RNA 형광 제자리 혼성화(FISH)를 통해 Caenorhabditis elegans 장에서 미생물 집락화 및 감염을 시각화합니다.

세포 외 박테리아와 오르세 바이러스 및 미세 포자충 (곰팡이)과 같은 세포 내 병원체를 포함한 장내 미생물은 종종 야생 Caenorhabditis 선충류와 관련이 있습니다. 이 기사에서는 C. elegans 선충류에 서식하는 미생물을 검출 및 정량화하고 실험실에서 통제 된 감염 후 병원체 부하를 측정하기위한 프로토콜을 제시합니다.

RNA FISH 염색은 마이크로바이옴 박테리아 및 세포 내 병원체를 포함하여 C.elegans에 자연적으로 서식하거나 감염시키는 미생물의 시각화, 식별 및 정량화에 유용합니다. 이 기술은 간단하고 빠르며 견고하여 온전한 동물 전체의 맥락에서 미생물을 효과적으로 염색하고 시각화 할 수 있습니다. RNA FISH를 사용하여 야생 C.elegans에서 장내 미생물 군집 박테리아를 감지하고 시각화 할 수 있습니다.

이것은 포유류 시스템에서 비교 가능한 상호 작용을 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. NGM 플레이트에서 미세 원심분리 튜브로 원하는 미생물로 선충을 옮긴 후 1X PBST 1밀리리터를 미세 분리 튜브에 추가하여 선충을 세척합니다. 마이크로 원심 분리기 또는 나노 퓨지에서 적절한 속도로 샘플을 회전시킵니다.

피펫을 사용하여 100 마이크로 리터의 상청액을 제외한 모든 것을 제거하십시오. PBST로 2-3회 세척을 반복합니다. 파라포름알데히드로 선충류를 고정하려면 선충 펠릿 위에 100마이크로리터의 상청액이 들어 있는 미세원속 튜브에 33마이크로리터의 16%파라포름알데히드를 추가하여 최종 농도가 4%파라포름알데히드가 되도록 합니다.

관심있는 미생물에 집락되거나 감염된 선충류를 함유하는 샘플을 실온에서 30 내지 45분 동안 인큐베이션한다. 파라포름알데히드 용액을 제거하고 0.5밀리리터의 PBST를 샘플에 추가합니다. 텍스트 원고에 언급된 대로 적절한 속도로 미세 원심분리기에서 샘플을 회전시킵니다.

피펫을 사용하여 펠릿을 방해하지 않고 가능한 한 많은 상청액을 제거하십시오. 미세원심분리 튜브의 샘플에 0.5밀리리터의 PBST를 추가합니다. PBST로 2-3회 세척을 반복합니다.

마지막 세척 후 샘플을 스핀다운하고 상청액을 제거하여 펠릿을 그대로 둡니다. 다음으로, 샘플당 1밀리리터의 혼성화 완충액을 준비한다. 800 마이크로리터의 혼성화 완충액을 선충류 펠릿을 포함하는 마이크로원거리 튜브에 첨가한다.

마이크로 원심 분리기에서 샘플을 펠릿합니다. 펠릿을 방해하지 않고 상청액을 제거하십시오. 시료당 100 마이크로리터의 하이브리드화 완충액을 원하는 FISH 프로브와 혼합하여 프로브 당 5 내지 10 나노그램의 최종 농도로 준비한다.

각 샘플에 FISH 프로브를 포함하는 100마이크로리터의 혼성화 버퍼를 추가합니다. 튜브를 부드럽게 튕기거나 뒤집어 섞습니다. 샘플을 섭씨 46도에서 54 도의 건조 수조 또는 섭씨 46도에서 54 도의 열 혼합기에서 분당 1, 200 회전으로 밤새 배양하십시오.

샘플 당 3 밀리리터의 세척 완충액을 준비하십시오. 적절한 속도로 샘플을 원심분리합니다. 피펫을 사용하여 혼성화 완충액을 제거하면서 선충 펠릿을 방해받지 않도록 주의하십시오.

준비된 세척 버퍼 1ml을 각 샘플에 추가합니다. 적절한 속도로 샘플을 원심분리합니다. 펠릿이 방해받지 않도록 주의하면서 피펫을 사용하여 세척 버퍼를 제거합니다.

준비된 세척 버퍼 1ml을 각 샘플에 추가합니다. 샘플을 건조 수조 또는 섭씨 48도에서 56도에서 섭씨 48도에서 56도에서 분당 1, 200 회전으로 1 시간 동안 배양합니다. 마른 욕조에서 배양하는 경우 15-20 분마다 튜브를 부드럽게 뒤집습니다.

적절한 속도로 샘플을 원심분리합니다. 피펫을 사용하여 세척 버퍼를 제거하고 펠릿을 방해하지 않도록 주의하십시오. 각각의 샘플에 100 내지 500 마이크로리터의 PBST를 첨가한다.

이 시점에서 샘플은 프로토콜이 계속될 준비가 될 때까지 최대 일주일 동안 섭씨 4도의 PBST에 보관할 수 있습니다. 적절한 속도로 샘플을 펠릿합니다. 선충 펠릿을 방해하지 않고 가능한 한 많은 PBST를 제거하십시오.

DAPI가 있는 20마이크로리터의 페이드 방지 장착 매체를 샘플에 추가합니다. 20 마이크로리터 피펫 팁으로 200마이크로리터 피펫터를 로드하고 가위를 사용하여 피펫 끝을 잘라 더 큰 선충을 피펫팅할 수 있도록 합니다. 절단된 피펫 팁을 사용하여 5-10마이크로리터의 펠릿을 현미경 슬라이드로 옮깁니다.

22 x 22 커버 슬립으로 덮으십시오. 슬라이드를 보관하려면 커버슬립의 가장자리를 매니큐어로 밀봉하고 나중에 사용할 준비가 될 때까지 섭씨 4도의 어두운 상자에 보관하십시오. 미분 간섭 대비 현미경 아래에서, 야생 Caenorhabditis tropicalis 균주는 장 상피에 방향성 부착되는 것으로 보이는 박테리아와 함께 식민지화되는 것으로 밝혀졌습니다.

녹색 범용 16S rRNA 프로브와 빨간색 알파프로테오박테리아 종 프로브의 형광 신호가 완전히 겹쳐져 장에 서식하는 대부분의 박테리아가 부착된 알파프로테오박테리아 박테리아임을 시사합니다. 오르세 바이러스의 이분법 RNA 게놈은 RNA1 및 RNA2 세그먼트로 구성되며 두 세그먼트를 표적으로 하는 FISH 프로브가 개발되었습니다. 녹색 형광 단백질로 태그된 ZIP1 단백질은 세포질에서 양성 오르세 바이러스 FISH 염색을 보이는 세포의 장핵에 국한된 것으로 보입니다.

오르세 특이적 또는 N.parisii-특이적 FISH로 염색된 다수의 동물은 용이한 정량화를 위해 이 신호의 강도를 나타내도록 나타내었다. 18S에 결합하기 위해 경쟁하는 종 특이적 프로브를 사용하여 두 개의 미세포자충 기생충으로 C.elegans를 공동 감염시키고, 핵을 염색하기 위해 DAPI를 사용하면 전체 동물의 맥락에서 감염의 더 나은 국소화를 허용합니다., 특히 크고 쉽게 식별할 수 있는 핵이 있는 장의 경우. N.parisii에 감염되면 메론트가 포자로 발달합니다.

결과 FISH 염색은 N.parisii 특이적 프로브로 빨간색으로 염색된 N.parisii 포자와 일치할 가능성이 있는 작고 큰 막대 모양의 구조를 보여줍니다. 고정제를 선택할 때 PFA 고정은 형태 및 형질 전환 GFP의 더 나은 보존을 허용하지만 포자 plasms의 시각화를 위해서는 아세톤 고정이 필요하다는 것을 기억하십시오. RNA FISH는 C.elegans 내장에 서식하는 박테리아를 식별하고 시각화하는 데 사용할 수 있습니다.

그런 다음 연구원은 이러한 숙주-미생물 상호 작용과 관련된 요인을 식별하기 위해 더 많은 유전자 스크리닝을 수행할 수 있습니다.