Name: 암세포의 내경동맥 주입에 의한 뇌전이 모델링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: 학습하세요 내경동맥 주입법을 이용한 뇌전이 마우스 모델 구축 방법을. 최소한의 전신 종양으로 재현성 높은 뇌내 종양을 형성하여 약물 분포와 치료 반응을 객관적으로 분석할 수 있습니다.

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이 연구는 호주 국립 보건 및 의학 연구위원회 (NHMRC), 보조금 번호 APP1162560의 자금 지원을 받았습니다. ML은 UQ 대학원 연구 장학금으로 자금을 지원받았습니다. 축산과 동물의 생체 내 이미징을 도와 주신 모든 분들께 감사드립니다. 이 연구를 위해 지르코늄 분취량을 기증해 주신 Royal Brisbane and Women's Hospital에 감사드립니다.

모든 연구는 퀸즐랜드 대학교 동물 윤리위원회 (UQCCR / 186 / 19)의 지침과 과학 목적을위한 동물 관리 및 사용에 대한 호주 코드에 따라 수행되었습니다.
1. 주사용 암세포의 제조
참고: 이 연구에서는 인간 유방암 세포주인 BT-474(BT474)를 사용했습니다. BT474는 10% 소 태아 혈청 및 1% 인슐린이 보충된 RPMI 1640 배지를 포함하는 완전 성장 배지에서 배양하였다. 세포를 공기 분위기에서 5% 이산화탄소로 37°C의 배양기에서 유지하였다. 위성 탠덤 반복 시험35에 의해 세포주를 인증하고, 리포터 단백질(예를 들어, 루시페라아제)이 있는 경우 발현을 확인하고, 마이코플라즈마 감염을 확인한다.
<ol><li>2.0 x 10의 파종 밀도에서 BT474 암세포를6 세포를 T75 플라스크에 넣고 10mL의 완전한 성장 배지를 사용하여 배양 (37 ° C에서 5 % CO2)을 주입하기 전에 70 % -80 % confluency로 시드합니다.</li>
	<li>주사 당일에, 성장 배지를 버리고 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포 단층을 2회 세척한다.</li>
	<li>예열된 세포 배양 해리 시약 5mL( 재료 표 참조)를 추가하고 37°C에서 5분 동안 또는 세포가 분리될 때까지 배양합니다. 5분 후 플라스크를 부드럽게 두드려 세포 분리를 돕습니다.</li>
	<li>해리 시약 활성을 소멸시키기 위해 10% 태아 소 혈청을 포함하는 완전 성장 배지 5mL를 추가합니다.</li>
	<li>세포 덩어리를 줄이기 위해 피펫팅으로 세포를 부드럽게 재현탁시킵니다.</li>
	<li>세포 현탁액을 50mL 튜브로 옮기고 실온에서 3분 동안 180 x g 로 원심분리합니다.</li>
	<li>상청액을 따라 내고 세포 응집을 최소화하기 위해 칼슘과 마그네슘이 없는 Hank's Balanced Salt Solution(HBSS) 10mL에 세포 펠릿을 재현탁합니다.</li>
	<li>세포 현탁액을 실온에서 3분 동안 180 x g 로 원심분리합니다.</li>
	<li>상청액을 디캔트하여 잔류 혈청/해리 시약을 제거하고 세포 펠릿을 HBSS 3mL에 재현탁합니다.</li>
	<li>새로운 50mL 원뿔형 튜브에 100μm 세포 여과기를 놓고 세포 현탁액을 통과시켜 세포 덩어리를 제거합니다. 참고: 단일 세포 현탁액은 혈관 폐색과 주사 시 뇌졸중 위험을 최소화하는 데 필수적입니다.</li>
	<li>Trypan Blue 배제 및 표준 방법으로 혈구 측정기를 사용하여 생존 가능한 세포 수를 계산하십시오.</li>
	<li>HBSS로 세포 현탁액을 2.5 x 106 cells/mL의 세포 농도로 희석합니다.</li>
	<li>튜브를 얼음 위에서 수평으로 유지하고 튜브를 주기적으로 부드럽게 흔들어 덩어리를 최소화하십시오. 세포 현탁액은 최대 6시간 동안 얼음에 보관할 수 있습니다. 알림: 흔들기는 수동으로 수행되었지만 낮은 rpm에서 셰이커를 사용하여 수행 할 수도 있습니다.</li>
</ol>2. 절차를위한 마우스 준비
참고: 이 연구에서, 4-5주령의 암컷 NOD scid 마우스를 사용하였다. 시술 3일 전에 쥐에게 소프트 다이어트 회복 식품(예: 다이어트 젤, 하이드로겔, 으깬 마우스 차우)을 도입하여 시술 후 수유를 장려합니다.
<ol><li>오토클레이브 수술 도구. 수술 부위와 장비를 표면 소독제로 스프레이하고 닦은 다음 70 % 에탄올을 뿌립니다.</li>
	<li>저체온증을 예방하기 위해 수술 보드 아래에 동물 열 매트를 놓습니다. 수술 30 분 전에 이것을 켜십시오. 표면 소독제와 70 % 에탄올로 수술 보드를 스프레이하고 닦습니다.</li>
	<li>회복을 위해 깨끗한 동물 케이지와 따뜻한 가열 패드를 준비하십시오.</li>
	<li>깨끗한 개인 보호 장비 (가운, 마스크, 헤어 넷 및 장갑)를 착용하십시오. 깨끗한 검사 장갑과 '기기 팁 전용'기술을 사용하여 절차 전반에 걸쳐 무균 상태를 유지하십시오.</li>
	<li>마우스가 페달 반사를 잃을 때까지 산소 흐름이 2L/min인 5% 이소플루란을 사용하여 마취실로 마우스를 마취합니다.</li>
	<li>동물을 챔버에서 꺼내 나머지 수술 절차를 위해 2L/min의 산소 흐름으로 2% 이소플루란을 전달하는 노즈 콘에 넣습니다.</li>
	<li>식별을 위한 귀 펀치 마우스와 전기 클리퍼를 사용하여 목 부위의 모피를 면도합니다. 테이프를 사용하여 노출 된 피부에서 과도한 모발을 청소하십시오.</li>
	<li>필요한 마취제 및 진통제 용량을 계산하기 위해 마우스의 무게를 측정합니다. 부 프레 노르 핀과 멜 록시 캄을 각각 50 μg / kg 및 1 mg / kg으로 피하 주사를 통해 투여하십시오.</li>
	<li>마우스를 따뜻한 수술판으로 옮기고 테이프로 코 콘을 고정합니다.</li>
	<li>건조를 방지하기 위해 눈에 안구 윤활제를 바르십시오.</li>
	<li>먼저 수술 보드에 테이프로 붙인 실을 사용하여 앞니 위쪽 치아를 걸고 앞다리와 뒷다리를 테이프로 감아 마우스를 부드럽게 고정합니다. 이 단계는 몸을 확장하고 절차 중에 목을 똑바로 유지합니다.</li>
	<li>아래 설명에 따라 수술 전 피부 준비를 수행하십시오.<ol><li>국소 방부제 (포비돈 요오드)로 목을 닦아 피부 미생물 부하를 줄이고 느슨한 머리카락을 제거하십시오. 절개 부위의 재 오염을 방지하기 위해 바깥쪽으로 작업하면서 피부 중앙에서 청소하십시오. 70 % 에탄올을 사용하여 과정을 반복하십시오. 소독을 위해 요오드와 에탄올을 세 번 교대로 수행하십시오.</li>
		<li>동물 위에 수술 용 드레이프를 놓습니다. 이것은 멸균 종이 타월 또는 오토클레이브 백으로 자르고 만듭니다.</li>
	</ol></li>
	<li>수술 도구 용 멸균 종이 타월 또는 오토 클레이브 백을 배치하십시오.</li>
	<li>시술을 계속하기 전에 충분한 마취를 보장하기 위해 '핀치 테스트'를 통해 반사를 확인하십시오.</li>
</ol>3. 경동맥 내 주사
알림: 이 실험에서는 주입 절차를 용이하게 하기 위해 31G 주입 캐뉼러 및 발 활성화 주사기 드라이버 설정을 사용했습니다(보충 그림 1). 이 설정은 선택 사항이며 사용자는 31G 인슐린 주사기를 사용하고 3.11 및 3.12 단계를 건너 뛸 수 있습니다. 주입 캐뉼라를 준비하려면 두 쌍의 봉합사 클램프를 사용하여 31G 바늘의 주사기 피팅 부분에서 바늘 부분을 당겨 분리합니다. 다음으로, 바늘 부분을 약 10cm 길이의 미세 주입 튜브의 한쪽 끝에 부착합니다.
<ol><li>해부 현미경을 마우스 위에 놓습니다.</li>
	<li>가위를 사용하여 턱 아래 15mm에서 시작하여 흉부 입구까지 목 부위의 정중선을 따라 수직 5mm 절개를합니다.</li>
	<li>두 쌍의 각진 집게를 사용하여 피부와 밑에있는 타액선을 분리하고 견인기를 적용하여 기관이 노출 된 상태로 유지합니다. 다음 단계는 기관과 평행 한 경동맥 덮개를 노출시킵니다.</li>
	<li>두 쌍의 미세한 각도의 집게를 사용하여 기관에 인접한 근육과 지방 조직을 무뚝뚝하게 해부하여 오른쪽 경동맥 덮개를 노출시킵니다. 경동맥은 총 경동맥, 정맥 및 미주 신경을 덮고있는 섬유질 층이며,이 번들은 밝은 빨간색 총 경동맥으로 시각화 할 수 있습니다. 이 연구에서는 오른쪽 경동맥에 주사를 수행했습니다.</li>
	<li>주변 근막의 경동맥 분기점까지 총 경동맥 꼬리의 일부를 제거하고 미주 신경 및 정맥에서 분리하십시오.</li>
	<li>경동맥 분기점 (외부 및 내부 경동맥을 연결하는 접합부)을 주변 신경과 근막에서 분리하고 제거하십시오. 외부 경동맥 아래에 미세한 집게를 놓고 동맥 아래에 실크 봉합사 (5-0 두께)를 통과시킵니다. 매듭을 짓고 봉합사를 조이고 여분의 선을 자릅니다. 참고: 이 합자(L1)는 주사제가 외부 경동맥을 통해 통과하는 것을 방지합니다.</li>
	<li>총 경동맥 아래에 미세한 집게를 놓고 동맥 아래에 실크 봉합사 (5-0 두께)를 통과시킵니다. 매듭을 묶고 제안 된 주사 부위 근처의 위치에서 봉합사를 조입니다. 약 10mm의 선을 남기고 여분의 봉합사를 자릅니다. 알림: 이 두 번째 합자(L2)는 주사 후 혈류와 출혈을 제한합니다. 또한 주사하는 동안 경동맥을 배치하고 유지하는 데 사용됩니다.</li>
	<li>보푸라기가 적은 일회용 와이퍼 (재료 표 참조) 스트립을 약 10mm x 5mm 정도 자르고 적 십니다. 스트립을 4mm x 5mm, 두께 2-3mm로 접고 제안 된 주사 부위의 경동맥 아래에 놓습니다. 이것은 주사하는 동안 혈관을지지합니다.</li>
	<li>제안 된 주사 부위의 총 경동맥 주둥이에 느슨한 매듭이있는 세 번째 결찰 (L3)을 놓습니다. 이것은 주입 후에 만 조여집니다 (3.16 단계에서).</li>
	<li>세포 현탁액을 부드럽게 교반하고 200μL의 세포 현탁액을 인슐린 주사기(31G 바늘 포함)에 넣습니다.</li>
	<li>활성화 풋 페달에 연결된 주사기 드라이버에 주사기를 넣습니다.</li>
	<li>31G 바늘이 있는 가는 캐뉼러를 주사기에 부착하고 라인을 프라이밍합니다.</li>
	<li>경동맥이 잘 배치되고 가압되어 있는지 확인하십시오.</li>
	<li>두 개의 가는 각도의 집게를 사용하여 하나는 첫 번째 합자의 끝에 부드럽게 장력을 가하고 다른 하나는 31G 바늘을 잡고 베벨이 있는 바늘을 혈관의 내강에 천천히 삽입하여 구멍을 뚫지 않도록 주의합니다.</li>
	<li>100μL의 세포 현탁액(1.13단계에서)을 10μL/s의 속도로 총경동맥에 천천히 주입합니다. 이것은 2.5 x 105 세포를 혈관으로 전달합니다. 성공적인 주사는 경동맥 혈관 에서 혈액을 제거하여 시각화됩니다.</li>
	<li>역류 및 출혈을 방지하기 위해 바늘을 뺀 직후 느슨한 합자 (L3) (3.9 단계에서)를 부드럽게 들어 올리고 조입니다. 과도한 봉합사를 다듬습니다. 알림: 바늘을 뺀 후 소량의 혈액이 분출되는 것을 관찰하는 것은 정상입니다. 그러나 세 번째 합자를 조인 후 활성 출혈이 없어야합니다.</li>
	<li>축축한 보푸라기가 적은 일회용 와이퍼 조각을 제거하십시오.</li>
	<li>P200 피펫을 사용하여 150-200 μL의 멸균수 또는 식염수로 수술실을 두 번 헹굽니다.</li>
	<li>출혈이 있는지 다시 확인한 다음 견인기를 제거하십시오.</li>
	<li>연조직, 타액선 및 피부를 경동맥과 기관 위에 재배치하십시오.</li>
	<li>봉합사 바늘 홀더, 겸자 및 흡수성 또는 비흡수성 6/0 모노필라멘트 봉합사를 연속 패턴으로 사용하여 절개 부위의 피부층을 닫습니다.</li>
	<li>캐뉼러 바늘 주사기를 버리고 다음 마우스를 위한 새 설정을 준비합니다. 새 주사기를 사용하면 각 마우스에 주입되는 세포의 수가 일정하게 유지됩니다. 참고: 절차의 대표적인 스냅샷은 보충 그림 2에 있습니다. 주사제 누출 또는 출혈로 표시된 바늘에 의해 혈관이 뚫리거나 찢어지면 절차가 실패한 것으로 간주됩니다. 그런 다음 바늘을 빼내고 세 번째 합자를 즉시 조여 출혈을 방지해야합니다. 봉합사를 조인 후에도 출혈이 지속되면 동물을 펜토 바르비탈로 안락사시켜야합니다.</li>
</ol>4. 주입 후 회복
<ol><li>수술 후 통증 완화로 부프레노르핀(50μg/kg)과 멜록시캄(1mg/kg)을 피하 주사를 통해 주사합니다.</li>
	<li>마취에서 회복하기 위해 동물을 따뜻하고 깨끗한 새장으로 옮기십시오. 동물이 깨어 난 후 활동이 억제되는 것은 정상입니다 (웅크 리고 활동하지 않거나 천천히 움직이는).</li>
	<li>30-45 분 후, 마우스를 장기 보유 시설로 옮깁니다.</li>
	<li>수술 후 적어도 일주일 동안 마우스에게 부드러운식이 요법 (다이어트 젤, 하이드로 겔, 매쉬)을 제공하고 뇌졸중, 감염, 상처 부위 주변의 출혈 징후에 특별한주의를 기울여 매일 신체 상태를 확인하십시오.</li>
	<li>수술 2 일 후, 동물은 활동이 감소하고 가벼운 주름진 모피가 있으며 수술 전 체중의 15 %가 감소하는 것이 일반적입니다. 통증 관리 및 회복을 돕기 위해 수술 후 2-3일 동안 매일 진통제(멜록시캄)를 투여합니다.</li>
	<li>3일째부터 동물은 활동을 회복하고 수유 및 몸단장 빈도를 늘리고 체중을 회복해야 합니다. 복강 주사를 통해 200mg/kg의 펜토바르비탈 나트륨을 주사하여 수술 후 4일 후에 신체 상태 결손(통증, 옹기종기종기, 비활성, 체중 감소)이 지속되는 동물을 안락사시킵니다.</li>
	<li>종양 생착 및 진행은 마취 및 생체 발광 영상, MRI 또는 PET/MRI와 같은 선택된 영상 양식을 사용하여 모니터링할 수 있습니다. 이러한 이미징을 수행하기 위한 요구 사항과 능력은 본질적으로 개별 프로젝트 목표 및 수행 시설에 따라 달라지며, 사용되는 세포주의 리포터 태그 유형, 관련 방사화학 및 핵 이미징 시설의 접근성36,37 알림: 일부 동물은 성공적인 시술에도 불구하고 잘 반응하지 않고 뇌졸중을 경험할 수 있습니다. 시술 후, 신경 학적 고통 (머리를 돌리고 한쪽으로 당기고, 행동을 돌고, 구르고, 때리고, 운동 기능 상실)의 증상을 나타내는 동물은 즉시 안락사해야합니다.</li>
</ol>

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다. 자금 제공자는 연구 설계에 아무런 역할도 하지 않았습니다. 데이터의 수집, 분석 또는 해석; 원고 작성 또는 논문 출판 결정.

뇌 전이는 암세포가 원발성 부위에서 뇌로 퍼지는 복잡한 과정입니다. 이 다단계 과정의 특정 단계를 반영하는 다양한 동물 모델을 사용할 수 있으며 전임상 전이 연구41,42를 설계하는 데 생리적, 실제적 고려 사항이 있습니다. 뇌 전이 치료를위한 나노 의학의 사용을 조사하는 대부분의 발표 된 연구는 심장 내43,44 및 두개 내 45,46,47,48,49 모델을 사용했습니다. 경동맥을 통해 암세포를 이식하면 전이 과정과...

뇌 전이는 매우 나쁜 예후와 관련된 널리 퍼진 악성 종양입니다 1,2. 뇌 전이 환자의 표준 치료는 환자의 일반적인 건강 상태, 두개외 질환 부담, 뇌 종양의 수와 위치에 따라 신경외과,전뇌 방사선 요법 및/또는 정위 방사선 수술로 구성된 다중 모드입니다3,4. 최대 3개의 두개내 병변이 있는 환자는 외과적 절제 또는 정위 방사선 수술을 받을 수 있으며, 다발성 병변이 있는 환자는 수술 관련 감염 및 부종의 위험을 피하기 위해 전뇌 방사선 요법을권장합니다5. 그러나 전뇌 방사선 치료는 방사능에 민감한 뇌 구조에 손상을 주어 삶의 질을 저하시킬 수 있습니다6.
전신 요법은 다발성 병변 환자를 치료하기 위한 비침습적 대안적이고 논리적인 접근법이다7. 그러나 혈류를 통한 세포 독성 약물의 수동 전달은 안전하지 않은 독성의 위험 없이는 뇌에서 치료 수준을 달성 할 수 없기 때문에 전신 요법이 효능이 좋지 않다는 오랜 개념으로 인해 덜 고려됩니다8. 이 패러다임은 최근 미국 식품의약국(FDA)이 승인한 전신 요법(전이성 HER2+ 유방암 뇌 전이에 대해 트라스투주맙 및 카페시타빈을 사용한 투카티닙)9,10,11,12 및 뇌 전이 환자에 대한 전신 요법 옵션 고려를 포함하는 치료 지침의 업데이트로 변화하기 시작했습니다13,14.
이러한 맥락에서, 분자 표적 요법, 면역 요법 및 표적 나노-약물 운반체와 같은 대체 약물 전달 시스템 분야의 개발은 잠재적으로 뇌 전이 치료15,16,17,18의 도전을 극복할 수 있다. 또한 뇌종양 장벽의 투과화를 통해 약물 전달을 개선하기위한 화학적 및 기계적 접근법도 조사되고 있습니다19,20. 이러한 접근법을 목적에 맞게 연구하고 최적화하려면 뇌 전이의 복잡한 생리학을 반영할 뿐만 아니라 두개내 약물 반응의 객관적인 분석을 허용하는 전임상 모델을 사용하는 것이 중요합니다.
대체로, 생체 내에서 뇌 전이를 모델링하기 위한 현재의 접근법은 마우스에서 암세포의 심장내(좌심실), 정맥내(일반적으로 꼬리 정맥), 두개내 또는 경동맥내(총경동맥) 주사를 포함합니다 21,22,23,24,25,26,27 . 종양 생착 전략 외에도, 종양 억제 유전자의 제거 또는 종양 유전자의 활성화에 의해 종양 형성이 촉발되는 유전자 조작 마우스 모델은 종양 모델링에 유용하다. 그러나 유전자 조작 마우스 모델은 소수에 불과하여 이차 종양을 생성하는 것으로 보고되었으며 뇌 전이를 안정적으로 생성하는 모델은 훨씬 적습니다28,29,30.
심장 내 (좌심실) 및 정맥 주사 (보통 꼬리 정맥) 주사와 같은 생착 방법은 암의 전신 전파를 모방합니다. 이러한 모델은 일반적으로 순환기 '첫 번째 통과'31 동안 대부분의 종양 세포를 가두는 모세 혈관에 따라 여러 장기 (예 : 뇌, 폐, 간, 신장, 비장)에 병변을 생성합니다. 그러나 뇌 생착의 일관되지 않은 속도는 원하는 통계적 검정력에 대한 샘플 크기를 달성하기 위해 더 많은 동물을 필요로합니다. 이러한 심장 내 및 정맥 주사 방법을 통해 결국 뇌에 확립되는 종양 세포의 수는 다양합니다. 따라서 뇌 전이 종양 부담은 동물마다 다를 수 있으며 진행의 차이로 인해 실험 일정을 표준화하고 결과를 해석하는 것이 어려울 수 있습니다. 두개외 종양 부담은 비뇌 전이 사망률로 이어질 수 있으며, 이러한 모델은 두개내 효능을 평가하는 데 적합하지 않습니다. 뇌-트로픽 세포주는 두개외 확립을 감소시키기 위해 인공 클론 선택 과정을 사용하여 확립되었지만, 복용률은 일관되지 않았고, 클론 선택 과정은 인간 종양에서 정상적으로 발견되는 이질성을 감소시킬 수 있다(32).
두개내 및 경동맥 내 주사와 같은 뇌 특이적 생착 방법은 보다 일관되고 효율적인 뇌 전이 모델링을 가능하게 합니다. 두개내 방법(33)에서, 암세포는 전형적으로 전두대뇌 피질 내로 주입되며, 이는 낮은 전신 침범으로 빠르고 재현가능한 종양 성장을 생성한다. 이 절차는 낮은 사망률로 잘 견디지만33, 주의할 점은 뇌에 (국소화된) 세포 덩어리를 빠르게 도입하고 초기 뇌 전이 병인을 모델링하지 않는 비교적 조잡한 접근 방식이라는 것입니다. 바늘은 뇌 조직 혈관을 손상시켜 국소 염증 5,34를 유발합니다. 경험에 비추어 볼 때, 바늘을 제거하는 동안 종양 세포 주사가 역류하는 경향이 있으며, 이는 렙토메닌 침범으로 이어집니다. 대안적으로, 경동맥 내 방법은 뇌 미세 혈관계를 갖는 세포를 총 경동맥으로 전달하여 순환, 혈관 외 유출 및 식민지화24에서의 생존을 모델링한다. 다른사람들과 일치 25,이 방법에 대한 우리의 경험은 외부 경동맥을 통해 이러한 조직의 모세 혈관으로 암세포를 의도하지 않게 전달하여 안면 종양을 유발할 수 있음을 발견했습니다 (미공개 데이터). 일반적인 경동맥 주사 전에 먼저 외부 경동맥을 결찰함으로써 안면 종양을 예방할 수 있습니다 (그림 1). 기사의 나머지 부분에서는이 방법을 '내 경동맥 주사'라고합니다. 경험을 통해 내경동맥 주사 방법은 전신적 사건이 거의 없는 뇌 전이를 지속적으로 생성하며 다양한 원발성 암(예: 흑색종, 유방암 및 폐암)의 뇌 전이 모델을 생성하는 데 성공했습니다(그림 1). 단점은 기술적으로 까다롭고 시간이 많이 걸리고 침습적이며 세포 수와 모니터링 일정을 신중하게 최적화해야 한다는 것입니다. 요약하면, 두개내 및 내경동맥 주사 방법 모두는 뇌종양 관련 생존 이점에 대한 치료 효과를 평가하기에 적합한 마우스 모델을 생성한다.
이 프로토콜은 내 경동맥 주사 방법을 설명하여 전신 침범이 거의없는 뇌 전이의 마우스 모델을 생성하므로 약물 분포 및 실험 치료제의 효능에 대한 전임상 평가에 적합합니다.
<img alt="경동맥 주사 설정을 사용한 마우스 뇌암 전이 모델 다이어그램; 조직학적 결과." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64216/64216fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 그림 1: 뇌 전이를 위한 내경동맥 주입 프로토콜의 개략적인 표현. 외부 경동맥 결찰을 통한 내 경동맥 주사는 다양한 원발성 암으로부터 뇌 전이 모델을 신뢰성있게 생성 할 수있다. 이 프로토콜에서는 3 개의 합자가 경동맥에 배치됩니다 (그림에서 L1-L3으로 주석이 달림). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64216/64216fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>100&마이크로; m 세포 여과기</td><td>Corning</td><td>CLS431752</td><td></td></tr><tr><td>30G Microlance needle</td><td>BD</td><td>23748</td><td></td></tr><tr><td>31G Ultra-Fine II 인슐린 주사기</td><td>BD</td><td>326103</td><td></td></tr><tr><td>각도 겸</td>자 <td>Proscitech</td><td>T67A-SS</td><td>미세 뾰족하고 톱니가 없는 각도, 18mm 팁, 길이 128mm</td></tr><tr><td>동물 열 매트</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>항생제 및 항진균제</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>오토클레이브 백</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BT-474 (HTB-20) 유방암 세포주</td><td>ATCC</td><td>HTB-20</td><td></td></tr><tr><td>부프레노르핀 (TEMGESIC)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>백작 세포 계수기</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C10227</td><td></td></tr><tr><td>Diet-76A</td><td>ClearH2O</td><td>72-07-5022</td><td></td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>귀 펀처</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>전기 클리퍼</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>미세 각도 집게</td><td>Proscitech</td><td>DEF11063-07</td><td>각도 45도, 팁 스무스, 팁 너비: 0.4mm, 팁 치수: 0.4 x 0.3mm, 길이 9cm</td></tr><tr><td>캐뉼라용 미세 튜브, 튜빙 OD (in) 1/32, 튜빙 ID (in) 1/100in</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-06419-00</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>칼슘과 마그네슘이 없는 Hank's Balanced Salt Solution</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14170120</td><td></td></tr><tr><td>하이드로겔</td><td>ClearH2O</td><td>70-01-5022</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes 보푸라기 낮은 일회용 와이퍼</td><td>Kimberly Clark- Kimwipes</td><td>Z188964</td><td></td></tr><tr><td>매쉬드 마우스 차우</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Meloxicam (METACAM)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>노즈 콘</td><td></td><td></td><td>마이크로퓨지 튜브로 만들어진</td></tr><tr><td>PAA 안구 윤활제 (Carbomer 2mg/g)</td><td>&nbsp; Bausch and lomb</td><td></td><td></td></tr><tr><td>포비돈-요오드 용액</td><td>Betadine</td><td>2505692</td><td></td></tr><tr><td>PPE (장갑, 마스크, 가운, 헤어네트)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>견인기</td><td>Kent Scientific</td><td>SURGI-5001</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Media</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>Silk suture 13mm 5-0, P3, 45cm</td><td>Ethicon</td><td>JJ-640G</td><td></td></tr><tr><td>멸균 생리식염수</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>TM4469</td><td></td></tr><tr><td>접착 테이프</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>수술용 보드</td><td></td><td></td><td>오토클레이브 백으로 감싼 도마.</td></tr><tr><td>수술 용 가위</td><td>Proscitech</td><td>T104</td><td>팁 크기 (LxD) : 38x7mm, 길이 115mm</td></tr><tr><td>봉합 집게 / 곡선 브로피 집게</td><td>Proscitech</td><td>T113C</td><td>곡선, 둥근 좁은 2mm 팁, 톱니 포함, 길이 165mm</td></tr><tr><td>봉합사 바늘 홀더 (Olsen Hegar 바늘 홀더)</td><td>Proscitech</td><td>TC1322-180</td><td>길이 190mm, 래칫 클램프</td></tr><tr><td>주사기 드라이버 (풋 페달 포함) / UMP3 울트라 마이크로 펌프</td><td>World Precision Instruments</td><td>UMP3-3</td><td></td></tr><tr><td>T75 조직 배양 플라스크</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>156499</td><td></td></tr><tr><td>Thread</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trigene II 표면 소독제</td><td>Ceva</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue 및 세포 계수 챔버 슬라이드</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express 해리 매체</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12605010</td><td></td></tr></tbody></table>

암세포의 내경동맥 주입에 의한 뇌전이 모델링

Modeling Brain Metastasis by Internal Carotid Artery Injection of Cancer Cells

뇌 전이는 암 환자의 심각한 이환율과 사망률의 원인입니다. 복잡한 신경 미세 환경 및 기질 세포 상호 작용과 같은 전이성 질환의 중요한 측면은 시험관 내 분석으로 완전히 복제 할 수 없습니다. 따라서 동물 모델은 치료 적 개입의 효과를 조사하고 이해하는 데 중요합니다. 그러나 대부분의 뇌종양 이종 이식 방법은 시간 프레임과 종양 부담 측면에서 지속적으로 뇌 전이를 일으키지 않습니다. 암세포의 심장 내 주사에 의해 생성 된 뇌 전이 모델은 의도하지 않은 두개 외 종양 부담을 초래할 수 있으며 비 뇌 전이성 이환율 및 사망률을 초래할 수 있습니다. 암세포의 두개내 주사는 두개외 종양 형성을 제한할 수 있지만, 주사된 세포가 주사 부위에서 종종 단일 종양 덩어리를 형성하고, 높은 렙토메닌질 침범, 바늘 침투 중 뇌 혈관 구조 손상과 같은 몇 가지 주의 사항이 있습니다. 이 프로토콜은 내 경동맥 주사에 의해 생성 된 뇌 전이의 마우스 모델을 설명합니다. 이 방법은 다른 장기의 침범없이 일관되게 두개 내 종양을 생성하여 뇌 전이 치료제를 평가할 수 있습니다.

외부 경동맥 결찰 유무에 관계없이 일반적인 경동맥 주사 비교 암세포를 먼저 외부 경동맥24를 결찰하지 않고 총 경동맥을 통해 주사했을 때, 이식 된 마우스의 77.8 %에서 안면 종양이 발견되었습니다 (n = 7/9 동물). 안면 종양의 예는 보충 그림 3에 설명되어 있습니다. 이 프로토콜에 설명 된 방법은 총 경동맥 전에 외부 경동맥을 결찰하여 의도하지 않은 안면 전이를 방지합니다.
두 가지 방법을 비교하기 위해, 렉틴은 외부 경동맥 결찰의 유무에 관계없이 도태 된 마우스의 총 경동맥에 주입되었습니다. 그런 다음 안면 조직과 뇌를 고정, 처리 및 형광 현미경으로 관찰했습니다. 외부 경동맥이 결찰되었을 때 뺨 조직의 면역 형광 분석에서 렉틴의 감소가 관찰되었습니다 (그림 2A-B<stro...

뇌 전이는 암 환자의 심각한 이환율과 사망률의 원인입니다. 대부분의 뇌 전이 마우스 모델은 사망률 및 치료 개입 결과의 혼란 분석을 혼란시키는 전신 전이에 의해 복잡합니다. 여기에 제시된 것은 최소한의 전신 종양으로 일관된 두개 내 종양을 생성하는 암세포의 내 경동맥 주사를위한 프로토콜입니다.

Brain metastasis is a cause of severe morbidity and mortality in cancer patients. Critical aspects of metastatic diseases, such as the complex neural ...

그렇다면이 프로토콜이 중요한 이유는 무엇입니까? 음, 뇌 전이는 치료하기가 매우 어려우며이 프로토콜은 최소한의 두개 외 종양이있는 임상 적으로 관련된 마우스 모델을 생성합니다. 이 기술은 약물 분포 및 두개 내 종양의 반응을 객관적으로 분석 할 수있게합니다.이 기술의 주요 장점은 모델이 재현성이 높고 주사 후 비교적 짧은 시간에 뇌 전이가 발생한다는 것입니다. 질병 진행은 동물간에 유사하므로 연구자가 실험, 치료 일정 및 종점을 더 쉽게 표준화 할 수 있습니다. 초보자를위한 나의 조언은 해부 현미경을 통해 보면서 집게와 주사기를 사용하여 목 주위의 해부학 적 랜드 마크에 익숙해지고 수의사가있는 곳에서 프로토콜을 연습하는 것입니다.BT-474 암세포를 10 밀리리터의 완전한 성장 배지를 사용하여 T-75 플라스크에 6 개의 세포에 10 배의 2 배 밀도로 파종하고 세포가 주입 전에 70-80 %의 컨플루언시에 도달 할 때까지 배양합니다. 주입 당일에 성장 배지를 버리고 세포 단층을 PBS로 두 번 세척하고 예열 된 세포 배양 해리 시약 5 밀리리터를 첨가합니다. 섭씨 37도에서 5분 동안 또는 세포가 분리될 때까지 배양합니다.5분 후 인큐베이터에서 플라스크를 꺼내 부드럽게 두드려 세포 분리를 돕습니다. 해리 시약 활성을 담금질하기 위해 10%FBS를 포함하는 완전한 성장 배지 5밀리리터를 추가합니다. 세포 덩어리를 줄이기 위해 피펫팅으로 용액에 세포를 부드럽게 재현탁시킵니다.세포 현탁액을 50 밀리리터 튜브로 옮기고 실온에서 3 분 동안 180G에서 원심 분리합니다. 상청액을 따라 내고 세포 응집을 최소화하기 위해 칼슘과 마그네슘없이 10ml의 HBSSS에 세포 펠릿을 재현탁하십시오. 세포 현탁액을 실온에서 3분 동안 180 G에서 원심분리하여 상청액을 디캔트하여 잔류 혈청 또는 해리 시약을 제거하고 세포 펠렛을 HBSS 3밀리리터에 재현탁시킨다.새로운 50밀리리터 원뿔형 튜브에 100마이크로미터 세포 여과기를 놓고 세포 현탁액을 통과시켜 세포 덩어리를 제거합니다. 트리판 블루를 사용하여 생존 세포의 수를 계산하고, 세포 현탁액을 HBSS로 희석하여 밀리리터당 6개의 세포에 10배한 2.5배의 세포 농도로 희석한다. 튜브를 얼음 위에서 수평으로 유지하고 튜브를 주기적으로 부드럽게 흔들어 덩어리를 최소화하십시오.세포 현탁액은 최대 6시간 동안 얼음 위에 보관할 수 있습니다. 식별을위한 귀 펀치 마우스와 전기 클리퍼를 사용하여 목 부위의 모피를 면도합니다. 테이프를 사용하여 노출 된 피부에서 과도한 모발을 청소하십시오.건조를 방지하기 위해 눈에 안구 윤활제를 바르십시오. 수술 보드에 테이프로 붙인 실을 사용하여 위 앞니를 걸고 앞다리와 뒷다리를 테이핑하여 마우스를 부드럽게 고정합니다. 이 단계는 몸을 확장하고 절차 중에 목을 똑바로 유지합니다.수술 전 피부 준비를 위해 포비돈 요오드와 같은 국소 방부제로 목을 닦아 피부 미생물 부하를 줄이고 느슨한 모발을 제거하십시오. 절개 부위의 재 오염을 방지하기 위해 바깥쪽으로 작업하면서 피부 중앙에서 청소하십시오. 70 % 에탄올을 사용하여 과정을 반복하고 소독을 위해 요오드와 에탄올을 세 번 번갈아 가며 수행하십시오.절차를 계속하기 전에 마취 사망을 보장하기 위해 핀치 테스트를 통해 반사를 확인하십시오. 동물 위에 멸균 수술 드레이프를 놓습니다. 해부 현미경에서 턱 아래 5mm에서 흉부 입구까지 가위를 사용하여 마우스 목 부위의 정중선을 따라 수직 15mm 절개를합니다.두 쌍의 각진 집게를 사용하여 피부와 밑에있는 타액선을 분리하고 견인기를 적용하여 기관이 노출 된 상태로 유지합니다. 두 쌍의 미세한 각도의 집게를 사용하여 기관에 인접한 근육과 지방 조직을 무뚝뚝하게 해부하여 오른쪽 경동맥 덮개를 노출시킵니다. 경동맥은 총 경동맥, 정맥 및 미주 신경을 덮고있는 섬유질 층이며,이 번들은 밝은 빨간색 총 경동맥으로 시각화 할 수 있습니다.주변 근막의 경동맥 분기점까지 총 경동맥 꼬리의 일부를 제거하고 미주 신경 및 정맥에서 분리하십시오. 주변 신경과 근막에서 경동맥 분기점을 분리하고 제거하십시오. 외부 경동맥 아래에 미세한 집게를 배치하고 동맥 아래에 5-0 실크 봉합사를 통과시킵니다.매듭을 짓고 봉합사를 조이고 여분의 선을 자릅니다. 총 경동맥 아래에 미세한 집게를 배치하고 동맥 아래에 5-0 실크 봉합사를 통과시킵니다. 매듭을 묶고 제안 된 주사 부위 근처의 위치에서 봉합사를 조입니다.초과 봉합사를 자르고 약 10 밀리미터의 선을 남겨 둡니다. 보푸라기가 적은 일회용 와이퍼 스트립을 약 10x5mm 정도 자르고 축축하게 합니다. 스트립을 접어서 제안 된 주사 부위의 경동맥 아래에 놓습니다.이것은 주사하는 동안 혈관을지지합니다. 제안 된 주사 부위의 총 경동맥 주둥이에서 느슨한 매듭으로 세 번째 결찰을 놓습니다. 이것은 주입 후에 만 조여집니다.세포 현탁액을 부드럽게 교반하고 200 마이크로 리터의 세포 현탁액을 31 게이지 바늘로 인슐린 주사기에 넣습니다. 활성화 풋 페달에 연결된 주사기 드라이버에 주사기를 넣습니다. 31 게이지 바늘이있는 미세한 캐뉼러를 주사기에 부착하고 라인을 프라이밍합니다.경동맥이 잘 배치되고 가압되어 있는지 확인하십시오. 두 개의 가는 각도의 집게를 사용하여 하나는 첫 번째 합자 끝에 부드럽게 장력을 가하고 다른 하나는 31게이지 바늘을 잡고 베벨이 있는 바늘을 혈관 내강에 천천히 삽입하여 구멍이 뚫리지 않도록 주의합니다. 이전에 준비한 100 마이크로 리터의 세포 현탁액을 초당 10 마이크로 리터의 속도로 총 경동맥에 천천히 주입합니다.이것은 5 번째 세포에 10의 2.5 배를 혈관 내로 전달할 것입니다. 성공적인 주사는 경동맥 혈관에서 혈액을 제거하여 시각화 할 수 있습니다. 역류와 출혈을 방지하기 위해 바늘을 뺀 직후 느슨한 합자를 부드럽게 들어 올리고 조입니다.과도한 봉합사를 다듬고 축축한 보푸라기가 적은 일회용 와이퍼 조각을 제거하십시오. P-200 피펫을 사용하여 150-200 마이크로 리터의 멸균 수 또는 식염수로 수술실을 두 번 헹굽니다. 출혈을 확인한 후 연조직, 타액선 및 피부를 경동맥과 기관 위의 위치로 바꿉니다.봉합사 바늘 홀더, 겸자 및 흡수성 또는 비흡수성 6-0 모노필라멘트 봉합사를 연속적인 패턴으로 사용하여 절개의 피부층을 닫습니다. 수술 후 통증 완화로 피하 주사를 통해 부 프레 노르 핀 킬로그램 당 50 마이크로 그램과 멜 록시 캄 킬로그램 당 1 밀리그램을 주사하십시오. 마취에서 회복하기 위해 동물을 따뜻하고 깨끗한 새장으로 옮기십시오.렉틴은 외부 경동맥 결찰의 유무에 관계없이 마우스의 총 경동맥에 주사되었습니다. 외부 경동맥이 결찰되었을 때 뺨 조직에서 렉틴의 감소가 관찰되었습니다. 결과는 결찰이 뇌 전달에 영향을 미치지 않는다는 것을 보여주었습니다.종양 진행은 루시페라아제-발현, HER2-증폭된 유방암 세포주를 사용하여 모니터링하였다. BT474 뇌 전이 모델은 내부 경동맥 주사 후 5주차부터 생체발광 신호의 증가를 나타내었고, 그 후 점진적으로 성장하였다. 5 주에서 8 주 사이에 이질적인 신호 강도는 복잡한 유체 관류가있는 두개 내 종양을 나타 냈습니다.종양 영역 내의 가돌리늄 농도는 혈액 순환에서 종양 조직으로 누출됨에 따라 증가했습니다. 나노의학의 축적과 뇌 전이는 BT-474 마우스에서 관련되지 않은 뇌 영역에 비해 종양 영역에서 더 높은 나노의학 수준이 검출됨으로써 확인되었습니다. BT-474 뇌 전이 모델이 진행됨에 따라 동물은 체중이 최대 20%까지 감소하기 시작하여 주사 후 평균 생존 시간이 9주가 되었습니다.조직학 결과는 종양이 일방적으로 위치하여 종양이 대부분 고체, 독방 덩어리로 나타나는 경동맥 주사 부위와 일치한다는 것을 보여주었습니다. 빈 공간의 주머니가 자주 관찰되었고 괴사 세포로 구성되었으며 일부 동물에는 더 작은 파생물이 존재했습니다. 프로토콜을 시도 할 때 기억해야 할 가장 중요한 것은 바늘을 삽입하기 전에 경동맥을 올바르게 준비하고 배치 한 다음 바늘을 삽입하는 동안 적절한 장력을 가하는 것입니다.이 모델은 뇌로의 약물 전달과 뇌 전이 치료를 위한 새로운 치료제의 효능을 탐구하는 연구자에게 유용합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

이 비디오는 두개내 주사를 수행하여 쥐의 뇌에 종양 세포를 이식하는 방법을 보여줍니다.

두개내 정소성 모델: 마우스 뇌에 암세포를 이식하는 절차

이 비디오는 형광 표지된 암세포의 경동맥내 주입에 의한 뇌 전이 마우스 모델의 확립을 보여줍니다. 마우스 모델은 새로운 치료법의 효과와 근본적인 생리학적 메커니즘을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

Brain Metastasis Mouse Model: 경동맥내 암세포 주입에 의한 뇌 전이 마우스 모델을 생성하는 방법

출처: Lim, M., et al. 암세포의 내부 경동맥 주입에 의한 뇌 전이 모델링. J. Vis. Exp. (2022)이 영상에서는 마취된 쥐가 암세포를 총경동맥(CCA)에 주입하여 뇌로의 표적 전달을 촉진하는 수술을 받습니다. 이 시술에는 경동맥의 정확한 봉합 및 조작이 포함되어 주입된 세포를 내부 경동맥(ICA)으로 향하게 하여 시간이 지남에 따라 뇌의 종양 형성을 촉진합니다.

암세포의 내부 경동맥 주입을 통한 뇌종양 전이 모델링

유방암 뇌 전이의 마우스 모델은 MDA-MB231/Br-GFP 세포의 초음파 영상 유도 심장 내 주입으로 설정됩니다. 다 초점 두개 내 전이의 개발은 고해상도 9.4 T MRI를 사용하여 세로 방향으로 모니터링하고있다.

종 MRI에 이어 유방암 뇌 전이 마우스 모델을 개발하기 위해 초음파 영상 유도 심장 내 주입

치료 옵션을 완화 남아있는 동안 그 빈도는 증가로 뇌 전이는 긴급 충족되지 않은 의료 요구되고있다. 암 세포의 intracarotid 동맥 주입을 통해 뇌 전이의 실험 동물 모델을 만들기 소설 개입 요법의 질병 생물학 및 평가의 기계론의 연구를 용이하게한다.

Intracarotid 암 세포 주입 뇌 전이의 마우스 모델을 제작하기

두개 내 뇌 전이 모델링은 정확하고 시기 좋은 방법으로 치료에 종양 크기와 반응을 모니터링할 수 없다는 것에 의해 복잡합니다. 제시된 방법론은 자기 공명 화상 진찰 분석과 두개 내 종양 주입을 결합할 때, 정확하고 일관된 주사, 향상된 동물 감시 및 정확한 종양 부피 측정을 육성합니다.

두개 내 주입 및 자기 공명 이미징을 통해 뇌 전이를 모델링

우리는 내인성 HER2 증폭 염증성 유방암 세포주의 꼬리 정맥 주사를 통해 생성된 유방암 뇌 전이의 이종이식 마우스 모델을 설명합니다.

염증성 유방암 세포의 꼬리 정맥 주입을 통한 뇌 전이 모델링

이 원고는 실험적인 뼈 전이를 확립하기 위해 뼈를 포함한 뒷다리 조직에 암세포를 특이적으로 전달하는 기술인 장골 내 동맥(IIA) 주입의 자세한 절차를 제공합니다. 처음에는 유방 종양 모델로 확립되었지만, 이 프로토콜은 다른 암 유형으로도 쉽게 확장될 수 있습니다.

현미경 뼈 전이의 효율적이고 선택적 모델링을위한 내부 장골 동맥 주입

문맥 주사를 통해 유선종양 세포를 쥐 간으로 전달하는 수술이 개발되었습니다. 이 모델을 사용하면 간의 종양 세포 유출, 파종, 생존 및 전이성 성장을 포함하여 완전히 면역이 있는 숙주에서 간 전이의 후기 단계를 조사할 수 있습니다.

포탈 정맥 주입 모델 간 전이 유방암의 공부를

여기서, 우리는 순환 종양 세포 (CTCs)를 특성화 하는 표현 형 및 분자 특징을 식별 하는 통합 워크플로우를 제시 합니다. 당사는 단일 및 클러스터형 CTCs의 살아있는 면역 염색 및 로봇 미세 조작을 단일 세포 기반 기술로 결합 하 여 전이 시드 능력의 다운스트림 분석과 평가를 제공 합니다.

하류 분자 분석 및 전이성 전위 평가를 위한 순환 종양 세포의 미세 조작

학습하세요 내경동맥 주입법을 이용한 뇌전이 마우스 모델 구축 방법을. 최소한의 전신 종양으로 재현성 높은 뇌내 종양을 형성하여 약물 분포와 치료 반응을 객관적으로 분석할 수 있습니다.

암세포의 내경동맥 주입에 의한 뇌전이 모델링

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