Name: 감염성 단핵구증이 있는 어린이의 말초 혈액 샘플에서 면역 세포 하위 집단 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: 학습하세요 감염성 단핵구증 어린이의 말초 혈액에서 면역 자기 구슬과 형광 활성화 세포 분류를 이용한 면역 세포 하위 집단 분리 방법. 이 기법은 EBV 감염 메커니즘 연구와 면역 반응 분석에 활용됩니다.

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이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (82002130), 베이징 자연 과학 재단 (7222059) 및 의학을위한 CAMS 혁신 기금 (2019-I2M-5-026)의 지원을 받았습니다.

혈액 샘플은 IM 환자(n=3), 건강한 EBV 보균자(n=3) 및 EBV에 감염되지 않은 어린이(n=3)로부터 얻었다. 베이징 어린이 병원, 수도 의과 대학에서 자원 봉사자를 모집했으며 모든 연구는 윤리적으로 승인되었습니다. 수도의과대학 베이징 아동병원 윤리위원회에서 윤리적 승인을 받았습니다(승인 번호: [2021]-E-056-Y). 이 연구는 임상 테스트를 위해 나머지 샘플 만 사용했기 때문에 환자의 정보에 입각 한 동의가 면제되었습니다. 모든 데이터는 환자의 개인 정보를 보호하기 위해 완전히 익명화되고 익명화되었습니다.
1. 말초 혈액에서 PBMC의 분리
<ol><li>표준 정맥 천자로 IM 환자의 신선한 말초 혈액 (2mL)을 K3EDTA 튜브로 수집합니다. 참고: 세포 생존력을 유지하려면 프로세스가 빨라야 합니다.</li>
	<li>인산염 완충 식염수(PBS)로 말초 혈액을 2배 부피로 희석하고 15mL 원심분리 튜브에서 인간 림프구 분리 배지(밀도: 1.077 ± 0.001g/mL) 위에 놓습니다. 참고: 혈액, PBS 및 분리 배지의 부피비는 1:1:1이었습니다. 혈액을 분리 매체에 천천히 추가하고 혈액이 분리 매체에 침전되지 않도록 즉시 원심 분리하십시오.</li>
	<li>실온에서 20 분 동안 800 ×g에서 원심 분리합니다. 중간 층(농축 PBMC)을 다른 15mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. 참고: 원심분리 후에, 관의 바닥에 적혈구가 있고, 중간 층은 분리 매체이고, 최상층은 혈장이고, 플라스마 층과 별거 액체 층 사이에는 PBMC (림프구 및 단핵구 포함)가 있었습니다.</li>
	<li>PBMC를 10mL의 PBS로 세척하고 실온에서 20분 동안 800× g 에서 원심분리합니다. 상청액을 조심스럽게 폐기하십시오.</li>
	<li>세척 및 원심분리(단계 1.4)를 2 x 반복한다. 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 1mL의 PBS로 PBMC를 재현탁하고 트리판 블루 기반의 자동 카운터로 세포를 계수합니다.</li>
</ol>2. CD14 마이크로비드를 사용하여 PBMC로부터 CD14+ 단핵 구의 분리
<ol><li>PBS (pH 7.2) 중 0.5% 소 태아 혈청 (FBS) 및 2 mM EDTA를 함유하는 완충 용액을 준비한다. 버퍼를 차갑게 유지하십시오 (2-8 ° C). 알림: 기포가 컬럼을 막을 수 있으므로 사용하기 전에 버퍼를 탈기하십시오. 세포 표면의 항체 캡핑 및 비특이적 세포 표지를 방지하기 위해 세포를 차갑게 유지하십시오.</li>
	<li>PBMC를 실온에서 10 분 동안 300×g으로 원심분리합니다. 상청액을 조심스럽게 폐기하십시오. 세포를 80 μL의 완충액으로 재현탁시킨다. 20μL의 CD14 마이크로비드를 세포 현탁액에 추가합니다. 참고: ≤107 PBMC가 있는 경우 위에 표시된 볼륨을 사용하십시오. >107 PBMC 가 있는 경우 모든 시약 부피와 총 부피를 비례적으로 늘립니다.</li>
	<li>CD14 마이크로비드와 세포를 1.5mL 마이크로원심분리 튜브에서 웰 혼합하고 4°C 냉장고에서 15분 동안 배양합니다. PBMC를 1mL의 완충액으로 세척하고 실온에서 10분 동안 300× g 에서 원심분리합니다. 상청액을 완전히 폐기하십시오. 500 μL의 완충액으로 세포를 재현탁시킨다. 참고: ≤108 PBMC가 있는 경우 위에 표시된 볼륨을 사용하십시오. >108 PBMC 가 있는 경우 비례적으로 버퍼 볼륨을 늘립니다.</li>
	<li>기둥이있는 자기 분리 :<ol><li>컬럼을 마그네틱 비드 분리기 위에 놓고 3mL의 완충액으로 컬럼을 세척합니다. 세포 현탁액(2.3단계에서)을 컬럼에 추가합니다.</li>
		<li>컬럼을 통과하는 라벨링되지 않은 세포를 15mL 원심분리 튜브에 수집하고 3mL의 완충액으로 컬럼을 세척합니다. 3 x 3 mL의 완충액으로 컬럼을 세척합니다. 15mL 원심분리 튜브에 총 유출물을 수집합니다.</li>
		<li>컬럼을 새 15mL 원심분리 튜브에 넣습니다. 컬럼에 완충액 5mL를 추가합니다. 플런저를 컬럼에 단단히 밀어 넣어 자기적으로 표지된 셀을 15mL 원심분리 튜브로 즉시 플러시합니다.</li>
		<li>자기적으로 표지된 세포를 300 × g 에서 5분 동안 원심분리하고 상청액을 제거한다. 후속 전사체 시퀀싱에 사용하기 위해 1.5mL 미세 원심분리 튜브에 500μL의 PBS에 세포를 재현탁합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 형광 표지된 항체 염색 및 FACS에 의한 PBMC로부터 림프구 집단의 분리
<ol><li>표지되지 않은 세포를 300 × g 에서 5분 동안 원심분리하고(단계 2.4.2) 상청액을 제거한다. 세포를 1.5mL 미세 원심분리 튜브에 100μL의 PBS에 재현탁시킵니다.</li>
	<li>100μL의 세포 현탁액에 2μL의 각 표지된 항체(CD3, CD4, CD8, CD16, CD19, CD56)를 추가하고(항체의 부피 및 접합된 형광단 정보는 표 1에 표시됨), 30분 동안 얼음에서 배양하고 빛으로부터 보호합니다.</li>
	<li>PBS 1mL를 첨가하고 실온에서 5분 동안 300× g 에서 원심분리하여 세포를 2배 세척합니다. 세포를 1.5mL 마이크로원심분리 튜브에 500μL의 PBS에 재현탁시킨다. 유동 세포 분류기 세포분석기에서 데이터를 수집하기 전에 세포 현탁액을 부드럽게 소용돌이합니다.</li>
</ol>4. 유세포 분석 파라미터 설정
<ol><li>필요에 따라 1.5mL 미세 원심분리 튜브에서 100μL의 세포 현탁액(섹션 1 참조)을 취하고 음성 대조군 샘플, CD3 단일 염색 샘플, CD4 단일 염색 샘플, CD8 단일 염색 샘플, CD19 단일 염색 샘플 및 CD56/CD16 염색 샘플을 설정합니다.</li>
	<li>세포 현탁액 및 와류의 100 μL 당 상응하는 형광 표지된 항체 2 μL를 첨가한다. 어둠 속에서 30 분 동안 얼음 위에서 배양하십시오. 300 × g 에서 5분 동안 원심분리하고 상청액을 흡인한다. 500μL의 PBS와 와류로 펠릿을 재현탁합니다.</li>
	<li>분류 스트림을 시운전하고 다음과 같이 형광 비드를 사용하여 액적을 지연시킵니다.<ol><li>셀 분류 시스템을 열고 전원 켜기 프로그램을 실행하고 85μm 노즐을 설치하고 분류 스트림을 엽니다. 정렬 전압을 4,500V로 설정하고 주파수 를 47로 설정합니다.</li>
		<li>주로 제조업체의 지침에 따라 주 흐름 액적 중단점과 액적 지연을 조정하여 매개변수를 조정합니다12. 브레이크 오프 창에서 첫 번째 드롭릿 중단점 위치(Drop1)를 275로 설정하고 간격을 8로 설정합니다. Sweet Spot 자동 정렬 모드를 켜서 세포분석이 자동으로 액적 진폭 값을 결정하여 스트림을 안정화할 수 있도록 합니다.</li>
		<li>형광 비드를 로드하여 사이드 스트림 창에서 액적 지연을 30.31로 조정하여 비드가 초기 또는 미세 조정 모드에서 >99%의 측면 흐름 편향을 달성하도록 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>그림 1에 표시된 게이팅 전략을 참조하여 다음과 같이 게이팅을 수행합니다.<ol><li>전방 산란 영역(FSC-A)/측면 산란 영역(SSC-A) 점도표를 사용하여 다각형 게이트(P1) 를 그려 온전한 림프구 집단을 식별합니다.</li>
		<li>FSC-A/FSC-높이(FSC-H) 점도표를 사용하여 다각형 게이트(P2)를 그려 단일 셀을 식별하고 이중선을 제외합니다(그림 1A).</li>
		<li>CD19 FITC-A/CD3 PerCP-Cy5.5-A 점도표를 사용하여 직사각형 게이트(P3)를 그려 CD3+ T 세포와 CD19+ B 세포를 선택합니다(그림 1A,B). </li>
		<li>CD4 APC-Cy7-A/CD8 PE-A 점도표를 사용하여 직사각형 게이트를 그려 CD4+ T 세포와 CD8+ T 세포(각각 이러한 마커에 대해 형광이 높은 세포)를 선택합니다.</li>
		<li>CD56/CD16 APC-A/SSC-A 점도표를 사용하여 직사각형 게이트를 그려 CD56+/CD16+ NK 세포를 선택합니다(그림 1C).</li>
	</ol></li>
	<li>음성 대조군 샘플을 사용하여 기기 파라미터를 조정합니다.<ol><li>네거티브 컨트롤 튜브를 로딩 포트에 설치하고 획득 대시보드에서 로드(Load)를 클릭합니다. 소프트웨어에서 세포분석기 설정을 선택합니다.</li>
		<li>인스펙터 창에서 매개 변수 탭을 클릭하고 FSC, SSC 및 다양한 형광 염료의 전압을 조정합니다. FSC : 231, SSC : 512, PE : 549, APC : 615, APC- 시아닌 7 : 824, FITC : 555, PerCP- 시아닌 5.5 : 663.</li>
	</ol></li>
	<li>단일 염색 샘플을 사용하여 보정조정 13.<ol><li>단일 염색 튜브를 세포분석에 순차적으로 로드하고 소프트웨어에서 세포분석기 설정을 선택합니다. 보정 탭을 클릭하여 보정을 조정합니다. 참고: 유세포분석의 보상 기준은 표 2에 나와 있습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>5. 유세포분석을 통한 세포 분류 및 데이터 수집
<ol><li>세포 현탁액(섹션 1-3에 따라 분리된 PBMCs)을 잠시 와동시켜 튜브를 세포분석기에 넣기 전에 세포를 재현탁합니다. 나머지 튜브를 얼음 위에 보관하십시오.</li>
	<li>4개의 수집 흐름 튜브에 200μL의 FBS를 추가하여 분류된 세포가 튜브 벽에 달라붙지 않도록 하고 세포분석기 수집 챔버에 넣습니다.</li>
	<li>4개의 유동 튜브에서 IM 환자의 샘플과 별도로 CD3+CD4+ T 세포, CD3+CD8+ T 세포, CD3-CD19+ B 세포 및 CD3- CD56+/CD16+ NK 세포를 수집합니다(그림 2A).</li>
	<li>분리된 세포를 300×g에서 5 분 동안 원 심분리하고 상층액을 제거한다. 전사체 시퀀싱을 위해 200μL의 RNA 분리 시약을 세포에 추가합니다.</li>
	<li>위의 단계에 따라 건강한 EBV 보균자와 EBV에 감염되지 않은 어린이로부터 샘플의 면역 세포 하위 집단을 분리합니다(그림 2B, C).</li>
</ol>

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</ol>

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

이 프로토콜은 말초 혈액 면역 세포 하위 집단을 분류하는 효율적인 방법을 나타냅니다. 이 연구에서는 IM 환자, 건강한 EBV 보균자 및 EBV에 감염되지 않은 어린이의 정맥혈 샘플을 연구 목표로 선택했습니다. IM 환자의 말초 혈액을 사용하는이 작업은 주로 다색 유세포 분석을 통해 다양한 세포 하위 집합의 비율을 분석하고 결정하는 데 중점을 둡니다. 전사체 시퀀싱은 주로 동일한 질병 상태에서 IM을 가진 소아에서 다른 면역 세포 하위 집단의 분자 특성 및 기능의 포괄적이고 구체적인 비교에 불충분 한 림프구의 특정 하위 집단의 검출 및 분석에 사용됩니다. 따라서 말초 혈액에서 여러 유형의 세포를 분류하고 전사체 시퀀싱을 수행하여 이러한 면역 세포의 발현 유전자 및 기능의 차이를 비교하면 IM의 발병 기전 연구에 중요한 데이터를 제공 할 수 있습니다.
FACS 분류는 추가의 시험관내 또는 생체내 실험14를 ...

인간 헤르페스 바이러스 4형으로도 알려진 γ 헤르페스 바이러스인 엡스타인-바 바이러스(EBV)는 인간 인구에서 어디에나 있으며성인 인구의 90% 이상에서 평생 잠복 감염을 확립합니다1. 대부분의 EBV 1차 감염은 소아기 및 청소년기에 발생하며, 일부 환자는 감염성 단핵구증(IM)2을 나타내며, 혈액 내 CD8+ T 세포에 의한 면역 반응 활성화 및 구인두에서 EBV에 감염된 B 세포의 일시적인 증식을 포함한 특징적인 면역병리를보입니다3. IM의 과정은 2-6 주 동안 지속될 수 있으며 대부분의 환자는 잘 회복됩니다4. 그러나 일부 개인은 이환율과 사망률이 높은 지속적이거나 재발적인 IM 유사 증상을 나타내며, 이는 만성 활동성 EBV 감염(CAEBV)으로 분류됩니다5. 또한 EBV는 중요한 발암 바이러스로, 비인두암, 버킷 림프종, 호지킨 림프종(HL) 및 T/NK 세포 림프종6과 같은 상피 및 림프성 악성 종양을 포함한 다양한 악성 종양과 밀접한 관련이 있습니다. EBV는 50년 넘게 연구되어 왔지만 그 발병 기전과 림프구의 증식을 유도하는 메커니즘은 완전히 밝혀지지 않았습니다.
여러 연구에서 전사체 시퀀싱에 의한 EBV 감염의 면역병리학에 대한 분자 서명을 조사했습니다. Zhong 등은 IM 또는 CAEBV가 있는 중국 어린이의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 전체 전사체 프로파일링을 분석하여 CD8+ T 세포 확장이 IM 그룹7에서 주로 발견되어 CD8+ T 세포가 IM에서 중요한 역할을 할 수 있음을 시사합니다. 유사하게, 또 다른 연구에서는 EBV 재활성화 및기타 약제 모두에 의해 유발된 IM 환자보다 1차 EBV 감염으로 인한 IM 환자에서 EBV 특이적 세포독성 T 및 CD19+ B 세포의 비율이 낮고 CD8+ T 세포의 비율이 더 높다는 것을 발견했습니다8. B 세포는 EBV 수용체가 표면에 제시되기 때문에 IM에 먼저 관여합니다. Al Tabaa 등은 IM9 동안 B 세포가 다클론으로 활성화되고 분화된 원형질모세포(CD19+, CD27+ 및 CD20- 및 CD138- 세포) 및 형질 세포(CD19+, CD27+ 및 CD20- 및 CD138+)를 발견했습니다. 또한, Zhong et al. 단핵구 마커 CD14 및 CD64가 CAEBV에서 상향 조절된다는 것을 발견했으며, 이는 단핵구가 항체 의존성 세포 세포 독성 (ADCC) 및 과민성 식균 작용을 통해 CAEBV의 세포 면역 반응에 중요한 역할을 할 수 있음을 시사합니다7. ALKA 등은 IM 또는 HL 환자 4 명으로부터 분류 된 MACS CD56희미한 CD16 + NK 세포의 전사체를 특성화하고 IM 및 HL의 NK 세포가 선천성 면역 및 케모카인 신호 전달 유전자를 하향 조절하여 NK 세포의 저 반응성을 담당 할 수 있음을 발견했습니다10. 또한, 그리노 등은 IM을 가진 개인의 10개의 PBMC로부터 분류된 CD8+ T 세포의 유전자 발현을 분석하였다. 그들은 IM에서 CD8+ T 세포의 상당 부분이 바이러스 특이적이고, 활성화되고, 분열하고, 이펙터 활성을 발휘할 준비가 되어 있다고 보고했습니다11. T 세포 매개 EBV 특이적 반응과 NK 세포 매개 비특이적 반응은 모두 1차 EBV 감염 동안 필수적인 역할을 합니다. 그러나 이러한 연구는 다양한 면역 세포 혼합물 또는 림프구의 특정 하위 집단의 전사체 결과만을 조사했으며, 이는 동일한 질병 상태의 IM 소아에서 다른 면역 세포 하위 집단의 분자 특성 및 기능을 포괄적으로 비교하기에 충분하지 않습니다.
이 논문은 면역자기 비드와 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 결합하여 PBMC(단핵구, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, B 세포 및 NK 세포)의 정의된 면역 세포 하위 집단을 분리하고 분석하는 방법을 설명합니다. 이 방법을 사용하여, 자기 및 형광 표지된 세포를 자기 분리기 및 FACS를 사용하여 정제하거나 유세포분석에 의해 분석할 수 있다. RNA는 전사체 시퀀싱을 위해 정제된 세포로부터 추출될 수 있다. 이 방법은 IM 환자의 동일한 질병 상태에서 서로 다른 면역 세포의 특성화 및 유전자 발현을 가능하게 하여 EBV 감염의 면역병리학에 대한 이해를 넓힐 것입니다.

<table><tbody><tr><td>APC anti-human CD16</td><td>Biolegend</td><td>302012</td><td>형광 항체&nbsp;</td></tr><tr><td>APC anti-human CD56 (NCAM)</td><td>Biolegend</td><td>362504</td><td>형광 항체&nbsp;</td></tr><tr><td>APC/Cyanine7 항인간 CD4</td><td>Biolegend</td><td>344616</td><td>형광 항체&nbsp;</td></tr><tr><td>자동 세포 계수</td>기 <td>BIO RAD</td><td>TC20</td><td>세포 수</td></tr><tr><td>BD FACSAria 형광 활성화&nbsp; 흐름&nbsp; 세포&nbsp; sorter-cytometer (BD FACSAria II)</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>644832</td><td>Cell sort</td></tr><tr><td>CD14 MicroBeads, human</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-050-201</td><td>microbeads</td></tr><tr><td>Cell ctng slides</td><td>BIO RAD</td><td>1450016</td><td>Cell count</td></tr><tr><td>Centrifuge tubes</td><td>Falcon</td><td>35209715</td><td>15 mL centrifuge tube</td></tr><tr><td>EDTA (&ge; 99%, BioPremium)</td><td>Beyotime</td><td>ST1303</td><td>EDTA</td></tr><tr><td>에틸렌 디아민 테트라 아세트산(EDTA) 항응고제 튜브</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>&nbsp; 367862&nbsp;</td><td>EDTA 항응고제 튜브</td></tr><tr><td>FITC 항인간 CD19</td><td>Biolegend</td><td>302206</td><td>형광 항체&nbsp;</td></tr><tr><td>Gibco 태아 소 세럼</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16000-044</td><td>태아 소 세럼</td></tr><tr><td>&nbsp; 고속&nbsp; 원심분리기</td><td>시그마</td><td>&nbsp; </td><td>15 mL 원심분리 튜브용 3K15 세포 원심분리</td></tr><tr><td>&nbsp; 고속&nbsp; 원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td>세포 원심분리 1.5 mL Eppendorf (EP) 튜브</td></tr><tr><td>인간 림프구 분리 매체</td><td>Dakewe</td><td>DKW-KLSH-0100</td><td>Ficoll-Paque</td></tr><tr><td>LS&nbsp; 분리&nbsp; 칼럼</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>분리&nbsp; 컬럼</td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td>1.5 mL 마이크로 원심분리기</td></tr><tr><td>튜브 MidiMACS 분리기</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td>자기 비드 분리기</td></tr><tr><td>PE anti-human CD8</td><td>Biolegend</td><td>344706</td><td>형광 항체&nbsp;</td></tr><tr><td>PerCP/Cyanine5.5 항인간 CD3</td><td>Biolegend</td><td>344808</td><td>형광 항체&nbsp;</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>BI</td><td>02-024-1ACS</td><td>PBS</td></tr><tr><td>폴리스티렌 원형 바닥 튜브</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td>FACS 유세포 분석기용 5mL 튜브</td></tr><tr><td>TRIzol 시약</td><td>RNA 추출을 위한</td><td>Ambion</td><td>15596024</td> Lyse 세포</tr><tr><td>Trypan Blue 염색 세포 생존력 분석 키트</td><td>Beyotime</td><td>C0011</td><td>Trypan Blue 염색</td></tr></tbody></table>

감염성 단핵구증이 있는 어린이의 말초 혈액 샘플에서 면역 세포 하위 집단 분리

Separation of Immune Cell Subpopulations in Peripheral Blood Samples from Children with Infectious Mononucleosis

전염성 단핵구증(IM)은 주로 원발성 엡스타인-바 바이러스(EBV) 감염과 관련된 급성 증후군입니다. 주요 임상 증상으로는 불규칙한 발열, 림프절 병증 및 말초 혈액의 림프구 증가가 있습니다. IM의 병원성 메커니즘은 아직 명확하지 않습니다. 효과적인 치료 방법은 없으며 주로 증상 치료법을 사용할 수 있습니다. EBV 면역생물학의 주요 질문은 왜 감염된 개인의 소수만이 심각한 임상 증상을 보이고 심지어 EBV 관련 악성 종양이 발생하는 반면, 대부분의 개인은 바이러스에 감염된 평생 동안 무증상입니다.
B 세포는 EBV 수용체가 표면에 제시되기 때문에 IM에 먼저 관여합니다. 자연 살해(NK) 세포는 EBV 감염 세포를 죽이는 데 중요한 세포독성 선천 림프구입니다. 급성 EBV 감염 동안 CD4+ T 세포의 비율은 감소하는 반면 CD8+ T 세포의 비율은 극적으로 확장되며, CD8+ T 세포의 지속성은 IM의 평생 제어에 중요합니다. 이러한 면역 세포는 IM에서 중요한 역할을 하며 그 기능은 별도로 식별해야 합니다. 이러한 목적을 위해, 단핵구는 먼저 CD14 마이크로비드, 컬럼 및 자기 분리기를 사용하여 IM 개체의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 분리된다.
나머지 PBMC는 페리디닌-클로로필 단백질 (PerCP)/시아닌 5.5 항-CD3, 알로피코시아닌 (APC)/시아닌 7 항-CD4, 피코에리트린 (PE) 항-CD8, 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC) 항-CD19, APC 항-CD56 및 APC 항-CD16 항체로 염색되어 유동 세포계를 사용하여 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, B 세포 및 NK 세포를 분류합니다. 또한, 5 개의 하위 집단의 전사체 시퀀싱을 수행하여 IM에서 기능과 병원성 메커니즘을 탐색했습니다.

게이팅 전략의 참조 4개의 림프구 하위 집단을 분류하는 데 사용되는 게이팅 전략은 그림 1에 나와 있습니다. 간략하게, 림프구는 세분도 (SSC-A) 대 크기 (FSC-A)를 보여주는 점도표에서 선택됩니다 (P1). 그런 다음 크기(FSC-A) 대 전방 산란(FSC-H)을 보여주는 점도표에서 단일 셀(P2)을 선택하고 이중선 셀은 제외합니다. CD3+ T 세포(P3) 및 CD19+ B 세포(그림 1B)는 CD3 PerCP-Cy5.5-A 대 CD19 FITC-A를 보여주는 점도표에서 별도로 선택됩니다. CD8+ T 세포 및 CD4+ T 세포는 P3의 CD8 PE-A 대 CD4 APC-Cy7-A를 보여주는 점도표에서 별도로 선택됩니다. CD16+/CD56+ NK 세포는 P4의...

면역자기 비드와 형광 활성화 세포 분류를 결합하여 말초 혈액 단핵 세포(단핵구, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, B 세포 및 자연 살해 세포)의 정의된 면역 세포 하위 집단을 분리하고 분석하는 방법을 설명합니다. 이 방법을 사용하여 자기 및 형광 표지 된 세포를 정제하고 분석 할 수 있습니다.

Infectious mononucleosis (IM) is an acute syndrome mostly associated with primary Epstein&#8211;Barr virus (EBV) infection. The main clinical symptoms ...

이 방법은 IM 환자의 동일한 질병 상태에서 다른 면역 세포의 특성을 분석할 수 있게 하여 EBV 감염 메커니즘에 대한 이해를 넓힐 것입니다. 절차를 시연하는 것은 우리 실험실의 의사 인 Linlin Zhang이 될 것입니다. 시작하려면 1.5밀리리터 미세 원심분리 튜브에서 이전에 분리된 PBMC를 취하고 실온에서 300분 동안 10G에서 회전시킵니다.상청액을 버리고, 제조된 완충액 80 마이크로리터로 세포를 재현탁시킨다. 다음으로, 20 마이크로리터의 CD 14 마이크로비드를 세포 현탁액에 첨가하고, 피펫팅에 의해 잘 혼합하고, 튜브를 얼음 상에서 15분 동안 인큐베이션한다. 그런 다음 1 밀리리터의 완충액을 사용하여 PBMC를 세척하고 실온에서 10 분 동안 300G에서 원심 분리합니다.전체 상청액을 버리고, 세포를 500 마이크로리터의 완충액으로 재현탁시킨다. 자기 분리의 경우 마그네틱 비드 분리기에 컬럼을 놓고 3밀리리터의 버퍼로 세척하여 컬럼을 프라이밍합니다. 다음으로, 세포 현탁액을 컬럼에 추가합니다.통과시키고 표지되지 않은 세포를 15 밀리리터 원심 분리 튜브에 모으십시오. 3 밀리리터의 완충액으로 컬럼을 3 번 세척하고 15 밀리리터 원심 분리 튜브에 전체 유출 물을 수집합니다. 이제 컬럼을 새 15밀리리터 원심분리 튜브에 넣고 컬럼에 5밀리리터의 버퍼를 추가합니다.플런저를 컬럼에 단단히 밀어 넣어 자기적으로 표지된 셀을 튜브로 플러시합니다. 자기적으로 표지된 셀을 300G에서 5분 동안 원심분리합니다. 상청액을 제거한 후, 세포를 500 마이크로리터의 PBS에 재현탁시키고, 후속 전사체 시퀀싱을 위해 세포 현탁액을 1.5 밀리리터 마이크로원심분리 튜브로 옮긴다.수집된 표지되지 않은 세포를 300 G에서 5분 동안 원심분리하여 펠렛하고, 세포를 1.5 밀리리터 마이크로원심분리 튜브에 100 마이크로리터의 PBS에 재현탁시킨다. 이어서, 2 마이크로리터의 각각의 표지된 항체를 세포 현탁액에 첨가하고, 빛으로부터 보호하면서 30분 동안 얼음 상에서 인큐베이션한다. 다음에, PBMC 세포 현탁액을 1.5 밀리리터 마이크로원심분리 튜브에 분취하여 음성 대조군 샘플 CD3, CD4, CD8, 및 CD19, 단일 염색 샘플, 및 CD 56, 또는 CD16 염색 샘플을 설정하였다.그런 다음 각 튜브에 상응하는 형광 표지 항체 2 마이크로 리터를 추가하고 빛으로부터 보호하면서 얼음 위에서 30 분 동안 배양합니다. 배양 후, 이전에 입증된 바와 같이 PBS로 모든 세포를 세척하고, 500 마이크로리터의 PBS에 재현탁시킨다. 셀 분류 시스템을 열고 전원 켜기 프로그램을 실행합니다.그런 다음 85마이크로미터 노즐을 설치하고 분류 스트림을 엽니다. 정렬 전압을 4, 500V로 설정하고 주파수를 47로 설정합니다. 브레이크 오프 창에서 간격을 8로 설정하고 스위트 스폿 자동 정렬 모드를 켜서 액적 진폭 값을 자동으로 결정합니다.마지막으로 사이드 스트림 창에서 액적 지연을 30.31로 조정합니다. 순방향 대 측면 산점도를 사용하여 다각형 게이트 P1을 그려 온전한 림프구 집단을 식별합니다. 다음으로, 전방 산점도 영역 대 높이 점도를 사용하여 다각형 게이트 P2를 그려 단일 셀을 식별하고 이중선을 제외합니다.그런 다음 CPCY 5.5 영역 도트 플롯 당 CD 19 FITC 영역 대 CD 3을 사용하여 직사각형 게이트 P3을 그려 CD 3 양성 T 세포 및 CD 19 양성 B 세포를 선택합니다. 다음으로, CD 4 APCCY 7 영역 대 CD 8 PE 영역 점도표를 사용하여 직사각형 게이트를 그려 CD 4 및 CD 8 양성 T 셀을 선택합니다. 마지막으로, 측면 산란 영역 대 CD 56 또는 CD 16 APC 영역 점도를 사용하여 직사각형 게이트를 그려 CD 56 또는 CD 16 양성 자연 살해 세포를 선택합니다.음성 컨트롤 튜브의 경우 획득 대시보드에서 로드를 클릭하고 소프트웨어에서 세포분석기 설정을 선택합니다. 인스펙터 창에서 파라미터 탭을 클릭하고 순방향 산란, 측면 산란 및 다양한 형광 염료의 전압을 조정합니다. 단일 염색 튜브를 세포분석기에 로드한 후 획득 대시보드에서 로드를 클릭한 다음 보정 탭을 클릭하여 텍스트에 설명된 대로 보정을 조정합니다.튜브를 세포 분석기에 넣기 전에 세포 현탁액을 부드럽게 소용돌이하십시오. 4개의 수집 흐름 튜브에 200마이크로리터의 FBS를 추가하고 튜브를 소용돌이합니다. 세포 분석기 수집 챔버에 넣으십시오.4개의 플로우 튜브에서 다양한 유형의 셀을 개별적으로 수집합니다. 분리된 세포를 300G에서 5분 동안 스핀다운하고 전사체 시퀀싱을 위해 200마이크로리터의 RNA 분리 시약을 세포 팔레트에 추가합니다. 본 연구에서, 상이한 샘플의 말초 혈액으로부터의 면역 세포 서브 집단은 면역 자기 비드 및 형광 활성화 세포 분류의 기술을 결합하여 효율적으로 분류되었다.중요하게도 이 프로토콜에서 세포 분류 단계는 세포 생존율을 개선하도록 최적화되었습니다. 분류 된 면역 세포는 건강한 Epstein-Barr 바이러스 운반체 및 감염되지 않은 샘플 모두에 비해 감염성 단핵구증 환자에서 CD 3, CD 8 양성 T 세포의 비율이 증가한 것으로 나타났습니다. 대조적으로, 건강한 EBV 보균자 및 EBV에 감염되지 않은 소아에 비해 감염성 단핵구증 환자에서 CD 3, CD 4 양성 T 세포 및 CD 19 양성 B 세포의 비율 감소가 관찰되었습니다.또한, 감염성 단핵구증 환자에서 감염되지 않은 EBV 소아에 비해 CD 56 또는 CD 16 양성 자연 살해 세포의 비율이 감소하는 것이 관찰되었습니다. 세포 생존력을 유지하는 것은 후속 실험에 필수적입니다. 분류 과정에서 세포를 얼음이나 냉장고에 보관하면 세포 생존에 도움이됩니다.

separation-immune-cell-subpopulations-peripheral-blood-samples-from

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

Neutrophils은 염증성 면역 반응의 사이트에 도착을 가장 먼저 세포 사이에하며, 그들의 기능과 메커니즘은 체외에서 광범위하게 연구되고있다. 우리는 상용 분리 미디어를 사용 전체 혈액에서 인간 neutrophils을 분리하기위한 기준 밀도 기울기 분리 방법을 보여줍니다.

호중구 격리 프로토콜

이 비디오에서는 면역자기 음성 분리를 통해 전인의 혈액에서 단핵구를 분리하는 방법을 보여줍니다. 분리된 단핵구는 추가 다운스트림 분석에 사용할 수 있습니다.

면역자기 음성 선택에 의한 전혈에서 단핵구의 분리

이 비디오에서는 밀도 구배 원심분리를 통해 인간 버피 코트에서 단핵구와 림프구를 포함하는 말초 혈액 단핵 세포(PBMCs)를 분리하는 방법을 보여줍니다. 분리된 PBMC는 추가 분석에 사용할 수 있습니다.

Isolation of Peripheral Blood Mononuclear Cells from Human Buffy Coats

이 동영상은 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 CD4+ 및 CD8+ T 세포, γδ T 세포, B 세포, 자연 살해(NK) 세포 및 단핵구를 식별하기 위해 두 개의 형광 색소를 사용하는 유세포 분석 기반 기술을 보여줍니다. 표면 마커에 대해 형광 색소 접합 항체로 세포를 배양하면 최적의 유세포 분석 게이팅 전략을 사용하여 세포 subset을 식별할 수 있습니다.

말초 혈액 단핵 세포에서 면역 세포 subset을 식별하기 위한 유세포 분석 분석

여기 탯줄 혈액에서 전구체의 하위 집합 B-세포를 분리에 대한 프로토콜을 설명합니다. 핵산의 충분한 수량과 품질은 세포에서 추출되어 DNA 또는 RNA를 이용 후속 assays에 사용 될 수 있습니다.

탯줄 혈액에서 전구체 B-세포 하위 집합의 절연

구개 편도선은 B와 T 림프구의 풍부한 공급원입니다. 여기에서는 인간 구개 편도선에서 B 림프구와 T 림프구를 분리하기 위한 쉽고 효율적이며 빠른 프로토콜을 제공합니다. 설명된 방법은 편도선염으로 알려진 편도선 염증의 바이러스 병인학 연구에 특별히 적용되었습니다.

인간 팔라티노 편도선에서 B와 T 림프구에 대한 효율적인 분리 프로토콜

인간의 말초 혈액은 일반적으로 체액성 면역 반응의 평가에 사용됩니다. 여기에서는 말초 혈액에서 인간 B 세포를 분리하고, 배양에서 인간 B 세포를 항체(Ab) 분비 B 세포(ASC)로 분화하고, ELISpot 분석을 통해 총 IgM- 및 IgG-ASC를 열거하는 방법에 대해 설명합니다.

분리는 차별화 및 정량화 인간의 혈액에서 B 세포를 항체가 분비 : ELISPOT을 체액 면역의 기능 판독으로

여기, 선물이 CD4를 식별 하는 흐름 cytometric 프로토콜+ 와 CD8+ T 세포, γ T 세포, B 세포, NK 세포와 7 대신만 두 형광을 사용 하 여 인간의 말 초 혈액에 monocytes. 이 방법을 5 추가 마커 대부분 교류 cytometers에 기록할 수 있습니다.

2 형광 색소에 의해 7 개의 면역 세포 하위 집합의 차별 Cytometry 흐름

우리는 세자리 증후군으로 진단 된 환자로부터 얻은 전혈에서 말초 혈액 단핵 세포를 분리하기위한 간단한 프로토콜을 제시하고, CD4 + T 세포의 선택, phorbol12-myristate13-acetate 및 A23187 ionophore로 자극, 전사 프로파일 링을위한 RNA 준비.

전사 프로파일링을 위해 세자리 증후군 환자로부터 인간 말초 혈액 단핵 세포 및 CD4+ T 세포 분리

이 프로토콜은 바이오뱅킹 및 기타 목적을 위해 인간 말초 혈액 단핵 세포를 분리하는 고처리량 자동화 호환 방법에 대해 자세히 설명합니다.

High Throughput Immunomagnetic Bead Separation을 통해 Buffy Coats에서 인간 말초 혈액 단핵 세포 분리

이 프로토콜은 신생아 및 소아 환자의 혈액 샘플을 수집하고 보존하며, scRNA-seq, 단백질체학, 스펙트럼 유세포 분석을 적용하여 이 샘플에서 면역 세포 집단을 특성화하는 방법을 설명합니다.

최소 입력으로 영아 면역 지도화: 통합 단세포 및 다종체 프로파일링

학습하세요 감염성 단핵구증 어린이의 말초 혈액에서 면역 자기 구슬과 형광 활성화 세포 분류를 이용한 면역 세포 하위 집단 분리 방법. 이 기법은 EBV 감염 메커니즘 연구와 면역 반응 분석에 활용됩니다.

감염성 단핵구증이 있는 어린이의 말초 혈액 샘플에서 면역 세포 하위 집단 분리

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