Name: 미세 다공성 어닐링 입자 스캐폴드를위한 마이크로 겔 빌딩 블록의 미세 유체 합성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-16T14:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: 배우세요 미세유체 기술을 활용한 단일분산 마이크로겔 합성법으로 미세다공성 입자 스캐폴드를 제작하는 방법입니다. 이 기술은 재생의학 분야에서 조직 통합 및 재생 효율을 높이는 데 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

저자들은 로스 앤젤레스 캘리포니아 대학의 Joe de Rutte와 Di Carlo Lab이보고 된 장치가 개발 된 원래의 미세 유체 장치 설계와 PDMS 장치 제조 및 문제 해결에 대한 초기 지침에 대한 도움을 인정하고자합니다. 그림 회로도는 Biorender.com 로 작성되었습니다.

<ol><li>Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., di Carlo, D., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+wound+healing+by+injectable+microporous+gel+scaffolds+assembled+from+annealed+building+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks.</a> Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).</li>
<li>Koh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+in+vivo+delivery+of+stem+cells+using+microporous+annealed+particle+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Enhanced in vivo delivery of stem cells using microporous annealed particle scaffolds.</a> Small. 15 (39), 1903147(2019).</li>
<li>Pruett, L. J., Jenkins, C. H., Singh, N. S., Catallo, K. J., Griffin, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparin+microislands+in+microporous+annealed+particle+scaffolds+for+accelerated+diabetic+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Functional+Materials%22%5BJournal%5D)">Heparin microislands in microporous annealed particle scaffolds for accelerated diabetic wound healing.</a> Advanced Functional Materials. 31 (35), 2104337(2021).</li>
<li>Darling, N. J., Sideris, E., Hamada, N., Carmichael, S. T., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injectable+and+spatially+patterned+microporous+annealed+particle+%28MAP%29+hydrogels+for+tissue+repair+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Science%22%5BJournal%5D)">Injectable and spatially patterned microporous annealed particle (MAP) hydrogels for tissue repair applications.</a> Advanced Science. 5 (11), 1801046(2018).</li>
<li>Isaac, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microporous+bio-orthogonally+annealed+particle+hydrogels+for+tissue+engineering+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+and+Engineering%22%5BJournal%5D)">Microporous bio-orthogonally annealed particle hydrogels for tissue engineering and regenerative medicine.</a> ACS Biomaterials Science and Engineering. 5 (12), 6395-6404 (2019).</li>
<li>Pruett, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+microporous+annealed+particle+hydrogel+for+long-term+vocal+fold+augmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Laryngoscope%22%5BJournal%5D)">Development of a microporous annealed particle hydrogel for long-term vocal fold augmentation.</a> Laryngoscope. 130 (10), 2432-2441 (2020).</li>
<li>Nih, L. R., Sideris, E., Carmichael, S. T., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injection+of+microporous+annealing+particle+%28MAP%29+hydrogels+in+the+stroke+cavity+reduces+gliosis+and+inflammation+and+promotes+NPC+migration+to+the+lesion%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Injection of microporous annealing particle (MAP) hydrogels in the stroke cavity reduces gliosis and inflammation and promotes NPC migration to the lesion.</a> Advanced Materials. 29 (32), (2017).</li>
<li>Griffin, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activating+an+adaptive+immune+response+from+a+hydrogel+scaffold+imparts+regenerative+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Activating an adaptive immune response from a hydrogel scaffold imparts regenerative wound healing.</a> Nature Materials. 20 (4), 560-569 (2021).</li>
<li>Sideris, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+hydrogels+based+on+hyaluronic+acid+building+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+and+Engineering%22%5BJournal%5D)">Particle hydrogels based on hyaluronic acid building blocks.</a> ACS Biomaterials Science and Engineering. 2 (11), 2034-2041 (2016).</li>
<li>Schaeffer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injectable+microannealed+porous+scaffold+for+articular+cartilage+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Plastic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Injectable microannealed porous scaffold for articular cartilage regeneration.</a> Annals of Plastic Surgery. 84, 6S Suppl 5 446-450 (2020).</li>
<li>Pruett, L., Ellis, R., McDermott, M., Roosa, C., Griffin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+heterogeneous+epidermal+growth+factor+release+from+microporous+annealed+particle+%28MAP%29+hydrogel+for+improved+wound+closure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Spatially heterogeneous epidermal growth factor release from microporous annealed particle (MAP) hydrogel for improved wound closure.</a> Journal of Materials Chemistry B. 9 (35), 7132-7139 (2021).</li>
<li>Jivan, F., Alge, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio-orthogonal%2C+site-selective+conjugation+of+recombinant+proteins+to+microporous+annealed+particle+hydrogels+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Bio-orthogonal, site-selective conjugation of recombinant proteins to microporous annealed particle hydrogels for tissue engineering.</a> Advanced Therapeutics. 3 (1), 1900148(2020).</li>
<li>de Rutte, J. M., Koh, J., di Carlo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+high-throughput+production+of+modular+microgels+for+in+situ+assembly+of+microporous+tissue+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Functional+Materials%22%5BJournal%5D)">Scalable high-throughput production of modular microgels for in situ assembly of microporous tissue scaffolds.</a> Advanced Functional Materials. 29 (25), 1900071(2019).</li>
<li>Pfaff, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+and+improved+photoannealing+of+microporous+annealed+particle+%28MAP%29+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+and+Engineering%22%5BJournal%5D)">Selective and improved photoannealing of microporous annealed particle (MAP) scaffolds.</a> ACS Biomaterials Science and Engineering. 7 (2), 422-427 (2021).</li>
<li>Darling, N. J., Hung, Y. S., Sharma, S., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+the+kinetics+of+thiol-maleimide+Michael-type+addition+gelation+kinetics+for+the+generation+of+homogenous+poly%28ethylene+glycol%29+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Controlling the kinetics of thiol-maleimide Michael-type addition gelation kinetics for the generation of homogenous poly(ethylene glycol) hydrogels.</a> Biomaterials. 101, 199-206 (2016).</li>
<li>Sandell, J. L., Zhu, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+in-vivo+optical+properties+of+human+tissues+and+its+impact+on+PDT%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">A review of in-vivo optical properties of human tissues and its impact on PDT.</a> Journal of Biophotonics. 4 (11-12), 773-787 (2011).</li>
</ol>

저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

이 프로토콜은 미세다공성 어닐링된 입자(MAP) 스캐폴드의 빌딩 블록으로서 작용하는 마이크로겔을 합성하고 특성화하는 방법을 기술한다. 이 프로토콜은 고처리량 마이크로유체 접근법을 사용하여 대량의 균일한 마이크로겔을 생성하는데, 이는 유동 집속 마이크로유체학 1,4,7,9 (높은 단일분면, 낮은 수율), 배치 에멀젼6,10 및 전기 분무 5,12와 같은 다른 방법으로는 달성될 수 없다. (낮은 단분산도, 높은 수율). 본원에 기재된 방법에 의해, 단분산 마이크로겔은 다양한 재생 의학 용도(예를 들어, 세포 전달, 상처 치유)에 사용될 수 있는 MAP 스캐폴드에 사용하기 위해 제조될 수 있다.
이 프로토콜의 중요한 단계는 PDMS 미세유체 장치의 생성이다. 장치가 올바르게 만들어지지 않으면 마이크로 겔 형성 및 단분산도에 부정적인 하류 영향을 줄 수 있습니다. 경화되기 전에 PDMS에 아티팩트 (즉, 거품, 먼지)가 도입되는 것을 방지하는 것이 중요합니다.이 방법은 채널을 막히고 마이크로 겔 형성에 큰 영향을 줄 수 있기 때문입니다. 이를 최대한 완화하려면 테이프를 사용하여 먼지를 제거하고 장치를 먼지가없는 컨테이너에 보관하고 가능한 경우 먼지가없는 후드에서 작업해야합니다. 또한 표면 처리로 최상의 결과를 얻기 위해 장치를 60 °C에 보관하는 것이 좋습니다.
PDMS 장치를 붓을 때, 생검 펀치의 길이와 거의 같거나 작은 균일한 두께를 유지하는 것이 중요하다. 장치가 너무 두꺼우면 생검 펀치가 끝까지 침투 할 수 없습니다. 또한 생검 펀치로 펀칭하거나 튜브를 삽입하는 동안 PDMS 장치 입구 / 출구를 찢지 않는 것이 중요합니다. PDMS 장치의 찢어짐은 입구 / 출구에서 누출되어 젤 전구체 용액이 손실 될 수 있습니다. PDMS 장치에 누출이 있는 경우 가장 좋은 해결책은 가능한 한 빨리 새 장치로 교체하는 것입니다.
플라즈마-디바이스를 처리할 때, 순수한 산소 및 플라즈마-처리를 30초 동안 사용하는 것은 PDMS를 유리 슬라이드에 부착하기 위한 최상의 결과를 생성하였다. 장치가 올바르게 결합되지 않는 경우 (즉, 플라즈마 처리 후 PDMS를 유리 슬라이드에서 들어 올릴 수 있음) 플라즈마 처리기가 올바르게 작동하고 장치 및 슬라이드가 철저히 청소되었는지 다시 확인해야합니다. 또한 올바른 실란 표면 처리를 사용하는 것이 중요하며, 최상의 결과를 얻으려면 PDMS 장치를 사용 전에 직접 표면 처리해야 합니다. 화학 기상 증착과 같은 표면 처리의 다른 방법도 또한 사용될 수 있다.
또 다른 중요한 단계는 마이크로겔 형성을 위해 PDMS 마이크로유체 장치를 올바르게 사용하는 것이다. 최소 2:1의 유속비(이 프로토콜은 6mL/h 오일 유량과 3mL/h 수성 유량을 사용함)를 사용하는 것이 좋지만 원하는 마이크로겔 크기를 달성하도록 조정할 수 있습니다. 마이크로겔 전구체 용액의 pH는 또한 장치의 막힘을 방지하기 위해 최적화하기 위한 중요한 메트릭이다. 포스페이트 완충 식염수 (PBS)는 마이클 타입 첨가 화학에서 티올레이트 형성을 가속화하고, 이 프로토콜에 사용된 PBS 농도는 마이크로유체 장치에서 마이크로겔 겔화에 대한 최상의 결과를 산출한다. 주사기 펌프가 시작되면 미세 유체 채널에 약간의 기포가있을 수 있지만 몇 분 후에 평형을 이루어야합니다. 현미경으로 마이크로 겔 형성을 모니터링하는 것이 좋습니다. 흐름이 이 비디오에서와 유사하게 보이지 않거나 큰 입자를 생성하는 채널이 몇 개 있는 경우, 이는 표면 처리 단계의 문제로 인한 것일 수 있습니다. 가장 좋은 해결책은 장치를 갓 표면 처리 된 장치로 교체하는 것입니다.
마이크로겔이 합착되는 것으로 보인다면, 이는 FluoroSurfactant의 불충분한 농도 때문일 수 있다. 권장되는 해결책은 오일상에서 계면활성제의 wt%를 증가시키는 것이다. 그러나, 고농도의 계면활성제를 사용하는 것의 한 가지 한계는 정제 단계 동안 제거하기가 더 어려울 수 있다는 것이다. 미세 유체 장치를 한 번만 사용하는 것이 좋지만 사용 직후에 Novec 오일로 플러시하면 장치에서 겔화되어 채널을 막힐 수있는 수용액을 제거하면 장치를 재사용할 수 있습니다. 하나의 마이크로유체 장치가 높은 처리량의 마이크로겔(mL/h)을 생산할 수 있지만, 이 생산 속도는 여러 마이크로유체 장치를 병렬로 사용하여 확장할 수 있습니다.
MAP 스캐폴드 어셈블리의 어닐링 단계는 라디칼 중합의 광활성화 광개시제의 사용에 의존하며, 광개시제는 원하는 용도에 기초하여 선택될 수 있다. 예를 들어, LAP 광개시제는 장파 자외선을 사용할 때 빠른 어닐링 시간(<30초)을 가지며, 이는 시험관내14에서 세포 생존력에 최소한의 영향을 미친다. 그러나, 이러한 파장은 조직(16 )에 의해 고도로 흡수되고, 생체 내에서 시험관내만큼 높은 어닐링 효능을 갖지 않을 수 있다.
Eosin Y는 가시 파장 (505 nm)에 의해 활성화 된 또 다른 광개시제이며 조직으로 더 깊이 침투하여 조직 아래에 어닐링되는 MAP 스캐폴드의 능력을 향상시킵니다. 그러나, Eosin Y 어닐링에 필요한 긴 광 노출 시간은 자유 라디칼에 대한 세포 노출을 연장시키고 시험관내14에서 세포 생존력에 영향을 미칠 수 있다. 매우 균일 한 마이크로 겔 빌딩 블록의 고처리량 생성을 위해 이러한 방법을 사용하면 MAP 스캐폴드 중심의 연구를 가속화하고 재생 의학을위한 주사 가능한 다공성 물질 분야의 지식을 향상시킬 수 있습니다.

MAP 스캐폴드 플랫폼은 하이드로겔 마이크로입자(마이크로겔)로 전적으로 구성된 주사용 생체재료로서, 함께 가교결합될 때 세포 규모의 미세다공성을 제공하여 분해에 독립적인 세포 이동 및 벌크 조직 통합을 가능하게 한다(1). 숙주 조직과 신속하게 통합할 수 있는 능력과 본질적으로 낮은 면역원성으로 인해, MAP 스캐폴드 플랫폼은 진피 상처 치유 가속화를 포함하여 다양한 재생 의학 요법 2,3,4,5,6,7,8,9,10에 대한 전임상 적용가능성을 입증했습니다 1,3 ,11, 뇌졸라 뇌졸강7, 중간엽 줄기세포2 전달, 응고기능 부전 치료를 위한 조직 벌크 제공6. MAP는 또한 M2 대식세포3의 모집을 통해 숙주 조직에 항염증 효과를 전달하는 것으로 밝혀졌으며, 심지어 Th2 "조직 수복" 면역 반응을 촉진하도록 조정될 수 있다8. MAP 스캐폴드 플랫폼의 이러한 유리한 특성은 다양한 임상 적용으로 확장될 수 있게 한다.
MAP 스캐폴드 형성을 위한 마이크로겔을 생성하기 위한 이전에 공개된 방법에는 유동-집속 액적-마이크로유체학 1,4,7,9, 전기 분무 5,12, 및 배치 에멀젼 6,10을 사용한 오버헤드 방사가 포함되었다. 액적 미세 유체 방법은 높은 단분산도를 가진 입자를 생성 할 수 있지만 매우 느린 유속을 사용하여 낮은 입자 수율 (μL / h)을 생성합니다. 대안적으로, 전기 분무 및 배치 에멀젼 방법은 높은 입자 다분산도를 갖지만 많은 부피의 입자를 생성할 수 있다. 이 프로토콜은 de Rutte et al.13의 작업을 기반으로 단분산 집단을 가진 마이크로겔을 생산하기 위해 고처리량 마이크로유체 방법을 사용한다. 이 방법은 소프트 리소그래피 기술을 사용하여 포토 마스크에서 폴리디메틸실록산 (PDMS) 미세 유체 장치를 만든 다음 유리 슬라이드에 결합합니다. 이 장치 설계는 대량의 마이크로겔 입자(mL/h)를 생성하기 위해 단계적 유화에 의존합니다. 이 방법으로 달성될 수 있는 단분산도는 다른 기술에 비해 다공도의 우수한 제어를 제공하는데, 이는 단분산 마이크로겔이 보다 균일한 기공 크기2를 갖는 스캐폴드를 형성할 수 있기 때문이다.
MAP 스캐폴드의 빌딩 블록으로 작용할 수 있는 개별 마이크로겔을 합성하고 특성화하는 방법은 이 원고 내에 요약되어 있으며, 특히 마이크로겔 겔화를 위한 티올 기능화 가교결합제와 함께 효율적인 마이클형 첨가에 쉽게 참여하는 말레이미드(MAL) 그룹을 갖는 PEG 백본으로 구성된 마이크로겔을 만드는 측면에서 요약되어 있다. 마이크로겔 겔화를 MAP 스캐폴드 어닐링으로부터 분리하기 위해, 이 원고는 또한 이종 작용성 메타크릴아미드/말레이미드 4-arm PEG 마크로머인 공개된14 개의 커스텀 어닐링 마크로머인 MethMAL을 합성하는 방법을 기술한다. 메타크릴아미드 작용기는 자유 라디칼 광중합(마이크로겔 어닐링의 경우)에 쉽게 참여하면서, MAL 작용기에 대한 마이클형 첨가를 촉진하는 조건에 비교적 불활성으로 남아 있다.
또한이 원고는 PDMS 미세 유체 장치를 만들고, 마이크로 겔 겔화 동역학을 결정하고, 마이크로 겔 크기를 특성화하기위한 프로토콜을 간략하게 설명합니다. 원고의 마지막 부분은 MAP 스캐폴드 어닐링 을 상세히 설명하는데, 이는 마이크로겔이 마이크로겔의 표면을 함께 공유적으로 결합시키는 보조적인, 광개시 가교 단계를 통해 벌크 스캐폴드로 계내에서 전이될 때이다. 앞서 기술한 바와 같이 효소-매개 어닐링과 같은 광-기반 화학에 의존하지 않는 MAP 스캐폴드 시스템에서 구현될 수 있는 다른 어닐링 방법이 있다는 점에 유의하는 것이 중요하다1. 전반적으로, 이들 방법은 직접 사용되거나 임의의 적용을 위한 MAP 스캐폴드를 생성하기 위해 상이한 히드로겔 제형 화학(예를 들어, 히알루론산 기반)과 함께 사용될 수 있다.

<table><tbody><tr><td>2-aminoethanethiol hydrochloride</td><td>Acros Organics</td><td>AC153770250</td><td>For MethMal Synthesis MW: 113.61 Da</td></tr><tr><td>35 mm 플레이트 로터</td><td>HAAKE</td><td>P35/Ti</td><td>Geometry for HAAKE 점도계</td></tr><tr><td>4-arm PEG-Maleimide (10 kDa)</td><td>NOF AMERICA Corporation</td><td>SUNBRIGHT PTE-100MA</td><td>마이크로겔 전구체 용액</td></tr><tr><td>4-arm PEG-Maleimide (20 kDa)</td><td>NOF AMERICA Corporation</td><td>SUNBRIGHT PTE-200MA</td><td>For MethMal Synthesis 각 배치에 특정한 분자량</td></tr><tr><td>Luer-Lok 팁이 있는 BD 주사기</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td>일회용 플라스틱 주사기</td></tr><tr><td>생검 펀치</td><td>Mitex</td><td>MLTX33-31A-P/25</td><td>1.5mm 직경</td></tr><tr><td>Chloroform-d</td><td>Acros Organics</td><td>AC209561000</td><td>For MethMal Synthesis</td></tr><tr><td>Collimated LED Light Source</td><td>ThorLabs</td><td>M365LP1-C1</td><td>365 nm</td></tr><tr><td>배양 접시 (15 cm)</td><td>Corning</td><td>CLS430599</td><td>150 mm x 25 mm</td></tr><tr><td>DMTMM(4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methyl-morpholinium chloride)</td><td></td><td>메스말 합성을 위한 오크우드 화학 151882 MW: 276.72 Da</td><td></td></tr> <tr><td>Fluorosurfactant</td><td>Ran Technologies</td><td>008-Flurosurfactant-5wtH-200G</td><td>5 중량 퍼센트 008- HFE7500</td></tr><tr><td>FreeZone Triad 동결 건조 시스템의</td> 플루로 계면 활성제 <td>Labconco</td><td>7400000 시리즈</td><td>메스 말 합성 동결 건조기</td></tr><tr><td>유리 슬라이드</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-A3</td><td>일반 유리 슬라이드, 코팅되지 않은</td></tr><tr><td>HAAKE Rheowin 점도계</td><td>HAAKE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>버전 1.8.0_172</td></tr><tr><td>KDS Legato 210 이중 견인삭 주사기 펌프</td><td>Kd 과학&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LED 드라이버</td><td>ThorLabs</td><td>DC2200</td><td></td></tr><tr><td>리튬 페닐 -2,4,6- 트리메틸 벤조일 포스피 네이트 (LAP)</td> <td>시그마-알드리치</td><td>900889</td><td>광개시</td></tr>제 <tr><td>메타 크릴 산</td><td>시그마 알드리치</td><td>155721</td><td>메스 말 합성 MW : 86.09 Da 밀도 : 1.015g / mL</td></tr><tr><td>미세 유체 장치 SU8-Si 마스터 웨이퍼</td><td>FlowJem</td><td>N / A</td><td>실란화</td></tr><tr><td>MMP-2 분해성 가교제</td><td>포함 주문품 FlowJem</td><td></td><td>시퀀스: Ac-GCGPQGIAGQDGCG-NH2</td></tr><tr><td>Needles (25G, beveled)</td><td>BD</td><td>305122</td><td>길이: 15.88 mm 게이지: 0.5 mm</td></tr><tr><td>Novec 7500</td><td>3M</td><td>7100025016</td><td>불소화 오일</td></tr><tr><td>산소</td><td>Praxair</td><td>UN1072</td><td>압축</td></tr><tr><td>Peek 튜빙</td><td>Trajan Scientific</td><td>03-350-523</td><td>1/32" 외경; 0.02" 내경; 10' 길이</td></tr><tr><td>PFOCTS (트리클로로(1H,1H,2H,2H-퍼플루오로옥틸)실란)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>448931</td><td>표면 처리용</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염</td>수 <td>Fisher BioReagants</td><td>BP3994</td><td>초순수에서 1배로 희석, pH = 7.4</td></tr><tr><td>플라즈마 클리너</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-001-HP</td><td></td></tr><tr><td>면도날</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>RGD 세포 접착 펩타이드</td><td>WatsonBio Sciences</td><td></td><td>시퀀스: Ac-RGDSPGGC-NH2</td></tr><tr><td>Rheowin 소프트웨어</td><td>HAAKE&nbsp;</td><td></td><td>HAAKE 점도계</td></tr><tr><td>메스 블레이드</td><td>Bard-Parker</td><td>371210</td> 크기와 호환되는 소프트웨어 <td>: # 10</td></tr><tr><td>메스 핸들</td><td>Bard-Parker</td><td>371030</td><td>크기 : # 3</td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP358-1</td><td>MethMal 합성 MW : 58.44 Da Sylgard</td></tr><tr><td>184 실리콘 엘라스토머 키트</td><td>DOW 화학</td><td>2065622</td><td>염기 및 경화제</td></tr><tr><td>MethMal 합성용 Triethylamine</td><td>Fisher Scientific</td><td>O4884-100</td><td> MW: 101.19 Da 밀도: 0.73g/mL</td></tr><tr><td>Tygon 튜빙</td><td>Saint Gobain Performance Plastics</td><td>AAD04103</td><td>ID: 0.51 mm OD: 1.52 mm</td></tr><tr><td>Varian Inova 500 분광계</td><td>Varian</td><td></td><td>NMR UVA 생체 분자 자기 공명 시설에 위치</td></tr></tbody></table>

미세 다공성 어닐링 입자 스캐폴드를위한 마이크로 겔 빌딩 블록의 미세 유체 합성

Microfluidic Synthesis of Microgel Building Blocks for Microporous Annealed Particle Scaffold

미세다공성 어닐링된 입자(MAP) 스캐폴드 플랫폼은 과립형 하이드로젤의 서브클래스이다. 이차 광기반 화학적 가교 단계(즉, 어닐링)에 이어 계내에서 세포 규모 다공성을 갖는 구조적으로 안정한 스캐폴드를 형성할 수 있는 마이크로겔의 주사용 슬러리로 구성된다. MAP 스캐폴드는 진피 상처 치유, 보컬 폴드 증강 및 줄기 세포 전달을 포함한 다양한 재생 의학 응용 분야에서 성공을 보여주었습니다. 이 논문은 MAP 스캐폴드를 형성하기 위한 빌딩 블록으로서 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG) 마이크로겔의 합성 및 특성화 방법을 설명한다. 이들 방법은 맞춤형 어닐링 마크로머 (MethMAL)의 합성, 마이크로겔 전구체 겔화 동역학의 결정, 마이크로유체 장치 제조, 마이크로겔의 마이크로유체 생성, 마이크로겔 정제, 및 마이크로겔 사이징 및 스캐폴드 어닐링을 포함하는 기본 스캐폴드 특성화를 포함한다. 구체적으로, 본원에 기재된 고처리량 마이크로유체 방법은 특히 재생 의학 분야에서 임의의 원하는 적용을 위해 MAP 스캐폴드를 생성하는데 사용될 수 있는 다량의 마이크로겔을 생산할 수 있다.

이 프로토콜의 목적은 MAP 스캐폴드에 사용되는 마이크로겔 빌딩 블록을 합성하는 데 필요한 모든 단계를 개략적으로 설명하는 것입니다. MethMAL 어닐링 마크로머는 매우 선택적이고 효율적이며 다수의 폴리머 백본(14)과 양립가능하다. 높은 어닐링 효율을 보장하기 위해 20 kDa PEG-말레이미드의 적어도 67%-75%가 메타크릴아미드 작용기로 개질되는 것이 중요하다. 퍼센트 수정은 그림 1과 같이 1H-NMR 스펙트럼 피크를 분석하여 가장 쉽게 결정할 수 있습니다. 점도계에 의해 결정되는 겔화 동역학은 각 겔 제형에 대해 고려해야 할 중요한 지표입니다. 이 프로토콜은 마이크로겔 겔화를 위해 티올 기능화 가교결합제와 효율적으로 반응하는 MAL 그룹을 갖는 PEG 백본으로 구성된 겔 전구체 용액을 사용한다. 그러나, 많은 히드로겔 화학이 본원에 기재된 고처리량 마이크로유체 방법을 통해 마이크로겔을 제조하는데 사용될 수 있다. 겔화의 개시까지의 시간은 마이크로유체 마이크로겔 생성의 지속기간에 대한 통찰력을 제공할 것이다. 30분(그림 2)에서 2시간 사이에 겔화를 시작할 수 있는 겔 전구체 pH를 선택하는 것이 좋습니다.
겔화 시간이 너무 빠르면 겔 전구체 용액이 미세 유체 장치 내에서 중합되기 시작하고 채널을 막히게됩니다. 추가적으로, 티올화 리간드 농도 (예를 들어, RGD)의 변화는 겔화 동안 네트워크 형성에 영향을 미칠 수 있고, 제형을 조정함으로써 설명될 필요가 있을 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요하다. 미세유체 장치 제조 단계는 지루할 수 있지만 성공적으로 접합된 장치의 대표적인 결과는 그림 3에 나와 있습니다. 이 프로토콜은 de Rutte et al.13의 설계에서 채택 된 고처리량, 병렬화, 단계 유화 미세 유체 장치를 사용하며 실리콘 웨이퍼 제조는 마이크로 유체 기술 회사에 아웃소싱되었습니다. 그러나 이 프로토콜에 요약된 단계는 SU-8 실리콘 웨이퍼 포토마스크에 에칭된 모든 장치 설계와 함께 사용할 수 있습니다. 포토 마스크 상의 채널의 스텝 크기는 마이크로겔 입자의 크기에 영향을 미치기 때문에 장치 제조 중에 최적화되어야 한다는 점에 유의하는 것이 중요하다.
마이크로겔의 마이크로유체 생성을 위한 유속은 겔화 시간, 원하는 입자 크기 및 마이크로유체 장치 설계와 같은 인자에 기초하여 각 겔 제형에 대해 최적화되어야 한다. 고처리량 장치를 사용하는 경우 성상의 유속은 최대 5mL/h까지 올라갈 수 있습니다. 그림 4B는 이 프로토콜에 사용되는 고처리량 장치의 설정을 보여줍니다. 장치가 올바르게 작동하는 경우 마이크로겔 형성은 그림 4D에 표시된 것과 유사하게 보일 것입니다. 정제 전에, 마이크로겔은 불투명할 것이다. 다양한 오일, PBS, 및 헥산 세척을 완료한 후, 겔은 도 5의 대표 이미지처럼 선명하게 보일 것이다. 형광단을 마이크로겔에 혼입시키는 경우, 정제된 생성물은 약간의 착색된 색조를 가질 수 있지만, 여전히 반투명에 근접해야 한다. 정제 및 팽윤 후, 마이크로겔은 크기가 매우 균일해야 하고, 도 6에 도시된 바와 같이 1.00 내지 1.05 사이의 PDI를 가져야 한다. 다양한 광개시제가 MAP 스캐폴드를 포토어닐링하기 위해 사용될 수 있다. 본원에 기재된 LAP에 대한 대안을 사용하는 경우, 앞서 기술된 바와 같이 어닐링 동역학을 결정해야 한다(14). 추가적으로, 광원이 광개시제와 대응하는 한, 다양한 광원이 광어닐링에 사용될 수 있다. 광원을 보정하고 초점을 맞추어야합니다. 어닐링 시간 및 광강도는 겔 제형 및 광개시제 농도에 기초하여 최적화될 필요가 있을 수 있다. 이 프로토콜에 요약된 어닐링 방법은 시험관내 및 생체내 연구에 사용될 수 있다. 어닐링 후, 마이크로겔은 이광자 현미경으로 시각화될 수 있는 다공성 스캐폴드를 형성할 것이다(도 7B-C).

이 프로토콜은 다양한 재생 의학 응용에 사용될 수 있는 미세다공성 어닐링된 입자 스캐폴드를 위한 마이크로겔 빌딩 블록을 합성하기 위한 일련의 방법을 기술한다.

The microporous annealed particle (MAP) scaffold platform is a subclass of granular hydrogels. It is composed of an injectable slurry of microgels that ...

미세 다공성 어닐링 입자 스캐폴드를 위한 단분산 마이크로겔 빌딩 블록의 고처리량 제조는 스캐폴드 다공성의 향상된 제어를 제공합니다. 이것은 기공 크기와 후속 조직 통합 결과에 영향을 미칠 수 있습니다. 이 프로토콜은 고처리량 미세유체 접근법을 사용하여 유동 초점 미세유체학, 배치 에멀젼 및 전기 분무와 같은 다른 방법으로는 달성할 수 없는 대량의 단분산 미세겔을 생성합니다.생성된 마이크로겔은 빠른 조직 및 성장을 허용하는 세포 규모 다공성으로 인해 재생 의학 응용 분야에 유리한 미세 다공성 어닐링된 입자 스캐폴드로 형성될 수 있습니다. PDMS 미세유체 장치당 하나의 유리 슬라이드를 준비하는 것으로 시작합니다. 테이프, 여과된 공기 또는 이소프로필 알코올 세척제를 사용하여 슬라이드에서 먼지를 제거합니다.PDMS 장치 설계 슬라이드의 유리 슬라이드를 96웰 플레이트 덮개에 나란히 놓고 플라즈마 클리너에 넣습니다. 도어와 공기 흐름 밸브를 닫고 진공 펌프를 켭니다. 최소 30초 동안 실행한 다음 끕니다.산소 탱크 가스 튜브를 공기 흐름 밸브에 연결합니다. 플라즈마 챔버에 30초 동안 산소를 채운 다음 산소를 끄고 기류 밸브를 닫습니다. 진공 펌프를 켜고 무선 주파수 레벨을 높음으로 설정하십시오.챔버가 보라색 분홍색으로 변할 때까지 기다렸다가 30 초가 지날 때까지 기다리십시오. 타이머가 꺼지면 플라즈마와 진공을 끈 다음 공기 흐름 밸브를 천천히 열어 진공을 해제합니다. 플라즈마 클리너에서 트레이를 제거합니다.PDMS 장치를 유리 슬라이드에 부드럽게 뒤집어 접착합니다. 결합이 발생하면 PDMS의 투명도에 약간의 차이가 있음을 관찰하십시오. 최상의 결과를 얻으려면 사용 직전까지 접합된 장치를 섭씨 60도에서 보관하십시오.PFOCTS 및 Novec 오일을 희석하여 표면 처리를 준비하고 3-4 개의 장치에 1 밀리리터를 사용하십시오. 부피를 1 밀리리터 주사기로 옮기고 25 게이지 바늘을 부착하십시오. 장치 당 10-12 센티미터의 Tygon 튜브를 자릅니다.PEEK 튜브 조각을 약 1인치 길이로 자릅니다. 바늘이 Tygon 튜브 입구에 구멍을 뚫는 것을 방지하기 위해 Tygon 튜브 끝에 PEEK 튜브의 몇 밀리미터를 삽입합니다. 가열 된 챔버에서 장치를 꺼내고 Tygon 튜브의 PEEK가 아닌 끝을 수성 입구 구멍에 삽입합니다.표면 처리 주사기의 바늘을 PEEK 튜브에 삽입하고 오일 챔버 출구 구멍을 덮습니다. 트리트먼트를 천천히 주입하고 기포 없이 장치를 채우는지 확인합니다. 수성 챔버가 먼저 채워질 때까지 기다린 다음 더 작은 채널과 오일 챔버가 채워질 때까지 기다리십시오.장치에서 타이곤 튜브를 제거합니다. 장치가 채워지면 실온에서 10 분 동안 그대로 두십시오. 5 밀리리터 주사기에 기름 만 채우고 25 게이지 바늘을 부착하십시오.입구와 출구를 통해 장치에서 표면 처리를 흡입하십시오. 타이곤 튜브를 수성 유입구에 삽입합니다. 오일이 든 주사기를 PEEK 튜브에 삽입하고 각 장치에 오일을 세척합니다.장치에서 오일을 흡입하십시오. 오일 세척을 두 번 반복하고 Tygon 튜브를 제거하십시오. Tygon 튜브의 PEEK가 아닌 끝을 미세 유체 장치의 입구에 삽입합니다.끝에 PEEK 튜브가 없는 나머지 Tygon 튜브 조각을 미세 유체 장치 콘센트에 삽입합니다. 5 밀리리터 플라스틱 주사기에 최소 3 밀리리터의 오일을 넣고 25 게이지 바늘에 부착하십시오. Tygon 입구 중 하나의 PEEK 튜브에 바늘을 조심스럽게 삽입합니다.튜브와 장치를 오일로 부드럽게 세척하십시오. 원추형 튜브의 콘센트에서 오일을 수집하십시오. 다른 Tygon 입구에서 오일 플러시를 반복합니다.주사기 펌프를 원하는 유량으로 설정하십시오. 계면 활성제가 들어있는 주사기를 25 게이지 바늘을 통해 오일 입구에 연결하고 튜브와 미세 유체 장치의 오일 채널을 프라이밍하기에 충분한 오일을 부드럽게 분배합니다. 장치와 오일 주입구가 설치되면 젤 전구체를 포함 할 새로운 5 밀리리터 주사기에 0.5 밀리리터의 오일을 첨가하십시오.이 소량의 오일을 사용하여 미세유체 장치를 통해 전구체 용액을 플러시하는 데 도움을 줍니다. 원추형 튜브에서 1.5 밀리리터의 PEG 백본 용액과 1.5 밀리리터의 가교 결합제 용액을 결합합니다. 30초 동안 와동시키고 혼합된 겔 전구체 용액을 5밀리리터 주사기로 신속하게 옮긴다.25 게이지 바늘을 통해 겔 전구체 용액이 있는 주사기를 수성 입구에 연결합니다. 튜브와 수성 채널을 프라이밍하기에 충분한 용액을 부드럽게 분배합니다. 주사기를 주사기 펌프에 고정하고 실행을 누릅니다.채널에서 균일 한 크기의 입자를 찾으십시오. 원추형 튜브의 콘센트에서 마이크로 젤을 수집합니다. 겔화가 완료되면 피펫을 사용하여 튜브 바닥에서 오일 상을 조심스럽게 제거합니다.이것을 불소화 폐기물을 위한 적절한 폐기물 용기에 보관하십시오. 마이크로젤 수집 튜브에 오일을 더 추가합니다. 수집 튜브를 부드럽게 뒤집어 혼합합니다.상이 분리될 수 있도록 수집 튜브를 5분 동안 그대로 두십시오. 하단의 오일 상과 상단의 수성 마이크로 겔 상을 찾으십시오. 오일 세척을 적어도 두 번 더 반복하십시오.앞에서 설명한 것처럼 젤에 오일을 더 넣은 다음 PBS를 젤에 첨가하십시오. 여러 번 혼합하기 위해 반전하십시오. 층을 분리하려면 튜브를 2, 000 RCF에서 약 30 초 동안 원심 분리하십시오.튜브 바닥의 오일 상, 중간의 젤, 상단의 PBS를 찾으십시오. 피펫으로 오일 상을 제거하고 폐기물 용기에 폐기하십시오. 오일과 PBS 세척을 두 번 반복하십시오.최종 세척까지 젤이 불투명에서 투명으로 전환되는지 확인하십시오. 모든 오일을 제거하십시오. 원추형 튜브에서 PBS를 제거하지 마십시오.화학 흄 후드에서 유리 피펫을 사용하여 PBS와 동일한 부피로 튜브에 헥산을 추가합니다. 원추형 튜브를 30 초 동안 또는 완전히 혼합 될 때까지 와동시킵니다. 4, 696 RCF에서 5 분 동안 원심 분리기.분리 후 최상층에서 헥산, 중간에 PBS, 하단에서 젤을 찾으십시오. 헥산 층을 제거하고 유기 폐기물 용기에 버립니다. PBS를 흡인합니다.PBS 세척에서 헥산을 적어도 두 번 또는 겔이 거의 반투명하게 보일 때까지 반복합니다. PBS로 젤을 한 번 더 씻어 남아있는 헥산 잔여 물을 제거하십시오. 4, 696 RCF에서 5 분 동안 원심 분리하고 PBS 층을 흡인합니다.20킬로달톤 PEG 말레이미드의 약 67-75%가 메타크릴아미드 작용기로 변형되어 높은 어닐링 효율을 보장합니다. 퍼센트 변형은 1H NMR 스펙트럼 피크를 분석함으로써 결정하였다. 겔화의 시작은 미세 유체 마이크로 겔 생성 기간에 대한 통찰력을 제공했습니다.30 분에서 2 시간 사이에 겔화를 시작할 수있는 겔 전구체 pH를 선택하는 것이 좋습니다. 정제 및 팽윤 후, 마이크로겔은 단분산 개체군으로 정의된 1.00 내지 1.02 사이의 균일한 크기 및 다분산 지수를 가졌다. 어닐링 후, 마이크로겔은 2광자 현미경으로 시각화된 다공성 스캐폴드를 형성하였다.PDMS 장치를 유리 슬라이드에 올바르게 접착하고 장치를 올바르게 표면 처리하는 것은 최상의 미세 유체 장치 성능을 위해 매우 중요합니다. 이 기술을 사용하면 균일한 마이크로겔 빌딩 블록을 신속하게 생산하여 상처 치유를 포함한 다양한 생체 내 재생 응용 분야에 사용할 수 있는 맵 스캐폴드를 형성할 수 있습니다.

microfluidic-synthesis-microgel-building-blocks-for-microporous

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

우리는 과포화 NIPAAm 단량체 용액의 상 분리에 대해 명확하게 구획화된 구조 기반을 가진 동일한 기본 물질인 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)(PNIPAAm)로 완전히 구성된 Janus 마이크로하이드로겔을 합성하는 프로토콜을 제시합니다. 합성된 Janus 마이크로하이드로겔은 이방성 열 반응성 및 유기친성/친수성 로딩 능력과 같은 고유한 특성을 보여줍니다.

폴리의 합성 (<em&gt; N</em&gt; 이소 프로필 아크릴 아미드) 이방성 열 응답 성 및 유기화 / 친수성로드 기능에 대한 야누스 Microhydrogels

우리는 폴리디메틸실록산(PDMS)에서 두 마이크로채널 사이에 나노유체 접합을 생성하기 위해 실리카 콜로이드 나노입자의 간단한 자기 조립 기술을 제안합니다. 이 기술을 사용하여 기공 크기가 ~45nm인 나노다공성 비드 멤브레인을 마이크로채널 내부에 구축하고 DNA 샘플의 동전기 사전 농축에 적용했습니다.

콜로이드 입자의 자기 조립 과정을 통해 PDMS 미세 유체 칩의 하위 50 Nm의 나노 유체 접합 만들기

여기에서는 폴리디메틸실록산(PDMS)으로 만들어진 이중층 미세유체 시스템의 제조 및 작동에 대해 설명합니다. 우리는 트래핑을 위한 이 장치의 잠재력을 보여주고, 결정질 분자 물질의 배위 경로를 지시하고, 온칩 트랩 구조에 대한 화학 반응을 제어합니다.

미세 유체 압축 공기를 넣은 케이지 : A의 칩 크리스탈 트래핑, 조작에 대한 새로운 접근 방식 및 제어 화학 처리

프로토콜 분해성 thermoresponsive hydrogels hydrazone 대량 규모, 미, 그리고 나노, 젤 나노 입자 및 nanofibers의 준비에 대 한 후자에 고분자 올리고의 cross-linking에 따라 제작에 대 한 설명 합니다.

자기 조립, 분해 Thermoresponsive Hydrogels 반응 압출, 마이크로, 통해 여러 길이 가늠 자에를 조작 하 고 전기

UV crosslinkable hydrogels 처리 첨가제 제조 전략 개발 되었습니다. 이 전략 ﹙ 하이드로 겔 구조의 레이어, 레이어 조립 뿐만 아니라 저조한 자석 회전에 반응 하는 움직이는 구성 요소를 포함 하는 통합된 장치 독립적인 구성 요소, 어셈블리 허용 한다.

첨가제 제조 기술은 자석으로 응답 구성 요소와 히드로 기반 Micromachines의 손쉬운 고 빠른 제작을 위해

물방울 분석은 분석 화학, 효소 진화 및 단일 세포 분석에 유용하지만 일반적으로 액적을 형성하기 위해 미세 유체학이 필요합니다. 여기서는 액적 저술을 수행하기 위한 미세유체없는 접근 방식인 입자 템플릿 유화제를 설명합니다.

입자 템플릿 유화제를 통해 미세 유체가 없는 물방울 분석을 가능하게 합니다.

이 작업은 압출 단편화로 마이크로 젤을 제조하고, 마이크로 젤을 주사용 과립 하이드로 젤로 처리하고, 과립 하이드로젤을 생물 의학 응용 분야를위한 압출 인쇄 잉크로 적용하는 간단하고 적응력이 뛰어나며 저렴한 방법을 설명합니다.

대량 하이드로젤을 단편화하고 생물 의학 응용 분야를 위한 입상 하이드로젤로 처리

상보적인 반응성 그룹을 갖는 마이크로겔 로드는 수용액에서 상호 연결될 수 있는 능력을 가진 마이크로유체공학을 통해 생산됩니다. 아니소메트릭 마이크로젤은 구형 기반 시스템에 비해 더 큰 기공을 가진 안정적인 구조물로 막히고 상호 연결됩니다. GRGDS-PC로 변형 된 마이크로 겔은 세포 배양에 사용할 수있는 거대 다공성 3D 구조물을 형성합니다.

마이크로젤 로드의 상호 연결된 거대 다공성 3D 스캐폴드

입상 스캐폴드 내에서 입자 분획의 변동성을 최소화하면 재현 가능한 실험이 용이해집니다. 이 작업은 시험관 내 조직 공학 응용 분야를 위해 제어된 입자 분획으로 과립 스캐폴드를 생성하는 방법을 설명합니다.

3D 세포 배양을 위한 미세 다공성 어닐링 입자 스캐폴드의 입자 분획 제어

본 프로토콜은 고해상도 현미경 이미징과 동시 압력 차이 측정을 결합하여 준 2D 다공성 배지에서 생물막 발달을 연구하는 미세 유체 플랫폼을 설명합니다. 이 플랫폼은 다공성 매체의 공극 크기와 유체 유속이 생물 막힘에 미치는 영향을 정량화합니다.

다공성 매체의 생물 막힘을 연구하기 위한 미세유체 플랫폼

이 기사에서는 미세유체 장치를 사용한 고처리량 젤라틴 메타크릴로일 마이크로겔 제조, 마이크로젤을 부유 가능한 분말(마이크로 에어로젤)로 변환, 마이크로겔의 화학적 조립을 위한 입상 하이드로겔 스캐폴드, 3D 바이오프린팅을 위한 미세 다공성이 보존된 입상 하이드로겔 바이오잉크 개발에 대해 설명합니다.

젤라틴 메타크릴로일 과립형 하이드로겔 스캐폴드: 고처리량 마이크로겔 제조, 동결건조, 화학 조립 및 3D 바이오프린팅

배우세요 미세유체 기술을 활용한 단일분산 마이크로겔 합성법으로 미세다공성 입자 스캐폴드를 제작하는 방법입니다. 이 기술은 재생의학 분야에서 조직 통합 및 재생 효율을 높이는 데 활용됩니다.

미세 다공성 어닐링 입자 스캐폴드를위한 마이크로 겔 빌딩 블록의 미세 유체 합성

더 많은 동영상 탐색