Name: 트리파노소마 크루지 감염 세포, 휴면 무산소 및 손상되지 않은 정화 장기의 T 세포의 정량적 3D 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-23T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: 배우세요 광시트 형광 현미경을 활용한 휴면 및 증식 중인 트리파노소마 크루지 기생충과 T 세포의 3D 정량화 방법을. 조직 투명화와 자동화된 소프트웨어 분석으로 샤가스병 치료 효과를 평가합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

조직 투명화 및 면역염색 프로토콜에 관한 귀중한 도움과 권장 사항에 대해 Etsuo Susaki 박사에게 감사드립니다. 또한 LSFM 및 컨포칼 이미징을 사용한 기술 지원에 대해 CTEGD Biomedical Microscopy Core의 M. Kandasamy에게 감사드립니다. 또한이 연구 전반에 걸쳐 유용한 제안을 해주신 Tarleton Research Group의 모든 구성원에게 감사드립니다.

<ol><li>Schofield, C. J., Jannin, J., Salvatella, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+Chagas+disease+control%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Parasitology%22%5BJournal%5D)">The future of Chagas disease control.</a> Trends in Parasitology. 22 (12), 583-588 (2006).</li>
<li>Marin-Neto, J. A., Cunha-Neto, E., Maciel, B. C., Simoes, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+chronic+Chagas+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of chronic Chagas heart disease.</a> Circulation. 115 (9), 1109-1123 (2007).</li>
<li>Tarleton, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%2B+T+cells+in+Trypanosoma+cruzi+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">CD8+ T cells in Trypanosoma cruzi infection.</a> Seminars in Immunopathology. 37 (3), 233-238 (2015).</li>
<li>Padilla, A. M., Simpson, L. J., Tarleton, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insufficient+TLR+activation+contributes+to+the+slow+development+of+CD8%2B+T+cell+responses+in+Trypanosoma+cruzi+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Insufficient TLR activation contributes to the slow development of CD8+ T cell responses in Trypanosoma cruzi infection.</a> Journal of Immunology. 183 (2), 1245-1252 (2009).</li>
<li>Basso, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+immune+response+in+experimental+Chagas+disease%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Modulation of immune response in experimental Chagas disease.</a> World Journal of Experimental Medicine. 3 (1), 1-10 (2013).</li>
<li>Martin, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%2B+T-Cell+responses+to+Trypanosoma+cruzi+are+highly+focused+on+strain-variant+trans-sialidase+epitopes%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">CD8+ T-Cell responses to Trypanosoma cruzi are highly focused on strain-variant trans-sialidase epitopes.</a> PLOS Pathogens. 2 (8), 77(2006).</li>
<li>Sanchez-Valdez, F. J., Padilla, A., Wang, W., Orr, D., Tarleton, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+dormancy+protects+Trypanosoma+cruzi+during+extended+drug+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Spontaneous dormancy protects Trypanosoma cruzi during extended drug exposure.</a> Elife. 7, 34039(2018).</li>
<li>Sanchez-Valdez, F., Padilla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+detection+of+dormant+Trypanosoma+cruzi+amastigotes+using+bioluminescent-fluorescent+reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">In situ detection of dormant Trypanosoma cruzi amastigotes using bioluminescent-fluorescent reporters.</a> Methods in Molecular Biology. 1955, 179-186 (2019).</li>
<li>Vieites-Prado, A., Renier, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+and+3D+imaging+in+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology.</a> Development. 148 (18), 199369(2021).</li>
<li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+and+its+applications+in+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing and its applications in neuroscience.</a> Nature Reviews Neuroscience. 21, 61-79 (2020).</li>
<li>Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. L., Erturk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guidebook+for+DISCO+tissue+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">A guidebook for DISCO tissue clearing.</a> Molecular Systems Biology. 17, 9807(2021).</li>
<li>Pan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+learning+reveals+cancer+metastasis+and+therapeutic+antibody+targeting+in+the+entire+body%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Deep learning reveals cancer metastasis and therapeutic antibody targeting in the entire body.</a> Cell. 179 (7), 1661-1676 (2019).</li>
<li>Qi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FDISCO%3A+Advanced+solvent-based+clearing+method+for+imaging+whole+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">FDISCO: Advanced solvent-based clearing method for imaging whole organs.</a> Science Advances. 5, 8355(2019).</li>
<li>Cai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Panoptic+imaging+of+transparent+mice+reveals+whole-body+neuronal+projections+and+skull-meninges+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections.</a> Nature Neuroscience. 22, 317-327 (2019).</li>
<li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+3D+imaging+of+fixed+and+cleared+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids.</a> Nature Protocols. 14, 1756-1771 (2019).</li>
<li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expanding+human+airway+organoids+for+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Long-term expanding human airway organoids for disease modeling.</a> The EMBO Journal. 38 (4), 100300(2019).</li>
<li>Hu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Term+Expansion+of+Functional+Mouse+and+Human+Hepatocytes+as+3D+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids.</a> Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CUBIC+protocols+for+whole-brain+and+whole-body+clearing+and+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging.</a> Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497, 332-337 (2013).</li>
<li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159 (4), 911-924 (2014).</li>
<li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+landscape+for+tissue+clearing+based+on+hydrophilic+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Chemical landscape for tissue clearing based on hydrophilic reagents.</a> Cell Reports. 24 (8), 2196-2210 (2018).</li>
<li>Murakami, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-dimensional+single-cell-resolution+whole-brain+atlas+using+CUBIC-X+expansion+microscopy+and+tissue+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A three-dimensional single-cell-resolution whole-brain atlas using CUBIC-X expansion microscopy and tissue clearing.</a> Nature Neuroscience. 21, 625-637 (2018).</li>
<li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+probing+of+intact+human+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular probing of intact human organs.</a> Cell. 180 (4), 796-812 (2020).</li>
<li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).</li>
<li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iDISCO%3A+a+simple%2C+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li>
<li>Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLARITY+for+mapping+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">CLARITY for mapping the nervous system.</a> Nature Methods. 10, 508-513 (2013).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+whole-organ%2Fbody+staining+and+imaging+based+on+electrolyte-gel+properties+of+biological+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues.</a> Nature Communications. 11, 1982(2020).</li>
<li>Kubota, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+profiling+of+cancer+metastasis+with+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution.</a> Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).</li>
<li>Bustamante, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+drug+regimen+clears+active+and+dormant+trypanosomes+in+mouse+models+of+Chagas+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">A modified drug regimen clears active and dormant trypanosomes in mouse models of Chagas disease.</a> Science Translational Medicine. 12 (567), (2020).</li>
<li>Wang, H., Khoradmehr, A., Tamadon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACT+or+PACT%3A+A+comparison+between+free-acrylamide+and+acrylamide-based+passive+sodium+dodecyl+sulfate+tissue+clearing+for+whole+tissue+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Journal%22%5BJournal%5D)">FACT or PACT: A comparison between free-acrylamide and acrylamide-based passive sodium dodecyl sulfate tissue clearing for whole tissue imaging.</a> Cell Journal. 21 (2), 103-114 (2019).</li>
<li>Hofmann, J., Gadjalova, I., Mishra, R., Ruland, J., Keppler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+tissue+clearing+and+multi-organ+volumetric+imaging+enable+quantitative+visualization+of+sparse+immune+cell+populations+during+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Efficient tissue clearing and multi-organ volumetric imaging enable quantitative visualization of sparse immune cell populations during inflammation.</a> Frontiers in Immunology. 11, 599495(2020).</li>
<li>Messal, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+retrieval+and+clearing+for+whole-organ+immunofluorescence+by+FLASH%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Antigen retrieval and clearing for whole-organ immunofluorescence by FLASH.</a> Nature Protocols. 16, 239-262 (2021).</li>
<li>Kolesova, H., Capek, M., Radochova, B., Janacek, J., Sedmera, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+different+tissue+clearing+methods+and+3D+imaging+techniques+for+visualization+of+GFP-expressing+mouse+embryos+and+embryonic+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Comparison of different tissue clearing methods and 3D imaging techniques for visualization of GFP-expressing mouse embryos and embryonic hearts.</a> Histochemistry and Cell Biology. 146 (2), 141-152 (2016).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+tiling+light+sheet+microscope+for+imaging+of+cleared+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A versatile tiling light sheet microscope for imaging of cleared tissues.</a> Cell Reports. 33, 108349(2020).</li>
</ol>

저자는 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.

기생충과 면역 반응에 대한 광범위한 전체 장기 영상의 부재는 숙주-기생충 상호 작용의 복잡성에 대한 이해를 제한하고 샤가스병에 대한 치료법의 평가를 방해합니다. 본 연구는 T. cruzi에 감염된 마우스의 손상되지 않은 장기와 조직을 명확히하고 염색하기 위해 CUBIC 파이프 라인을 채택했습니다.
이 연구에서 여러 조직 투명화 프로토콜이 테스트되었습니다 (PACT32,ECi 33, FLASH34, iDISCO 11,26 및 fDISCO13). 그러나 CUBIC 만이 높은 수준의 tdTomato 또는 GFP 기생충 형광을 보존했습니다. 유사하게, 이전의 보고는 다른 조직-투명화 접근법과 비교하...

원생동물 기생충 T. cruzi에 의해 발생하는 샤가스병은 세계에서 가장 방치된 열대성 질병 중 하나이며 연간 약 13,000명이 사망합니다. 감염은 종종 부정맥, 심부전 및 갑작스런 사망을 포함하여 환자의 30 %에서 심장 병리를 일으키는 급성에서 만성 단계로 진행됩니다 1,2. 급성기 동안 기생충에 대해 유도 된 강력한 숙주 면역 반응에도 불구하고, 적은 수의 기생충이 심장 및 골격근과 같은 조직에서 숙주의 평생 동안 만성적으로 지속됩니다. 적응 면역 반응의 지연된 발병 및 비 복제 형태의 기생충의 존재를 포함한 몇 가지 요인은 면역계 3,4,5,6에 의한 완전한 제거를 피하기 위해 T. cruzi의 능력에 기여할 수 있습니다. 또한, 복제되지 않는 휴면 형태의 기생충은 트리파노시드 약물에 대한 낮은 감수성을 나타내며 많은 경우 7,8에서 관찰되는 치료 실패의 원인이 될 수 있습니다.
새로운 이미징 기술의 개발은 감염된 조직에서 기생충의 공간적 분포와 통제에 관여하는 면역 세포와의 관계에 대한 통찰력을 얻을 수있는 기회를 제공합니다. 이러한 특성은 면역 체계에 의한 기생충 제어 과정을 더 잘 이해하고 만성 조직에 존재하는 희귀 휴면 기생충을 추적하는 데 중요합니다.
라이트 시트 형광 현미경(LSFM)은 얇은 절편 없이 큰 조직 또는 장기의 3D 이미징을 위한 가장 포괄적이고 편견 없는 방법 중 하나입니다. 라이트 시트 현미경은 얇은 빛의 시트를 사용하여 초점면의 형광단만 여기시키고, 샘플의 광퇴색 및 광독성을 줄이며, 초고속 카메라를 사용하여 수천 개의 조직층의 이미지를 기록합니다. 조직에서 레이저 광의 적절한 침투에 필요한 높은 수준의 조직 투명성은 조직 지질 화 및 탈색 후 굴절률 (RI)을 균질화하여 얻어지며, 이는 빛의 산란을 줄이고 고품질 이미지를 렌더링합니다 9,10,11.
조직 투명화 접근법은 전체 마우스12,13,14, 오가노이드15,16,17, 리포터 형광 마커를 발현하는 기관 18,19,20,21,22,23, 및 최근에는 제한된 수의 인간 조직(24)의 이미징을 위해 개발되었습니다. . 조직 청소를 위한 현재의 방법은 세 가지 제품군으로 분류됩니다: (1) DISCO 프로토콜25,26과 같은 유기 용매 기반 방법, (2) CLARITY 27과 같은 하이드로겔 기반 방법 및 CUBIC (투명하고 방해받지 않는 뇌/신체 이미징 칵테일 및 전산 분석)18,19,28,29와 같은 수성 방법 . CUBIC 프로토콜은 장기 모양과 조직 무결성을 유지하여 내인성으로 발현된 리포터 단백질의 형광을 보존합니다. 이 기술의 가장 최근의 업데이트인 CUBIC-HistoVision (CUBIC-HV)은 또한 형광-표지된 항체 및 DNA 표지28을 사용하여 에피토프의 검출을 허용한다.
본 프로토콜에서, 정제된 무손상 마우스 조직에서 형광 단백질을 발현하는 T. cruzi 를 검출하기 위한 CUBIC 파이프라인을 사용하였다. 광학적으로 투명한 조직을 LSFM 이미지화하고 3D로 재구성했으며 장기 당 T. cruzi 감염 세포, 휴면 무명 및 T 세포의 정확한 총 수를 자동으로 정량화했습니다. 또한, 이 프로토콜은 항체 및 핵 얼룩이 있는 투명화된 장기의 균일한 표지를 얻기 위해 성공적으로 채택되었습니다. 이러한 접근법은 감염된 숙주에서 T. cruzi 의 확장 및 제어를 이해하는 데 필수적이며 샤 가스 병에 대한 화학 및 면역 치료제를 완전히 평가하는 데 유용합니다.

<table><tbody><tr><td>1-메틸이미다졸</td>, <td>밀리포어, 시그마</td><td>616-47-7</td><td></td></tr>, <tr><td>2,3-디메틸-1-페닐-5-피라졸론(안티피린,</td><td>TCI,</td><td>D1876</td><td></td></tr>, <tr><td>6-웰, 세포 배양 플레이트</td>, <td>ThermoFisher Scientific</td><td>, 140675</td><td></td></tr>, <tr><td>AlexaFluor 647, 안티-마우스 Fab 단편</td>, <td>Jackson Immuno Research Laboratories</td>, <td>315-607-003</td><td></td></tr>, <tr><td>AlexaFluor 647, 안티-토끼 팹 단편</td><td>Jackson Immuno Research Laboratories</td><td>111-607-003</td><td></td></tr><tr><td>anti-GFP nanobody Alexa Fluor 647</td><td>Chromotek</td><td>gb2AF647-50</td><td></td></tr><tr><td>anti-RFP</td><td>Rockland</td><td>600-401-379</td><td></td></tr><tr><td>anti-&alpha;-SMA</td><td>Sigma</td><td>A5228</td><td></td></tr><tr><td>B6. C+A2:A44G-GT(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J 마우스</td><td>잭슨 연구소</td><td>균주 #007914</td><td>일반 이름: Ai14, Ai14D 또는 Ai14(RCL-tdT)-D</td></tr><tr><td>B6. Cg-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J 마우스</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>Strain #007914</td><td>Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D</td></tr><tr><td>BOBO-1</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>B3582</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA)</td><td>Sigma</td><td>#A7906</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J 마우스</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>Strain #032080</td><td>Common 이름: Cd8A-Cre (E8III-Cre)</td></tr><tr><td>CAPSO</td><td>Sigma</td><td>#C2278</td><td></td></tr><tr><td>청소용 물티슈 Kimwipes</td><td>&nbsp; Kimberly-Clark</td><td>T8788</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 레이저 스캐닝 현미경</td><td>Zeiss</td><td>LSM 790</td><td></td></tr><tr><td>CUBIC-HV 1 3D 면역 염색 키트</td><td>TCI</td><td>C3699</td><td></td></tr><tr><td>CUBIC-HV 1 3D 핵 염색 키트</td><td>TCI</td><td>C3698</td><td></td></tr><tr><td>CUBIC-L</td><td>TCI</td><td>T3740</td><td></td></tr><tr><td>CUBIC-P</td><td>TCI</td><td>T3782</td><td></td></tr><tr><td>CUBIC-R+</td><td>TCI</td><td>T3741</td><td></td></tr><tr><td>시아노아크릴레이트 기반 겔 초강력 571605</td> 스카<td>치</td><td>DiR</td><td></td></tr><tr><td>(DiIC18(7); 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindotricarbocyanine iodide) 회사: Biotium</td><td>Biotium</td><td>#60017</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌 디아민 테트라 아세트산(EDTA)</td><td>Millipore Sigma</td><td>60-00-4</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 원심분리기 튜브 15mL</td><td>Corning</td><td></td><td></td>CLS430791</tr><tr><td>Falcon 원심분리기 튜브 50&nbsp; mL</td><td>Corning</td><td>CLS430290</td><td></td></tr><tr><td>Formalin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>J16920. BBR</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Sigma</td><td>#H3884 또는 #H4272</td><td></td></tr><tr><td>Imaris 파일 변환기 x64</td><td>BitPlane</td><td>v9.2.0</td><td></td></tr><tr><td>Imaris 소프트웨어</td><td>BitPlane</td><td>v9.3</td><td></td></tr><tr><td>ImSpector 소프트웨어</td><td>LaVision BioTec, Miltenyi Biotec</td><td>v6.7</td><td></td></tr><tr><td>정맥 주사 바늘 23-G</td><td>Sartori, Minisart 주사기 필터</td><td>16534</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td></td><td></td><td>보푸라기 없는 물티슈</td></tr><tr><td>라이트 시트 형광 현미경</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>ULtramicroscope II 이미징 시스템</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>041838.K2</td><td></td></tr><tr><td>마이크로피펫 팁, 10 &마이크로; L, 200 &마이크로; L 및 1,000 &마이크로; L</td><td>Axygen</td><td>T-300, T-200-Y 및 T-1000-B</td><td></td></tr><tr><td>전동 피펫 디스펜서</td><td>Fisher Scientific, Fisherbrand</td><td>03-692-172</td><td></td></tr><tr><td>장착 솔루션</td><td>TCI</td><td>M3294</td><td></td></tr><tr><td>N-부틸디에탄올아민</td><td>TCI</td><td>B0725</td><td></td></tr><tr><td>니코틴아미드</td><td>TCI</td><td>N0078</td><td></td></tr><tr><td>N-메틸니코틴아미드</td><td>TCI</td><td>M0374</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드(PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered Saline (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>RedDot 2 Far-Red Nuclear Stain</td><td>Biotium</td><td>#40061</td><td></td></tr><tr><td>Sacrifice Perfusion System</td><td>Leica</td><td>10030-380</td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>혈청학 피펫</td><td>Costar Sterile</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>Shaking incubator</td><td>TAITEC</td><td>BR-43FM MR</td><td></td></tr><tr><td>Sodium azide (NaN3)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>447815000</td><td></td></tr><tr><td>Sodium carbonate (Na2CO3)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L13098.36</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨 (NaCl)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>447302500</td><td></td></tr><tr><td>탄산수소나트륨(NaHCO3)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>014707.A9</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX-G 녹색 핵산 염색</td><td>제 ThermoFisher Scientific</td><td>S7020</td><td></td></tr><tr><td>트리톤 X-100</td><td>시그마-알드리치</td><td>T8787</td><td></td></tr></tbody></table>

트리파노소마 크루지 감염 세포, 휴면 무산소 및 손상되지 않은 정화 장기의 t 세포의 정량적 3d 이미징

Quantitative 3D Imaging of Trypanosoma cruzi-Infected Cells, Dormant Amastigotes, and T Cells in Intact Clarified Organs

샤 가스 병은 주로 라틴 아메리카에서 전 세계 수백만 명의 사람들에게 영향을 미치는 무시 된 병리학입니다. 샤가스병 치료제인 트리파노소마 크루지 (T. cruzi)는 인간을 포함한 여러 포유류 종을 감염시켜 심장 및 소화기 병리를 유발하는 다양한 생물학을 가진 절대 세포 내 기생충입니다. 샤가스병의 복잡한 생물학을 이해하고 치료 요법의 결과를 정확하게 평가하기 위해서는 T. cruzi in vivo 감염의 신뢰할 수 있는 검출이 오랫동안 요구되어 왔습니다. 현재 프로토콜은 3D 재구성 및 제거 된 장기에서 T. cruzi 감염 세포의 자동 정량화를위한 통합 파이프 라인을 보여줍니다. 라이트 시트 형광 현미경을 사용하면 전체 장기 또는 조직에서 활발하게 증식하고 휴면 상태인 T. cruzi 기생충과 면역 이펙터 세포를 정확하게 시각화하고 정량화할 수 있습니다. 또한 항체 및 핵 염색으로 제거 된 장기의 균일 한 표지를 얻기위한 CUBIC-HistoVision 파이프 라인이 성공적으로 채택되었습니다. 3D 면역염색과 결합된 조직 투명화는 약물 치료 프로토콜을 종합적으로 평가하고 T. cruzi 감염 조직의 세포 조직에 대한 이해를 향상시키는 편견 없는 접근 방식을 제공하며 샤가스병의 항-T. 크루즈 면역 반응, 조직 손상 및 복구와 관련된 발견을 발전시킬 것으로 기대됩니다.

CUBIC 고정 조직을 PBS로 세척하여 고정액을 제거한 다음 조직에서 색소와 지질을 추출하는 아미노 알코올의 기본 완충 용액인 CUBIC-L 칵테일과 함께 배양하여 조직 구조를 유지하면서 조직을 탈색시켰습니다. 종이의 격자 선은 장기의 적절한 청소를 나타내는 조직을 통해 볼 수 있습니다 (그림 2A). 탈지화 후, 조직을 세척하고, RI 균질화 및 이미징을 위한 CUBIC-R+ 및 장착 용액에 각각 침지시켰다(도 2B).
야생형 마우스를 DiR 근적외선 시아닌 염료로 미리 염색된 td토마토 발현 트리포마스티고테에 감염시켰다. 마우스는 감염 후 15일 후에 안락사되었고, 온전한 심장은 해부, 고정 및 제거되었습니다. LSFM 이미징 및 3D 재구성을 통해 td토마토 발현 증식 T. cruzi 기생충...

본 프로토콜은 손상되지 않은 깨끗한 장기 및 조직에서 증식 및 휴면 중인 트리파노소마 크루지 기생충 및 T 세포를 시각화하고 정확하게 정량화하기 위한 광시트 형광 현미경 및 자동화된 소프트웨어 지원 방법을 설명합니다. 이러한 기술은 치료 결과를 평가하고 기생충-숙주 상호 작용에 대한 새로운 통찰력을 제공하는 신뢰할 수 있는 방법을 제공합니다.

트리파노소마 크루지 감염 세포, 휴면 무산소 및 손상되지 않은 정화 장기의 T 세포의 정량적 3D 이미징

Chagas disease is a neglected pathology that affects millions of people worldwide, mainly in Latin America. The Chagas disease agent, Trypanosoma cruzi ...

이 기술은 전체 투명 장기에 대한보다 완전한 3D 이미지를 제공했으며 복제뿐만 아니라 휴면 기생충 및 면역 인자 세포의 정량화에도 유용했습니다. 이 기술을 통해 기생충, 면역 세포 및 감염으로 인한 조직 손상의 특별한 연관성을 확인할 수 있습니다. 에피토프 면역염색 및 DNA 표지도 이 기술과 유사하였다.이 프로토콜은 샤가스병의 마우스 모델에서 치료 결과를 평가하는 데 효과적으로 사용되었습니다. 연장 된 치료 기간 동안 덜 자주 투여되는 더 높은 개별 용량의 치료는 복제 및 휴면 기생충을 모두 제거합니다. 이 절차를 시연하는 것은 Rick Tarleton 연구실의 연구 기술자 인 Caleb Hawkins가 될 것입니다.원고에 설명 된대로 감염된 마우스의 장기를 안락사, 해부 및 고정 한 후 각 장기를 50 % 물로 희석 한 CUBIC-L 10ml에 담그고 빛으로부터 보호 된 50 밀리리터 원추형 튜브에서 밤새 실온에서 부드럽게 흔들어줍니다. 다음날 50 % CUBIC-L을 100 % CUBIC-L 100ml로 교체하고 셰이커 인큐베이터에서 튜브를 평평하게 유지하면서 섭씨 37도에서 6 일 동안 배양합니다. 이 잠복기가 끝나면 조직은 거의 완전히 투명해야합니다.투명한 장기를 PBS로 섭씨 37도에서 2시간 동안 부드럽게 흔들어 두 번 씻습니다. 세척 할 때마다 조직을 새로운 50 밀리리터 원추형 튜브로 옮겨 Triton X-100을 제거합니다. DNA 염색을 위해, 시판되는 핵산 염료를 5밀리리터의 염색 완충액에 1:2, 500으로 희석한다.그런 다음 핵 염료 용액이 들어있는 15 밀리리터 원추형 튜브에 조직을 담그고 섭씨 37도에서 서있는 자세로 5 일 동안 부드럽게 회전하면서 배양합니다. 15 밀리리터의 3D 핵 염색 세척 완충액으로 부드럽게 흔들면서 실온에서 2 시간 동안 조직을 3 회 세척하십시오. 1 차 및 2 차 항체의 필요한 양을 계산하십시오.호박색 2 밀리리터 튜브에 1 차 및 2 차 항체를 혼합하고 섭씨 37도에서 1.5 시간 동안 배양합니다. 완충액 교환을 위해 7.5 밀리리터의 2x HV1 3D 면역 염색 버퍼를 7.5 밀리리터의 이중 증류수와 혼합하십시오. 조직 샘플을 완충액에 담그고 섭씨 32도에서 1.5 시간 동안 배양하고 수평 위치의 15 밀리리터 원추형 튜브에서 부드럽게 흔든다.완충액 교환 배지로부터 조직 샘플을 수집하고, 이를 항체 염색 용액에 침지시킨다. 섭씨 32도에서 일주일 동안 개별적으로 조직을 배양하여 빛에서 멀리 떨어진 서있는 위치에서 튜브를 부드럽게 흔 듭니다. 조직 샘플을 섭씨 4도로 옮기고 서 있는 자세에서 배양합니다.HV1 3D 면역염색 세척 완충액을 섭씨 4도로 냉각한 후, 샘플을 15밀리리터의 완충액으로 섭씨 4도에서 30분 동안 두 번 세척하고, 각각 수평 위치에서 부드럽게 흔들었다. 포르말린을 HV1 3D 면역 염색 세척 완충액에서 1%로 희석하고 부드럽게 흔들면서 섭씨 4도에서 24시간 동안 용액 8밀리리터에 샘플을 담그십시오. 이제 샘플을 섭씨 37도에서 1시간 동안 신선한 1%포르말린 용액에 배양하고 섭씨 25도에서 2시간 동안 PBS 15밀리리터로 세척합니다.투명한 장기를 실온에서 50 % 물 희석 CUBIC-R + 용액 50 밀리리터가 들어있는 50 밀리리터 원추형 튜브에 부드럽게 흔들어 담그십시오. 5 밀리리터 100 % CUBIC-R +로 교체하고 이틀 동안 부드럽게 흔들어 배양하십시오. Kimwipes를 사용하여 조직을 건조시킨 다음 6웰 배양 플레이트에 5밀리리터의 장착 용액으로 옮기고 실온에서 배양합니다.젤 슈퍼 접착제를 사용하여 조직을 현미경 샘플 홀더에 부착합니다. 120ml의 장착 용액으로 채워진 현미경 석영 큐벳에 샘플을 담그십시오. 그것들을 세로축에 가로로 이미지화하고 정점과 대동맥이 수평으로 정렬된 상태에서 심장을 부착합니다.3D 재구성 트리파노소마 크루지에 감염된 심장은 심실에 비해 심방에서 감염된 세포의 비율이 더 높았습니다. 휴면 기생충은 3D 확대 삽입에 묘사 된 것처럼 심장에서 식별 할 수 있습니다. ZsGreen1-발현 T 세포 뿐만 아니라 트리파노소마 크루지-감염된 세포는 트리파노소마 크루지에 감염된 CD8 리포터 마우스로부터 골격근에서 시각화하였다.3D 재구성 이미지의 3D 확대는 감염된 세포 영역에서 T 세포를 식별했습니다. 숙주-감염된 세포에서 T 세포의 계면을 공초점 현미경에 의해 시각화하였다. 면역 결핍 마우스의 심장에서 Trypanosoma cruzi의 두 가지 다른 균주에 감염된 숙주 세포가 검출되었으며, 조직을 통한 절단은 다양한 조직 깊이의 심장 심방에 풍부한 기생충 감염 세포를 보여주었습니다.Trypanosoma cruzi에 감염되고 맑아진 심장에서 혈관구조의 면역 검출은 심장의 복잡한 혈관을 나타냅니다. 기생충에 감염된 세포가 심장 심방에서 관찰 될 수 있습니다. 골격근의 핵 염색은 td토마토 기생충이 거의 없거나 검출되지 않는 부위에 핵이 축적된 것으로 나타났습니다.RFP 및 GFP에 대한 항체로 tdTomato 및 GFP 기생충 리포터 마커를 높이고 전체 골격근을 제거하면 강한 형광이 나타납니다. 따라서 임계점은 CUBIC 완충액에서의 배양 시간, DNA 염료의 희석 및 배양 시간, 항체에서의 배양 시간, 굴절 된 지수 일치 용액에서의 배양 시간입니다. 특정 항체 염료 및 빠른 반응과 함께 추가 염색을 사용하면 이 기술의 잠재력을 크게 증가시켜 손상되지 않은 장기에서 여러 세포, 공정 및 구조를 검출할 수 있습니다.우리는 이제 기생충을 죽이는 면역 세포, 기생충이 만성적으로 지속되는 조직 및 조직으로의 특정 약물의 분포를 탐구하는 더 좋고 완전한 방법을 가지고 있습니다.

quantitative-3d-imaging-trypanosoma-cruzi-infected-cells-dormant

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

우리는 GFP 형질 전환 말라리아 기생충이 장기 내에 기생충의 이동성과 혈액 흐름의 부량를 사용하여 비장의 intravital 현미경을 수행하는 방법을 보여줍니다.

비장의 Intravital 현미경 : 기생충 이동성 및 혈류의 정량 분석

우리는 고속 3D 라이브 세포 형광 현미경과 고해상도 cryo - 전자 단층 촬영을 결합하여 상호 현미경 방법을 설명합니다. 우리는 이미지 동적 호스트 헬라 세포와 상호 작용하는 작은 HIV-1 입자에 의해 상호 방식의 기능을 보여줍니다.

동적 상호 작용의 3 차원 구조 분석을위한 상호 현미경

이 프로토콜을 사용하여, 우리는 시각화 및 encysting 기생충 감염된 신경 세포 사이의 공간 관계의 분석을 가능하게 기생충 톡소 포자충, 감염된 마우스의 이미지를 160 μm의 두께 뇌 부분에 수 있었다.

신경 세포의 3 차원 이미징 및 분석 감염 생체와 톡소 포자충

이 원고는 말기 감염을 추적하기 위해 아프리카 트리파노좀의 생물 발광 균주를 사용하는 방법을 설명하고 in vivo 라이브 이미징을 사용하여 중추 신경계 내의 감염을 실시간으로 시각화하는 방법을 보여줍니다.

생물 발광 영상은 아프리카 트리파노소마 증의 늦은 단계의 감염을 감지하는

이 프로토콜에 붙일 레이블된 T. cruzi 투명 zebrafish 애벌레로 주입 했다 그리고 기생충 운동 성에서 관찰 되었다 vivo에서 빛 시트 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여.

조사 Trypanosoma cruzi 운동 비보 를 동물 모델로 서 애벌레 Zebrafish의 설립

Chagas 질병의 Trypanosoma cruzi 에이전트 오랫동안 무 증상 감염 갑자기 인식된 임상 병리학으로 개발 생산. 다음 연구 프로토콜 설명 짧은 실행 가족 기반 역학 연구를 푸는 T. cruzi 감염 성적으로 부모 로부터 자손에 전달 합니다.

치 메이 트 남성 및 여성에서 미국의 Trypanosomes의 성적인 전송

이 프로토콜은 샘플 수집, 대사 산물 추출, 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석 데이터 수집, 3D 모델 생성 및 마지막으로 데이터 시각화를 포함하여 trypanosomatid 감염 시 대사 산물 분포의 3D 모델을 생성하는 단계를 설명합니다.

화학 지도 제작 은 Trypanosomatid 감염을 연구 하는 접근

이 연구는 샤가스병의 원인이 되는 병원체인 트리파노소마 크루지(Trypanosoma cruzi)의 3가지 체외 수명 주기 단계에서 초구조 확장 현미경 검사를 수행하기 위한 상세한 프로토콜을 보여줍니다. 당사는 세포골격 단백질(cytoskeletal proteins) 및 범단백질체(pan-proteome) 라벨링에 최적화된 기술을 포함합니다.

Ultrastructural Expansion Microscopy in Three In Vitro Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi(트리파노소마 크루즈 의 3가지 체외 수명 주기 단계에서의 초구조 확장 현미경)

여기에서는 감염 중 병원성 박테리아를 장기 전체에서 검출하고 형광 리포터 활동을 정량화할 수 있는 절차에 대해 설명합니다.

고분해능 3차원 전장기 단층촬영(High-resolution three-dimensional whole-organ tomography of microbial infections)

여기에 제공된 프로토콜은 데이터 수집, 분석 및 해석에 중점을 두고 트리파노소마 크루지 감염의 생물 발광 모델에서 약물 효능 연구를 수행하기 위한 자세한 단계를 설명합니다. 기술적 문제를 최소화하기 위한 문제 해결 및 품질 관리 절차도 제공됩니다.

약물 효능 연구를 위한 샤가스병 마우스 모델의 In Vivo Bioluminescence 이미징 Demystifying In Vivo Bioluminescence Coaching

배우세요 광시트 형광 현미경을 활용한 휴면 및 증식 중인 트리파노소마 크루지 기생충과 T 세포의 3D 정량화 방법을. 조직 투명화와 자동화된 소프트웨어 분석으로 샤가스병 치료 효과를 평가합니다.

트리파노소마 크루지 감염 세포, 휴면 무산소 및 손상되지 않은 정화 장기의 T 세포의 정량적 3D 이미징

더 많은 동영상 탐색