초저온 전자 단층 촬영 원격 데이터 수집 및 서브 단층 촬영 평균화
July 12th, 2022
본 프로토콜은 Tomo5를 사용한 고분해능 초저온 전자 단층 촬영 원격 데이터 수집과 emClarity를 사용한 후속 데이터 처리 및 서브 단층 촬영 평균화를 설명합니다. 아포페리틴은 2.86 Å 분해능에서 cryo-ET 구조를 달성하기 위한 자세한 단계별 프로세스를 설명하기 위한 예로 사용됩니다.
이 프로토콜은 점점 더 대중화되고 있지만 복잡한 초저온 전자 단층 촬영의 세계로 쉽게 접근할 수 있는 경로를 제공합니다. 6개의 세포 표본을 이미지화할 수 있습니다. 원주민에 가까운 연구소.
그런 다음 미세 분자는 CROW, ET 및 하위 원자 평균화를 사용하여 기본 세포 환경에서 고해상도로 분해 될 수 있습니다. TEM 서버 PC에서 Tomo five 소프트웨어를 시작하여 시작하십시오. Presets(사전 설정) 아래의 준비 탭에서 이미지 획득 파라미터를 조정하여 세션 설정을 시작합니다.
이미지 획득 파라미터를 다른 모든 고배율 사전 설정에 복사합니다. 설정"을 눌러 현미경에 대한 노출을 설정하고 Get"을 눌러 개별적으로 선택한 후 다른 모든 고배율에 대한 노출 설정을 가져옵니다. 아틀라스를 수집하려면 아틀라스"탭에서 새 세션"을 클릭하십시오.
세션 기본 설정을 지정합니다. 저장 경로와 출력 형식을 입력하고 적용을 누릅니다. 선별"을 선택하고 획득할 모든 지도책을 선택합니다.
콜 밸브 닫기를 선택하십시오"현미경이 감독되지 않으면 컬럼 밸브가 닫힙니다. 그런 다음 심사를 시작하려면 시작 버튼을 누르십시오. 세션 설정에서 왼쪽 패널의 그리드를 클릭하여 대상에 대한 단일 또는 다중 지도책을 검사합니다."그런 다음 마우스 왼쪽 버튼을 클릭하고 드래그하여 이동하고 가운데 스크롤하여 확대 및 축소합니다.
대상 설정에 대한 그리드를 선택합니다. 그것을 선택하고 소프트웨어 내부에서 샘플로드를 클릭하십시오. 이미지 이동 보정을 수행하려면 자동 기능"탭에서 사전 설정을 Eucentric 높이"자동 Eucentric으로 탐색"스테이지 기울기로 설정하고 시작을 누릅니다.
타겟팅 중에 피처가 중앙에 유지되면 이미지 이동 보정을 건너뜁니다. 그렇지 않으면 이미지 시프트 보정을 위한 준비" 탭으로 이동하여 이미지 시프트 보정을 선택하고 시작을 누릅니다. 이렇게 하면 낮은 배율이 노출 배율을 중심으로 하는 피처에 정렬됩니다.
단층 촬영 설정의 경우 생물학적 샘플의 경우 세션 설정"에서 새 세션을 시작하십시오. 선택 슬래브 같은"샘플 유형으로 선택하고 배치"및 저용량"그런 다음 출력 형식 및 저장"폴더를 선택하십시오. 선택적으로 이메일 수신자를 추가하고 적용"대상을 설정하려면 아틀라스 화살표로 이동하여 관심 영역을 찾은 다음 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하면 나타나는 옵션을 선택하여 이동하십시오.
개요 이미지를 찍어 Eucentric 높이 조정에 적합한 위치를 확인합니다. 그런 다음 autoeucentric"을 눌러 단계 기울기로 유센트릭 루틴을 실행하고 새 개요 이미지를 다시 획득하여 유센트릭 높이를 업데이트합니다. 사각형 개요 또는 획득한 검색 맵을 검사합니다.
관심 지역으로 이동하고 검색 획득을 누릅니다. 그런 다음 관심 영역이 중앙에 있지 않은 경우 검색 이미지를 검사하고 원하는 위치를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 여기에서 단계 이동"을 반복하고 이미지를 획득합니다. 초점 및 추적 영역을 조정합니다.
마우스 왼쪽 버튼을 클릭하여 추적 및 초점 영역을 끕니다. 모든 매개 변수가 설정되면 위치 추가"자동 기능을 수행하려면 아틀라스를 탄소 영역으로 이동하여 자동 기능을 통해 정렬을 수행하는 설정을 확인하십시오"탭. 그 영역을 유센트릭 높이로 가져오고 텍스트 원고에 설명된 대로 정렬 순서를 따르십시오.
다음으로 단층 촬영 탭의 자동 획득을 시작하십시오. 데이터 수집"슬래브 아웃을 선택하고 원하는 매개 변수를 설정하십시오. 데이터 수집 매개 변수 설정 : 틸트 단계, 최대 포지티브 각도, 최대 네거티브 각도, 추적 체계.
그런 다음 유센트릭 높이 구성표에 대해 컬럼 밸브 닫기"를 선택합니다. 입력 파일 및 디렉토리 준비부터 시작하십시오. Project" 폴더 아래에 프로젝트 폴더를 설정합니다.
다른 새 폴더 고정 스택을 만들고 입력 파일을 준비합니다. 틸트 시리즈 1 고정 틸트 시리즈 1. XF 및 틸트 시리즈 1.tlt.
디포커스를 계산하려면 현미경 및 이미징 파라미터로 파라미터 파일을 업데이트합니다. 매개 변수 파일을 프로젝트 폴더에 복사합니다. 이름을 param_CTF로 변경합니다.
M을 클릭하고 표시된 명령을 실행합니다. 다음으로 CTF 추정 결과를 확인합니다. 각 스택에 대해 3D 모드를 사용하여 정렬된 스택을 확인하고 기준 비드가 올바르게 지워졌는지 확인합니다.
표시된 명령을 실행하여 손잡이가 올바른지 확인하십시오. 그런 다음 디포커스 값을 확인하고 이론적인 CTF 추정치와 일치하는지 확인합니다. 하위 영역을 정의하려면 벤드 단층 촬영을 생성합니다.
프로젝트 폴더에서 표시된 명령을 실행합니다. 6개의 점 Xmin Xmax Ymin, Ymax, Zmin 및 Zmax를 선택하여 경계를 결정하고 bin10 폴더 아래에 하나의 하위 영역을 만들려면 표시된 명령을 실행합니다. 다음으로 각 하위 영역에 대해 파티클 선택을 실행합니다.
아포페리틴 데이터 세트의 경우 빈 6에서 템플릿 검색을 수행합니다. 템플릿 밑줄 각도를 수정합니다. 검색 매개 변수를 사용하여 각도, 범위 및 간격을 결정하는 평면 내 또는 평면 밖 검색도 단위입니다.
프로젝트 폴더에서 표시된 명령을 실행합니다. 폴더 아래의 3D 모드를 사용하여 잘못된 입자를 제거합니다. Convmap_wedge_Type2_bin6. 표시된 명령을 실행합니다.
그런 다음 프로젝트를 초기화합니다. 프로젝트 폴더에서 표시된 명령을 실행하여 EM 명확성을 위한 데이터베이스인 AppoF.mat를 만듭니다. 서브 토모 평균화 및 정렬 전에 단층 촬영 재구성을 수행하여 bin4에서 CTF 보정된 하위 영역 단층 촬영을 생성하고 표시된 명령을 실행합니다.
다음으로, 서브 토모 평균화 및 정렬을 수행하려면 bin4에서 시작하는 CTF 보정된 서브 텔레그램을 사용하여 평균화를 수행합니다. 프로젝트 폴더에서 표시된 명령을 실행합니다. 계속해서 정렬을 수행하고 명령을 실행합니다.
표시된 명령을 실행하여 겹쳐진 입자를 청소합니다. 두 개의 절반 데이터 세트를 결합하여 최종 재구성을 수행합니다. 프로젝트 폴더에서 표시된 명령을 실행합니다.
세포 및 분자 단층 촬영을 위한 단층 촬영 워크플로우의 개요는 세포 및 라멜라 샘플에 대해 여기에 나와 있으며, 데이터 수집 전략은 주로 샘플과 이미징 연구의 목표에 따라 달라집니다. 여러 cryo ET 연구에 대한 수집 매개 변수가 여기에 나와 있습니다. 아포페리틴과 같은 분자 샘플의 대표적인 단층 촬영, 얇은 세포 과정 및 두꺼운 세포 표본의 집속 이온 빔 밀링 라멜라가 여기에 표시됩니다.
고해상도 구조 분석은 약물 표적에 대한 결합 부위를 밝히는 데 도움이 될 수 있으며 단층 촬영 및 하위 토모그랄 평균화도 SARS-CoV-2에 대한 백신 개발에 도움이 되었습니다.
개요
이 프로토콜은 apoferritin을 모델 시스템으로 사용하여, 고해상도 극저온 전자 단층촬영법(cryo-ET)의 원격 데이터 수집 및 처리에 대한 상세한 단계를 설명합니다. 이 워크플로우는 2.86 Å의 극저온 전자 단층촬영법 구조 분해능을 달성하여, 데이터 수집부터 서브 단층촬영 평균까지의 효율적인 방법을 보여줍니다.
주요 연구 구성 요소
연구 분야
- 극저온 전자 단층촬영법
- 구조 생물학
- 세포 이미지화
배경
- 극저온 전자 단층촬영법 기술 소개.
- 원래 상태의 세포 시료 이미지화의 중요성.
- 방법론적 설명을 위한 apoferritin의 사용.
사용된 방법
- Tomo5 소프트웨어를 사용한 원격 데이터 수집.
- 서브 단층촬영 평균을 위한 emClarity를 사용한 처리 방법.
- 생물학적 시스템에서의 고해상도 이미지화.
주요 결과
- 고해상도 데이터 수집 및 처리를 성공적으로 시연합니다.
- 상당한 해상도로 apoferritin의 상세한 이미지화를 달성합니다.
- 미래의 극저온 전자 단층촬영법 연구를 위한 방법론의 검증.
결론
- 이 연구는 구조 생물학에서의 고해상도 이미지화를 위한 체계적인 접근법을 제공합니다.
- 설명된 방법론은 극저온 전자 단층촬영법 연구를 발전시키는 데 관련이 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Cryo-electron tomography (cryo-ET) with remote data collection and subtomogram averaging enables high-resolution structural analysis of macromolecules in near-native cellular environments. This capability is critical for target validation, mechanistic de-risking, and accelerating early discovery decisions in biopharma R&D. The integration of robust remote workflows ensures uninterrupted access to advanced imaging infrastructure, supporting portfolio continuity and cross-site collaboration.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of molecular complexes in situ, supporting functional target validation.
- Facilitates mechanistic de-risking by revealing native conformations and interactions.
- Improves predictive confidence for target engagement and pathway interrogation.
Screening & Assay Development
- Provides validated structural templates for downstream assay development.
- Supports reproducible, quantitative imaging outputs for screening readiness.
- Enables standardization of sample preparation and imaging parameters across projects.
Translational & Preclinical Research
- Aligns high-resolution imaging with disease-relevant systems for translational biomarker discovery.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by maintaining native-state structural fidelity.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on structural insights.
Pipeline & Workflow Integration
This remote cryo-ET workflow bridges early discovery, lead identification, and preclinical research by providing high-resolution, quantitative structural data accessible from any location.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through direct molecular visualization.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging outputs for assay standardization.
- Analytics: Enables robust measurement of structural parameters and statistical comparison across conditions.
- Translational Research: Maintains structural continuity for biomarker alignment and disease modeling.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, remote-access imaging capability for multi-program support.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes imaging workflows and enables remote, scalable data collection.
- Strategic Value: Supports informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization and cross-functional advancement decisions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryo-EM instrumentation and data analysis software (Tomo5, emClarity).
- Demands robust IT infrastructure for remote access and data storage.
- Necessitates cross-team standardization of imaging and analysis protocols.
- Adaptation across diverse sample types may require protocol optimization.
- Practical limitations include sample thickness, imaging throughput, and computational resources.
