Name: 변경된 전기적 활동을 받은 개별 살아있는 제브라피쉬의 골격근 성장에 대한 실시간 및 반복 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-16T14:10:00.000+00:00
Duration: 11 min 41 s
Description: 학습하세요 살아있는 제브라피쉬 골격근 성장 실시간 측정 방법을 Danio rerio를 이용하여 세포생물학 및 발달생물학 연구에 활용하세요. 이 기법은 근육 위축 장애 치료 전략 개발에 중요한 통찰을 제공합니다.

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저자는 Hughes 연구소 구성원인 Drs Seetharamaiah Attili, Jana Koth, Fernanda Bajanca, Victoria C. Williams, Yaniv Hinits, Giorgia Bergamin 및 Vladimir Snetkov가 설명된 프로토콜의 개발을 위해 기울인 노력과 플라스미드 또는 제브라피쉬 라인을 공유한 Henry Roehl, Christina Hammond, David Langenau 및 Peter Currie에게 깊은 빚을 지고 있습니다. SMH는 프로그램 보조금 G1001029, MR / N021231 / 1 및 MR / W001381 / 1 지원을받는 의학 연구위원회 (MRC) 과학자입니다. MA는 King 's College London에서 MRC 박사 과정 과정 박사 과정 학생을 취득했습니다. 이 작업은 학자, 멘토 및 친구인 David M. Robinson의 삼각법 입력의 혜택을 받았습니다.

저자는 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.

여기에서 우리는 색소 침착이 영상에 큰 방해가되지 않고 일시적인 마취 및 / 또는 고정이 잘 견딜 수있는 단계 또는 유전 적 변이에서 살아있는 제브라 피쉬 유충의 근육량을 정확하고 효율적으로 추정하는 방법을보고합니다. 우리는 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경을 사용했지만 설명된 접근 방식은 스피닝 디스크 컨포칼 또는 라이트 시트 현미경 및 별개의 초점면에서 이미지 스택을 생성하는 다른 모든 방법에 적용할 수 있습니다. 조직 크기 및 세포 함량 추정에 대한 점점 더 정교해지는 일련의 접근법이 설명된다. 각 방법에는 장점과 한계가 있으며, 이를 정량화할 수 있습니다. 조직 성장 연구의 주요 한계는 급성 투여 자극에 의해 촉매되는 일련의 분자 또는 하위 세포 사건에 반응하여 성장 속도가 변함에 따라 성장 변화를 실시간으로 분석하기가 어렵다는 것입니다. 또한 개별 개인을 비교할 때 개체 차이가 문제를 일으킬 수 있습니다. 현재의 접근법은 단일 살아있는 개인에서 하루 미만의 기간 동안 조직 성장을 측정 할 수있게합니다. 접근법의 적용은 분 단...

세포 수 (증식) 및 / 또는 세포 크기 (비대)의 증가를 포함하는 조절 된 조직 성장은 발달, 재생, 생태 학적 및 진화 적 적응에 중요한 요소입니다. 최근 수십 년 동안 세포 및 발달 생물학에 대한 분자 유전 학적 이해가 크게 발전했음에도 불구하고 조직 및 장기 크기 조절에 대한 기계 론적 이해는 아직 초기 단계에 있습니다. 이러한 지식의 부족에 대한 한 가지 이유는 필요한 공간적, 시간적 정확성으로 살아있는 유기체의 조직 성장을 정량화하기가 어렵 기 때문입니다.
전체 유기체의 성장의 다양한 측면을 시간이 지남에 따라 반복적으로 측정하여 각 개별 1,2,3,4,5에 대한 성장 곡선을 나타낼 수 있습니다. 이중 X선 흡수측정법(DXA), 컴퓨터 단층 촬영(CT) 및 자기공명영상(MRI)과 같이 점점 더 정교해지는 스캐닝 방법을 통해 인간 및 모델 유기체 모두에서 단일 개체에서 전체 장기 및 기타 신체 영역(예: 개별적으로 식별된 골격근)의 성장을 추적할 수 있습니다.6,7,8,9,10 . 그러나 이러한 방법은 아직 개별 세포를 밝힐 수 있는 해상도가 없으므로 세포 행동과 조직 수준 성장 사이의 연관성을 식별하기 어려웠습니다. 이러한 연관성을 만들기 위해 전통적인 연구는 종종 유사한 개별 동물의 코호트에 의존했으며, 그 중 일부는 연속적인 시점에서 희생 된 다음 세포 학적 세부 사항으로 분석됩니다. 이러한 접근법은 (바람직하게는 유사하지만 그럼에도 불구하고 가변적 인) 개인의 그룹에 걸쳐 관찰 된 변화를 평균화해야하므로 시간적 및 공간적 해상도가 부족하여 원인과 결과를 암시하는 세포 수준에서 상관 된 사건을 찾기가 어렵습니다.
무척추 동물 모델 유기체에 대한 연구는 처음에 C. elegans와 D. melanogaster에서 세포 분해능을 달성하고 단일 개체의 시간 경과에 따른 성장을 정확하게 측정하기 위해 광학 현미경을 개발하여 이러한 문제를 우회했습니다. 이러한 연구는 이러한 작은 모델 유기체 11,12,13,14,15,16,17의 성장에서 현저하게 불변하는 세포 계통 행동을 밝혀 냈습니다. 그러나 모든 척추 동물을 포함한 많은 동물은 불확실한 세포 계통을 가지고 있으며 유 전적으로 암호화 된 성장 프로그램을 모든 구성 조직과 기관의 크기가 적절하게 일치하는 기능적 3 차원 유기체로 바꾸는 신비한 피드백 과정에 의해 조직 성장을 제어합니다. 이러한 복잡한 성장 과정을 이해하려면 선택한 시간에 유전적, 약리학적 또는 기타 개입에 의해 실험적으로 조작할 수 있고 이후에 효과를 분석할 수 있는 단일 개체에서 시간이 지남에 따라 전체 조직 또는 기관을 이미지화하는 것이 바람직합니다.
각 척추 동물 골격근은 정의 된 크기, 모양 및 기능을 가지고 있으며 뼈, 힘줄 및 신경과 같은 인접한 조직과의 잘 특성화 된 상호 작용을 가지고 있습니다. 일부 근육은 작고 피부 바로 아래에 있으므로 고해상도 이미징 연구에 적합합니다. 대부분의 장기와 마찬가지로 각 근육은 안정적인 성인 크기에 도달하기 전에 배아, 출생 후 및 청소년 생활 전반에 걸쳐 성장합니다. 그러나 근육은 또한 사용과 영양에 따라 성인 생활 동안 크기를 변화시키는 독특한 능력을 가지고 있습니다.18, 이 특성은 유기체 건강, 스포츠 성능 및 독립 생활에 큰 영향을 미칩니다. 노년기의 근육량과 기능 상실, 근육 감소증은 고령화 인구 19,20,21에 직면 한 사회에 대한 관심이 증가하는 문제입니다.
우리와 다른 사람들은 조직 성장, 유지 및 복구를 관찰하고 조작 할 수있는 수백 개의 세포를 포함하는 분명히 닫힌 시스템으로서 제브라 피쉬 유충의 분절 반복 몸체에서 골격근 조직의 정의 된 블록의 성장에 초점을 맞추 었습니다 22,23,24,25,26. 일부 정량적 작업은 이전에 25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35로보고되었지만 시간이 지남에 따라 개별 척추 동물의 세포 세부 사항에서 근육 성장을 측정하는 상세하고 검증 된 방법은 없습니다. 여기에는 검증과 함께 이러한 반복 측정을 수행하는 방법에 대한 효율적인 프로토콜이 설명되며, 변경된 전기 활동에 대한 반응으로 비대 및 과형성 성장의 변화를 분석하는 데 사용되는 예가 제공됩니다.

<table><tbody><tr><td>접착제, Blu Tack</td><td>Bostik</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>에어로졸 진공&nbsp;</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>아가로스</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td>-</td></tr><tr><td>아가로스, 저겔화 온도</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414</td><td>한 번 녹으면 블록 히터에서 37oC로 유지하여 반복 사용을 위한 액체 형태로 유지하십시오.</td></tr><tr><td>블록 히터</td><td>Cole-Parmer</td><td>SBH130-BODIPY</td><td></td></tr> <tr><td>FL C5-ceramide</td><td>Thermo Scientific</td><td>D3521</td><td>물고기 물에 희석하여 5 &micro에서 사용; M은 하룻밤 배양을 위한 것입니다.</td></tr><tr><td>악어 클립 및 와이어</td> <td>-</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>피지 / 이미지J</td><td>국립 보건원, NIH</td> <td>-</td><td></td></tr> <tr><td>어류 매체, 어류 물</td> <td>-</td><td></td> <td>어류 시설에서 수집 된 순환 시스템 물.</td></tr><tr><td>물고기 배지, E3 배지</td> <td>-</td><td></td> <td>E3는 The Zebrafish Book에 설명되어 있습니다. http://zfin.org (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2 및 0.33 mM MgSO4 증류수).</td></tr><tr><td>형광 현미경</td><td>Leica</td><td>Leica MZ16F</td><td>다른 종류의 형광 현미경도 적합할 것으로 예상됩니다.</td></tr><tr><td>유리 바늘</td><td>세계 정밀 기기, Inc.</td><td>1B100-6</td><td>조작 중 배아의 손상을 방지하기 위해 화염 연마됩니다.</td></tr><tr><td>잔디 자극기</td><td>다른 종류의 잔디 악기</td><td>S88</td><td>자극기도 적합 할 것으로 예상됩니다.</td></tr><tr><td>Kimwipes, 섬세한 작업 와이퍼</td><td>Kimberly-Clark Professional</td><td></td> <td>13258179-Laser</td></tr> <tr><td>스캐닝 현미경(LSM)&nbsp;</td><td>자이스</td><td>자이스 LSM 5 Exciter 다른 종류의 자이스 LSM 880</td><td>LSM도 적합할 것으로 예상됩니다.</td></tr><tr><td>Nunc 세포 배양 처리, 6웰 플레이트</td><td>Thermo Scientific</td><td></td> <td>140675-Objective</td></tr><tr><td>, 20회/1.0W 침수</td><td>Zeiss</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>파스퇴르 피펫, 눈금 1mL</td><td>Starlab Group</td><td>E1414-0100</td><td>-</td></tr><tr><td>파스퇴르 피펫, 마이크로 파인 팁 1mL</td><td>Starlab Group</td><td>E1414-1100</td><td>-</td></tr><tr><td>페트리 접시, 60mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5481</td><td>-</td></tr><tr><td>플라스미드, CMV-Cerulean</td><td>Christina L. Hammond (브리스톨 대학교)</td><td></td><td>pCS2+_cerulean_kanR 플라스미드를 단세포 단계에서 25-75 pg로 주입합니다. 인용 : Bussman J, and Schulte-Merker S. (2011) Development 138:4327-4332. 도이: 10.1242/dev.068080.</td></tr><tr><td>플라스미드, pCS-mCherry-CAAX</td><td>Henry Roehl (University of Sheffield)</td><td>-</td><td>SP6 프로모터를 이용한 시험관내 전사용(다른 막 표지 마커를 함유하는 플라스미드를 사용할 수 있음); 합성된 캡핑된 mRNA를 1세포 단계에서 100-200pg로 주입합니다.</td></tr><tr><td>펄스 컨트롤러&nbsp;</td><td>Hoefer Scientific Instruments</td><td>PC750</td><td>-</td></tr><tr><td>납땜 인두</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td>에틸 3-아미노벤조에이트 메탄설포네이트/ MS-222; 물고기 물에 용해되어 0.6 mM에서 사용됩니다.</td></tr><tr><td>Volocity</td><td>Perkin Elmer/Quorum Technologies Inc</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Watchmaker 집게, No. 5</td><td>-</td><td></td><td>-</td></tr><tr><td>와이어, 플래티넘</td><td>굿펠로우</td><td>PT005142/12</td><td>직경 0.40mm; 은의 비싼 대안.</td></tr><tr><td>Wire, Silver</td><td>Acros Organics</td><td>317730010</td><td>직경이 0.25mm입니다(직경 범위, 즉 0.25-0.5mm가 테스트되었으며 유사한 결과가 나왔습니다).</td></tr><tr><td>제브라피쉬, myog:H2B-mRFP</td><td>David M. Langenau (매사추세츠 종합병원; 하버드 줄기세포 연구소)</td><td>-</td><td>ZFIN 공식 명칭: Tg(myog:Hsa.HIST1H2BJ-mRFP), fb121Tg.&nbsp; http://zfin.org/ZDB-ALT-160803-2&nbsp; 인용 : Tang Q, Moore JC, Ignatius MS, Tenente IM, Hayes MN, Garcia EG, Torres Yord &aacute; n N, Bourque C, He S, Blackburn JS, Look AT, Houvras Y, Langenau DM. 광학적으로 투명한 면역 결핍 제브라피쉬에 세포 이식 후 종양 세포 이질성 이미징. 냇 코뮌. 2016 년 1 월 21 일;7:10358. 도: 10.1038/ncomms10358.</td></tr><tr><td>Zebrafish, &alpha;-actin:mCherry-CAAX</td><td>Peter D. Currrie (ARMI, Monash University)</td><td>-</td><td>ZFIN 공식 명칭: Tg(actc1b:mCherry-CAAX), pc22Tg.&nbsp; http://zfin.org/ZDB-ALT-150224-2 인용: Berger J, Tarakci H, Berger S, Li M, Hall TE, Arner A, and Currie PD. 제브라피시 돌연변이 tr&auml에서 Tropomodulin4 손실; GE는 세포질 막대 형성과 선충 근병증을 연상시키는 근육 약화를 유발합니다. 디스 모델 Mech. 2014 12 월; 7(12):1407-15. 도이: 10.1242/dmm.017376.</td></tr><tr><td>제브라피쉬, &beta;-actin:HRAS-EGFP</td><td>-</td><td>-</td><td>ZFIN 공식 명칭: Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP), vu119Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-061107-2&nbsp; 인용 문양: Cooper MS, Szeto DP, Sommers-Herivel G, Topczewski J, Solnica-Krezel L, Kang HC, Johnson I, and Kimelman D. GFP에 대한 필수 대조 염색으로 BODIPY TR 메틸 에스테르 염료를 사용하여 형질전환 제브라피시 배아의 형태 형성 시각화. 데브 다인(Dev Dyn.) 2005 년 2 월; 232(2):359-68. 도이: 10.1002/dvdy.20252.</td></tr><tr><td>ZEN 소프트웨어</td><td>Zeiss</td><td>-</td><td>-</td></tr></tbody></table>

변경된 전기적 활동을 받은 개별 살아있는 제브라피쉬의 골격근 성장에 대한 실시간 및 반복 측정

Real Time and Repeated Measurement of Skeletal Muscle Growth in Individual Live Zebrafish Subjected to Altered Electrical Activity

살아있는 배아, 애벌레 또는 어린 제브라 피쉬의 몸 전체에 걸쳐 개별 세포를 시각화하기 위해 여러 가지 방법을 사용할 수 있습니다. 형광으로 표시된 원형질막이 있는 활어를 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경으로 스캔하여 근육 조직의 부피와 존재하는 근육 섬유의 수를 결정할 수 있음을 보여줍니다. 시간 경과에 따른 살아있는 동물의 세포 수와 크기를 측정하기 위한 효율적인 접근 방식이 설명되고 보다 힘든 분할 방법에 대해 검증됩니다. 근육의 전기 및 수축 활동을 제어 할 수있는 방법이 설명되어 있습니다. 골격근 수축 활동의 손실은 근육 성장을 크게 감소시켰다. 유충에서는 패턴화 된 전기 유발 수축 활동의 재 도입을 허용하는 프로토콜이 설명됩니다. 설명 된 방법은 개인 간 변동성의 영향을 최소화하고 살아있는 유기체의 맥락에서 다양한 세포 및 생리적 성장 매개 변수에 대한 전기적, 유전 적, 약물 적 또는 환경 적 자극의 효과를 분석 할 수 있습니다. 개인에 대한 정의된 조기 개입의 측정된 효과에 대한 장기 추적 관찰을 이후에 수행할 수 있습니다.

빠르고 정확한 소마이트 부피 측정 제브라 피쉬 유충의 근육 성장을 신속하게 측정 할 수있는 샘플 준비, 데이터 수집 및 체적 분석 방법이 설명됩니다. 근육 크기는 세포막 표적 GFP(β-액틴:HRAS-EGFP ) 또는 엠체리(α-액틴:mCherry-CAAX )가 있는 원형질막에 라벨이 부착된 물고기를 사용하여 살아있는 동물에서 측정할 수 있습니다. 유충은 트리카인을 사용하여 일시적으로 마취되고, 저융점 아가로스에 장착되고, 공초점 형광 현미경을 사용하여 이미지화되었습니다. Somite(17)는 몸통-꼬리 계면(31)에서의 그의 접근성을 고려하여 근육 크기의 분석을 위해 선택되었다. 실제로 이론적으로 근종 부피는 근종 길이 (L)와 3 개의 단면적 측정 (CSA)의 평균의 곱으로 계산할 수 있습니다 (그림 2A, 4 슬라이스 방법이라고 함).
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광학 선명도는 제브라 피쉬의 세포 생물학적 및 생리 학적 작업에 대한 주요 이점입니다. 골격근 및 이웃 조직의 성장이 전신 성장과 어떻게 통합되는지에 대한 새로운 통찰력을 허용하는 개별 동물의 세포 성장 측정을위한 강력한 방법이 설명됩니다.

A number of methods can be used to visualize individual cells throughout the body of live embryonic, larval or juvenile zebrafish. We show that live fish ...

우리의 프로토콜을 통해 골격근과 같은 조직이 크기를 조절하는 방법을 연구 할 수 있으며, 이는 중요한 생리 학적 및 의학적 의미를 지닌 세포 및 발달 생물학의 핵심 질문으로 남아 있습니다. 우리 기술의 가장 큰 장점은 높은 수준의 공간적 및 시간적 정확도로 생체 내에서 살아있는 동물에서 세포 성장을 관찰하고 측정 할 수 있다는 것입니다. 초기 근육 성장에 대한 기본적인 이해의 진전은 초기 근육 문제의 발달 기원을 강조하고 노인 및 근육 소모성 장애 환자의 근육 손실을 예방하는 Novo Therapeutics의 발견으로 이어질 수 있습니다.1.5 밀리리터 튜브에 1 % LMA를 준비하고 반복 사용을 위해 섭씨 37 도의 열 블록에 보관하십시오. 장착 할 물고기를 선택하고 각 물고기를 일시적으로 마취하십시오. 열 충격을 방지하려면 열 블록에서 LMA 부분 표본을 제거하고 설정 바로 위까지 식히십시오.1 % LMA 층으로 코팅 된 60 밀리리터 페트리 접시를 가져 와서 해부 현미경 스테이지에 놓습니다. 1 밀리리터 플라스틱 파스퇴르 피펫으로 유충을 60mm 코팅 된 페트리 접시에 옮기고 가능한 한 많은 배지를 제거합니다. 그런 다음 파스퇴르 피펫을 사용하여 LMA 몇 방울을 물고기에 떨어뜨리고 LMA가 설정되기 전에 집게나 불광택이 나는 가는 유리 바늘을 사용하여 LMA의 전후 및 배복부 축이 수평에서 10도 이내인 LMA의 윗면 근처에 유충의 방향을 빠르게 향하게 합니다.또는 1밀리리터 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하십시오. 최소 어류 배지로 유충을 수집하고 유충을 냉각 된 LMA의 부분 표본으로 옮깁니다. 유충이 LMA에 완전히 둘러싸이도록 5 초 동안 가라 앉히십시오.그런 다음 유충을 회수하여 LMA 한 방울로 아가 로스 코팅 페트리 접시에 옮깁니다. 앞에서 설명한대로 유충을 빠르게 배치하십시오. 유충이 아가 로스 방울의 표면 근처에 수평으로 올바르게 장착되지 않은 경우 제거하고 다시 삽입하면 1 밀리리터 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 부드러운 흡입으로 유충을 쉽게 검색 할 수 있으며 LMA는 화학 물티슈를 사용하여 부드럽게 제거 할 수 있습니다.LMA가 설정될 때까지 약 10분 동안 기다립니다. 접시에 약 10밀리리터의 트리카인 함유 생선 배지를 가득 채웁니다. 공초점 스택을 캡처하려면 아가로스 팽창이 발생하므로 스캔하기 전에 장착된 물고기를 최소 10분 동안 그대로 두십시오.샘플 접시를 공초점 시스템의 스테이지에 로드합니다. 유충을 찾아 원하는 체절에 집중하십시오. Somite 17은 항문 통풍구 근처의 국소화가 용이하고 이미징이 쉽기 때문에 선택 될 수 있습니다.앞쪽에서 체세포를 세어 확인하십시오. YZ 이미지를 캡처하려면 Z 스택을 캡처하는 것처럼 설정합니다. 물고기의 상단과 하단을 정의하는 것으로 시작하십시오.왼쪽과 오른쪽 모두 원하는 대로 캡처할 수 있으므로 모든 빠른 YZ 스캔이 원하는 영역을 캡처할 수 있습니다. 컨포칼 소프트웨어가 허용하는 대로 물고기의 스캔 영역 방향을 지정합니다. 이미지 dex 축과 평행하게 하고 등쪽 축을 Y축과 평행하게 하고 등쪽 축을 필드 중앙에 소마이트 17로 배치합니다.수직 및 수평 근중격과 함께 전체 에축 및 최면 소마이트 반쪽이 보이고 고해상도 XY 이미지를 캡처하는 최상단 근종의 중간 평면에 초점을 맞춥니다. 파일 이름을 지정하고 이미지를 저장합니다. YZ 이미지를 캡처하려면 물고기의 전후 축에 수직 인 선택한 체절을 가로 질러 정확한 등쪽에서 복부 선을 그립니다.선택한 전후 위치를 추가한 다음 Z 스택 라인 스캔을 수행합니다. YZA, YZM 및 YZP를 포착하기 위해 선택한 근종을 따라 정의된 전후 위치에서 YZ 라인 스캔을 세 번 반복합니다. 이러한 이미지의 이름을 지정하고 관련 XY 이미지와 함께 저장합니다.이 프로토콜은 4 슬라이스 방법이라고하며 Zen 소프트웨어 또는 ImageJ를 사용하여 이미지를 분석 할 수 있습니다. 자극 챔버를 만들려면 6 x 35mm 웰 플레이트를 가져 와서 좁은 납땜 인두를 사용하여 각 우물의 각면에 1cm 간격으로 직경이 5mm 미만인 두 개의 작은 구멍을 만듭니다. 일단 생성되면 자극 챔버를 재사용 할 수 있습니다.각 우물의 구멍을 통해 한 쌍의은 또는 백금 와이어를 끼 웁니다. 재사용 가능한 접착 재료는 개구부 근처에 적용하여 와이어를 제자리에 유지하고 와이어 사이에 1cm 간격을 유지할 수 있습니다. 수정 후 3 일에 물고기를 물고기 중간 제어, 비활성 및 비활성 플러스 줄기의 세 가지 조건으로 나눕니다.비활성 및 비활성 플러스 줄기 그룹의 경우, 수정 후 72 시간에 유충을 0.6 밀리몰 트리카인으로 마취하십시오. 물고기 매체 대조 물고기의 경우 마취되지 않은 상태로 두십시오. 어류 배지에 60 밀리리터의 2 % 아가 로스를 준비하십시오.전자 레인지로 완전히 녹여 식히십시오. 그런 다음 트리카인을 넣고 자극 챔버의 각 우물에 적어도 4 밀리리터를 붓습니다. 전극 사이에 맞춤형 4 웰 빗을 즉시 추가하십시오.젤이 굳을 때까지 10 분 정도 기다리십시오. 빗을 조심스럽게 제거하여 4 개의 직사각형 우물을 만듭니다. 각 우물을 트리카인 물로 채우고 마이크로 피펫을 사용하여 각 우물에 단일 마취 된 비활성 플러스 줄기 유충을 배치하고 전후방 접근이 전극에 수직으로 있습니다.해부 형광 현미경으로 각 물고기가 각 챔버 웰 내에서 완전히 마취되었는지 확인하십시오. 챔버의 한쪽에 있는 각 전극에 연결된 악어 클립을 사용하여 극성 컨트롤러를 통해 조정 가능한 전기 생리학, 패턴 생성 자극기를 챔버에 연결합니다. 그런 다음 텍스트 원고에 설명 된대로 물고기를 자극하십시오.현미경으로 정기적으로 확인하여 물고기가 자극되고 있는지 확인하십시오. 전기 자극은 설명 된 매개 변수에 따라 5 초마다 한 번씩 가시적 인 양측 수축과 약간의 움직임을 유도해야합니다. 자극 후 플라스틱 피펫으로 부드럽게 씻어내어 각 우물에서 물고기를 조심스럽게 제거하고 신선한 트리카인이 함유 된 생선 배지에서 인큐베이터로 돌아갑니다.챔버 내에서 트리카인 물을 붓고 집게를 사용하여 각 우물에서 아가 로스를 자르고 제거하고 우물을 수돗물로 헹구고 건조시킵니다. 4 슬라이스 방법이라고 불리는 근육 크기 분석을 위해 제브라 피쉬 유충 근육의 XY 및 YZ 이미지를 얻고 체석 부피를 계산했습니다. 4 개의 슬라이스 방법과 전체 스택 방법 사이에 강한 상관 관계가 관찰되었지만 4 슬라이스 방법은 약간 더 큰 부피 추정치를 제공했습니다.체세포 16과 18의 인접한 근종의 체적 분석 결과 각 체석이 뒤에있는 것보다 약 7 % 더 큰 것으로 나타났습니다. 추가 조사에 따르면 단일 YZ 측정 만 필요한 두 슬라이스 방법이 근종 부피를 합리적으로 정확하게 추정 한 것으로 나타났습니다. 근종은 수정 후 2 일에서 5 일 사이에 길이와 단면적이 눈에 띄게 성장하여 부피가 꾸준히 증가했습니다.수정 후 3 일에서 4 일 사이에 마취 트리카인에 의해 비활성화 된 근육은 부피가 현저히 감소하여 유충 근육 성장이 활동 의존적임을 나타냅니다. 수정 후 3 일 및 4 일에 각 개별 물고기를 측정하는 것과 비교하여 수정 후 4 일에 근종 부피를 측정 할 때 근종 크기의 감소에 더 큰 변화가 관찰되었습니다. 그럼에도 불구하고, 근종 측정의 두 방법 사이에 근종 부피에서 유의 한 차이가 관찰되지 않았다.myotome 내의 섬유 수와 평균 섬유 부피를 측정 한 결과, 활동이 성장의 세포 측면을 모두 조절한다는 것이 밝혀졌습니다. 유충이 신선하게 준비된 트리카인을 사용하여 완전히 마취되었는지 확인하십시오. 부분 마취는 다양한 결과로 이어질 것입니다.우리가 알다시피, 유충은 전기 자극에 더 적극적으로 반응합니다. 다운스트림 전사체학 및 약리학 실험과 결합된 이 방법은 힘 감지가 골격근의 성장을 주도하는 방법에 대한 새로운 통찰력을 보여주었습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 비디오는 마비된 제브라피시 유충에서 구심성 뉴런의 전기 신호를 측선 신경절 근처에 마이크로피펫을 배치하고 신호 캡처를 위해 느슨한 밀봉을 형성하여 기록하는 방법을 보여줍니다. 세포외 용액은 이 과정에서 신경 세포의 생존력을 유지합니다.

고정된 제브라피시 유충에서 구심성 뉴런의 전기 신호 모니터링

애벌레의 zebrafish forebrain에서 세포 필드 잠재력을 기록하는 간단한 방법이 설명되어 있습니다. 방법은 강력한를...

애벌레의 Zebrafish의 Forebrain Electrophysiological 기록

제브라 피쉬는 골격 근육의 인간의 질환을 모델링하는 새로운 시스템이다. 우리는 배아 및 유충의 제브라 피쉬에서 골격 근육의 근섬유를 분리하는 빠르고 효율적인 방법을 설명합니다. 이 방법은 하나의 골격 근육 섬유 형태의 연구에 적합한 고밀도 근섬유 준비, 단백질 세포 내 현지화, 근육 생리를 얻을 수 있습니다.

해리 된 준비에서 배아와 애벌레 Zebrafish의 골격 근섬유의 분석

힘의 측정은 개발, 부상, 질병, 치료 또는 화학 물질의 독성에 의한 근육 기능의 변화를 보여주기 위해 사용할 수 있습니다. 이 비디오에서는, 우리는 zebrafish의 애벌레 몸통 근육의 최대 수축시 힘을 측정하는 방법을 보여줍니다.

Zebrafish의 유충의 근육 기능을 평가하기 위해 수축하는 동안 힘 측정

제브라피시는 이제 근이영양증, 선천성 근병증 및 관련 신경근 질환을 모델링하기 위한 확립되고 강력한 도구입니다. 복굴절(Birefringence)과 촉각(touch-hoked) 탈출 행동은 초기 발달 과정에서 제브라피시 배아의 근육 무질서 및 기관차 손상 정도를 결정하는 데 사용되는 두 가지 일반적인 비침습적 분석법입니다.

복굴절(Birefringence) 및 촉각-유발 탈출 반응 분석(Touch-evoke Escape Response Assay)에 의한 유충 제브라피시의 골격근 결손 분석

이 논문은 성인 제브라 피쉬는, 고정 삽관 및 녹음 및 손상 동물에서 신경 활동의 조작을 허용하는 생체 전기 생리학 실험에 사용 할 수있는 방법에 대해 설명합니다.

온전한 성인 Zebrafish의의 뇌에 전기 생리학 기록

얼룩말은 근육 기능과 질병을 연구하는 훌륭한 모델입니다. 초기 배발생 동안 제브라피쉬는 규칙적인 근육 수축을 시작하여 리드미컬한 수영 행동을 일으키며, 이는 근육이 파괴될 때 변경됩니다. 여기에서는 근육 기능의 척도로서 수영 성능을 조사하기 위해 촉각 유발 반응 및 운동 분석에 대해 설명합니다.

터치 유발 대응 및 로코 분석 실험을 사용하여 Zebrafish의 근육의 성능 및 기능을 평가하기 위해

여기에 설명된 프로토콜은 관심 세포 유형에서 선택적으로 발현되는 형광 공명 에너지 전달(FRET) 기반 유전자 인코딩 전압 지시기(GEVI)와 함께 생체 내 시스템에서 제브라피시 배아를 사용하여 가장 비침습적인 생리학적 조건에서 흥분성 세포의 전기적 특성을 연구할 수 있도록 합니다.

살아있는 Zebrafish 배아에서의 바이오 센스 모터 뉴런 멤브레인 잠재력

여기, 우리가 배아 개발, 운동, 시각화 세포 전기 전압 기자 제 브라 라인을 만드는 과정을 보여 그리고 물고기 종양 vivo에서세포.

Zebrafish 초기 배아에 종양 세포 전기 활동의 시각화

골격 근 재생 조직 상주 근육 줄기 세포에 의해 구동, 근육 이영양증 등 많은 근육 질환에서 손상 되는, 그리고이 재생 하는 근육의 무능력 결과. 여기서는 근육 질환의 제브라피시 모델에서 근육 재생을 검사할 수 있는 프로토콜을 설명합니다.

근육 질환의 제브라피시 모델에서 근육 재생 검토

제브라피시 유충 신경근 접합부(jebrafish larval neuromuscular junction)는 시냅스 생리학을 연구하기 위한 매력적인 모델입니다. 전기 생리학 및 광학 이미징을 포함한 많은 실험 기술에 적용할 수 있습니다. 여기에서는 정립 형광 현미경 하에서 pHluorin 기반 프로브를 사용하여 시냅스 전달을 이미징하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

절개된 유충 제브라피쉬의 신경근 접합부에서 시냅스 소포 재활용의 라이브 이미징

학습하세요 살아있는 제브라피쉬 골격근 성장 실시간 측정 방법을 Danio rerio를 이용하여 세포생물학 및 발달생물학 연구에 활용하세요. 이 기법은 근육 위축 장애 치료 전략 개발에 중요한 통찰을 제공합니다.

변경된 전기적 활동을 받은 개별 살아있는 제브라피쉬의 골격근 성장에 대한 실시간 및 반복 측정

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