Name: 3D 프린팅 기술을 이용한 혈관 플랩 제작 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: 학습하세요 3D 프린팅 기술을 이용한 혈관 플랩 제작 방법을 통해 계층적 혈관 네트워크를 구축하고 쥐 대퇴 동맥에 직접 문합하는 기술을 익히세요. 이 혈관화 조직 공학 기법은 큰 조직 결손 치료와 생체 내 혈관 통합 연구에 활용됩니다.

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이 프로젝트는 유럽 연합의 Horizon 2020 연구 및 혁신 프로그램 (보조금 계약 번호 818808)에 따라 유럽 연구위원회 (ERC)로부터 자금을 지원받았습니다. rhCollMA는 CollPlant (Rehovot, 이스라엘)에 의해 관대하게 제공되었습니다. 저자들은 동물 보호에 대한 도움을 주신 Technion의 전임상 연구 당국과 Janette Zavin, Galia Ben David 및 Idan Redenski에게 감사드립니다.

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저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

혈관화 된 조직 공학은 조직 공학20의 주요 과제 중 하나입니다. 공학적 혈관 조직을 만들기 위한 현재의 방법은 자기조립된 미세혈관구조(21,22,23)를 만들거나 중규모 혈관 스캐폴드(24,25)를 제작하는 데 초점을 맞추고 이식 시 즉시 그리고 직접 관류될 수 있는 계층적 혈관 구조 시스템을 재창조하는 데 초점을 맞추고 있다(26) . 이 작업에서는 두 가지 3D 인쇄 형식을 사용하여 마이크로 스케일과 중규모 혈관으로 구성된 계층 적 혈관 네트워크를 제작하는 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 3D 생체 인쇄, 자체 조립 된 미세 혈관 네트워크와 메조 스케일 혈관 스캐폴드를 결합하여 이식 가능한 혈관 플랩을 달성합니다. 또한,이 논문은이 플랩을 쥐의 대퇴 동맥에 직접 해부학하기위한 프로토콜을 제시합니다.
3D 바이오 프린팅은 전통적인 조직 공학 기술에 대한 다양성으로 인해 최근 몇 년 동안 관심을 끌었습니다. 이 프로토콜이 rhCollMA 바이오잉크에서 미세혈관 네트워크의 생성을 기술하는 반면, 사용된 방법은 연구되고 신규한 바이오잉크 및 지지욕(27,28)의 과다함으로부터 많은 다른 바이오잉크에 약간의 변형으로 적용될 수 있다. 우리는 인간 ECM에 I 형 콜라겐이 풍부하기 때문에 rhCollMA를 바이오 잉크로 사용하여 세포 부착에 적합한 환경을 제공하기로 결정했습니다. 더욱이, 그것은 식물에서 재조합적으로 생산되고 메타크릴레이트 그룹으로 추가로 변형되어 광중합 및 안정한 3D 하이드로겔29,30의 형성을 허용한다. 광가교는 광개시제 LAP의 첨가에 의해 달성되었으며, 이는 무독성인 것으로 나타났으며, 405 nm 청색광에 노출됨으로써 활성화되어, UV 광의 가능한 광독성을 감소시킨다. 그러나, 감광성 바이오잉크의 사용은 바이오잉크 및 지지체 물질의 제조를 위해 페놀 무함유 배양 배지의 사용을 필요로 한다. 또한, 프로토콜은 rhCollMA와 같은 바이오 잉크의 고충실도 압출을 가능하게하는 젤라틴 지지 물질의 사용을 설명합니다. 따라서 프린터 베드를 준비하고 냉각하는 동안 차가운 매체를 사용하는 것이 중요합니다. 과도한 가열은 가교에 사용되는 광원 또는 상승된 주변 온도로 인해 발생할 수 있습니다.
압출 기반 바이오 프린터는 생체 인쇄 된 미세 혈관 네트워크를 만들기 위해 여기에서 사용되어 왔으며 현재 유사한 구조를 생성 할 수있는 많은 상업적으로 이용 가능한 바이오 프린터가 있습니다. 더욱이, 제안된 방법들은 상이한 기하학들, 크기들, 및 채우기 패턴들을 연구하기 위해 쉽게 수정되고 적용될 수 있다. 이 작업에서는 상호 연결된 기공을 만들기 위해 직선형 채우기 패턴을 선택했으며, 이는 높은 충실도로 비교적 빠르게 인쇄 할 수 있습니다.
기포는 압출 바이오 프린팅, 특히 내부 지지 재료에 중요한 도전을 안겨줍니다. 따라서, 지지 물질의 이송, 바이오잉크-세포 현탁액의 준비, 및 인쇄 카트리지로의 이송을 위해 포지티브 변위 피펫을 사용함으로써 이러한 기포의 존재 및 형성을 최소화하는 것이 중요하다.
이 연구에서, 인간 지방 유래 내피 세포 및 치과 펄프 줄기 세포는 환자로부터 비교적 쉽게 분리되기 때문에 지원 세포로 사용되었다. 더욱이, 8 x 106 세포/mL의 총 세포 농도가 선택되었는데, 그 이유는 이 농도가 가장 발달된 혈관 네트워크(16)를 확립하는 것으로 보여졌기 때문이다. 이 프로토콜은 다른 세포 유형 및 소스뿐만 아니라 다른 바이오 잉크를 사용하여 미세 혈관을 생성하는 데 사용될 수 있지만, 미세 혈관 네트워크의 개발을위한 최상의 조건을 수립하기 위해 세포 농도의 교정이 수행되어야합니다. 또한, 조직-특이적 세포(즉, 근아세포 또는 조골세포)는 조직 특이적 혈관화된 플랩을 달성하기 위해 바이오잉크 내에 혼입될 수 있다.
다공성 혈관 스캐폴드용 몰드는 시판되는 압출 3D 프린터에서 3D 프린팅된 수용성 물질을 사용하여 제작되었다. 이는 신속한 프로토타이핑 플랫폼에 기초한 비용 효율적인 기술을 초래하여, 혈관 스캐폴드의 다양한 형상 및 크기가 신속하게 연구되고 스크리닝될 수 있게 한다(31). 그럼에도 불구하고, 이 방법의 한계는 대부분의 3D 프린터(32)의 해상도 한계이다. 그러나 적층 제조를 둘러싼 산업이 급속히 발전함에 따라 이러한 한계는 시간이 지남에 따라 개선 될 것으로 예상됩니다. 제조 공정을 위한 유기 용매의 사용은 프로토콜의 또 다른 한계이며, 대부분의 유기 용매는 세포에 독성이 있기 때문에, 바이오프린팅 절차와 혈관 스캐폴드 제조 공정을 결합하는 능력을 방지한다.
세포 현탁액을 밀어내는 것과 반대로 흡인을 사용하여 스캐폴드의 루멘을 시딩하는 기술된 방법은 시딩된 세포의 국소화에 큰 영향을 미친다. 음압을 사용하여 스캐폴드의 내부 내강으로의 내피화를 허용하면서 스캐폴드의 벽(16) 상의 천공을 통한 세포 현탁액의 임의의 유출을 최소화한다.
미세외과적 해부학을 위한 기술된 "커프" 방법은 상이한 혈관 스캐폴드 물질 또는 크기뿐만 아니라 광범위한 동물 모델에서 상이한 동맥 및 정맥에 용이하게 변형되고 적응될 수 있다. 프로토콜에 대한 적응에는 다른 폴리이미드 튜브 크기와 봉합사 크기가 포함됩니다. 이 방법은 스캐폴드 벽의 천공을 필요로하지 않으며, 이로 인해 결함이 발생할 수 있습니다. 이 작업은 많은 응용 프로그램으로 확장 할 수있는 프로토콜을 제공합니다. 중소 및 마이크로 스케일 혈관 구조의 제작과 조립 및 이식을 포함한이 프로토콜의 중요한 측면은 재건 응용 프로그램뿐만 아니라 혈관 및 기타 조직 공학 연구를위한 엔지니어링 플랩의 중요한 측면을 나타냅니다.

심한 조직 결함은 외상성 손상, 선천성 결함 또는 질병으로 인해 발생하며, 이러한 결함을 치료하기위한 현재의 황금 표준은 자가 이식편, 혈관화 된 조직 플랩 및 미세 혈관 프리 플랩을 조직 대체물로 사용하는 것입니다. 그러나, 이러한 옵션은 제한된 공여자 부위 조직 및 공여자 부위 이환률1의 단점을 갖는다. 따라서, 이러한 결함(2)을 교정하는데 사용될 수 있는 대체 조직 대체물에 대한 요구가 증가하고 있다. 조작된 조직 구축물의 두께는 세포를 향한 영양분 및 가스의 확산에 의해 제한되며, 따라서 적절한 혈관 네트워크는 크고 두껍고 적절하게 영양이 공급된 스캐폴드를 생성하는 데 필수적입니다.
숙주로부터 혈관 지지체의 생체내 모집, 스캐폴드 내의 성장 인자 및 사이토카인의 전달, 임플란트의 혈관 전형성, 마이크로패터닝 기술을 이용한 퍼퓨저블 분지화 마이크로혈관베드의 생성(4), 혈관 채널/네트워크 형성을 위한 희생 물질의 사용5 등 조작된 임플란트(3)의 혈관화를 촉진하기 위해 몇 가지 접근법이 적용되었다. , 뿐만 아니라 3D 생체 인쇄 구조 내에서 채널의 생성 5,6. 두꺼운 조직의 혈관화는 거대 규모 및 미세 모세관 규모의 혈관으로 구성된 계층 적 혈관 네트워크의 통합을 필요로합니다. 거대 규모의 혈관은 구조물 전체에 혈액을 효과적으로 분배하고 숙주 혈관을 가진 미세 외과 적 해부학을 허용하는 반면, 미세 모세관 규모의 혈관은 영양 확산을 허용합니다.
바이오 프린팅은 기존의 조직 공학 방법에 비해 제공하는 이점으로 인해 최근 몇 년 동안 강한 주목을 받고 있습니다. Tissues와 기관은 특정 아키텍처를 가진 복잡하고 복잡한 3D 객체입니다. 3D 바이오 프린팅은 생체 재료의 층을 고해상도로 증착 할 수있는 능력을 통해 복잡한 조직 및 장기 대용품 (예 : 신장, 폐, 간)을 만들 수 있습니다7. 압출 기반, 잉크젯 8, 레이저 보조 증착9,10 및 입체 조형 기반 11,12 바이오 프린팅을 포함한 여러 인쇄 기술이 바이오 인쇄에 적용되었습니다. 압출 기반 기술은 노즐과 반대되는 재료 벌크 표면에 압력을 가하여 노즐을 통해 재료를 압출하는 데 의존합니다.
현탁 하이드로겔(FRESH)의 자유형 가역적 매립은 압출된 물질이 지지조에 의해 제자리에 증착되고 고정되는 과립형 지지체 재료를 사용하는 바이오프린팅 기술(13,14)이다. 지지 배스는 가교 될 때까지 압출되고 미리 가교 된 바이오 잉크에 대한 기계적 지원을 제공합니다. 이 기술의 주요 장점은 지지 욕이 압출 후 및 가교(15) 전에 형상을 유지할 수없는 저점도 물질을 압출 할 수 있다는 것입니다. 이것은 바이오 잉크로 사용할 수있는 사용 가능한 재료의 풀을 확장합니다.
이 논문은 마이크로 스케일과 중규모 혈관을 결합한 혈관화 플랩의 생성을 위한 프로토콜을 제시한다. 이를 달성하기 위해, 생체인쇄된, 자기조립된, 미세혈관 네트워크는 재조합 인간 콜라겐 메타크릴레이트(rhCollMA) 하이드로젤에서 생성되고, 그 후 더 크고, 이식가능한 혈관 스캐폴드의 내부에 연결되어, 완전히 조작된 조직 플랩(16)을 생성한다. 조작 된 조직의 신속하고 직접적인 관류를 확립하기 위해서는 숙주 혈관에 대한 직접적인 미세 외과 적 해부학이 필요합니다. 상기 혈관 스캐폴드는 기존의 미세외과적 혈관벽 봉합법을 사용하여 해부학적으로 분석될 수 있는 충분한 봉합사 보유 강도를 갖지 않는다. 따라서 우리는 쥐의 일반적인 대퇴 동맥으로 해부학을 달성하기위한 "커프"17,18,19 방법을 설명합니다. 이 방법에서, 용기 끝은 혈관 벽을 천공 할 필요없이 원주 봉합사로 고정됩니다.
비록 제안된 프로토콜이 rhCollMA 환경에서 계층적 혈관구조를 연구하기 위해 준비되었지만, 이 접근법은 확장되고 다양한 새로운 응용에 적용될 수 있다. 이 프로토콜은 다양한 바이오잉크의 다양한 조직 특이적 세포를 바이오프린팅에 적용할 수 있다. 또한, 구조물의 기하학적 구조 및 크기는 대형 조직 재건 또는 생물학적 연구와 같은 특정 요구 사항에 맞게 쉽게 수정할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>1,4-Dioxane</td><td>Biosolve Chemical</td><td>42405</td><td></td></tr><tr><td>27 G x 0.5" 무딘 팁 디스펜싱 바늘</td><td>CML 공급</td><td>901-27-050</td><td></td></tr><tr><td>3cc 앰버 주사기 배럴 및 피스톤 세트</td><td>Nordson EFD</td><td>7012085</td><td>빛을 차단하고 조기 가교를 방지하는 데 사용되는 앰버 주사기</td></tr><tr><td>5-0 AssuCryl PGA 흡수 봉합</td>사 <td>Assut 봉합사</td><td></td><td>피부 상처 봉합에 사용되는 흡수성 봉합</td></tr>사 <tr><td>6-0 폴리프로펠렌 봉합</td>사 <td>Assut 봉합</td>사 <td>9351</td><td></td></tr><tr><td>Acland 클램프</td><td>S& T</td><td>B-1V</td><td></td></tr><tr><td>Adventitia 가위</td><td>S & T</td><td>SAS-15</td><td></td></tr><tr><td>앵글 3 호 보석상 겸자 S</td><td>& T</td><td>JFAL-3-18</td><td></td></tr><tr><td>BioAssemblyBot 400 3D 바이오프린터</td><td>고급 솔루션</td><td></td><td>6축 3D 바이오프린터</td></tr><tr><td>소 알부민 혈청 Probumin</td><td>Millipore</td><td>&nbsp; 82-045-1</td><td></td></tr><tr><td>부프레노르핀</td><td>vetmarket</td><td>B15100</td><td></td></tr><tr><td>BVOH 필라멘트</td><td>축어적</td><td>55903</td><td>수용성 1.75mm 직경 필라멘트</td></tr><tr><td>클램프 겸자</td><td>적용 S& T</td><td>CAF-4</td><td></td></tr><tr><td>치과 펄프 줄기 세포</td><td>Lonza</td><td>PT-5025</td><td></td></tr><tr><td>Dietrich 불독 클램프</td><td>Fine Science Tools (FST)</td> <td>18039-45</td><td></td></tr><tr><td>인산수소 나트륨 (Na2HPO4)</td> <td>Carlo Erba 시약</td><td>480141</td><td></td></tr><tr><td>해부 가위</td><td>S & T</td><td>18039-45</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, 고포도당, 페놀 없음 레드</td><td>Sartorius</td><td>01-053-1A</td><td></td></tr><tr><td>Duratears</td><td>Alcon</td><td>DJ03</td><td></td></tr><tr><td>ECM 미디어 + 총알 키트</td><td>Sciencell</td> <td># 1001</td><td></td></tr><tr><td>에탄올 96 %</td> <td>Gadot-Group</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco 35050061</td><td></td><td>글루타민 대체품</td></tr><tr><td>염소 안티 마우스 Cy3 항체</td><td>Jackson</td><td>115-166-072</td><td></td></tr><tr><td>Heparin Sodium&nbsp; 5,000 I.U./mL</td><td>Panpharma-Human</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>adipose microvascular cells</td><td>Sciencell</td><td>#7200</td><td></td></tr><tr><td>Human fibronectin</td><td>Sigma</td><td>F0895-5MG</td><td>A stock concentration of 1 mg/mL</td></tr><tr><td>Isoflurane, USP Terrell</td><td>Piramal Critical Care</td><td>NDC 66794-011-25</td><td></td></tr><tr><td>LifeSupport</td><td>Advanced Biomatrix</td><td>5244</td><td>FRESH 3D 바이오프린팅용 젤라틴 지원 슬러리</td></tr><tr><td>리튬 페닐-2,4,6-트리메틸벤조일포스피네이트(LAP)</td><td>시그마-알드리치</td><td>900889</td><td></td></tr><tr><td>저혈당 DMEM</td><td>Biological Industries</td><td>01-050-1A</td><td></td></tr><tr><td>MICROMAN E M1000E, 100-1,000 &micro; L</td><td>Gilson</td><td>FD10006</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-SMA 항체</td><td>Dako</td><td>M0851</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Gibco</td><td>11140068</td><td></td></tr><tr><td>바늘 홀더</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>12500-12</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde 용액 PBS</td><td>ChemCruz</td>에 4%;<td> SC-281692</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신-니스타틴 용액</td><td>생물학 산업</td><td>03-032-1B</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>시그마</td><td>P5368-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>폴리(에틸렌옥사이드), MW 250,000 to 400,000</td><td>Acros 유기물</td><td>178602500</td><td></td></tr><tr><td>폴리(L-락트산), IV 5.0 dl/g(PLLA)</td><td>Polysciencse, Inc.</td><td>18582-10</td><td></td></tr><tr><td>폴리이미드 튜빙, ID: 0.0249", OD: 0.0273"</td><td>Cole-Parmer</td><td>95820-05</td><td>미세 수술용 문어선을 제작하는 데 사용되는 얇은 벽 튜브</td></tr><tr><td>Prusa I3 MK2.5 3D 프린터</td><td>Prusa Research</td><td>http://www.prusa3d.com/</td> <td>인기 있는 상업용 3D 프린터</td></tr><tr><td>Resomer&nbsp; RG 503 H, 폴리(D,L-락타이드-코-글리콜라이드) (PLGA)</td><td>Evonik Industries</td><td>719870</td><td></td></tr><tr><td>rhCollMA</td><td>CollPlant</td><td>https://collplant.com/</td> <td>CollPlant(Rehovot, Israel)에서 넉넉하게 제공)</td></tr><tr><td>원형 핸들 바늘 홀더</td><td>S& T</td><td>B-15-8</td><td></td></tr><tr><td>메스 손잡이 - #3</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>작은 미세 직선 가위</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>14090-09</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Biosolve 화학</td><td>19030591</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨 이염기성(NaH2PO4)</td><td>Riedel-de Haen</td><td>4276</td><td></td></tr><tr><td>Solidworks</td><td>다쏘 시스템</td><td></td><td>CAD 소프트웨어</td></tr><tr><td>스트레이트 no.3 보석상 겸자</td><td>S & T</td><td>JF-3-18</td><td></td></tr><tr><td>스트레이트 톱니 겸자</td><td>Fine Science Tools (FST)</td> <td>11050-10</td><td></td></tr><tr><td>외과 용 메스 블레이드 No.15</td><td>Swann-Morton Limited</td><td>305</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>BioLab LTD</td><td>57836</td><td></td></tr><tr><td>TSIM</td><td>Advanced Solutions</td><td></td> BioAssembly Bot Vessel 확장기 용 <td>3D 슬라이싱 및 설계 소프트웨어</td></tr><tr><td>S</td><td>& T</td><td>D-5a.1</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Tivato 700 수술용 현미경</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

3d 프린팅 기술을 이용한 혈관 플랩 제작

Fabrication of Engineered Vascular Flaps Using 3D Printing Technologies

이식 가능하고 기능적이며 두꺼운 조직을 엔지니어링하려면 계층적 혈관 네트워크를 설계해야 합니다. 3D 바이오 프린팅은 인쇄 가능한 바이오 재료, 바이오 잉크 및 세포의 층에 질서 정연하고 자동 방식으로 레이어를 추가하여 조직을 만드는 데 사용되는 기술로, 전통적인 조직 공학 기술이 달성 할 수없는 매우 복잡한 구조를 만들 수 있습니다. 따라서 3D 바이오 프린팅은 밀리미터 혈관에서 미세 혈관 네트워크에 이르기까지 네이티브 혈관 구조 복합체 구조를 모방하는 매력적인 시험관 내 접근 방식입니다. 
과립형 하이드로젤의 3D 바이오프린팅의 발전은 저점도 세포외 매트릭스 기반 바이오잉크의 고해상도 압출을 가능하게 했습니다. 이 작품은 엔지니어링 된 혈관 조직 플랩을 제조하기위한 결합 된 3D 바이오 프린팅 및 희생 금형 기반 3D 인쇄 접근법을 제시합니다. 젤라틴 지지조 내에서 재조합 콜라겐-메타크릴레이트 바이오잉크를 이용한 내피 및 지지 세포의 3D 바이오프린팅은 자기조립된 모세관 네트워크의 제조에 활용된다. 이 인쇄된 미세혈관구조는 메조스케일 용기형 다공성 스캐폴드 주위에 조립되고, 희생적인 3D 프린트된 몰드를 사용하여 제작되며, 내피 세포로 시딩된다. 
이 조립체는 중규모 혈관의 내피를 주변 모세관 네트워크와 함께 아나스토모스로 유도하여, 조작된 조직 플랩 내에 계층적 혈관 네트워크를 구축한다. 그런 다음 조작 된 플랩은 커프 기술을 사용하여 쥐 대퇴골 동맥에 외과 적 해부학에 의해 직접 이식됩니다. 기술된 방법은 재건 수술 및 혈관화 연구에 사용하기 위한 다양한 혈관화된 조직 플랩의 제조를 위해 확장될 수 있다.

이 프로토콜은 혈관 스캐폴드 (그림 1Ai)와 생체 인쇄 된 미세 혈관 구조 (그림 1Aii)로 구성된 엔지니어링 플랩의 제조를 설명하며, 이는 메조 스케일 및 마이크로 스케일 혈관 구조를 달성하기 위해 조립되었습니다 (그림 1Aiii). 프로토콜에 따라, 혈관 스캐폴드의 BVOH 주형이 설계되고 3D 인쇄되었다(그림 1B,C). 획득 된 인쇄 된 구조물은 BVOH의 작은 가닥을 육안으로 검사했으며, 이는 금형의 빈 공간에서 발견 될 수 있습니다 (그림 1D). 이 가닥은 일반적으로 잘못된 재료 설정 또는 BVOH가 수분을 흡수했음을 나타냅니다. 이러한 가닥은 곰팡이의 불완전한 충전과 결과 혈관 스캐폴드의 구조적 결함으로 이어질 수 있으므로 제거해야합니다. 다음에, 주형을 PLLA:PLGA 용액으로 충전하고, 이어서 프로토콜에 기재된 바와 같이 동결건조 공정 및 세척 단계를 따랐다. 얻어진 PLLA:PLGA 혈관 스캐폴드를 육안으로 검사하여 혈관벽 완전성 및 루멘 개통도를 검증하였다(도 1E).
10 mg/mL의 농도로 중화된 rhCollMA 바이오잉크를 제조하고 PEO:LAP 용액과 1:1 비율로 조합하였다. Zs-Green1 및 치과용 펄프 줄기 세포로 표지된 인간 지방 미세혈관 내피 세포를 rhCollMA 바이오잉크로 재현탁시키고, 용액을 인쇄 카트리지에 로딩하고 프린터 상에 로딩하였다. 직선형 패턴(도 1D)을 갖는 중앙 채널을 갖는 박스 형상은 젤라틴 지지 욕조 내부에 생체인쇄되었다. 인쇄 후, 구조물을 가교 결합시키고, 지지 욕을 용해시키고 세척하였다. 배양 4일 후, 구축물을 생중-영상화하여 미세혈관 네트워크 자가조립을 확인하였다. 도 1D 는 생체인쇄 구축물에서 고도로 발달된 HAMEC-ZsGreen1 미세혈관 네트워크의 예를 도시한다.
다음에, 피브로넥틴-코팅된 혈관 스캐폴드를 인쇄된 구축물의 중앙 채널에 삽입하였다(도 2A). 조립된 구축물을 2일 동안 배양하였고, 그 동안 세포는 겔을 수축시키고, 이를 혈관 스캐폴드에 단단히 부착시켰다. 이어서, 혈관 스캐폴드를 프로토콜에 따라 tdTomato를 발현하는 HAMECs로 라이닝하였다. 배양 7일 후, 구축물을 고정시키고 이미지화하였다. 도 2B 는 생체인쇄된 미세혈관구조에서 내피 세포가 녹색으로 묘사되는 반면, 혈관 스캐폴드의 내피 내막은 적색으로 묘사되는 조립된 구조물의 측면도를 도시한다. 이미지는 생체 인쇄 된 젤에서 녹색 미세 혈관 자기 조립을 보여 주며, 혈관 스캐폴드는 적색 내피 세포로 줄 지어 있습니다. 배율이 높을수록 적색 내피 내막에서 유래 한 콩나물이 생 인쇄 된 미세 혈관 네트워크로 돋아나는 것과 아나스토모싱되는 것을 볼 수 있습니다 (그림 2C). 다음에, 작제물을 치과용 펄프 줄기 세포에 대한 마커로서 α평활근 액틴 (SMA)에 대해 염색하였다. 면역염색 후, 구축물을 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 사용하여 영상화하였다(도 2D).
마지막으로, 배양 7일 후, 조작된 플랩을 프로토콜에 기술된 바와 같이 래트의 대퇴동맥에 미세외과적으로 분석하였다. 대표적인 절차에 대한 비디오는 보충 비디오 S1에서 볼 수 있습니다. 도 2E 는 클램프 제거 전에 완성된 해부학의 대표적인 이미지를 나타내고, 도 2F 는 클램프 제거 및 지혈 후의 해부학 부위의 대표적인 이미지를 도시한다. 상처 폐쇄 전에 출혈이 보이지 않아야합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63920/63920fig01.jpg"> 그림 1: 제작된 메조- 및 마이크로스케일 용기의 대표적인 이미지. (A) 프로토콜 단계에 대한 개략적인 개요. 허락을 받아 복제16. (B) 혈관 스캐폴드의 희생 금형에 대한 CAD 설계. (C) 대표적인 3D 인쇄 희생 금형의 측면도(스케일 바 = 0.5mm). (d) 희생 주형의 상면도 (스케일 바 = 0.5 mm) (E) 설명 프로토콜을 사용하여 제조된 대표적인 혈관 스캐폴드 (스케일 바 = 5 mm). (F) 3D 생체 인쇄 rhCollMA 미세혈관 네트워크를 위한 CAD 설계. 그리드 라인 = 1 mm. (G) HAMEC-ZsGreen1을 녹색으로 보여주는 고도로 발달된 생체 인쇄 혈관 네트워크의 대표 이미지. 스케일 바 = 200 μm. 약어: CAD = 컴퓨터 지원 설계; rhCollMA = 재조합 인간 콜라겐 메타크릴레이트; HAMEC = 인간 지방 미세혈관 내피 세포; PLLA = 폴리-L-락트산; PLGA = 폴리락틱-코-글리콜산. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63920/63920fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63920/63920fig02v2.jpg"> 도 2: 조립된 혈관화된 플랩의 대표적인 이미지. (A) 생체인쇄된 미세혈관구조와 혈관 스캐폴드의 대표적인 조립체의 사진. 스케일 바 = 1 mm. (B) 혈관 스캐폴드의 내피 라이닝 4일 후 영상화된 대표적인 조작된 플랩의 측면도. 생체 인쇄 된 미세 혈관 구조는 녹색 (HAMEC-ZsGreen1)으로 표시되고 내피 내막은 빨간색 (HAMEC-tdTomato)으로 표시됩니다. 스케일 바 = 1 mm. (C) 녹색의 생체 인쇄 혈관 구조와 빨간색의 내피 라이닝 사이의 해부학의 대표적인 이미지. 스케일 바 = 200 μm. (D) 배양 7일 후 평활근 액틴(적색), 핵(청색) 및 내피세포(녹색)에 대한 면역염색의 대표적인 이미지. 스케일 바 = 0.1 mm. (E) 클램프 제거 전 및 (F) 클램프 제거 후 래트의 대퇴동맥을 갖는 조작된 플랩의 완성된 해부학의 대표적인 이미지. 약어: HAMEC = 인간 지방 미세혈관 내피 세포; SMA = 평활근 액틴; DAPI = 4',6-디아미디노-2-페닐인돌. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63920/63920fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 비디오 S1 : 쥐의 대퇴 동맥에 혈관 비계를 해부학하기위한 대표적인 미세 수술 절차. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63920/supplementary%20video%201%20(1).mp4" target="_blank">이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

엔지니어링 플랩은 통합된 기능적 혈관 네트워크가 필요합니다. 이 프로토콜에서, 우리는 계층 적 혈관 네트워크와 쥐 대퇴 동맥에 대한 직접적인 미세 외과 적 해부학을 포함하는 3D 인쇄 된 조직 플랩을 제작하는 방법을 제시합니다.

3D 프린팅 기술을 이용한 혈관 플랩 제작

Engineering implantable, functional, thick tissues requires designing a hierarchical vascular network. 3D bioprinting is a technology used to create ...

우리의 프로토콜을 통해 연구자들은 완전히 설계되고 이식 가능한 플랩 내에서 계층 적 혈관 네트워크를 생성 할 수 있으며, 이는 생체 내에서 통합되는 혈관 행동에 대한 새로운 연구를위한 길을 열었습니다. 이 기술은 두 가지 3D 프린팅 기술의 다양성을 결합하여 미세 수술을 사용하여 호스트 혈관으로 직접 해부학 적으로 분석 할 수있는 마이크로 및 메조 스케일의 용기를 만들고 조립합니다. 완전히 조작된 혈관화된 플랩은 큰 조직 결함을 치료하고 조직 개발 및 통합을 연구하기 위한 플랫폼을 제공하는 데 사용할 수 있습니다.제안 된 방법은 조직 특이적 세포의 혼입을 연구 할뿐만 아니라 다른 바이오 잉크 및 지지체 물질의 사용을 평가하기 위해 확장 될 수 있습니다. BVOH 주형을 30 마이크로리터의 중합체 용액으로 채우는 것으로 시작한다. 주형을 2분 동안 100배 g에서 원심분리하고, 완전한 충전을 보장하기 위해 추가로 20 마이크로리터의 중합체 용액으로 주형을 충전한다.채워진 금형을 영하 80도에서 적어도 30 분 동안 동결시켜 모든 폴리머 용액이 동결되도록하십시오. 밤새 동결건조하여 주형으로부터 용매를 제거한다. 희생 몰드 재료를 제거하려면 동결 건조 공정 후 몰드를 부드러운 교반 하에 5리터 탈이온수 욕조로 옮깁니다.흐려지면 욕조의 물을 교체하십시오. 모든 BVOH가 용해되면, 스캐폴드를 공기 건조시키고 사용 전까지 진공 챔버에 보관한다. 준비된 압축 된 지지 재료의 약 4 밀리리터를 포지티브 변위 피펫을 사용하여 12 웰 플레이트의 각 웰로 옮깁니다.딱딱한 표면의 웰 플레이트를 탭하여 지지 재료가 웰에 고르게 퍼지도록 강제합니다. 2백만 HAMEC-ZsGreen과 6백만 개의 치과용 펄프 줄기세포를 10밀리리터의 내피세포 배지에 담은 현탁액을 준비한다. 세포 현탁액을 200배 g에서 4분 동안 원심분리하여 세포 펠릿을 수득한 다음, 상층액 배지를 흡인하고 세포 펠릿을 1 밀리리터의 rhCollMA 바이오잉크에 재현탁시켜 바이오잉크 1 밀리리터당 총 세포 농도 8백만 세포의 바이오잉크를 얻었다.0.22mm 내부 직경 바늘을 3밀리리터 호박색 인쇄 카트리지에 맞추고 카트리지를 50밀리리터 원뿔형 튜브에 넣습니다. 1 밀리리터의 세포-바이오잉크 혼합물을 포지티브 변위 피펫을 사용하여 위에서 채워서 인쇄 카트리지로 옮겨 기포를 줄입니다. 인쇄 카트리지를 바이오 프린터의 해당 도구에 설치합니다.중앙에 직경 2mm 원형 채널이 포함된 4mm 정사각형의 2D 패턴을 스케치합니다. 스케치를 4mm 밀어서 중앙 채널이 있는 4mm 큐브를 가져옵니다. 이 개체를 STL 파일로 내보냅니다.12웰 플레이트 STL 템플릿을 바이오프린터 슬라이싱 소프트웨어의 솔리드 모델링 탭으로 가져와 가상 프린트 베드의 지정된 영역에 배치합니다. 큐브 모양의 STL 파일을 바이오 프린터 슬라이싱 소프트웨어의 솔리드 모델링 탭으로 가져옵니다. 외부 슬라이서 사용 확인란을 클릭한 다음 개체 속성 섹션 아래에서 슬라이서 구성을 클릭합니다.팝업 창에서 채우기 패턴의 직선형 패턴을 선택하고 채우기 밀도에 30%를 입력하고 수락을 클릭합니다. 큐브를 클릭하고 마우스를 사용하여 큐브 모양의 복사본을 원하는 각 가상 웰에 배치합니다. 바이오 프린터 슬라이싱 소프트웨어의 재료 탭에서 재료 추가 버튼을 클릭하여 rhCollMA 바이오 잉크에 대한 새로운 재료 설정을 만듭니다.인쇄할 재료 설정을 선택합니다. 압력의 경우 2 psi를 입력하고 속도의 경우 해당 상자에 초당 20 밀리미터를 입력하십시오. 선 너비 및 선 높이 값을 0.24mm로, 가속도 값을 평방 초당 400mm로 할당합니다.솔리드 모델링 탭에서 큐브 객체를 클릭한 다음 재료 섹션에서 rhCollMA 재질을 클릭하여 큐브 모양에 할당합니다. bioassembly 탭에서 인쇄 작업 보내기 단추를 클릭하여 인쇄 작업을 바이오 프린터로 보냅니다. 셀룰러 바이오잉크가 로딩된 인쇄 카트리지를 3D 압출 기반 바이오프린터의 3밀리리터 주변 공압 분배 도구에 로드합니다.바이오 프린터 인터페이스 화면의 가열 또는 냉각 제어 탭 아래의 냉각 버튼을 클릭하여 인쇄층 온도를 섭씨 4도까지 설정하십시오. 프린터 침대에 지지대와 함께 플레이트를 로드합니다. 바이오 프린터 인터페이스 화면의 인쇄 탭에서 인쇄 작업을 클릭 한 다음 시작을 클릭 한 다음 GO를 클릭하여 인쇄 작업을 시작하십시오.인쇄 후, 웰 플레이트를 평방 센티미터당 3밀리와트의 강도로 305나노미터 광원에 30초 동안 노출시켜 rhCollMA 바이오잉크의 가교결합을 개시한다. 가교결합 후, 웰 플레이트를 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소에서 모든 지지체 욕조가 녹을 때까지 적어도 20분 동안 인큐베이션한다. 액화된 지지체 배쓰를 부드럽게 흡인하고 내피 세포 배지로 교체한다.섭씨 37도에서 구조물을 인큐베이션하고 5 % 이산화탄소를 배양하십시오. 생체 인쇄 된 미세 혈관 네트워크의 지지체 물질 제거 직후, 피브로넥틴 코팅 PLLA:PLGA 혈관 스캐폴드를 생체 인쇄 구조 옆에 놓습니다. 혈관 스캐폴드를 생체 인쇄 구조의 주 채널에 삽입하십시오.조립 된 구조물을 섭씨 37도, 이산화탄소 5 %에서 이틀 동안 배양하십시오. tdTomato 발현 인간 지방 미세혈관 내피 세포의 세포 현탁액을 밀리리터당 1천만 세포의 농도로 제조한다. 이 세포 현탁액의 20 마이크로 리터 액적을 소수성 표면에 놓습니다.혈관 스캐폴드를 액적 위에 부드럽게 올려 놓으면 한쪽 끝에있는 스캐폴드의 내강이 세포 액적과 접촉합니다. 스캐폴드의 반대쪽 끝에서 물방울을 흡인하여 세포 현탁액으로 루멘을 채 웁니다. 앉은 스캐폴드를 마이크로 원심분리 튜브에 넣고 60분 동안 가습 인큐베이터 내부의 회전기에 넣습니다.마지막으로, 스캐폴드를 12-웰 플레이트로 옮기고 2 밀리리터의 내피 세포 배지를 첨가한다. 혈관 스캐폴드의 내피 라이닝 후 나흘 후에 이미지화된 대표적인 조작된 플랩의 측면도가 여기에 도시되어 있다. 생체 인쇄 된 미세 혈관은 녹색으로 표시되고 내피 내막은 빨간색으로 표시됩니다.대표적인 이미지는 생체 인쇄 된 혈관 구조와 내피 내막 사이의 해부학을 보여줍니다. 칠일 배양 후 평활근 액틴, 핵 및 내피 세포에 대한 면역염색이 여기에 제시되어 있다. 대표적인 이미지는 클램프 제거 전과 클램프 제거 후 쥐의 대퇴 동맥을 가진 엔지니어링 플랩의 완성 된 해부학을 보여줍니다.이 기술은 생체 내에서 3D 인쇄 혈관 구조의 성숙 및 통합을 연구하고 뒷다리에 임플란트의 관류를 모니터링하여 조직 결함을 치료하는 데 사용할 가능성과 안전성을 확립하는 데 사용할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

현재까지 두꺼운 조직 결손은 일반적으로 자가 조직 플랩 또는 엔지니어링 조직을 적용하여 재구성됩니다. 이 프로토콜에서는 자가 피판을 대체하기 위해 자가 척추경을 지닌 혈관 조직 피판을 엔지니어링하는 새로운 방법을 제시합니다.

엔지니어링 혈관을 근육 플랩

확장 가능한 설계 혈관 임상 적용 가능성을 향상시킬 것입니다. 쉽게 상당한 3D 인쇄 가이드 사용, 혈관 평활근의 고리가 생성되었고, 혈관 이식을 형성, 튜브형 형태로 쌓여있다. 이식 단순히 3D 인쇄 된 안내서의 크기를 변화시킴으로써 인간 동맥 치수의 범위를 만족하는 크기로 할 수있다.

3D 인쇄 가이드 및 반지 스태킹 방법을 사용하여 엔지니어링 혈관 이식의 크기 조정

우리 어디 보조 세포 유형 수 더 시드할 수이 microfibrous 구조 vascularized 조직 및 organoids를 생성 하는 틈새 공간으로 microfibrous 혈관 침대 엔지니어링에 대 한 미세 bioprinting 전략에 따라 일반화 된 프로토콜을 제공 합니다.

공학에 대 한 미세 Bioprinting 나가도록 조직 및 Organoids

여기, 우리는 선 천 성 대동맥 예외를 처리할 때 수술 계획 및 복잡 한 혈관 위치의 내부 요원 개편에 대 한 3 차원 인쇄 모델을 사용 하는 프로토콜을 제시.

복잡 한 대동맥 변칙의 3 차원 인쇄

이 프로토콜의 구조 조직 구조 엔지니어링 3D 인쇄를 decellularized 행렬 (DM)를 포함 하는 임베디드 polylactic 산 (PLA) 스피어와 polycaprolactone (PCL) 필 라 멘 트의 생산을 설명 합니다.

3D 인쇄에 대 한 새로운 과정 Decellularized 행렬

여기에 제시된 것은 혈관 및 기타 관 구조의 조직 공학에 적합한 중공 비계의 한 단계 제작을 위한 사용이 간편한 코어/쉘, 3차원 생체 인쇄 설정입니다.

관 구조의 조직 공학을 위한 코어/쉘 인쇄 비계

본 프로토콜은 돼지 근막-피부 피판 모델과 혈관화된 복합 조직 연구에서의 잠재적 용도를 설명합니다.

혈관화된 복합 동종이식편 생명공학 연구를 위한 신뢰할 수 있는 돼지 근막-피부 피판 모델

이 프로토콜은 맞춤형 관류 생물 반응기에서 플랩 혈관 구조를 통해 나트륨 도데 실 설페이트 세제의 관류에 의한 혈관 화 된 돼지 플랩의 외과 적 조달 및 후속 탈세포화를 설명합니다.

맞춤형 관류 생물 반응기에서 돼지 혈관 플랩의 조달 및 관류-탈세포화

이 기사에서는 세포외 기질 경화 및 섬유아세포 활성화를 연구하기 위해 광조정 가능 하이드로겔을 3D 바이오프린팅하는 방법을 설명합니다.

섬유아세포 활성화를 연구하기 위한 3D 바이오프린팅 광조정 가능 하이드로겔

당사는 VOP(vessels-on-a-plate)라고 하는 3D 바이오프린팅 기술을 사용하여 표준 6웰 플레이트에서 유연한 크기와 원하는 패턴을 가진 혈관 채널의 고처리량 생산을 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 플랫폼은 손상된 내피와 관련된 질환에 대한 치료법 개발을 발전시킬 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.

크기 및 패턴 유연성을 갖춘 표준 six-well plates의 혈관 투과성을 모델링하기 위한 High-throughput Bioprinting 방법

학습하세요 3D 프린팅 기술을 이용한 혈관 플랩 제작 방법을 통해 계층적 혈관 네트워크를 구축하고 쥐 대퇴 동맥에 직접 문합하는 기술을 익히세요. 이 혈관화 조직 공학 기법은 큰 조직 결손 치료와 생체 내 혈관 통합 연구에 활용됩니다.

3D 프린팅 기술을 이용한 혈관 플랩 제작

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