Name: CRISPR-Cas9 매개 제브라피쉬 하트의 정확한 녹인 편집 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-13T13:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: 학습하세요 CRISPR-Cas9을 이용한 정확한 녹인 편집 기법으로 Danio rerio에서 Long QT 증후군 유전자 변이를 모델링하는 방법을. 형광 리포터 시스템으로 편집 성공을 간편하게 확인할 수 있습니다.

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이 연구는 캐나다 보건원 연구 프로젝트 보조금 (TWC)과 캐나다 디스커버리 보조금의 자연 과학 및 공학 연구위원회 (TWC)의 지원을 받았습니다.

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저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

CRISPR-Cas9를 사용한 정밀한 유전자 편집 엔지니어링은 HDR 메커니즘의 낮은 효율성과 효율적인 검출로 인해 어려움을 겪고 있습니다. 여기에서는 양성 편집을 직접 시각적으로 감지하여 제브라피쉬에서 정밀한 편집을 생성하는 CRISPR-Cas9 기반 2-sgRNA 엑손 대체 접근법에 대해 설명합니다. 이 접근법의 효능은 zkcnh6a 유전자에서 정확한 편집을 생성함으로써 입증됩니다. 이 논문은 유전자 편집 제브라 피쉬 유충의 심장 기능이 심박수, 심낭 치수 및 ECG 형태의 비 침습적 표현형 측정을 사용하여 어떻게 평가 될 수 있는지 보여줍니다. 유전자 편집 도입에서 표현형 평가에 이르기까지이 접근법은 약 1 주일 이내에 처음부터 끝까지 완료 될 수 있습니다.
위의 편집 및 표현형 접근법의 이점은 CRISPR 변형 설계의 용이성, 여러 생리학적 시스템에서의 광범위한 적용 가능성, 큰 유전자 또는 유전자 단편을 삽입할 수 있는 능력, 개발 및 세대를 통해 종단적...

동물 모델에서 CRISPR 기반 유전자 편집 전략을 사용하면 전체 유기체 수준 1,2,3에서 유전적으로 유전되는 질병, 발달 및 독성학을 연구할 수 있습니다. 제브라피쉬는 쥐 또는 인간 유래세포 모델보다 다양한 생리학적 측면에서 인간에게 더 가까운 강력한 모델을 제공합니다4. 광범위한 유전 도구와 전략이 제브라 피쉬에서 전진5 및 역 유전자 스크리닝6 모두에 사용되었습니다. 제브라피쉬의 포괄적인 유전자 매핑 및 주석은 표적 유전자 녹아웃(KO) 및 정밀 녹인(KI)을 엔지니어링하는 주요 기술로서 유전자 편집 접근 방식을 촉진했습니다7.
그럼에도 불구하고 제브라 피쉬에서 정확한 KI 편집을 생성하는 것은 낮은 효율성과 정확한 탐지의 어려움으로 인해 제한됩니다. 전사 인자 유사 이펙터 뉴클레아제(TALENs)가 KI8에 성공적으로 사용되고 최적화되었지만, CRISPR은 더 간단한 sgRNA 표적화로 개선된 유전자 편집 전략을 제공합니다. 수많은 연구에서 CRISPR을 사용하여 제브라피쉬 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20에서 정확한 KI를 생성했지만, CRISPR 매개 상동성 지향 복구(HDR)를 통해 생성된 이러한 편집은 낮은 내재적 성공으로 비효율적인 경향이 있습니다. 유전형 분석을 기본 화면으로 요구하는 비율 9,10,14,21. 이는 제브라피쉬의 효율적인 KI CRISPR 시스템과 정밀한 편집을 감지하기 위한 신뢰할 수 있는 고처리량 시스템의 필요성을 보여줍니다.
이 연구의 목표는 성공적인 편집의 간단하고 높은 처리량 검출을 통해 제브라 피쉬 심장에서 정확한 심장 유전자 KI를 생성하는 플랫폼을 설명하는 것이 었습니다. CRISPR-Cas9 기반 2-sgRNA 엑손 치환 접근법이 설명되며, 이는 TALEN 접근법8에 기초한다. 이 접근법은 2-sgRNA 가이드를 사용하여 표적 서열을 절제하고 관심 있는 KI와 유전적으로 암호화된 인트론 리포터 유전자를 포함하는 외인성 주형 서열로 대체하는 것을 포함합니다(그림 1). 표적 유전자 인트론 서열 내에 유전적으로 암호화된 형광 리포터를 통합하면 양성 편집을 효율적으로 검출할 수 있습니다. 그런 다음 개인을 갑작스런 심장 사망에 걸리게하는 심장 전기 장애 인 유전 된 LQTS와 관련된 유전자 변이체의 비 침습적 특성화를 위해 제브라 피쉬 유충의 심장 전기 기능을 평가하기위한 표현형 플랫폼을 설명합니다.
이러한 접근법은 유전 질환을 모델링하고 유전자 발현 패턴 매핑 및 발달 조절과 같은 생물학적 및 생리학적 문제를 해결하기 위해 제브라피쉬 KI 유전자 편집에 대한 접근 및 사용을 향상시킬 것입니다. 제브라 피쉬 심장은 쥐 모델보다 인간 심장 전기 생리 학적 특성과 더 잘 평행하기 때문에 심장 질환 모델링을위한 유 전적으로 다루기 쉬운 시스템으로서 특히 매력적 일 수 있습니다 7,22,23.

<table><tbody><tr><td>Program</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CRISPOR</td><td>TEFOR Infrastructure</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ENSEMBL</td><td>European Bioinformatics Institute</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health (NIH)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro-Manager</td><td>Open Source (Github)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NEBiocalculator</td><td>New England Biolabs (NEB)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EQUIPMENT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24-well Plate</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>25 mm 페트리 디쉬</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blackfly USB3 카메라</td><td>Teledyne FLIR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C1000 Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5415C</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EZNA 겔 추출 키트</td><td>, Omega Biotek</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>MAXIscript T7, 전사 키트,</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MaxQ 5000 인큐베이터</td>, <td>Barnstead Lab Line</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>Miniprep 키트</td>, <td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mMessage mMachine T7 Ultra 전사 키트,</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ND1000 분광 광도계</td><td>Nanodrop</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR 정제 키트</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PLI 100A Picoinjector</td><td>Harvard Apparatus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PowerPac 기본 전원 공급 장치</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stemi 305 Steroscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wide Mini Sub Cell GT 전기 영동 시스템</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZebTec Zebrafish 하우징 시스템</td><td>Tecniplast</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SERVICES</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gene Synthesis</td><td>Genewiz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sanger Sequencing</td><td>Genewiz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>REAGENTS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10&beta; 유능한 세포</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10X PCR 완충액</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100mM 뉴클레오티드 혼합물</td><td>ABM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>암피실린</td><td>시그마</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BamHI 엔도뉴클레아제(완충액</td><td>포함) NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BsaI 엔도뉴클레아제(완충액</td><td>포함) NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DR274 플라스미드(XL1 파란색 세균성 한천 찌르기)</td><td>Addgene</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>EcoRI, 엔도뉴클레아제(완충액 포함</td>), <td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, 글리세롤</td><td></td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>HEPES,</td><td>시그마</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>힌드III, 엔도뉴클레아제(완충액 포함</td>), <td>NEB</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>카나마이신</td><td>시그마</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>메틸렌 블루</td><td>, 시그마</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MLM3613 플라스미드(XL1, 블루 세균성 한천 찌르기)</td><td>Addgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MS-222 (Tricaine)</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pKHR5 Plasmid (DH5&alpha; 세균성 한천 찌르기)</td><td>Addgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PmeI Endonuclease w/ buffer</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SalI Endonuclease w/ buffer</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4 Ligase 버퍼 포함</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Taq 중합효소</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TE 버퍼</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris Hydrochloride</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XhoI Endonuclease w/ 버퍼</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RECIPES</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solution</td><td>Component</td><td>Supplier</td><td></td></tr><tr><td>어닐링 버퍼(pH 7.5-8.0)</td><td>10mM Tris</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td></td><td>50mM NaCl</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td></td><td>1mM EDTA</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>E3 매체(pH 7.2)</td><td>5mM NaCl</td><td>시그마</td><td></td></tr><tr><td></td><td>0.17mM KCl</td><td>시그마</td><td></td></tr><tr><td></td><td>0.33mM CaCl2</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td></td><td>0.33mM MgSO4</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>주입 버퍼(pH 7.5)</td><td>20 mM HEPES</td><td>시그마</td><td></td></tr><tr><td></td><td>150 mM KCl</td><td>시그마</td><td></td></tr></tbody></table>

crispr-cas9 매개 제브라피쉬 하트의 정확한 녹인 편집

CRISPR-Cas9-Mediated Precise Knock-In Edits in Zebrafish Hearts

동물 모델에서 규칙적으로 간격을 둔 짧은 회문 반복(CRISPR)이 클러스터링되어 생리적 현상 연구를 위한 정확한 유전자 조작이 가능합니다. Zebrafish는 전체 장기 및 유기체 수준에서 유전성 질병, 발달 및 독성학과 관련된 수많은 질문을 연구하는 효과적인 유전 모델로 사용되었습니다. 주석이 잘 달리고 매핑된 제브라피쉬 게놈으로 인해 유전자 편집을 위한 수많은 도구가 개발되었습니다. 그러나 CRISPR을 사용하여 정확한 녹인 편집을 생성하는 효율성과 용이함은 제한 요소입니다. 여기에 설명된 것은 심장 재분극을 담당하고 전기 장애인 LQTS(Long QT 증후군)와 관련된 유전자에서 정밀한 편집을 간단하게 감지하는 CRISPR-Cas9 기반 녹인 접근 방식입니다. 이 2-단일 가이드 RNA(sgRNA) 접근법은 표적 서열을 절제 및 대체하고 유전적으로 암호화된 리포터 유전자를 연결합니다. 이 접근법의 유용성은 야생형 및 유전자 편집 제브라 피쉬 유충에서 심장 전기 기능의 비 침습적 표현형 측정을 설명함으로써 입증됩니다. 이 접근법은 전체 유기체에서 질병 관련 변이체의 효율적인 연구를 가능하게합니다. 또한, 이 전략은 리포터 유전자, 오르토로그 또는 유전자 편집자와 같은 외인성 선택 서열의 삽입 가능성을 제공합니다.

이 2-sgRNA 엑손 대체 CRISPR 접근법의 성공적인 사용은 제브라피쉬의 zkcnh6a 유전자에서 LQTS 관련 변이체 R56Q를 엔지니어링하기 위한 정밀 편집의 도입 및 간단한 검출로 강조됩니다. 도 6 은 상기와 같이 CRISPR 성분으로 단세포 배아 단계에서 주입된 대표적인 3 dpf 유충을 나타낸다. 도 6A 는 성공적인 주형 통합의 양성 리포터로서 눈 렌즈에서 YFP mVenus 리포터 유전자 발현의 존재를 보여준다. 그림 6B, C 는 각각 야생형 및 리포터 유전자 양성 어류의 꼬리 클립 샘플에서 분리 된 게놈 DNA에서 얻은 Sanger 시퀀싱 크로마토 그램을 보여줍니다. 리포터 유전자 양성 물고기는 Zkcnh6a에 R56Q 변이체를 도입하는 정확한 편집 G to A를 갖는 것으로 밝혀졌습니...

이 프로토콜은 CRISPR-Cas9 기술을 사용하여 제브라피쉬 배아에서 정밀한 녹인 편집을 용이하게 하는 접근 방식을 설명합니다. 표현형 파이프라인은 Long QT 증후군 관련 유전자 변이체를 모델링하기 위한 이러한 기술의 적용 가능성을 입증하기 위해 제시됩니다.

CRISPR-Cas9 매개 제브라피쉬 하트의 정확한 녹인 편집

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) in animal models enable precise genetic manipulation for the study of physiological ...

당사의 프로토콜은 CRISPR 편집의 정확한 통합과 간단한 시각적 감지를 위한 파이프라인과 편집 후 표현형의 예를 제공합니다. 이 접근법의 주요 장점은 CRISPR 편집 감지가 용이하여 성공적인 편집을 효율적이고 간단하게 식별 할 수 있다는 것입니다. 이 접근법은 제브라 피쉬에서 질병 관련 변이체의 간단한 생성 및 특성화를 허용합니다.여기에서는 긴 QT 증후군을 검사하고 있습니다. 그런 다음 제약 요법에 대한 후속 연구를 탐색할 수 있습니다. 관심 유전자에 대한 제브라피쉬 오르토로그를 식별하여 녹인 표적 부위 서열을 절제하기 위해 두 개의 sgRNA 가이드를 설계하는 것으로 시작합니다.Ensembl을 사용하여 주형을 만드는 데 사용되는 2킬로베이스 측면 서열을 포함하여 관심 유전자 서열 내에서 표적 부위를 찾습니다. CRISPOR와 같은 설계 소프트웨어 도구를 사용하여 Danio rerio 종과 Cas 효소를 선택하십시오. 두 가지 sgRNA 접근법의 경우 표적 엑손 앞에 하나의 sgRNA를 선택하고 바로 다운스트림 인트론 내에서 두 번째 sgRNA를 선택합니다.선택된 sgRNA가 높은 특이성과 낮은 예측된 오프-타겟 결합을 갖도록 한다. CRISPOR 순위를 사용하여 최소한의 오프 타겟 바인딩으로 가이드를 식별합니다. 이제 PCR 기반 Sanger 시퀀싱 유전형 분석에 대해 가장 가능성이 높은 잠재적 오프 타겟 부위를 식별합니다.2개의 sgRNA를 선택한 후, 각각에 대한 역방향 보체를 얻고, 돌연변이 앞에 있는 2개의 상보성 올리고 및 돌연변이의 하류에 있는 2개의 상보적 올리고를 얻는다. 각 올리고에 호환 가능한 제한 부위를 추가하여 선택한 플라스미드에 가이드를 통합합니다. 선택된 가이드 서열을 DR274 플라스미드에 통합하기 위해 5개의 프라임 BSA1 제한 부위를 사용하여 오버행을 생성하고 가이드의 5개 프라임 말단에서 BSA1 인식 부위를 엔지니어링합니다.다음으로, PKHR5 플라스미드에 수용된 M 정맥 YFP 리포터 유전자를 측면화할 2개의 서열 단편을 선택하여 제브라피쉬에서 HDR에 대한 외인성 주형을 설계한다. 주형을 두 개의 세그먼트로 나누어 M 정맥 YFP 리포터 유전자의 양쪽에 삽입합니다. 코딩 시퀀스가 절단되지 않도록 분할 사이트가 인트론에 있는지 확인합니다.PKHR5 플라스미드로의 클로닝을 용이하게 하기 위해 원고에 언급된 모든 필수 수정 사항을 통합합니다. 수정 후 약 40 분에 한 세포 단계에 배아를 주입합니다. 3 일간의 수정 후, 제브라 피쉬 유충을 0.3 % MS222가 들어있는 25mm 페트리 접시에 옮겨 자기 교정 반사를 잃을 때까지 마취시킵니다.일단 마취되면 유충을 24 웰 플레이트의 우물로 옮깁니다. GFP 또는 YFP를 검출할 수 있는 현미경을 사용하여 유충의 눈에서 리포터 유전자 형광을 스크리닝합니다. 유충의 이미지를 캡처한 후, 리포터 유전자 발현의 존재 또는 부재를 문서화한다.정확하고 정밀한 HDR 유전자 편집을 확인하려면 앞서 시연한 대로 수정 3일 후 유충을 먼저 마취시키고 핫샷 방법을 사용하여 꼬리 클립에서 게놈 DNA를 분리하여 유전형 분석을 수행합니다. 절제된 테일 클립을 15마이크로리터의 25밀리몰 수산화나트륨에 넣고 섭씨 95도에서 20분 동안 배양한 다음 1.5마이크로리터의 트리스 염산으로 중화합니다. 13, 800번 G에서 30초 동안 원심분리하고, 추출된 게놈 DNA가 포함된 상층액을 보유한다.E3 미디어에서 유충을 복구하고 추가 연구가 필요한 경우 하우징 시스템으로 되돌립니다. 추출된 게놈 DNA를 주형으로 사용하여 표적 및 잠재적 표적 외 부위의 PCR 기반 Sanger 시퀀싱을 수행합니다. 표적 프라이머 설계가 돌연변이 부위와 가장 가까운 sgRNA 결합 부위를 포착하는지 확인합니다.관심있는 유전자로의 통합을 확인하기 위해 삽입된 상동성 암과 표적 유전자로부터의 전이를 검출하기 위해 별도의 시퀀싱 프라이머를 설계한다. 프라이머를 설계하여 상위 3개의 잠재적인 오프 타겟 사이트를 시퀀싱합니다. 각 제브라피쉬에 대해 식별 가능한 온/오프 타겟 유전형 분석, 심박수, 심낭 치수, ECG 표현형 및 리포터 유전자 데이터를 컴파일합니다.YFP M 정맥 리포터 유전자 발현이 섬에서 관찰되어 성공적인 주형 통합의 긍정적 인 리포터 역할을했습니다. 리포터 유전자 양성 물고기는 Zkcnh2A에 R56Q 변이체를 도입하는 정확한 편집 G6A를 갖는 것으로 밝혀졌습니다. 눈 영역의 비율로 심낭 치수를 측정하는 것이 여기에 나와 있습니다.제브라 피쉬에서 심장 재분극 장애와 관련된 심낭 부종이 증가하는 서맥의 추세가 R56Q 유전자 편집 유충에서 관찰되었다. 수정 후 3 일 동안 제브라 피쉬 유충 심장에서 ECG 기록이 여기에 표시됩니다. 이 접근법의 가장 중요한 측면은 CRISPR 절차에서 흔히 그렇듯이 가이드 설계입니다.효과적인 가이드는 성공적인 CRISPR 편집에 필수적입니다. 더 많은 정밀도 또는 기타 기능을 허용하는 대체 CRISPR 방법을 따를 수 있습니다. 부가적으로, 생체내 유도성 편집 시스템을 제공하는 프라임 편집 복합체와 같은 큰 유전자가 삽입될 수 있다.

crispr-cas9-mediated-precise-knock-in-edits-in-zebrafish-hearts

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

트랜스 제닉 조작 게놈 편집 기능적 유전자 및 시스 - 규정 요소의 역할을 테스트하기 위해 중요하다. 여기에 (TOL2 매개 형광 리포터 유전자 구조, TALENs 및 CRISPRs 포함) 유전자 변형의 발생에 대한 자세한 미세 주입 프로토콜은 긴급 모델 물고기의 큰가시 고기에 대한 표시됩니다.

Threespine 큰가시 고기과에 형질 전환 및 게놈 편집에 대한 미세 주입

CRISPR/Cas9 시스템을 사용 하 여 채널 메기 배아에서 유전자 편집에 대 한 간단 하 고 효율적인 microinjection 프로토콜 제공 됩니다. 이 프로토콜에서 RNAs 가이드 및 Cas9 단백질 1 셀 배아의 노 른 자에 microinjected 했다. 이 프로토콜은 두 채널 메기 면역 관련 유전자를 노크 하 여 검증 되었습니다 않았습니다.

CRISPR/Cas9 단백질의 유전자 편집에 대 한 채널 메기, Ictalurus punctatus, 배아로 microinjection

타겟된 게놈 모델 시스템 Danio rerio (zebrafish)에서 편집 CRISPR-기반 접근의 출현에 의해 크게 촉진 되어 있다. 여기, 우리 생성 및 heteroduplex 이동성 분석 결과 통합 하는 CRISPR에서 파생 된 말도 대립 유전자의 식별 및 차세대 시퀀싱을 사용 하 여 돌연변이의 id에 대 한 간소화 된, 강력한 프로토콜을 설명 합니다.

효율적인 생산 및 모델 시스템 Danio rerio 에 유전자 녹아웃 식별의 CRISPR/Cas9 생성

진화 모델 시스템 Astyanax mexicanus유전자의 조작 방법을 설명합니다. 세 가지 다른 기술 설명: 중재 하는 Tol2 transgenesis, CRISPR/Cas9, 및 morpholinos를 사용 하 여 식의 최저 사용 하 여 게놈의 타겟된 조작. 이 도구는 기본 표면 및 동굴 주거 형태 사이의 변형 유전자의 직접 조사를 용이 해야.

멕시코 Cavefish에서 유전자 기능 조작

여기서, CRISPR/Cas9 게놈 녹아웃 전기 물고기를 생산하고 후방에 프로토콜이 제시된다. 상세히 설명된 것은 체육관 및 모르미리드 모두에 필요한 분자 생물학, 사육 및 축산 요구 사항, 및 Cas9-유도 인델 F0 애벌레를 생산하는 주입 기술이다.

불꽃을 침묵 : 약한 전기 물고기에서 CRISPR / Cas9 게놈 편집

이 프로토콜의 목표는 조립된 리보뉴클레오단백질 복합체와 스크리닝을 위한 dpy-10 공동 CRISPR 마커를 사용하여 C. elegans 게놈의 원활한 CRISPR/Cas9 편집을 가능하게 하는 것입니다. 이 프로토콜은 삽입, 삭제, 유전자 대체 및 코돈 대체를 포함하여 C. elegans에 있는 유전 수정의 각종을 만들기 위하여 이용될 수 있습니다.

CRISPR/Cas9 Dpy-10 공동 CRISPR 스크리닝 마커 및 조립된 리보뉴클레오단백질 복합체를 사용하여 C. elegans rbm-3.2 유전자의 편집.

초기 개발은 모계 유전 제품에 의존하며 이러한 제품 중 많은 부분의 역할은 현재 알려져 있지 않습니다. 여기에서는 CRISPR-Cas9를 사용하여 단일 세대에서 모성 효과 표현형을 식별하는 프로토콜을 설명했습니다.

모성 크리스펀트를 사용한 초기 발달에서 모계 발현 유전자의 역할 결정

CRISPR-Cas 기술은 게놈 편집 분야에 혁명을 일으켰습니다. 그러나 원하는 생식계열 편집을 찾고 분리하는 것은 여전히 주요 병목 현상으로 남아 있습니다. 따라서 이 프로토콜은 표준 PCR, 제한 분해 및 겔 전기영동 기술을 사용하여 생식계열 편집을 위해 F0 CRISPR 주입 제브라피쉬 정자를 신속하게 스크리닝하는 강력한 방법을 설명합니다.

제브라피쉬에서 생식계열 편집의 신속한 분리를 위한 정자 스크리닝

이 프로토콜은 zSpRY-ABE8e를 사용하여 정확한 제브라피쉬 질병 모델을 구성하기 위해 PAM 제한 없이 효율적인 아데닌 염기 편집을 수행하는 방법을 설명합니다.

zSpRY-ABE8e를 사용한 인간 유전 질환의 Zebrafish 모델링을 위한 효율적인 PAM 없는 염기 편집

여기에서는 제브라피시 유충에서 형광 단백질 태그로 단백질을 라벨링하는 프로토콜을 제시하며, 이는 새로 개발 및 수정된 생체 내 시스템으로, 제브라피시의 저농도 단백질을 시각화하는 데 특히 유용합니다.

제브라피시에서 저발현 단백질을 시각화하기 위한 형광 라벨링

여기에서는 안정적인 zpc:cas9 knock-in line과 sgRNA 발현 카세트의 Tol2 매개 전달을 결합하는 모계 돌연변이를 생성하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

zpc:cas9 Knock-in 제브라피시를 사용한 모계 돌연변이 생성

학습하세요 CRISPR-Cas9을 이용한 정확한 녹인 편집 기법으로 Danio rerio에서 Long QT 증후군 유전자 변이를 모델링하는 방법을. 형광 리포터 시스템으로 편집 성공을 간편하게 확인할 수 있습니다.

CRISPR-Cas9 매개 제브라피쉬 하트의 정확한 녹인 편집

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