Name: 해부학적으로 특이적인 단일 세포 유전자 발현 방법을 사용한 중독 행동의 반보상 동인 조사 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-04T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: 학습하세요 레이저 포획 현미절단 및 마이크로유체 RT-qPCR을 사용하여 단일 뉴런과 신경교세포의 전사체를 분석하는 방법을. 이 기술은 중독 관련 신경염증의 세포 유형별 반응을 연구하는 데 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

여기에 제시된 작업은 JS 및 RV에 수여 된 NIH HLB U01 HL133360, JS 및 EVB에 수여 된 NIDA R21 DA036372, SJO 'S를 지원하기 위해 Jan Hoek에게 수여 된 T32 AA-007463 및 국립 알코올 중독 및 알코올 남용 연구소 : R01 AA018873을 통해 자금을 지원했습니다.

<ol><li>Substance Use and Mental Health Indicators in the United States: Results from the 2019 National Survey on Drug Use and Health. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.samhsa.gov/data/">https://www.samhsa.gov/data/</a> (2020).</li>
<li>Prevalence of Serious Mental Illness (SMI). NIH. 49, Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.nimh.nih.gov/health/statistics/mental-illness.shtml">https://www.nimh.nih.gov/health/statistics/mental-illness.shtml</a> (2020).</li>
<li>Mattick, R. P., Kimber, J., Breen, C., Davoli, M. Buprenorphine maintenance versus placebo or methadone maintenance for opioid dependence. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMattick%2C+RP+%22Cochrane+Database+of+Systematic+Reviews%22">Cochrane Database of Systematic Reviews</a>. Mattick, R. P. , John Wiley & Sons, Ltd. (2008).</li>
<li>Mattick, R. P., Breen, C., Kimber, J., Davoli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methadone+maintenance+therapy+versus+no+opioid+replacement+therapy+for+opioid+dependence%5BTitle%5D)+AND+%22The+Cochrane+Database+of+Systematic+Reviews%22%5BJournal%5D)">Methadone maintenance therapy versus no opioid replacement therapy for opioid dependence.</a> The Cochrane Database of Systematic Reviews. 2009 (3), (2009).</li>
<li>Miller, P. M., Book, S. W., Stewart, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medical+treatment+of+alcohol+dependence%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Psychiatry+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Medical treatment of alcohol dependence: A systematic review.</a> International Journal of Psychiatry in Medicine. 42 (3), 227-266 (2012).</li>
<li>Holmes, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Lancet+Psychiatry+Commission+on+psychological+treatments+research+in+tomorrow%27s+science%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet.+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">The Lancet Psychiatry Commission on psychological treatments research in tomorrow's science.</a> The Lancet. Psychiatry. 5 (3), 237-286 (2018).</li>
<li>Ford, C. L., Young, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+opportunities+for+circuit-based+social+neuroscience%3A+advancing+21st+century+psychiatry%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Translational opportunities for circuit-based social neuroscience: advancing 21st century psychiatry.</a> Current Opinion in Neurobiology. 68, 1-8 (2021).</li>
<li>Holmes, E. A., Craske, M. G., Graybiel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psychological+treatments%3A+A+call+for+mental-health+science%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Psychological treatments: A call for mental-health science.</a> Nature. 511 (7509), 287-289 (2014).</li>
<li>Miranda, A., Taca, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromodulation+with+percutaneous+electrical+nerve+field+stimulation+is+associated+with+reduction+in+signs+and+symptoms+of+opioid+withdrawal%3A+a+multisite%2C+retrospective+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Drug+and+Alcohol+Abuse%22%5BJournal%5D)">Neuromodulation with percutaneous electrical nerve field stimulation is associated with reduction in signs and symptoms of opioid withdrawal: a multisite, retrospective assessment.</a> The American Journal of Drug and Alcohol Abuse. 44 (1), 56-63 (2018).</li>
<li>Metz, V. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+ibudilast+on+the+subjective%2C+reinforcing%2C+and+analgesic+effects+of+oxycodone+in+recently+detoxified+adults+with+opioid+dependence%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Effects of ibudilast on the subjective, reinforcing, and analgesic effects of oxycodone in recently detoxified adults with opioid dependence.</a> Neuropsychopharmacology. 42 (9), 1825-1832 (2017).</li>
<li>Heinzerling, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((placebo-controlled+trial+of+targeting+neuroinflammation+with+ibudilast+to+treat+methamphetamine+use+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroimmune+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">placebo-controlled trial of targeting neuroinflammation with ibudilast to treat methamphetamine use disorder.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 15 (2), 238-248 (2020).</li>
<li>Bogenschutz, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psilocybin-assisted+treatment+for+alcohol+dependence%3A+A+proof-of-concept+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Psychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Psilocybin-assisted treatment for alcohol dependence: A proof-of-concept study.</a> Journal of Psychopharmacology. 29 (3), 289-299 (2015).</li>
<li>O'Sullivan, S. J., Schwaber, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Similarities+in+alcohol+and+opioid+withdrawal+syndromes+suggest+common+negative+reinforcement+mechanisms+involving+the+interoceptive+antireward+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+and+Biobehavioral+Reviews%22%5BJournal%5D)">Similarities in alcohol and opioid withdrawal syndromes suggest common negative reinforcement mechanisms involving the interoceptive antireward pathway.</a> Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 125, 355-364 (2021).</li>
<li>O'Sullivan, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+systems+neuroscience%3A+A+growing+frontier+in+mental+illness%5BTitle%5D)+AND+%22Biocell%22%5BJournal%5D)">Single-cell systems neuroscience: A growing frontier in mental illness.</a> Biocell. 46 (1), 7-11 (2022).</li>
<li>O'Sullivan, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+glia+and+neuron+gene+expression+in+the+central+amygdala+in+opioid+withdrawal+suggests+inflammation+with+correlated+gut+dysbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Single-cell glia and neuron gene expression in the central amygdala in opioid withdrawal suggests inflammation with correlated gut dysbiosis.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 665(2019).</li>
<li>O'Sullivan, S. J., McIntosh-Clarke, D., Park, J., Vadigepalli, R., Schwaber, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+scale+neuronal+and+glial+gene+expression+and+putative+cell+phenotypes+and+networks+in+the+nucleus+tractus+solitarius+in+an+alcohol+withdrawal+time+series%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Systems+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Single cell scale neuronal and glial gene expression and putative cell phenotypes and networks in the nucleus tractus solitarius in an alcohol withdrawal time series.</a> Frontiers in Systems Neuroscience. 15, 739790(2021).</li>
<li>O'Sullivan, S. J., Reyes, B. A. S., Vadigepalli, R., Van Bockstaele, E. J., Schwaber, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+laser+capture+microdissection+and+microfluidic+qpcr+to+analyze+transcriptional+profiles+of+single+cells%3A+A+systems+biology+approach+to+opioid+dependence%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Combining laser capture microdissection and microfluidic qpcr to analyze transcriptional profiles of single cells: A systems biology approach to opioid dependence.</a> Journal of Visualized Experiments. (157), e60612(2020).</li>
<li>Achanta, S., Vadigepalli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+high-throughput+qRT-PCR+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Protocols.io%22%5BJournal%5D)">Single cell high-throughput qRT-PCR protocol.</a> Protocols.io. , (2020).</li>
<li>O'Sullivan, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interoceptive+antireward+pathway+and+gut+dysbiosis+in+addiction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Psychiatry%2C+Depression+%26+Anxiety%22%5BJournal%5D)">The interoceptive antireward pathway and gut dysbiosis in addiction.</a> Journal of Psychiatry, Depression & Anxiety. 7 (40), 1-5 (2021).</li>
<li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptional+analysis+reveals+novel+neuronal+phenotypes+and+interaction+networks+involved+in+the+central+circadian+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptional analysis reveals novel neuronal phenotypes and interaction networks involved in the central circadian clock.</a> Frontiers in Neuroscience. 10, 481(2016).</li>
<li>Staehle, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diurnal+patterns+of+gene+expression+in+the+dorsal+vagal+complex+and+the+central+nucleus+of+the+amygdala+-+Non-rhythm-generating+brain+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Diurnal patterns of gene expression in the dorsal vagal complex and the central nucleus of the amygdala - Non-rhythm-generating brain regions.</a> Frontiers in Neuroscience. 14, 375(2020).</li>
<li>Réus, G. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+inflammation+and+microglial+activation+in+the+pathophysiology+of+psychiatric+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The role of inflammation and microglial activation in the pathophysiology of psychiatric disorders.</a> Neuroscience. 300, 141-154 (2015).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+astrocytes+in+major+neuropsychiatric+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemical+Research%22%5BJournal%5D)">Role of astrocytes in major neuropsychiatric disorders.</a> Neurochemical Research. 46 (10), 2715-2730 (2021).</li>
<li>Park, J., Ogunnaike, B., Schwaber, J., Vadigepalli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+functional+gene+regulatory+network+phenotypes+underlying+single+cell+transcriptional+variability%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Biophysics+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Identifying functional gene regulatory network phenotypes underlying single cell transcriptional variability.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 117 (1), 87-98 (2015).</li>
<li>Lieber, C. S., DeCarli, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimental+model+of+alcohol+feeding+and+liver+injury+in+the+baboon%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Primatology%22%5BJournal%5D)">An experimental model of alcohol feeding and liver injury in the baboon.</a> Journal of Medical Primatology. 3 (3), 153-163 (1974).</li>
<li>Lieber, C. S., Decarli, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+chronic+ethanol+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Animal models of chronic ethanol toxicity.</a> Methods in Enzymology. 233, 585-594 (1994).</li>
<li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inputs+drive+cell+phenotype+variability%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Inputs drive cell phenotype variability.</a> Genome Research. 24 (6), 930-941 (2014).</li>
<li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Rat+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%3A+Hard+Cover+Edition%22">The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates: Hard Cover Edition</a>. , Academic Press. Elsevier Inc. (1982).</li>
</ol>

저자는 경쟁하는 재정적 이해 관계가 없다고 선언합니다.

알코올 사용 장애는 치료하기 어려운 질병으로 남아 있습니다. 우리 그룹은 시스템 신경 과학적 관점에서 보상 방지 과정을 조사함으로써이 장애에 접근했습니다. 우리는 알코올 금단 시계열16에서 단일 NTS 뉴런과 미세아교세포의 유전자 발현 변화를 측정했습니다. NTS는 알코올 금단 증후군에서 발생하는 자율 조절 장애에서 두드러진 역할을 위해 선택되었습니다. 자사는 LCM을 단일 세포 미세유체 RT-qPCR과 결합하여 해부학적 및 분자 민감도와 특이성으로 저렴한 비용으로 강력한 수의 샘플과 유전자를 측정할 수 있습니다(그림 1B-C). 단일-세포를 IHC 염색에 의해 확인 및 선택하고, 이들 세포 서브페노타입 그룹을 분자 발현으로 검증하였다 (도 1D-E). 그러나,...

중독은 선진국에서 여전히 증가하는 도전으로 남아 있습니다 1,2. 주요 과학 및 임상 발전에도 불구하고 중독률은 계속 증가하는 반면 기존 치료법의 효능은 기껏해야 안정적으로 유지됩니다 3,4,5. 그러나 생명 공학과 과학적 접근의 발전으로 물질 의존의 병태 생리학을 추가로 조사하기위한 새로운 방법과 가설이 생겨났습니다 6,7,8. 실제로, 최근의 발전은 새로운 개념과 치료 패러다임이 사회적, 경제적, 정치적 결과를 가져 오는 돌파구로 이어질 수 있음을 시사합니다 9,10,11,12.
우리는 알코올 및 오피오이드 의존13,14,15,16의 중단에 대한 보상에 대한 반보상을 조사했습니다. 방법은이 패러다임17,18의 핵심입니다. 레이저 포획 미세 해부(LCM)는 해부학적 특이성이 높은 단일 세포를 선택할 수 있습니다. 이 기능은 신경교와 뉴런 모두 동일한 동물13,14,15,16,19의 동일한 뉴런 하핵에서 수집 및 분석될 수 있기 때문에 신경염증 항보상 가설에 필수적입니다. 그런 다음 선택된 세포의 전사체의 관련 부분을 고처리량 미세유체 역전사 정량적 중합효소 연쇄 반응(RT-qPCR)으로 측정하여 기능적 네트워크(20,21)에 대한 통찰력을 제공하는 전산 분석을 위한 고차원 데이터 세트를 제공할 수 있습니다.
특정 뇌핵의 뉴런과 아교세포에서 전사체의 하위 집합을 측정하면 샘플 수와 측정된 유전자 모두에서 견고하고 민감하고 특이적인 데이터 세트가 생성됩니다. 이러한 도구는 주로 성상 세포와 미세 아교 세포와 같은 아교 세포가 지난 10 년 동안 신경 및 정신 질환에서 중심적인 역할을 입증했기 때문에 정신 질환에 대한 시스템의 신경 과학적 접근 방식에 최적입니다22,23. 우리의 접근 방식은 국소 파라크린 신호 전달에 관여하는 수많은 수용체와 리간드에서 동시에 신경교와 뉴런의 표현 반응을 측정할 수 있습니다. 실제로, 시그널링은 퍼지 로직(24)과 같은 다양한 정량적 방법을 사용하여 이들 데이터세트로부터 추론될 수 있다. 또한, 뉴런 또는 아교 세포에서 세포 하위 표현형과 그 기능을 식별하면 특정 핵의 뇌 세포가 단일 세포 수준에서 어떻게 조직, 반응 및 조절 장애에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 이 기능 시스템의 역학은 시계열 실험16으로도 모델링 할 수 있습니다. 마지막으로, 동물 모델은이 시스템의 접근 방식에 기계 론적 조건을 부여하기 위해 해부학 적 또는 약리학 적으로 교란 될 수 있습니다.
대표적인 실험: 아래에서는 이러한 방법의 적용 예를 제공합니다. 이 연구는 알코올 의존 및 후속 금단에 대한 반응으로 단독 핵 (NTS)에서 쥐 신경 및 미세 아교 세포 유전자 발현을 조사했습니다16. 쥐 코호트는 1) 대조군, 2) 에탄올 의존성 (EtOH), 3) 8 시간 철수 (Wd), 4) 32 시간 Wd 및 5) 176 h Wd로 구성되었습니다 (그림 1A). 빠른 참수 후, 뇌간을 전뇌에서 분리하고 냉동 절제하고, 티로신 하이드록실라제 양성(TH +) 뉴런과 미세아교세포에 대해 절편을 염색했습니다(그림 1B). LCM은 TH+ 및 TH- 뉴런과 미세아교세포 모두를 수집하는데 사용되었다. 모든 세포는 NTS에서 추출하고 10 세포 풀의 샘플로 분석했습니다. 4개의 96 x 96 마이크로유체 RT-qPCR 동적 어레이를 65개의 유전자를 측정하는 RT-qPCR 플랫폼에서 실행했습니다(그림 1B-C). 데이터는 -ΔΔCt 방법을 사용하여 정규화하고 R을 사용하여 분석했으며 단일 세포 선택은 분자 마커로 검증되었습니다 (그림 1D-E). 기술 검증은 단일 배치 내에서 그리고 배치 전반에 걸쳐 분석된 기술 복제에 의해 추가로 검증되었습니다(그림 2 및 그림 3). TH+ 및 TH- 뉴런은 유사한 염증성 유전자 클러스터를 갖지만 γ-아미노부티르산(GABA) 수용체(R) 클러스터가 다른 서로 다른 하위 표현형으로 구성됩니다(그림 4 및 그림 5). 염증성 유전자 클러스터의 발현이 상승한 하위 표현형은 32시간 Wd에서 과대 발현된 반면 GABA 수용체(GABAR) 발현은 장기간 알코올 금단(176시간 Wd)에서 낮게 유지되었습니다. 이 연구는 알코올 및 오피오이드 의존성에 대한 보상 반대 가설에 기여하며, 이는 금단 시 내장의 차단 피드백이 내장-정서적 뉴런 핵(즉, NTS 및 편도체)의 조절 장애에 기여하여 물질 의존에 기여하는 더 심각한 자율 및 정서적 후유증을 초래한다고 추측합니다(그림 6).

<table><tbody><tr><td>20X DNA 결합 염료</td><td>Fluidigm</td><td>100-7609</td><td>NA</td></tr><tr><td>2x GE 분석 로딩 시약</td><td>Fluidigm</td><td>85000802-R</td><td>NA</td></tr><tr><td>96.96 유전자 발현을 위한 동적 어레이 IFC (텍스트에서는 qPCR 칩이라고 함)</td><td>Fluidigm</td><td>BMK-M-96.96</td><td>NA</td></tr><tr><td>Anti-Cd11&beta; 항체</td><td>Genway Biotech</td><td>CCEC48</td><td>Microglia Stain</td></tr><tr><td>Anti-NeuN 항체, 클론 A60</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB377</td><td>신경 염색</td></tr><tr><td>항 티로신 하이드록실라제 항체</td><td>abcam</td><td>ab112</td><td>TH+ 뉴런 용 염색</td></tr><tr><td>ArcturusXT 레이저 캡처 미세 해부 시스템</td><td>Arcturus</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>NA Biomark HD</td><td>Fluidigm</td><td>NA</td><td>RT-qPCR 플랫폼</td></tr><tr><td>소 혈청 항원</td><td>시그마-알드리치</td><td>B4287</td><td></td></tr><tr><td>CapSure 매크로 LCM 캡</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>&nbsp; LCM0211</td><td>NA</td></tr><tr><td>CellDirect 원스텝 qRT-PCR 키트</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11753500</td><td>용해 완충액 용액 구성 요소</td></tr><tr><td>CellsDirect Resuspension & 용해 버퍼 키트</td>, <td>ThermoFisher Scientific</td><td>11739010</td><td>Invitrogen</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>, ThermoFisher Scientific</td><td>62248</td>, <td>Nucleus Stain</td></tr><tr><td>DNA, 현탁액 버퍼</td><td>, TEKnova</td><td>T0221</td><td></td></tr>, <tr><td>당나귀 anti-Rabbit IgG (H+L) ReadyProbe 2차 항체, Donkey anti-Rabbit IgG (H+L), ReadyProbe, 2차 항체, Alexa Fluor 488</td>, <td>ThermoFisher Scientific</td><td>R37118</td>, <td>Seconadry 항체</td></tr><tr><td>엑소뉴클레아제 I</td><td>New Englnad BioLabs, Inc.</td><td>M0293S</td><td>NA</td></tr><tr><td>ExtracSure 샘플 추출 장치</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>LCM0208</td><td>NA</td></tr><tr><td>FisherbrandTM Superfrost Plus 현미경 슬라이드</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>22-037-246</td><td>일반 유리 슬라이드</td></tr><tr><td>GeneAmp 얇은 벽 반응관</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>N8010611</td><td></td></tr><tr><td>염소 안티 마우스 IgG (H + L), Superclona 재조합 2 차 항체, Alexa Fluor 555</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A28180</td><td>Seconadry 항체</td></tr><tr><td>IFC 컨트롤러</td><td>Fluidigm</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>NA RNaseOut</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10777019</td><td></td></tr><tr><td>SsoFast EvaGreen Supermix with Low Rox</td><td>Bio-Rad</td><td>PN 172-5211</td><td>NA</td></tr><tr><td>SuperScript VILO cDNA 합성 키트</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11754250</td><td>포함 VILO 및 SuperScript</td></tr><tr><td>T4 유전자 32 단백질</td><td>New Englnad BioLabs, Inc.</td><td>M0300S</td><td>NA</td></tr>, <tr><td>TaqMan 프리앰프, 마스터 믹스</td>, <td>ThermoFisher Scientific 4391128</td><td></td>, <td>NA</td></tr><tr><td>TE 버퍼</td>, <td>TEKnova</td><td>T0225</td><td>NA</td></tr>, <tr><td>TempPlate Semi-skirted 96-Well PCR 플레이트, 0.2 mL</td>, <td>USA Scientific</td><td>1402-9700</td><td>NA</td></tr></tbody></table>

해부학적으로 특이적인 단일 세포 유전자 발현 방법을 사용한 중독 행동의 반보상 동인 조사

Investigating Drivers of Antireward in Addiction Behavior with Anatomically Specific Single-Cell Gene Expression Methods

중독 행동의 증가율은 정신 건강 연구자와 임상의 모두가 안티 보상과 회복을 이해하도록 동기를 부여했습니다. 보상과 시작에서 벗어나는 이러한 전환은 중독을 조사하는 데 적용되는 방법의 확장과 함께 새로운 관점, 패러다임 및 가설을 필요로합니다. 여기에서는 레이저 포획 미세 해부(LCM)와 고처리량 미세유체 역전사 정량적 중합효소 연쇄 반응(RT-qPCR)을 결합한 안티보상을 조사하기 위한 시스템 생물학 접근 방식을 제공합니다. 유전자 발현 네트워크 역학을 측정하고 알코올 및 오피오이드 금단에서 신경 내장 조절 장애의 주요 동인인 신경 염증을 확인했습니다. 이러한 기술의 조합은 높은 처리량 감도 및 특정 유전자 발현 측정과 함께 단일 세포 분해능에서 해부학적 및 표현형 특이성을 제공하여 가설 생성 데이터 세트와 새로운 통찰력 및 치료 기회를 생성하는 기계론적 가능성을 모두 제공합니다.

단일 셀 수집의 검증은 LCM 절차 중에 시각적으로 수행됩니다. 세포핵은 QC 스테이션에서 평가됩니다. 세포 유형은 그 세포 유형 및 그의 일반적인 형태에 대한 태그된 형광단의 방출에 의해 결정될 수 있다. 캡에서 원하지 않는 세포가 선택되면 QC 스테이션에서 UV 레이저로 유전 물질을 파괴 할 수 있습니다. 분자 분석을 통한 추가 검증도 필요합니다. 이 대표적인 실시예16에서, 미세아교세포 이외에 티로신 하이드록실라제(Th) 양성(+) 및 Th 음성(-)의 두 가지 유형의 뉴런이 선택되었다. 도 1D 는 뉴런이 되도록 의도된 샘플이 뉴런 마커인 NeuN 의 통계적으로 유의한 상승된 발현을 입증했음을 입증한다. 동시에, 미세아교세포 샘플은 미세아교세포 마커인 CD34 및 Cx3xr1 의 상당한 상승을 가졌으며, 이는 샘플 선택이 높은 충실도로 수행되었음을 시사합니다. 또한, Th+ 뉴런...

레이저 포획 미세 해부와 미세 유체 RT-qPCR의 조합은 단일 뉴런 및 아교 세포에서 전사체를 측정 할 때 해부학 적 및 생물 공학적 특이성을 제공합니다. 정신 질환에 대한 시스템의 생물학적 접근 방식으로 창의적인 방법을 적용하면 중독에 대한 신경 염증 보상 가설과 같은 이해와 치료의 돌파구로 이어질 수 있습니다.

Increasing rates of addiction behavior have motivated mental health researchers and clinicians alike to understand antireward and recovery. This shift ...

이 프로토콜은 매우 민감하며 단일 세포 분해능에서 유전자 발현 프로필의 높은 처리량 캡처를 허용합니다. 이 기술은 단일 세포 분해능에서 해부학적 공간 및 분자 특이성을 모두 제공합니다. 뇌를 수확하고, 단일 세포를 선택하고, mRNA를 준비한 후, 프라이밍을 위해 qPCR 칩에 컨트롤 라인 유체를 주입한다.qPCR 칩을 미세유체 혼합 장치에 삽입합니다. 프라임 스크립트를 선택하고 프로그램을 실행합니다. 프로그램 완료 후, 프라이밍된 qPCR 칩을 제거하고 PCR 샘플 플레이트로부터 반응물의 6마이크로리터를 피펫하여 프라이밍된 qPCR 칩의 상응하는 샘플 웰로 한다.이제, PCR 분석 플레이트로부터의 반응물을 프라이밍된 qPCR 칩에 상응하는 분석 웰 내로 6 마이크로리터를 피펫팅한다. 그런 다음 칩을 미세유체 혼합 장치에 삽입합니다. 로드 믹스 스크립트를 선택하고 프로그램을 실행합니다.미세유체 RT-qPCR 플랫폼을 켜고 전구를 예열합니다. 미세유체 혼합 장치에서 qPCR 칩을 제거하고 칩 바닥에서 보호 스티커를 벗겨냅니다. 미세유체 RT-qPCR 플랫폼을 열고 qPCR 칩을 플랫폼에 로드합니다.새 실행 시작을 클릭하여 데이터 수집 소프트웨어를 시작합니다. 칩 바코드 및 칩 유형을 확인합니다. 그런 다음 다음을 클릭하십시오.칩 실행 파일을 선택하고 데이터 수집 스토리지의 파일 위치를 찾습니다. 그런 다음 응용 프로그램 유형을 클릭하고 유전자 발현을 선택합니다. 수동 기준의 경우 ROX, 단일 프로브의 경우 EVAGreen을 선택하고 프로브 유형의 경우 EVAGreen을 선택합니다.열 순환 프로그램을 클릭하여 선택하고 Biomark HD GE:Fast 96x96 PCR+Melt v2를 선택합니다. PCL 파일에 저장됩니다. 데이터 분석 소프트웨어를 다운로드합니다.소프트웨어를 실행하여 미세유체 RT-qPCR 실험을 분석합니다. 칩 실행을 클릭하고 ChipRun을 엽니다. 실험자가 만든 BML 파일입니다.수동 기준, 프로브 및 PCR 열 프로그램을 포함한 실험 세부 정보를 표시하는 창이 나타납니다. 칩 탐색기 탭에서 샘플 플레이트 설정을 클릭하고 새 샘플 플레이트 템플릿을 만듭니다. 샘플 레이블을 복사하여 실험 설계에 따라 소프트웨어 스프레드시트에 붙여넣습니다.표준 샘플에 사용되는 샘플 이름과 RNA 농도를 입력합니다. 이제 작업 메뉴에서 맵을 클릭하고 SBS96-Left.dsp를 선택하여 샘플 설정을 매핑합니다. 그런 다음 세부 정보 보기를 선택하여 파일에서 이러한 변경 내용을 업데이트하고 분석을 클릭합니다.검출기 플레이트 설정을 선택하고 새 분석 플레이트를 생성합니다. 적절한 컨테이너 유형 및 형식을 선택합니다. 실험 설계에 따라 분석 이름을 붙여넣고 분석을 클릭합니다.분석 설정 창에서 사용자를 클릭하고 피팅을 자동으로 설정합니다. 이제 96x96 칩의 각 반응을 수동으로 검토합니다. 증폭 및 용융 곡선을 시각화하여 각 반응이 예상되는 qPCR 패턴을 따르는지 확인합니다.증폭 또는 용융 곡선이 예상과 일치하지 않으면 해당 반응에 실패합니다. QC 후 파일을 선택하고 내보내기를 클릭한 다음 데이터 세트를 csv 파일로 저장하여 데이터를 내보냅니다. 내보낸 csv 파일에는 통과 실패 행렬과 원시 CT 값이 있는 행렬이 모두 있으므로 통과 실패 행렬을 사용하여 데이터 세트의 실패한 셀을 NA로 바꿉니다. 최신 버전의 오픈 소스 R 소프트웨어를 다운로드한 다음 R Studio 애플리케이션을 다운로드합니다.중앙값 중심화의 경우 R 소프트웨어를 사용하여 개별 샘플의 모든 CT 값에서 계산된 CT 중앙값 값을 계산한 다음 이 중앙값에서 모든 개별 CT 값을 빼서 마이너스 델타 CT 값을 얻습니다. 하우스키핑 유전자 정규화의 경우 각 샘플에 대한 하우스키핑 유전자의 평균 발현을 계산하고 이 값을 사용하여 개별 CT 값을 뺍니다. 마이너스 델타 델타 CT 값을 생성하려면 R 소프트웨어에서 코드를 실행합니다.정규화된 데이터 세트를 R에 업로드하고 scale 함수를 사용하여 데이터를 분석하고 스케일링된 데이터를 생성한 다음 R 히트 맵 함수 또는 별도의 소프트웨어를 사용하여 히트 맵을 생성합니다. 다른 기능에 대한 데이터 세트를 구성하려면 각 유전자 간의 Pearson 상관 관계와 용융 함수를 계산하십시오. 이 데이터를 유전자 상관 네트워크 소프트웨어로 내보내고 업로드합니다.뉴런은 NeuN의 상승된 발현을 나타내었고, 소교세포 샘플은 미세아교세포 마커 Cd34 및 Cx3xr1의 유의한 발현을 보였다. Th+뉴런 샘플은 Th-뉴런 및 미세아교세포 샘플에 비해 Th의 발현이 유의하게 증가한 것으로 나타났습니다. Th- 뉴런은 Gcg의 유의 한 발현을 나타 냈으며, 이는 Th- 뉴런 샘플이 Glp1을 신경 전달 물질로 사용하는 뉴런으로 풍부하다는 것을 시사합니다.선형 차별 분석은 이 세 가지 세포 유형이 65개 유전자 모두에서 상이한 유전자 발현 프로필을 갖는 것으로 나타났습니다. 알코올 금단 시계열을 통한 Glp1 농축 뉴런 샘플의 세포 하위 표현형은 히트 맵을 사용하여 표현하였다. 상기 서브 표현형 A는 염증성 유전자 클러스터를 고도로 발현하나, 8시간 금단 시점에서 비율이 증가하고, 32시간 금단 시점에서 최대에 도달한다.염증성 서브 표현형은 176시간 금단에 의해 조절되도록 정상화된다. GABA 수용체 유전자 클러스터 2를 고도로 발현하는 서브 표현형 B는 176시간 금단 조건에 의해 이러한 유전자 클러스터의 발현에서 전반적인 억제를 나타낸다. 개별 샘플의 유전자 발현을 평균으로 결합하여 유전자 클러스터의 발현과 해당 유전자 전사체의 단백질 위치를 시계열 전체에 걸쳐 시각화할 수 있었습니다.이 기술은 질병이나 섭동에 대한 세포 반응을 이해하기 위해 모든 생물학적 시스템이나 조직에 적용될 수 있습니다. 그것은 조직의 공간 및 해부학적 구조와 관련된 단일 세포 분해능에서 분자 반응을 해독하는 것입니다.

investigating-drivers-antireward-addiction-behavior-with-anatomically

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

도파민은 분명히 세포 기관 및 도파민 뉴런의 dendrites을 포함 midbrain의 핵에서 규제하고 있습니다. 여기 substantia nigra (SN)과 설치류의 복부 tegmental 지역 (VTA)의 midbrain의 핵에 도파민 규정에 따라서 절개 및 샘플 처리 결과를 극대화하는 접근 방식과 결론 및 통찰력을 설명합니다.

Substantia Nigra 및 복부 Tegmental 지역의 도파민 규정의 종합적인 프로파일

이 문서에서는 마우스의 뇌에 바이러스 벡터를 microinject하고 수집, 멸종 위기 및 회복 단계를 포함하는 에어컨 장소 환경 패러다임에서 테스트하는 방법에 대해 설명합니다.

크레 재조합이 코카인 컨디셔닝 장소 환경에있는 표적 유전자의 역할을 연구하는 표현 바이러스 성 벡터의 정위 미세 주입

이 원고는 행동 패러다임에 따라 설치류의 특정 뇌핵에서 유도된 전사 프로그램의 분석을 위해 포괄적인 프로파일링을 적용하는 프로토콜을 설명합니다. 본 명세서에서, 이 접근법은 미세유체 qPCR 어레이를 활용하여 급성 코카인 노출 후 마우스의 측좌핵(NAc)에서 유도된 유전자를 프로파일링하는 맥락에서 설명됩니다.

행동 경험에 따라 뇌 샘플에서 전사 역학의 종합 분석

개별 도파민 뉴런의 단리 또는 직접 또는 간접 면역과 복측 피개 영역은 레이저 미세 절제를 캡처하여 설명된다. 적외선 레이저를 이용하여 유리 슬라이드 조직으로부터 단리 및 적외선 및 자외선 레이저의 조합을 이용하여 막 slide에서 파라미터 논의된다.

레이저 캡처 이외에 Microdissection - 개별 도파민 신경 세포의 분리 및 전체 복부 피개 영역의 데모

설치류는 행동과 복잡한 정신 장애의 분자 기질을 조사하기에 적합한 모델입니다. 깨어 있는 설치류의 뇌 미세주입은 질병 기질을 밝히는 데 사용할 수 있습니다. 효율적이고 사용자 정의 가능한 뇌 미세주입 방법과 동기 부여를 정량화하는 조작적 패러다임의 실행이 제시됩니다.

쥐 뇌 미세 주입은 분자 기판 동기를 행동을 연구하기 위해

여기에서 우리는 신선한 냉동 모두 뇌 조직에서 신경 앙상블 별점이 발현 분자 변화를 연구하는 형광 활성화 된 셀 정렬 (FACS) 프로토콜을 제안한다. 동결 조직의 사용은 유용한 동물 피험자의 사용을 최대화하기 위해 다수의 세션을 통해 많은 뇌 영역의 FACS 분리 할 수​​있다.

형광 활성화 된 셀 정렬 (FACS)와 신선한 및 냉동 쥐 뇌 조직 FOS를 발현하는 신경 세포의 유전자 발현 분석

우리는 보람 유도 및 보상 상태의 변화에 대한 조치로 자발적인 에탄올 소비를 사용하여 초파리 (Drosophila의 melanogaster의) 경험을 nonrewarding위한 프로토콜을 설명합니다.

사용 보상 추구 행동의 변화를 측정하는 간단한 방법<em&gt; 노랑 초파리</em

이 문서 내용을 사용 하 여 탄소 섬유 전극 효소 바이오 센서 기술에 자연적인 보상 행동 동안 도파민과 높은 시간 해상도와 조미료의 릴리스를 측정 하는 고정 잠재력 amperometric 녹음의 사용은 여자는...

자연스럽 게 여성 시리아 햄스터에 동작을 보람 있는 하는 동안 Extracellular 신경 전달 물질의 생체 내에서 변화를 측정

핵 accumbens에 있는 도파민 D1-알파 수용 체의 식별은 중앙 신 경계 질환 중 D1 수용 체 역 기능을 명확히 중요 합니다. 우리는 새로운 RNA 제자리에서 교 잡 분석 결과 시각화 특정 뇌 영역에 하나의 RNA 분자를 수행.

탐지 기술 현장에서 혁신적인 RNA에 의해 설치류 핵 Accumbens에서 도파민 D1-알파 수용 체의 식별

이 프로토콜은 레이저 포획 미세 분면을 사용하여 높은 정확도와 해부학 적 특성으로 편도체의 중앙 핵에서 단일 뉴런, 마이크로 글리아 및 성상 세포를 수집하는 방법을 설명합니다. 추가적으로, 우리는 이 세포의 전사체의 부분 집합을 측정하기 위하여 미세 유체 성 RT-qPCR의 우리의 사용을 설명합니다.

레이저 캡처 미세 해부 및 미세 유체 qPCR을 결합하여 단일 세포의 전사 프로필을 분석: 오피오이드 의존에 대한 시스템 생물학 접근법

학습하세요 레이저 포획 현미절단 및 마이크로유체 RT-qPCR을 사용하여 단일 뉴런과 신경교세포의 전사체를 분석하는 방법을. 이 기술은 중독 관련 신경염증의 세포 유형별 반응을 연구하는 데 활용됩니다.

해부학적으로 특이적인 단일 세포 유전자 발현 방법을 사용한 중독 행동의 반보상 동인 조사

더 많은 동영상 탐색