해 된 단백질을 0.2 마이크로 미터 니트로 셀룰로오스 막으로 옮깁니다. 마지막으로, 웨스턴 블롯 분석을 수행하여 단백질을 평가한다. 은으로 염색된 SDS-PAGE 겔은 각 분획에 대한 전체 단백질 프로파일을 보여줍니다.데이터는 나중 분획이 더 많은 단백질을 함유하고 100R 물질과 유사하다는 것을 보여줍니다. LAM, LpqH 및 GroES를 검출하는 웨스턴 블롯은 단백질 마커가 분획에 걸쳐 변화한다는 것을 입증합니다. 고정 전에 뽑은 SEC 분획 1 내지 3의 투과 전자 현미경 또는 TEM 이미지가 여기에 도시되어 있다.Mtb EV의 밀도 구배 초원심분리는 TEM 이미징을 위해 음성으로 염색되었습니다. SEC 분획 1 내지 3의 나노입자 추적 분석 또는 NTA 분포가 여기에 나와 있다. 밀도 구배 초원심분리 Mtb EV는 나노입자 추적 분석으로 분석되었으며 크기 분포가 여기에 표시됩니다.이 프로토콜은 3mg의 100R에서 EV 정제에 최적화되었습니다. 단백질 부하가 변하는 경우, 결과 분획에 대한 권장 희석 및 BCA 전략에 조정이 필요할 수 있습니다. 이 기술로 준비된 Mtb EV는 다운스트림 구성 및 오믹스 기반 연구에 사용할 수 있습니다.또한 시험관 내 및 생체 내 실험에도 적합합니다. 이 기술은 고품질 Mtb EV 준비를 생산하는 쉽고 효율적인 방법을 제공하여 향후 Mtb EV 실험에서 재현성을 높일 수 있는 길을 열어줍니다.

mycobacterium-tuberculosis-extracellular-vesicle-enrichment-through

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

출처: Gupta, S., Marcela Rodriguez, G. 철 제한 마이코박테리아에 의해 생성된 세포외 소포의 분리 및 특성화. J. Vis. 경험. (2019년)이 비디오는 숙주 환경을 모방하는 철분 제한 조건에서 배양된 Mycobacterium tuberculosis 에서 세포외 소포(EV)를 단계적으로 분리하는 방법을 보여줍니다. EV 함유 분획을 농축하고 식별하기 위해 한외여과, 차등 원심분리 및 밀도 구배 분리를 사용하는 방법을 간략하게 설명합니다.

Mycobacterium tuberculosis에서 Siderophore 함유 세포외 소포의 분리

출처: 왓슨, DC, et.al. 대장균 및 기타 박테리아로부터 세포외 소포의 확장 가능한 분리 및 정제. J. Vis. 경험. (2021년)이 비디오는 유전자 조작 박테리아의 외막에서 파생된 세포외 소포(EV)의 분리 및 농축을 보여줍니다. 이 과정에는 박테리아를 배양하여 EV를 방출한 다음 세포와 잔해물을 제거하기 위한 순차적 원심분리 및 여과 단계가 포함됩니다. 마지막으로, 한외여과는 다운스트림 분석을 위해 EV를 농축하는 데 사용됩니다.

박테리아로부터 외막 유래 세포외 소포의 분리 및 농축

출처: Watson, DC, et al. 대장균 및 기타 박테리아로부터 세포외 소포의 확장 가능한 분리 및 정제. J. Vis. 경험. (2021년)이 비디오는 박테리아 배양 여과액에서 박테리아 세포외 소포(EV)를 분리하기 위해 다공성 수지 비드를 사용한 크기 배제 크로마토그래피를 사용하는 방법을 보여줍니다. 더 큰 EV는 수지 기공을 우회하여 조기에 용리되는 반면, 더 작은 단백질은 기공으로 들어가 나중에 용리됩니다.

크기배제 크로마토그래피를 이용한 박테리아 세포외 소포의 분리 

이 비디오에서는 박테리아에서 유래한 외막 소포 또는 OMV의 이질적인 집단을 분리하는 기술(크기 배제 크로마토그래피)을 시연합니다. 이러한 소포는 나노 크기의 구형 구조이며 크기 배제 크로마토그래피를 통해 크기에 따라 크고 작은 하위 모집단으로 분리됩니다.

Size Exclusion Chromatography Based Separation of Bacterial Extracellular Vesicles: A technique to separateing of gram-negative bacterial outer membrane vesicles (박테리아 세포외 소포체의 이질성 집단을 크기에 따라 분리하는 기술)

이 비디오는 한외여과를 사용하여 박테리아 세포외 소포체를 포함하는 박테리아 배양 여과액 단백질의 분리 및 농축을 보여줍니다. 농축된 세포외 소포체는 질병 감지를 위한 진단 마커 역할을 합니다.

한외여과 장치를 사용한 박테리아 배양 여과 단백질 농도 여과

이 동영상은 결핵균(Mycobacterium tuberculosis, Mtb)의 배양 여과액에서 박테리아 세포외 소포체(EV)를 정제하기 위한 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 기술을 보여줍니다. 이 기술은 다공성 수지 충전 컬럼을 사용하여 EV의 정제된 분획을 얻습니다. 다공성 입자는 더 작은 단백질이 기공으로 들어가도록 선택적으로 허용하여 용리 속도를 늦춥니다. 동시에 EV는 크기가 크기 때문에 모공으로 들어가는 것이 배제되고 먼저 용출됩니다.

Mycobacterial Extracellular Vesicles를 정제하기 위한 크기 배제 크로마토그래피 기술

결핵 균은 낮은 철 조건에 응하여 세포외 소포의 증가된 생산 그리고 방출을 보여줍니다. 이 작품은 철 결핍에 응하여 풀어 놓인 진균 세포외 소포의 정제 그리고 특성화를 위한 낮은 철 조건 및 방법을 생성하기 위한 프로토콜을 상세히 기술합니다.

철분 제한 마이코박테리아에 의해 생성된 세포외 소포의 격리 및 특성화

세균성 소포는 병인에 중요한 역할을 하고 유망한 생명 공학 응용 프로그램이 있습니다. 소포의 이질성은 분석과 사용을 복잡하게 합니다. 따라서 다양한 크기의 소포를 분리하는 간단하고 재현 가능한 방법이 필요합니다. 여기에서, 우리는 Aggregatibacter actinomycetemcomitans에의해 생성된 이기종 소포를 분리하기 위하여 크기 배제 크로마토그래피의 사용을 보여줍니다.

크기 배제 크로마토그래피는 세균 외부 막 소포 이질성을 분석

박테리아는 생리 활성 생물학적 분자를 운반하는 나노 미터 크기의 세포 외 소포 (EV)를 분비합니다. EV 연구는 생물 발생, 미생물-미생물 및 숙주-미생물 상호 작용 및 질병에서의 역할, 잠재적 인 치료 응용 프로그램을 이해하는 데 중점을 둡니다. EV 연구의 표준화를 촉진하기 위해 다양한 박테리아로부터 EV를 확장 가능한 분리를 위한 워크플로우가 제시됩니다.

대장균 및 다른 박테리아로부터의 세포외 소포의 확장 가능한 분리 및 정제

이 프로토콜은 Mycobacterium smegmatis(Msm)의 액센 배양에서 천연 마이코박테리아 세포외 소포체(mEV)의 농축과 mCherry(적색 형광 리포터) 함유 재조합 MsmEV를 설계하고 농축할 수 있는 방법을 자세히 설명합니다. 마지막으로, 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)의 EsxA 단백질을 함유한 MsmEV의 농축을 통해 새로운 접근법을 검증합니다.

마이코박테리아의 native and recombinant extracellular vesicles 농축

이 프로토콜은 효소 소화 및 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 소변 골격근과 골수에서 작은 세포외 소포를 분리하여 구조적으로 복잡하고 저수율 조직에서 소포 농축 분획을 재현 가능하게 회수하여 하위 분자 분석에 활용할 수 있도록 합니다.

크기 배제 크로마토그래피를 이용한 쥐 골격근 및 골수에서 작은 세포외 소포 분리

배우세요 Mycobacterium tuberculosis 세포밖 소포 농축을 위한 크기 배제 크로마토그래피 기법을. 이 간단하고 재현 가능한 방법은 전통적인 초원심분리 대신 사용할 수 있으며 높은 수율과 최소한의 단백질 오염을 제공합니다.

마이코박테리움 결핵 크기 배제 크로마토그래피를 통한 세포밖 소포 농축

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