해부학적으로 특이적인 단일 세포 유전자 발현 방법을 사용한 중독 행동의 반보상 동인 조사
2022년 8월 4일
레이저 포획 미세 해부와 미세 유체 RT-qPCR의 조합은 단일 뉴런 및 아교 세포에서 전사체를 측정 할 때 해부학 적 및 생물 공학적 특이성을 제공합니다. 정신 질환에 대한 시스템의 생물학적 접근 방식으로 창의적인 방법을 적용하면 중독에 대한 신경 염증 보상 가설과 같은 이해와 치료의 돌파구로 이어질 수 있습니다.
이 프로토콜은 매우 민감하며 단일 세포 분해능에서 유전자 발현 프로필의 높은 처리량 캡처를 허용합니다. 이 기술은 단일 세포 분해능에서 해부학적 공간 및 분자 특이성을 모두 제공합니다. 뇌를 수확하고, 단일 세포를 선택하고, mRNA를 준비한 후, 프라이밍을 위해 qPCR 칩에 컨트롤 라인 유체를 주입한다.
qPCR 칩을 미세유체 혼합 장치에 삽입합니다. 프라임 스크립트를 선택하고 프로그램을 실행합니다. 프로그램 완료 후, 프라이밍된 qPCR 칩을 제거하고 PCR 샘플 플레이트로부터 반응물의 6마이크로리터를 피펫하여 프라이밍된 qPCR 칩의 상응하는 샘플 웰로 한다.
이제, PCR 분석 플레이트로부터의 반응물을 프라이밍된 qPCR 칩에 상응하는 분석 웰 내로 6 마이크로리터를 피펫팅한다. 그런 다음 칩을 미세유체 혼합 장치에 삽입합니다. 로드 믹스 스크립트를 선택하고 프로그램을 실행합니다.
미세유체 RT-qPCR 플랫폼을 켜고 전구를 예열합니다. 미세유체 혼합 장치에서 qPCR 칩을 제거하고 칩 바닥에서 보호 스티커를 벗겨냅니다. 미세유체 RT-qPCR 플랫폼을 열고 qPCR 칩을 플랫폼에 로드합니다.
새 실행 시작을 클릭하여 데이터 수집 소프트웨어를 시작합니다. 칩 바코드 및 칩 유형을 확인합니다. 그런 다음 다음을 클릭하십시오.
칩 실행 파일을 선택하고 데이터 수집 스토리지의 파일 위치를 찾습니다. 그런 다음 응용 프로그램 유형을 클릭하고 유전자 발현을 선택합니다. 수동 기준의 경우 ROX, 단일 프로브의 경우 EVAGreen을 선택하고 프로브 유형의 경우 EVAGreen을 선택합니다.
열 순환 프로그램을 클릭하여 선택하고 Biomark HD GE:Fast 96x96 PCR+Melt v2를 선택합니다. PCL 파일에 저장됩니다. 데이터 분석 소프트웨어를 다운로드합니다.
소프트웨어를 실행하여 미세유체 RT-qPCR 실험을 분석합니다. 칩 실행을 클릭하고 ChipRun을 엽니다. 실험자가 만든 BML 파일입니다.
수동 기준, 프로브 및 PCR 열 프로그램을 포함한 실험 세부 정보를 표시하는 창이 나타납니다. 칩 탐색기 탭에서 샘플 플레이트 설정을 클릭하고 새 샘플 플레이트 템플릿을 만듭니다. 샘플 레이블을 복사하여 실험 설계에 따라 소프트웨어 스프레드시트에 붙여넣습니다.
표준 샘플에 사용되는 샘플 이름과 RNA 농도를 입력합니다. 이제 작업 메뉴에서 맵을 클릭하고 SBS96-Left.dsp를 선택하여 샘플 설정을 매핑합니다. 그런 다음 세부 정보 보기를 선택하여 파일에서 이러한 변경 내용을 업데이트하고 분석을 클릭합니다.
검출기 플레이트 설정을 선택하고 새 분석 플레이트를 생성합니다. 적절한 컨테이너 유형 및 형식을 선택합니다. 실험 설계에 따라 분석 이름을 붙여넣고 분석을 클릭합니다.
분석 설정 창에서 사용자를 클릭하고 피팅을 자동으로 설정합니다. 이제 96x96 칩의 각 반응을 수동으로 검토합니다. 증폭 및 용융 곡선을 시각화하여 각 반응이 예상되는 qPCR 패턴을 따르는지 확인합니다.
증폭 또는 용융 곡선이 예상과 일치하지 않으면 해당 반응에 실패합니다. QC 후 파일을 선택하고 내보내기를 클릭한 다음 데이터 세트를 csv 파일로 저장하여 데이터를 내보냅니다. 내보낸 csv 파일에는 통과 실패 행렬과 원시 CT 값이 있는 행렬이 모두 있으므로 통과 실패 행렬을 사용하여 데이터 세트의 실패한 셀을 NA로 바꿉니다. 최신 버전의 오픈 소스 R 소프트웨어를 다운로드한 다음 R Studio 애플리케이션을 다운로드합니다.
중앙값 중심화의 경우 R 소프트웨어를 사용하여 개별 샘플의 모든 CT 값에서 계산된 CT 중앙값 값을 계산한 다음 이 중앙값에서 모든 개별 CT 값을 빼서 마이너스 델타 CT 값을 얻습니다. 하우스키핑 유전자 정규화의 경우 각 샘플에 대한 하우스키핑 유전자의 평균 발현을 계산하고 이 값을 사용하여 개별 CT 값을 뺍니다. 마이너스 델타 델타 CT 값을 생성하려면 R 소프트웨어에서 코드를 실행합니다.
정규화된 데이터 세트를 R에 업로드하고 scale 함수를 사용하여 데이터를 분석하고 스케일링된 데이터를 생성한 다음 R 히트 맵 함수 또는 별도의 소프트웨어를 사용하여 히트 맵을 생성합니다. 다른 기능에 대한 데이터 세트를 구성하려면 각 유전자 간의 Pearson 상관 관계와 용융 함수를 계산하십시오. 이 데이터를 유전자 상관 네트워크 소프트웨어로 내보내고 업로드합니다.
뉴런은 NeuN의 상승된 발현을 나타내었고, 소교세포 샘플은 미세아교세포 마커 Cd34 및 Cx3xr1의 유의한 발현을 보였다. Th+뉴런 샘플은 Th-뉴런 및 미세아교세포 샘플에 비해 Th의 발현이 유의하게 증가한 것으로 나타났습니다. Th- 뉴런은 Gcg의 유의 한 발현을 나타 냈으며, 이는 Th- 뉴런 샘플이 Glp1을 신경 전달 물질로 사용하는 뉴런으로 풍부하다는 것을 시사합니다.
선형 차별 분석은 이 세 가지 세포 유형이 65개 유전자 모두에서 상이한 유전자 발현 프로필을 갖는 것으로 나타났습니다. 알코올 금단 시계열을 통한 Glp1 농축 뉴런 샘플의 세포 하위 표현형은 히트 맵을 사용하여 표현하였다. 상기 서브 표현형 A는 염증성 유전자 클러스터를 고도로 발현하나, 8시간 금단 시점에서 비율이 증가하고, 32시간 금단 시점에서 최대에 도달한다.
염증성 서브 표현형은 176시간 금단에 의해 조절되도록 정상화된다. GABA 수용체 유전자 클러스터 2를 고도로 발현하는 서브 표현형 B는 176시간 금단 조건에 의해 이러한 유전자 클러스터의 발현에서 전반적인 억제를 나타낸다. 개별 샘플의 유전자 발현을 평균으로 결합하여 유전자 클러스터의 발현과 해당 유전자 전사체의 단백질 위치를 시계열 전체에 걸쳐 시각화할 수 있었습니다.
이 기술은 질병이나 섭동에 대한 세포 반응을 이해하기 위해 모든 생물학적 시스템이나 조직에 적용될 수 있습니다. 그것은 조직의 공간 및 해부학적 구조와 관련된 단일 세포 분해능에서 분자 반응을 해독하는 것입니다.
전체 스크립트를 보고 수천 개의 과학 동영상에 액세스하세요
개요
본 연구는 레이저 캡처 미세절단술(laser capture microdissection)과 미세유체 RT-qPCR을 활용하여 개별 뉴런 및 글리아의 전사체를 분석합니다. 이 방법의 높은 민감도와 특이도를 강조하며, 이는 특히 중독과 관련하여 신경염증과 연관된 정신 질환에 대한 이해를 증진시킬 수 있습니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 전사 분석
- 정신과적 질환
배경
- 뉴런과 글리아 세포의 RNA 발현 패턴을 이해하는 것은 정신 질환을 규명하는 데 매우 중요합니다.
- 이전의 방법들은 해부학적 공간 특이성과 분자 특이성이 모두 부족했습니다.
- 신경염증은 중독의 항보상 가설(antireward hypothesis)과 관련이 있는 것으로 알려져 있습니다.
연구 목적
- 단일 세포 해상도로 유전자 발현 프로파일을 포착하기 위한 민감한 방법을 개발한다.
- 이러한 분자적 변화가 정신과적 질환에서의 행동 반응과 어떻게 연관되는지 분석한다.
- 중독 관련 기전에서 신경 염증의 역할을 평가한다.
사용된 방법
- 마이크로플루이딕 RT-qPCR을 활용하여 단일 세포로부터 고효율의 데이터 수집을 수행하였습니다.
- mRNA 준비 및 분석을 위해 채취한 뇌 조직에서 단일 세포를 분리하였습니다.
- 칩 프라이밍, 데이터 수집 및 분석을 위한 상세 프로토콜을 실시하였습니다.
- 유전자 발현 데이터를 통계 소프트웨어를 사용하여 검증하고 분석하였습니다.
주요 결과
- 뉴런은 NeuN의 발현이 증가한 반면, 미세아교세포는 Cd34 및 Cx3xr1의 유의미한 발현을 보였습니다.
- 특히 금단 현상 및 신경 염증에 대한 반응에서 유전자 발현 프로파일을 기반으로 서로 다른 서브타입이 식별되었습니다.
- 히트맵 분석을 통해 금단 스트레스 동안의 유전자 클러스터 및 그 조절에 관한 핵심 결론을 도출하였습니다.
결론
- 본 연구는 이러한 방법론들을 결합함으로써 신경염증에 대한 세포 유형별 반응을 더욱 풍부하게 이해할 수 있음을 보여줍니다.
- 이를 통해 얻은 통찰은 중독과 관련된 정신 질환에 대한 표적 치료법을 개발하는 데 도움이 될 수 있습니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
해부학적 특이성을 갖춘 단일 세포 유전자 발현 프로파일링은 신경정신과적 타겟 발굴, 특히 중독 및 항보상 경로에 있어 기전적 리스크 제거를 가능하게 합니다. 이러한 접근 방식은 신경 염증 유발 인자에 대한 고해상도 통찰력을 제공하여, 분자 병리학과 행동 표현형의 교차점에서 예측 신뢰도를 높여줍니다. 이러한 방법들을 초기 발굴 파이프라인에 통합하면 CNS 약물 개발을 위한 포트폴리오 선별과 중개 연구의 연속성을 강화할 수 있습니다.
바이오제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 표적 검증
- 단일 세포 해상도로 신경 염증 및 항보상 가설의 조사를 가능하게 합니다.
- 유전자 발현을 해부학적 및 표현형적 특이성과 연결함으로써 기능적 표적 검증을 지원합니다.
- 중독 및 금단 증상과 관련된 CNS 표적의 기전적 리스크 제거를 촉진합니다.
- 신경정신과적 표적의 진전을 위한 예측 신뢰도를 향상시킵니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 하위 전사체 및 표현형 스크리닝을 위해 검증된 세포 시스템을 준비합니다.
- 분석 표준화를 위해 정량적이고 재현 가능한 유전자 발현 결과물을 제공합니다.
- 정의된 세포 유형 전반에 걸쳐 유전자 네트워크의 고처리량 분석을 가능하게 합니다.
- 신경 염증 경로에 미치는 화합물 효과의 신뢰성 있는 평가를 지원합니다.
중개 및 전임상 연구
- 중독 모델에서 분자적 발견 사항을 질환 관련 신경해부학적 시스템과 연계합니다.
- 신경염증 바이오마커의 발견부터 전임상 검증까지의 연속성을 제공합니다.
- CNS 치료 프로그램의 리스크 조정된 추진 결정에 정보를 제공합니다.
- 유전자 발현을 금단 현상 표현형과 매핑하여 중개 바이오마커 개발을 강화합니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
본 방법은 중추신경계(CNS) 조직에서 고처리량의 해부학적으로 정밀한 유전자 발현 분석을 가능하게 함으로써, 초기 발견 단계와 전임상 연구 사이의 간극을 메워줍니다.
- 발견 생물학(Discovery Biology): 신경 염증 및 항보상 메커니즘에 대한 가설 검증과 경로 명확화를 지원합니다.
- 스크리닝(Screening): 분석법 개발 및 화합물 스크리닝을 위해 재현 가능하고 정량적인 유전자 발현 데이터를 제공합니다.
- 분석(Analytics): 네트워크 분석, 히트맵 작성 및 세포 표현형의 통계적 비교를 위한 확장 가능한 데이터 세트를 생성합니다.
- 중개 연구(Translational Research): 분자적 시그니처를 질환 관련 금단 상태 및 바이오마커 정렬과 연결합니다.
- 기업적 재사용(Enterprise Reuse): 다양한 CNS 및 질환 모델에 걸쳐 단일 세포 전사체학을 위한 재사용 가능한 플랫폼을 제공합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: CNS 타겟 검증에 있어 예측 신뢰도를 높이고 기전적 모호성을 줄입니다.
- 운영적 가치: 표준화되고 확장 가능하며 재현 가능한 단일 세포 유전자 발현 워크플로우를 제공합니다.
- 전략적 가치: 신경정신질환 R&D에서 정보에 기반한 진행/중단(go/no-go) 결정과 자본 효율적인 포트폴리오 관리를 가능하게 합니다.
- 포트폴리오 영향: 위험 조정 우선순위 설정 및 CNS 치료제 후보 물질의 개발 진전을 지원합니다.
실행 시 고려 사항
- 레이저 캡처 미세해부(laser capture microdissection) 및 미세유체 RT-qPCR 플랫폼에 대한 전문 지식이 필요합니다.
- 고처리량 데이터 처리 및 네트워크 분석을 위한 강력한 분석 인프라가 요구됩니다.
- 시료 준비 및 데이터 정규화 프로토콜의 팀 간 표준화가 필요합니다.
- 적절한 최적화를 통해 다양한 중추신경계(CNS) 조직 및 질환 모델에 적용 가능합니다.
- 특수 장비 및 생물정보학 지원 체계의 활용 여부에 따라 달라집니다.
