Name: 3D 자기력 액추에이터와 다기능 형광 이미징을 결합하여 핵 역학 연구 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: 학습하세요 3D 자기력 액추에이터와 다기능 형광 이미징을 결합한 비침습적 핵 역학 연구 방법을. 자성 미세구슬을 이용해 살아있는 세포 핵에 직접 힘을 가하고 공초점 형광 현미경으로 실시간 이미징하여 핵 기계수용 메커니즘을 규명합니다.

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이 프로젝트는 UF Gatorade Award Start-up Package (XT), UFHCC Pilot Award (XT 및 Dr. Dietmar Siemann), UF Opportunity Seed Fund (XT) 및 UFHCC University Scholars Program (H.Y. Wang)의 지원을 받습니다. 우리는 Dr. Jonathan Licht (UFHCC), Dr. Rolf Renne (UFHCC), Dr. Christopher Vulpe (UFHCC), Dr. Blanka Sharma (BME), Dr. Mark Sheplak (MAE & ECE), Dr. Daniel Ferris(BME), Dr. Malisa Sarntinoranont (MAE), Dr. Ashok Kumar (MAE), Dr. Benjamin Keselowsky (BME), Dr. Brent Gila (RSC), Dr. Philip Feng (ECE), Dr. Gregory A. Hudalla (BME), Dr. Steven Ghivizzani (OSSM), Dr. Yenisel Cruz-Almeida (CDBS), Dr. Roger Fillingim (CD-BS), Dr. Robert Caudle (OMS), Dr. John Neubert (DN-OR), Dr. Justin Hiliard (신경 외과), Dr. Tian He (Harvard University), Dr. Youhua Tan (Hong Kong Polytechnic University), Jessie L-S Au 박사 (Institute of Quantitative Systems Pharmacology), Dr. David Hahn (University of Arizona), 그리고 Nikon의 지원 팀 (Drs. Jose Serrano-Velez, Larry Kordon 및 Jon Ekman). 우리는 Tang, Yamaguchi, Sharma 's, Au, Siemann 및 Guan의 연구소의 모든 구성원과 UF MAE 부서의 모든 직원의 효과적인 지원에 깊이 감사드립니다.

1. CRISPR / Cas9 엔지니어링 B2B 셀의 유지 보수
<ol><li>B2B 세포를 RPMI-1640이 보충된 T25 플라스크에서 10% 태아 소 혈청과 1% 페니실린-스트렙토마이신으로 배양합니다.</li>
	<li>B2B 세포를 37°C의 가습 인큐베이터에서 5%CO2로 유지한다.</li>
	<li>B2B 세포를 계대배양하면 컨플루언시가 70% 내지 80%에 도달한다.</li>
	<li>B2B 세포주를 -80°C 냉동고에서 10%(v/v) DMSO가 있는 RPMI-1640 배양 배지에 보관합니다.</li>
	<li>실험에서 계대수가 10 미만인 B2B 세포를 사용한다.</li>
</ol>2. 세포 배양
<ol><li>유리 바닥 페트리 접시에 세포를 씨를 뿌립니다.<ol><li>내부에 B2B 세포가 들어있는 플라스크를 인큐베이터에서 생물 안전 캐비닛으로 옮깁니다.</li>
		<li>진공 펌프가 연결된 흡인 피펫을 사용하여 플라스크에서 배양 배지를 제거합니다.</li>
		<li>2mL의 인산염 완충 식염수(PBS)로 플라스크를 세척합니다.</li>
		<li>흡인 피펫을 사용하여 PBS를 제거합니다.</li>
		<li>0.05% 트립신 용액 0.5mL를 추가하여 플라스크 기판 바닥에서 세포를 분리합니다.</li>
		<li>플라스크를 인큐베이터에 5 분 동안 두십시오.</li>
		<li>플라스크를 생물 안전 캐비닛으로 옮깁니다. 5mL의 새로운 배양 배지를 플라스크에 넣고 용액을 위아래로 피펫팅합니다.</li>
		<li>셀(300 cells/μL)이 있는 배지 50μL를 유리 바닥 페트리 접시에 증착합니다. 배양 배지 2mL를 페트리 접시에 추가합니다.</li>
		<li>페트리 접시를 인큐베이터에 넣으십시오. 셀이 부착 될 때까지 12 시간 동안 기다리십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>자성 마이크로 비드로 세포를 배양하십시오.<ol><li>7 μm 평균 직경 카르보닐 철 마이크로비드(이하 7 μm 마이크로비드라고 함, 재료 표 참조)의 0.2 g의 무게를 잰다.</li>
		<li>피펫을 사용하여 마이크로비드를 RPMI-1640 배양 배지 1mL에 현탁시킵니다.</li>
		<li>B2B 세포가 담긴 페트리 접시를 생물안전 캐비닛으로 가져갑니다.</li>
		<li>마이크로비드가 포함된 배지 200μL를 페트리 접시에 추가합니다. 알림: 마이크로비드의 침전을 방지하기 위해 배지를 빠르게 추가하십시오.</li>
		<li>마이크로 비드가 세포에 의해 내부화 될 때까지 페트리 접시를 인큐베이터에 다시 넣으십시오. 6시간마다 내재화를 확인하여 다른 세포주에 대한 내재화를 위한 최적의 시간을 결정합니다.</li>
		<li>내재화를 확인하려면 컨포칼 형광 이미징을 수행하여 마이크로비드, 핵 및 세포 경계를 시각화합니다. 마이크로비드가 세포에 의해 내재화되면 세포 경계 내에 있게 됩니다.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 핵의 시각화
<ol><li>배양기에서 배양 배지 1.5mL를 15 분 동안 따뜻하게합니다.</li>
	<li>생물 안전 캐비닛의 조명을 끕니다. 세포, 예열 된 배양 배지, 핵 얼룩 및 베라파밀 HCl이 들어있는 페트리 접시를 생물 안전 캐비닛에 넣습니다. 알림: 핵 염색 성분은 빛에 민감합니다. 작동 중 빛에 노출되지 않도록하십시오.</li>
	<li>DMSO에 의한 1000x 핵 얼룩을 100x로 희석합니다.</li>
	<li>DMSO에 의해 100 mM 베라파밀 HCl을 10 mM로 희석한다.</li>
	<li>15μL의 100x 핵 염색과 15μL의 10mM 베라파밀 HCl을 1.5mL의 배양 배지에 추가합니다. 위아래로 피펫팅하여 잘 섞는다.</li>
	<li>페트리 접시에서 배양 배지를 제거합니다. 핵 염색이 포함된 배양 배지를 페트리 접시에 첨가한다.</li>
	<li>세포를 인큐베이터에 2 시간 이상 다시 넣으십시오.</li>
</ol>4. 자기력 응용 하드웨어의 준비
<ol><li>아크릴로니트릴 부타디엔 스티렌(ABS)을 사용하여 모든 부품을 3D 프린팅하고 CAD 설계에 따라 조립합니다(그림 1A). CAD 설계는 재료 테이블에 포함되어 있습니다.</li>
	<li>양면 테이프를 사용하여 자석 이동 장치에 자석을 부착합니다(그림 1A).</li>
	<li>자석 이동 장치를 현미경 스테이지 옆에 놓습니다. 세 개의 손잡이를 사용하여 자석이 페트리 접시 위로 13mm에서 120mm 사이로 이동할 수 있을 때까지 자석의 공간 위치를 조정합니다. 알림: 자석과 페트리 접시 사이의 거리 상한이 마그네틱 마이크로비드에 원치 않는 힘이 가해지지 않도록 가능한 한 큰지 확인하십시오. 이 실험 설정에서 최대값은 120mm입니다. 자석이 대물렌즈 및 전동 스테이지를 포함한 현미경 부품을 방해하지 않는지 확인하십시오.</li>
	<li>자석을 가장 높은 z 위치(120mm)로 설정합니다.</li>
</ol>5. 강제 적용 및 라이브 셀 이미징
<ol><li>장기 이미징을 위한 환경실 설치<ol><li>75 % 에탄올 용액을 적용하여 환경 챔버를 철저히 살균하고 청소하십시오.</li>
		<li>환경 챔버를 도립 현미경의 전동 스테이지에 놓습니다.</li>
		<li>CO2 탱크를 열고CO2 유입 속도를 160mL/분으로 설정합니다.</li>
		<li>챔버의 온도를 44°C(상단), 42°C(수조) 및 40°C(스테이지)로 조정합니다.</li>
		<li>20mL의 정제수를 환경 챔버의 욕조에 추가하여 90% 습도를 유지합니다.</li>
		<li>조직 배양 인큐베이터에서 표적 세포가 들어있는 유리 바닥 페트리 접시를 꺼내 챔버에 넣습니다.</li>
		<li>환경 챔버의 금속 클램프를 적용하여 페트리 접시 위치를 고정합니다. 알림: 페트리 접시는 고정되지 않으면 자기력이 접시를 움직일 수 있으므로 챔버에 단단히 고정해야 합니다.</li>
		<li>챔버의 뚜껑을 닫습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>이미징 파라미터의 최적화<ol><li>핀홀 크기 최적화: 핀홀은 초점이 맞지 않는 광자를 차단합니다. 핀홀 크기가 클수록 초점이 맞지 않는 광자가 더 많이 생성되지만 이미지는 더 밝아집니다. 핀홀 크기가 작을수록 더 초점이 맞춰지고 어두운 이미지가 생성됩니다. 핀홀 크기를 최적화하여 적절한 신호 대 잡음비로 초점이 맞는 컨포칼 이미지를 얻으십시오.</li>
		<li>레이저 강도 최적화: 레이저 강도는 여기의 강도를 결정하여 빛을 방출합니다. 낮은 레이저 강도는 낮은 신호 대 잡음비를 제공합니다. 레이저 강도가 너무 높으면 광퇴색이 발생합니다. 그에 따라 레이저 강도를 조정하십시오.</li>
		<li>단계 크기 및 단계 최적화: 단계 및 단계 크기는 Z 스택에서 촬영할 이미지 수를 결정합니다. 스텝 크기가 작고 스텝이 많을수록 Z 스택 해상도가 증가하지만 광퇴색도 증가합니다. 이 실험에서는 ~15μm 세포 높이의 세포에 대해 1μm 스텝 크기를 사용했습니다.</li>
		<li>노출 시간 최적화: 노출 시간은 세포가 여기 레이저에 노출되는 시간을 결정합니다. 노출 시간이 짧으면 신호 대 잡음비가 감소합니다. 노출 시간이 길면 광퇴색이 발생합니다. 이 실험에는 4 초 당 1 프레임의 노출 시간이 사용되었습니다.</li>
		<li>이미징 파라미터 최적화: 4개의 파라미터 중 하나를 반복적으로 변경하고 다른 파라미터는 일관성을 유지합니다. 매번 각 영상의 YAP N/C 비율을 측정하고 YAP N/C 비율 변화를 비교하여 광퇴색 수준을 결정합니다. 신호 대 잡음비, 이미징 속도 및 광퇴색 간의 균형을 얻을 때까지 최적화 프로세스를 반복합니다.</li>
		<li>실험 중 더 빠른 이미징 설정을 위해 최적화된 이미징 파라미터를 사용하여 이미징 구성을 정의합니다. 알림: 이 연구에 사용된 구성은 이미징 매개변수의 섹션 5.3에 설명되어 있습니다. 섹션 5.3에서 구성의 이미징 파라미터를 최적화하려면 5.2.5단계와 동일한 방법을 사용합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>작은 힘 적용 및 컨포칼 이미징 참고: 이 연구에서는 Nikon Ti2-E 현미경이 이미징에 사용되었으며 이미지 획득을 위한 자세한 단계는 아래에 나와 있습니다.<ol><li>도립 현미경을 엽니다. 소프트웨어 응용 프로그램 요소를 엽니다.</li>
		<li>구성 magnetic_find 정의합니다. FITC 채널만 확인합니다. PMT HV = 70, 오프셋 = 0, 레이저 강도 = 10을 설정합니다. 1/2 버튼을 클릭하여 스캔 속도를 2초당 1프레임으로 설정합니다. 1.2 AU 버튼을 클릭하여 핀홀 크기를 1.2AU로 설정합니다. 이 구성은 5.3.5단계에서 사용됩니다.</li>
		<li>구성 magnetic_YAP_Nucleus 정의합니다. FITC 채널을 확인하십시오. PMT HV = 70, 오프셋 = 0, 레이저 강도 = 10을 설정합니다. 1/2 버튼을 클릭하여 스캔 속도를 4초당 1프레임으로 설정합니다. 1.2 AU 버튼을 클릭하여 핀홀 크기를 1.2AU로 설정합니다. 핵 경계와 핵 염색 강도를 이미지화하려면 Cy5 채널을 확인하십시오. PMT HV = 70, 오프셋 = 0, 레이저 강도 = 10을 설정합니다. 핀홀 크기는 3D YAP 이미징에 최적화되어 있습니다. Cy5 채널을 확인한 후 1.2 AU 버튼을 다시 클릭하지 마십시오. 이 구성은 5.3.7단계에서 사용됩니다.</li>
		<li>필요한 경우 엘리먼츠를 통해 DIA를 켭니다. SpinView를 열고 명시야를 사용하고 개체의 초점을 조정하여 초점이 맞는 선명한 셀 이미지를 얻습니다. 10x 대물렌즈를 사용하여 내부에 단일 마이크로비드가 있는 상태, 내부에 여러 개의 마이크로비드가 있는 경우, 내부에 마이크로비드가 없는 세 가지 조건에서 적절한 다중 단일 셀을 찾습니다. 40x 대물렌즈로 전환합니다. 이 위치의 이름을 적절한 위치 번호로 지정합니다.</li>
		<li>요소를 엽니다. magnetic_find 클릭합니다. 인터록 제거 버튼을 클릭합니다.</li>
		<li>스캔을 클릭하고 초점면의 Z 위치를 조정합니다. 위쪽 및 아래쪽 단추를 클릭하여 선택한 셀의 Z 스택에 대한 하한과 상한을 설정합니다. 스캔을 다시 클릭하여 스캔을 중지합니다.</li>
		<li>magnetic_YAP_Nucleus 구성으로 전환합니다. 파일 이름을 before_small_force.nd2로 설정합니다. 기록 된 Z 스택으로 실행 버튼을 클릭하십시오.</li>
		<li>올바른 광 경로로 전환하고 DIA를 켭니다. 스핀뷰를 열고 녹음 버튼을 클릭합니다. 한편, 자석 이동 장치의 손잡이를 돌려 자석을 페트리 접시 바닥에서 46mm 아래로 이동합니다. 명시야 이미지 시퀀스 또는 비디오를 저장합니다. 비디오를 확인하여 마이크로비드가 자기력에 의해 유도된 변위를 나타내는지 확인하십시오.</li>
		<li>5.3.5-5.3.7 단계를 반복하십시오. 파일 이름을 after_small_force.nd2로 설정합니다.</li>
		<li>올바른 광 경로로 전환하고 DIA를 켭니다. 그런 다음 SpinView 를 열고 녹음 버튼을 클릭합니다. 한편, 자석 이동 장치의 손잡이를 돌려 자석을 페트리 접시 바닥에서 최대 120mm 위로 이동합니다. 명시야 이미지 시퀀스 또는 비디오를 저장합니다.</li>
		<li>5.3.5-5.3.7단계를 반복하고 파일 이름을 before_large_force.nd2로 설정합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>큰 힘 적용 및 컨포칼 이미징<ol><li>자석이 페트리 접시 바닥에서 13mm 위에 도달하도록 환경 챔버의 뚜껑을 제거합니다.</li>
		<li>올바른 광 경로로 전환하고 DIA를 켭니다. 스핀뷰를 열고 녹음 버튼을 클릭합니다. 한편, 자석 이동 장치의 손잡이를 돌려 자석을 페트리 접시 바닥에서 13mm 아래로 이동합니다. 명시야 이미지 시퀀스 또는 비디오를 저장합니다. 비디오를 확인하여 마이크로비드가 자기력에 의해 유도된 변위를 나타내는지 확인하십시오.</li>
		<li>5.3.5-5.3.7단계를 반복하고 파일 이름을 after_large_force.nd2로 설정합니다.</li>
		<li>올바른 광 경로로 전환하고 DIA를 켭니다. 그런 다음 SpinView 를 열고 녹음 버튼을 클릭합니다. 한편, 자석 이동 장치의 손잡이를 돌려 자석을 페트리 접시 바닥에서 최대 120mm 위로 이동합니다. 명시야 이미지 시퀀스 또는 비디오를 저장합니다.</li>
		<li>5.3.5-5.3.7 단계를 반복하십시오. 파일 이름을 retract_large_force.nd2로 설정합니다.</li>
		<li>환경 챔버의 뚜껑을 닫습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>필요한 경우 여러 보기 필드에 대해 5.2단계와 5.3단계를 반복하여 더 많은 데이터를 얻습니다.</li>
</ol>6. 이미지 처리 및 데이터 분석
<ol><li>YAP N/C 비율의 정량화<ol><li>피지 이미지J를 엽니다. 5단계에서 촬영한 .nd2 이미지를 엽니다.</li>
		<li>분석 > 측정값 설정을 클릭합니다. 면적, 통합 밀도, 평균 회색 값 및 모양 설명자를 확인합니다.</li>
		<li>Cy5 채널을 사용하여 핵을 식별합니다. 자유형 선택을 클릭하여 자유 선택 도구를 사용하여 핵의 윤곽을 그립니다. 또한 ImageJ에서 자동 핵 마스크 매크로를 확인하십시오 ( 재료 표 참조).</li>
		<li>FITC 채널에서 분석 > 측정을 클릭합니다. 평균의 측정값은 평균 핵 YAP 강도 DN이다.</li>
		<li>Cy5 채널을 사용하여 핵을 식별합니다. FITC 채널을 사용하여 셀을 식별합니다. 자유형 선택을 클릭하여 자유 선택 도구를 사용하여 세포질 내에서 관심 영역을 선택하고 자기 마이크로비드를 방지합니다. 이 관심 영역에는 핵이 포함되어서는 안됩니다.</li>
		<li>FITC 채널에서 분석 > 측정을 클릭합니다. 평균의 측정값은 평균 세포질 YAP 강도 DC이다.</li>
		<li>YAP N / C 비율 = D N / DC를 계산하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>핵 형상 및 정규화된 핵 얼룩 강도의 정량화<ol><li>피지 이미지J를 엽니다. 5단계에서 촬영한 .nd2 이미지를 엽니다.</li>
		<li>분석 > 측정값 설정을 클릭합니다. 면적, 통합 밀도, 평균 회색 값 및 모양 설명자를 확인합니다.</li>
		<li>Cy5 채널을 사용하여 핵을 식별합니다. 자유형 선택을 클릭하여 자유 선택 도구를 사용하여 핵의 윤곽을 그립니다.</li>
		<li>Cy5 채널에서 분석 > 측정을 클릭합니다. 평균 의 측정값은 핵 얼룩 강도입니다. Circ의 측정값입니다. 핵 순환성입니다.</li>
		<li>다른 힘 상태에서의 핵 얼룩 강도를 비교하기 위해 모든 핵 얼룩 강도를 "before_small_force.nd2"의 핵 얼룩 강도로 나누어 정규화된 핵 얼룩 강도를 생성합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

선언할 이해 상충이 없습니다.

자성 마이크로비드의 내재화(섹션 2.2)는 세포외 마이크로비드가 핵에 직접 힘을 가할 수 없기 때문에 중요합니다. 힘 적용 및 이미징 (섹션 5.3)은이 실험에서 중요한 단계이며 핵을 변형시키고 의미있는 생물학적 결과를 유도하는 데 필요한 힘은 샘플에 따라 달라질 수 있습니다. 이 실험에서 힘 크기 (0.8 nN 및 1.4 nN)는 덜 민감한 세포에서 핵 기계 감지를 유발하기 위해 더 증가 될 수 있습니다.
높은 처리량으로 정량적 방식으로 자기력을 적용하려면 단일 마이크로비드의 내재화가 이상적인 접근 방식입니다. 이 연구에서 단일 마이크로비드 내재화가 있는 세포의 비율은 12시간(26%)과 24시간(28%)에서 유사했지만 마이크로비드 내재화가 없는 세포는 24시간(20%)보다 12시간(53%)에서 더 높았습니다(그림 3B). 12 시간은 더 많은 단일 마이크로 비드가 포함될 수 있고 세포를 제어 할 수 있기 때문에 강제 적용 ...

이 연구는 세포핵에 직접 기계적 힘을 가하는 자기 액추에이터와 구조적 및 기능적 세포 내 변화를 동시에 이미지화하는 공초점 형광 현미경을 결합하여 핵 기계 생물학을 해명하는 새로운 기술을 개발하고 적용하는 것을 목표로 합니다. 세포는 조직 경직 1,2,3,4, 간질 유체 압력 및 전단 응력 5,6,7, 표면 토폴로지 / 기하학 8,9,10,11,12 및 인장 / 압축 응력13,14를 포함한 세포 외 생물 물리학 적 신호를 감지합니다. 15,16. 생물 물리학 적 신호는 생화학 적 신호로 변환되어 유전자 발현 및 세포 행동의 잠재적 인 다운 스트림 변화를 유발합니다 - 기계 전달 17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27로 알려진 과정 . 기계변환 과정을 연구하기 위해, 원자력 현미경(28), 세포 연신 장치(29), 바이오-MEMS(마이크로-전자 기계 시스템) 힘 센서(15,30,31), 전단 유변학(32) 및 스테레오 비전 시스템(33)과 같은 세포에 기계적 힘을 가하기 위한 무수한 기술이 개발되었다. . 최근의 리뷰는 세포 외 기계적 신호를 적용하고 기계 감지34를 방해하는 접근법을 요약합니다. 현재까지 이러한 방법의 대부분은 세포 원형질막에 힘을 가하고 세포는 인테그린, 카데린, 이온 채널 및 G-단백질 결합 수용체와 같은 막 수용체를 통해 이러한 세포외 생물물리학적 신호를 직접 수신합니다. 그 후, 그들은 세포 내 세포 골격과 핵에 신호를 전달합니다. 예를 들어, 예 연관 단백질 (YAP) 전좌를 기계 감지의 지표로 사용하여 세포는 세포막에서 기질 경화 및 세포 외 장력의 기계적 신호를 감지하고 세포 골격을 통해 핵으로 전달하여 YAP 세포질-핵 전좌를 유도하는 것으로 나타났습니다28,35.
최근의 증거는 세포핵 자체가 독립적 인 기계 센서 8,36,37임을 시사한다. 이것은 세포로부터 수확 된 분리 된 핵에 대해 수행 된 실험에 의해 입증되며, 핵은 그들에게 직접 가해지는 기계적 힘에 반응하여 강성을 적응 적으로 변화시키는 것으로 밝혀졌다36. 많은 생리적 조건 동안, 종양 및 건강한 세포 모두의 핵은 세포 외 생물 물리학 적 신호를 감지하고 기계적 성질 및 어셈블리를 변화시킨다38,39,40. 예를 들어, 혈관 외 유출시, 종양 세포의 핵 경직은 감소하고 24 시간38 이상 동안 부드러움을 유지합니다. 제한된 간질 공간을 통해 이동하는 동안, 종양 세포의 핵은 종종 구조적 완전성을 잃고 회복한다39. 그러나 핵이 생물 물리학 적 신호를 감지하는 방식은 알려져 있지 않지만 Lamin A / C 및 핵 골격 및 세포 골격 (LINC) 복합체38,41의 링커와 같은 여러 핵 외피 단백질 및 단백질 계열이 관여하는 것으로 밝혀졌습니다. 따라서 핵에 직접 힘을 가할 수있는 새로운 비 침습적 방법은 세포-원형질막과 세포 골격에서 힘 전달 효과를 분리하고 이전에는 접근 할 수 없었던 핵 기계 감지의 분자 메커니즘을 밝히는 데 도움이 될 것입니다.
세포 소기관(42)과 세포(43)에 주입된 마이크로비드를 조작하기 위해 광학 핀셋을 사용한 연구는 핵에 직접 힘을 가하는 기술적 능력을 보여주었다. 그러나, 광학 핀셋 기술은 몇 가지 한계를 갖는다: (1) 낮은 처리량 - 광학 핀셋은 종종 한 번에 하나의 셀 또는 마이크로비드만을 조작하고; (2) 핵의 잠재적 광손상 및 온도 인공물-변형은 수십pN36을 필요로 하고, 상응하는 필요한 레이저 출력은 pN(44,45)당 약 10mW이다. 이러한 레이저 강도는 실험(46) 동안 세포에서의 광손상 및 교란 세포 기능을 유발하기에 충분하다.
살아있는 세포 내의 마이크로 비드를 통해 가해지는 자기력은 핵에 직접 힘을 가할 수있는 잠재력을 보여주고 광학 핀셋의 한계를 극복합니다. 마이크로비드가 세포질로 전달되면 자기장은 고처리량 방식으로 여러 마이크로비드에 동시에 자기력을 가할 수 있습니다. 자기장은 셀 기능(47)에 영향을 미치지 않지만, pN에서 nN으로의 힘을 발생시키며, 이는 핵 변형(36,48,49)을 유도하기에 충분하다. 현재까지, 자성 마이크로비드의 조작은 세포 원형질막(4)8, 세포질(50) 내부, F-액틴(51), 핵(47) 내부, 및 단리된 핵(36)에 적용되었다. 그러나 마이크로 비드의 자기 조작은 핵의 기계 변환을 연구하기 위해 핵 외피에 직접적인 기계적 힘을 가하는 데 사용 된 적이 없습니다.
이 논문에서는 자성 마이크로비드를 세포질에 비침습적으로 전달하고 이러한 마이크로비드를 사용하여 핵에 기계적 힘을 가하는 간단한 기술을 개발했습니다(그림 1). 여기에서 mNeonGreen21-10/11 태그 YAP를 내인성으로 발현하는 CRISPR/Cas9 조작된 인간 정상 B2B 세포주를 사용하여 방법을 검증합니다. YAP는 기계-민감성 단백질이고, YAP의 전좌는 핵-기계-센싱14,28에 의해 조절된다. CRISPR/Cas9 조절 녹인 접근법은 내인성 YAP에 형광 단백질(FP) mNeonGreen21-10/11을 태그하기 위해 선택되었습니다. CRISPR 편집이 불완전한 효율성과 오프 타겟 효과를 갖는 것으로 알려져 있지만, 이전 간행물의 프로토콜은 형광 분류를 통합하여 올바른 개방 판독 프레임 삽입을 선택했습니다52,53,54. 이러한 추가 선택 계층으로, 이전에 생성된 52,53,54,55 20+ 세포주에서 오프-타겟 태깅 이벤트가 관찰되지 않았다. 이것은 분할 형광 단백질 작제물이지만, 원칙적으로 임의의 표현 가능한 형광 태그를 사용할 수 있다. 이 표지 접근법은 전이 유전자 또는 항체 방법보다 우수합니다. 첫째, 전이유전자 발현과 달리, 태그된 단백질은 단일 카피 유전자 투여량을 유지하고 천연 유전자 조절 네트워크의 생리학적 맥락에서 발현하여 단백질 농도, 국소화 및 상호작용의 편차를 제한한다. 이 연구에 사용된 태깅 방법은 전체 FP 태깅보다 훨씬 더 높은 처리량과 효율성을 달성합니다. 또한 고정 인공물 및 고품질, 고특이성 항체의 제한된 가용성으로 인한 면역형광과 관련된 문제를 방지합니다. 둘째, 이 논문에서 사용된 접근 방식은 세포 생리학에 대한 섭동을 최소화하고 모든 내인성 YAP를 실시간으로 실시간으로 밝힐 수 있습니다. 대조적으로, 다른 일반적인 전이 유전자 방법은 종종 YAP의 과발현을 유도합니다. 생성된 인공 분포는 잠재적으로 세포독성을 유발할 수 있고 세포(56,57,58)의 기계-감지에 영향을 미칠 수 있다.
이 연구는 세포질로 전달되는 자기 마이크로 비드를 통해 핵에 직접 힘을 가하고 동시 라이브 셀 형광 이미징을 수행하는 프로토콜을 제시합니다. 요약하면, 여기에 제시된 프로토콜은 (1) 핵 외부에 있는 동안 자기 마이크로비드를 세포 내로 전달하고, (2) 마이크로비드를 조작하여 핵에 자기력을 가하고, (3) 조작 중에 세포의 컨포칼 형광 이미징을 수행하고, (4) 힘 적용 프로세스 전반에 걸쳐 YAP 핵/세포질(N/C) 비율을 정량적으로 분석하는 방법을 보여줍니다. 결과는 (1) 엔도 사이토 시스를 통해 자성 마이크로 비드가 2 시간 이내에 B7B 세포의 세포질로 비 침습적으로 전달 될 수 있음을 시사합니다 (그림 2 및 그림 3). (2) 핵에 직접 가해지는 정량화된 자기력(그림 4, 그림 5 및 그림 6)만으로도 CRISPR/Cas9 엔지니어링 B2B 세포에서 YAP N/C 비율의 다양한 변화를 유발할 수 있습니다(그림 7 및 그림 8).

<table><tbody><tr><td>0.05 % 트립신</td><td>Corning</td><td>25-051-CI</td><td></td></tr><tr><td>25 cm2 플라스크</td><td>Corning</td><td>156340</td><td></td></tr><tr><td>7-&micro; m 평균 직경 카르보닐 철 마이크로비즈</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>A1R 컨포칼 시스템</td><td>니콘</td><td></td><td></td></tr><tr><td>카르보닐철 분말 CM</td><td>BASF</td><td>30042253</td><td>마그네틱 마이크로비드</td></tr><tr><td>배양 배지(RPMI-1640)</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>데스크탑 컴퓨터</td><td>Dell</td><td></td><td>Windows 10 운영 체제</td></tr><tr><td>환경 챔버 TIZB</td><td>Tokai Hit</td><td>TIZB</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 혈청 (FBS)</td><td>Gibco</td><td>26140</td><td></td></tr><tr><td>피지 ImageJ</td><td>국립 보건원 및 광학 및 컴퓨터 계측</td><td></td><td></td>연구소</tr> 유리 <tr><td>바닥 페트리 접시</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>자석</td><td>K & J 마그네틱스, Inc.</td><td>D99-N52</td><td></td></tr><tr><td>모노크롬&nbsp; 카메라</td><td>FLIR</td><td>BFS-U3-70S7M-C</td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements 소프트웨어 플랫폼</td><td>Nikon</td><td></td><td>소프트웨어 플랫폼</td></tr><tr><td>Nucleus 마스크 ImageJ 매크로</td><td></td><td></td><td>https://github.com/KOLIUG/Nuclear 마스크</td></tr><tr><td>NucSpot Live 650</td><td>Biotium</td><td>#40082</td><td>핵 염색</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Ti2-E 도립 현미경</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XYZ mover(CAD 파일)</td><td></td><td></td><td>https://github.com/KOLIUG/XYZ-mover</td></tr></tbody></table>

3d 자기력 액추에이터와 다기능 형광 이미징을 결합하여 핵 역학 연구

Combining 3D Magnetic Force Actuator and Multi-Functional Fluorescence Imaging to Study Nucleus Mechanobiology

기계 생물학의 근본적인 질문은 살아있는 세포가 세포 생리학 및 병리학의 맥락에서 세포 외 기계적 자극을 감지하는 방법입니다. 세포 외 기계적 자극의 세포 기계 감각은 막 수용체, 관련 단백질 복합체 및 세포 골격을 통해 이루어지는 것으로 여겨집니다. 기계 생물학의 최근 발전은 세포질 자체의 세포핵이 독립적으로 기계적 자극을 동시에 감지 할 수 있음을 보여줍니다. 그러나 세포핵이 기계적 자극을 감지, 형질도입 및 반응하는 방법에 대한 기계론적 이해는 주로 기존 도구로 핵 역학에 접근하고 정량화하는 기술적 어려움 때문에 부족합니다. 이 백서에서는 정밀하고 비침습적인 3D 기계적 자극을 적용하여 세포핵을 직접 변형시키는 새로운 자기력 액추에이터의 설계, 제조 및 구현에 대해 설명합니다. CRISPR/Cas9 엔지니어링 셀을 사용하여 이 연구는 고해상도 컨포칼 형광 이미징과 결합된 이 도구가 핵 변형의 함수로서 단일 세포에서 기계 민감성 예 관련 단백질(YAP)의 실시간 역학을 밝힐 수 있음을 보여줍니다. 이 간단한 방법은 기계 생물학 커뮤니티의 현재 기술 격차를 해소하고 핵 기계 변환과 세포 기능 사이의 관계에 존재하는 지식 격차에 대한 해답을 제공 할 수있는 잠재력을 가지고 있습니다.

자석 이동 장치의 설계 및 자기력의 적용 자성 마이크로 비드를 통해 핵에 힘을 가하기 위해 자석의 공간적 위치를 제어하기 위해 자석 이동 장치가 설계 및 제작되었습니다. 자석 이동 장치에는 중앙 프레임, 3개의 손잡이 및 레일이 포함되어 있어 사이클당 1.59mm의 공간 분해능으로 부착된 자석을 x, y 및 z 방향으로 독립적으로 이동할 수 있습니다(그림 1A). 자석이 세포로 전달되는 7μm 마이크로비드에 가깝게 이동하면(그림 1B) 마이크로비드를 자기적으로 끌어당겨 핵에 힘을 가합니다(그림 1C). 힘의 방향과 크기는 자석과 마이크로비드 사이의 상대적 위치에 의해 제어됩니다.
이 논문에서, 마이크로 비드에 두 가지 다른 크기의 힘이 적용되었다 : (1) 자석이 셀 위 46mm에 놓였...

이 연구는 세포질로 전달되는 자기 마이크로 비드를 통해 세포핵에 기계적 힘을 직접 적용하고 동시 살아있는 세포 형광 이미징을 수행하는 새로운 프로토콜을 제시합니다.

3D 자기력 액추에이터와 다기능 형광 이미징을 결합하여 핵 역학 연구

A fundamental question in mechanobiology is how living cells sense extracellular mechanical stimuli in the context of cell physiology and pathology. The ...

이 방법에서는 힘이 핵에 직접 적용됩니다. 이것은 세포 원형질막과 세포 골격에서 힘 전달 효과를 분리하여 핵 기계 감지의 분자 메커니즘을 드러냅니다. 힘은 비침습적인 방식으로 살아있는 세포 내에 적용됩니다.광학 핀셋에 비해 자기장과 자기력은 셀 기능에 영향을 미치지 않으며 처리량이 더 높습니다. 평균 직경이 7 마이크로미터인 카보닐 철 마이크로비드 0.2 그램의 칭량에 의해 자성 마이크로비드로 세포를 배양하기 시작한다. 마이크로비드를 피펫을 사용하여 1 밀리리터 RPMI 1640 배지에 현탁시킨다.그런 다음 B2B 세포가 있는 페트리 접시를 생물안전 캐비닛으로 가져가 마이크로비드가 포함된 배지 200마이크로리터를 페트리 접시에 빠르게 추가합니다. 마이크로 비드가 세포에 의해 내재화 될 때까지 인큐베이터에 페트리 접시를 넣으십시오. 도립 현미경을 열고 컨포칼 형광 이미징을 사용하여 마이크로비드, 핵 및 세포 경계를 시각화하여 6시간마다 세포주의 내재화를 위한 최적의 시간을 결정합니다.내재화된 마이크로비드는 세포 경계 내에 존재할 것이다. 작은 힘 응용 프로그램 및 라이브 셀 이미징의 경우 소프트웨어 응용 프로그램 Elements를 엽니다. 구성 자기 찾기를 정의하려면 1개 이상의 2개 버튼을 클릭하여 스캔 속도를 2초당 1프레임으로 설정합니다.핀홀 크기를 1.2 Airy 단위로 설정합니다. FITC 채널만 확인하고 PMT HV를 70으로, 오프셋을 0으로, 레이저 강도를 10으로 설정합니다. 구성 자기 YAP 핵을 정의하려면 4개 이상의 버튼을 클릭하여 스캔 속도를 4초당 1프레임으로 설정합니다.그런 다음 1.2 Airy 유닛 버튼을 클릭하여 핀홀 크기를 1.2 Airy 유닛으로 설정하고 FITC 채널을 확인합니다. PMT HV를 70으로, 오프셋을 0으로, 레이저 강도를 10으로 설정합니다. 핵 경계 및 핵 염색 강도를 이미징하려면 시아닌 5 채널을 확인하십시오.1.2 Airy 단위 버튼을 클릭하지 말고 PMT HV를 70으로, 오프셋을 0으로, 레이저 강도를 10으로 설정하십시오. 핀홀 크기는 3차원 YES 관련 단백질 이미징에 최적화됩니다. 그런 다음 엘리먼츠를 통해 DIA를 켭니다.스핀 뷰를 열고 명시야를 사용하고 물체의 초점을 조정하여 초점이 맞는 세포의 선명한 이미지를 얻습니다. 10X 대물렌즈를 사용하여 내부에 단일 마이크로비드가 있는 세포, 내부에 여러 마이크로비드가 있는 셀, 내부에 마이크로비드가 없는 셀과 같은 세 가지 조건에서 적절한 다중 단일 셀을 찾습니다. 그런 다음 40X 대물렌즈로 전환하고 적절한 위치 번호로 이 위치의 이름을 지정합니다.요소를 열고 자기 찾기를 클릭하고 인터록을 제거한 다음 탭을 스캔한 다음 상단 및 하단 버튼을 선택하여 선택한 셀의 Z 스택에 대한 하한과 상한을 설정하기 위해 초점면의 Z 위치를 조정합니다. 스캔을 다시 클릭하여 스캔을 중지합니다. 자기 YAP 핵 구성으로 전환하고 파일 이름을 before_small_force.nd2로 설정합니다.기록된 Z 스택이 있는 실행 버튼을 클릭합니다. 올바른 광 경로로 전환하고 DIA를 켭니다. 스핀보기를 열고 녹음 버튼을 클릭하십시오.자석 이동 장치의 손잡이를 돌려 페트리 접시 바닥에서 46mm 위로 자석을 이동합니다. 비디오를 저장하고 확인하여 자기력에 의해 유도된 마이크로비드 변위를 확인합니다. 파일 이름을 after_small_force.nd2로 설정하여 스캔 절차를 반복합니다.그런 다음 오른쪽 조명 경로로 전환하고 DIA를 켜고 녹음 버튼을 클릭하기 전에 스핀보기를 엽니 다. 자석 이동 장치 손잡이를 페트리 접시 바닥에서 최대 120mm까지 돌리고 명시야 이미지 시퀀스 또는 비디오를 저장합니다. 파일 이름을 before_large_force.nd2로 설정하여 스캔 단계를 반복합니다.마이크로비드는 FITC 또는 시아닌 5 채널에서 레이저 여기 하에서 형광을 방출할 수 없습니다. 따라서, 내재화된 마이크로비드는 YES 관련 단백질 및 핵의 형광의 공초점 이미징에 위치한 어두운 중공에 의해 확인되었다. 핵 원형도는 대조군 세포와 마이크로비드 내재화를 갖는 세포 사이에 유의한 차이를 나타내지 않았다.마이크로비드와 공동 배양되었지만 내재화가 없는 대조군 세포와 마이크로비드 내재화가 있는 세포의 YES 관련 단백질 세포핵 대 세포질 비율도 유의한 차이가 없는 것으로 나타났습니다. 액틴의 핵 변형 및 해중합은 세포 골격 함유 세포에서 마이크로 비드에 의해 적용된 압축력에 의해 발생했습니다. 정량적 AFM 힘 변위 관계에 의해 제공되는 정량적 이미징 분석 교정 곡선.이러한 관계에 기초하여, 적용된 비드 힘이 추정되었다. 핵 변형 및 YES-관련 단백질 전좌는 적용 또는 자기력의 방출 시 관찰되었다. 녹색 채널에서 YES 관련 단백질의 강도 변화 및 적색 채널에서 핵 염색의 변화가 없는 것은 YES 관련 단백질 전좌에 의해 유발된 자기력 유도 핵 변형임을 확인하였다.두 그룹 내에서 YES 관련 단백질 핵 대 세포질 비율의 순 변화의 정량화는 세포질 내 마이크로 비드에 적용된 자기력이 YES- 관련 단백질 전좌를 유도하고 YES- 관련 단백질 핵 대 세포질 비율을 변화 시켰음을 확인했다. 힘과 이미징을 적용하기 전에 세포가 자성 마이크로비드를 내재화하고 비드가 세포 경계 내에 있는지 확인하십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

본 논문은 문화에 살고있는 세포의 기계적 자극에 대한 통합 원자의 운영 독자 강제 광학 이미징 현미경을 지시하는 것을 목표로하고있다. 단계별 프로토콜이 제공됩니다. 기계적 자극에 살고 세포 응답을 보여주는 대표적인 데이터 집합이 제공됩니다.

기계 자극에 라이브 세포 응답 통합 광학과 원자 힘 현미경에 의해 연구

우리는 글로벌 또는 지역화된 스트레인 응용 프로그램에 대한 응답으로 하나의 살아있는 자기편 세포에서 유도된 핵 및 cytoskeletal deformations을 측정하기 위해 두 개의 독립적인, 현미경 기반의 도구를 제시한다. 이러한 기술은 핵 강성 (즉, deformability)을 확인하고 핵과 cytoskeleton 세포 사이에 강제로 전송을 탐사하는 데 사용됩니다.

계면 세포 핵의 기계적 성질을 알아내기 위해 Biophysical Assays : 기판 스트레인 신청 및 Microneedle 조작

이 문서에서 우리는 높은 parallelizable 방식으로 단일 분자 수준에서 효소 proteolysis에 대한 힘의 효과를 공부하는 자기 족집게의 사용을 설명합니다.

마그네틱 족집게를 사용하여 다중 단일 분자 강제 Proteolysis 측정

우리는 단일 T 림프구에서 힘 조절 단일 수용체-리간드 결합 역학과 칼슘 신호의 실시간 이미징을 동시에 측정하는 기술을 설명합니다.

형광 생체막 포스 프로브 : 하나의 세포에서 수용체 - 리간드 속도론의 동시 정량 및 바인딩에 의한 세포 내 신호

최근 많은 FRET 기반 힘 바이오센서가 개발되어 세포 내 힘의 단백질 특이적 분해능을 가능하게 합니다. 이 프로토콜에서는 LINC(nucleoskeleton-cytoskeleton) 복합 단백질 Nesprin-2G의 링커용으로 설계된 이러한 센서 중 하나를 사용하여 핵 LINC 복합체에 대한 액토마이신 힘을 측정하는 방법을 보여줍니다.

포스터 공명 에너지 전달 (FRET) -force의 바이오 센서를 사용하는 프로토콜은 핵 LINC 단지에서 기계의 힘을 측정하는

이 프로토콜에서 우리가 직접 살아있는 세포에서 핵을 제어 힘을 적용 하는 micropipette 방법을 설명 합니다. 이 분석 결과 생활, 부착 세포에서 핵 기계적 특성의 심문 수 있습니다.

핵과 골격 사이 기계적인 통합을 측정 하기 위한 직접적인 힘 프로브

여기, 선물이 포스터 공명의 동시 사용에 대 한 프로토콜 에너지 전송 기반 긴장 센서 측정 단백질 역학 힘 민감한 측정을 사용 하는 photobleaching 후 단백질 부하 및 형광 복구를 측정 하 살아있는 세포 내 단백질 역학입니다.

살아있는 세포 형광 기술의 조합을 사용 하 여 힘에 민감한 단백질 역학의 측정

이전에 설계 된 장치를 사용 하 여 부착 세포에 기계적 변형을 적용 하는이 백서는 새롭게 디자인 된 하 층 구조와 100 배 오일 침 지 대물 렌즈를 사용 하 여 변형 된 셀의 고해상도 단일 셀 이미징을 위한 맞춤형 장치를 설명 합니다.

일축 인장 스트레인 하에서 살아있는 세포의 핵 역학에 대 한 고해상도 이미징

여기서, 우리는 광학 트랩에 의한 직접 힘 측정을 통해 3차원 감금에서 격리된 배아 제브라피쉬 세포의 세포내 기계적 특성을 조사하는 프로토콜을 제시한다.

광학 핀셋을 사용하여 감금된 세포 전 역학의 직접 힘 측정

여기에서는 시험관 내에서 미세소관 다발을 재구성하고 동시 광학 트래핑 및 전반사 형광 현미경을 사용하여 그 안에 가해지는 힘을 직접 정량화하는 프로토콜을 제시합니다. 이 분석은 활성 미세소관 네트워크 내에서 단백질 앙상블에 의해 생성된 힘과 변위의 나노스케일 수준 측정을 허용합니다.

재구성된 활성 미세소관 다발 내의 힘을 직접 측정

학습하세요 3D 자기력 액추에이터와 다기능 형광 이미징을 결합한 비침습적 핵 역학 연구 방법을. 자성 미세구슬을 이용해 살아있는 세포 핵에 직접 힘을 가하고 공초점 형광 현미경으로 실시간 이미징하여 핵 기계수용 메커니즘을 규명합니다.

3D 자기력 액추에이터와 다기능 형광 이미징을 결합하여 핵 역학 연구

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