포유류 숙주에서 활성 감염 중 칸디다 알비칸스 돌연변이 균주에서 형태형성 표현형을 스크리닝하기 위한 생체 내 이미징 사용

칸디다 알비칸스 형태 형성은 무수한 환경 신호에 의해 유발됩니다. 생체 내 형태 형성을 연구함으로써 우리는 유기체가 이러한 모든 환경 신호를 통합하고 반응하는 방법을 결정합니다. 이 기술의 주요 장점은 시험관 내 모델 시스템을 사용하여 도입 될 수있는 편견이나 인공물이없는 상태에서 형태 형성을 연구 할 수 있다는 것입니다.

피내 주사 경험이있는 사람은 거의 없습니다. 이 기술을 처음 접하는 사람은 동물 자원 수의사에게 연락하여 배우는 데 도움을 받는 것이 좋습니다. 절차를 시연하는 것은 우리 실험실 그룹의 박사후 연구원 인 Rohan Wakade가 될 것입니다.

접종 전 최소 7 일 동안 엽록소가없는 차우를 먹여 접종을 위해 동물을 준비하는 것으로 시작하십시오. 주사하기 하루 전에 이쑤시개를 사용하여 한 식민지에서 캐나다 알비 칸스 세포를 가볍게 치십시오. 25 밀리리터의 YPD를 접종하고이 과정을 여러 번 반복하여 여러 다른 콜로니에서 세포를 얻습니다.

배양물을 섭씨 30도의 175RPM의 궤도 쉐이커 인큐베이터에서 밤새 배양합니다. 500 x g에서 2 분 동안 1 밀리리터의 배양 물을 원심 분리 한 다음 1 밀리리터의 멸균 DPBS로 효모를 3 번 씻습니다. 펠릿을 멸균 DPBS 1밀리리터에 재현탁하고 배양물을 1 내지 100으로 희석한다.

혈구계를 사용하여 세포를 세고 그에 따라 세포 밀도를 조정하십시오. 다음으로, 동일한 부피의 참조 균주와 실험 균주를 혼합하여 주입용 접종물을 만듭니다. 면봉을 사용하여 처방전 없이 살 수 있는 제모 크림을 마취된 동물의 양쪽 귀 안쪽과 바깥쪽 표면에 자유롭게 바릅니다.

2-3 분 후 마른 거즈로 귀를 부드럽게 닦은 다음 멸균 된 물에 적신 거즈 패드를 사용하여 탈모 크림 잔여 물을 완전히 제거하십시오. 귀 표면을 70 % 에탄올로 멸균 한 후 바이알을 여러 번 뒤집거나 볼텍싱하여 접종 물을 잘 혼합합니다. 인슐린 주사기에 20-30 마이크로 리터의 접종 물을 넣습니다.

바늘을 똑바로 세우고 주사기를 부드럽게 두드려 배럴의 공기가 상단에 있는지 확인합니다. 플런저가 10마이크로리터 표시에 오도록 공기와 과도한 접종물을 접종 튜브 또는 폐 튜브로 조심스럽게 다시 배출합니다. 카운터 양면 스킨 테이프를 작은 원추형 또는 둥근 바닥 플라스틱 튜브에 바르고 테이프를 가로 질러 귀를 드레이프하여 마취 코 콘이 빠지지 않도록하십시오.

주사기 바늘을 피부와 거의 평행하게 유지하고 큰 정맥을 피하면서 경사가 덮일 때까지 바늘 끝을 피부의 가장 바깥 쪽 층에 삽입하고 천천히 접종 물을 피내 주사합니다. 좋은 피내 주사는 피부에 작은 거품을 일으 킵니다. 누출을 최소화하기 위해 귀에서 바늘을 제거하기 전에 바늘을 15-20 초 동안 제자리에 유지하십시오.

기관 프로토콜에 따라 케이지의 동물이 칸디다 알비 칸스에 감염되었음을 나타내는 생물학적 위험 라벨로 케이지를 표시하십시오. 접종물을 제조하는데 사용된 동일한 세척된 배양물을 사용하여, RPMI 1640에서 세포의 1 내지 50 희석액을 만들고, 10%열 및 활성화된 태아 소 혈청을 보충하고, 4시간 동안 텀블링과 함께 섭씨 37도에서 배양한다. 현미경을 사용하여 샘플을 검사합니다.

적어도 100 개의 세포를 세고 각 균주에 대한 효모 및 사상 세포의 수를 기록합니다. 작동 거리가 긴 대물렌즈를 제자리로 돌리고 렌즈에 액침액 방울을 놓습니다. 커버 슬립을 놓을 때 발생할 수 있는 손상을 방지하기 위해 렌즈를 내립니다.

1.5번 커버 슬립을 무대 개구부 위에 놓고 제자리에 테이프로 붙입니다. 침지액이 대물 렌즈와 커버 슬립에 닿도록 대물렌즈를 들어 올립니다. 현미경 스테이지에 마취 코 원뿔을 고정하여 이미징 위치에 있을 때 동물의 코를 완전히 덮습니다.

마취 된 마우스의 코를 코 원뿔에 넣습니다. 대물 렌즈 위의 커버 슬립에 멸균수 한 방울을 놓습니다. 마취 코 콘을 조정하고 마우스의 귀가 물방울 위에 오도록 마우스를 배치합니다.

다른 커버 슬립을 가져와 커버 슬립의 가장자리가 마우스 본체와 평행하도록 놓고 가장자리가 귀와 머리가 만나는 마우스에 닿도록 합니다. 힌지 동작을 사용하여 커버 슬립의 자유 가장자리를 현미경 스테이지로 내립니다. 커버 슬립이 현미경 스테이지에 닿으면 귀가 평평해집니다.

상단 덮개 슬립을 테이프로 단단히 고정하여 귀를 평평하게 유지하고 테이프에 쥐의 머리카락이나 수염이 걸리지 않도록 충분한 압력을 유지합니다. 환경 챔버가 있는 현미경을 사용하지 않는 한 정상적인 열 환경을 유지하기 위해 멸균 드레이프로 마우스 몸을 느슨하게 덮으십시오. 백색광, 광시야 이미징을 사용하여 초점 평면을 귀 조직으로 조정하고 혈관에서 움직이는 적혈구에 초점을 맞춥니다.

시야의 모든 세포에 대해 형태를 결정할 수 있도록 충분히 강한 신호 대 잡음비를 얻으려면 레이저 출력 또는 이미징 속도를 조정하십시오. 조직 손상을 방지하려면 가능한 가장 낮은 레이저 출력을 사용하십시오. 참조된 균주에서 명확한 필라멘트 형성이 있고 대부분의 유기체가 형태를 결정할 수 있을 만큼 충분히 퍼져 있는 시야를 선택하십시오.

Z 스택의 상단 및 하단 초점 평면을 설정합니다. 감염된 영역의 전체 깊이를 덮을 필요는 없지만 이미징 된 볼륨의 상단 또는 하단에있는 유기체는 일반적으로 분석에서 제외됩니다. Z 스택 이미지를 획득하고 각 채널을 의사 색상으로 지정하여 각 변형을 구별하고 채널을 오버레이합니다.

이미지를 저장합니다. 이미징 소프트웨어를 사용하여 Z 스택을 2차원 이미지로 최대 투영합니다. 최대 투영 이미지에서 볼 수 있는 각 유기체를 균주 유형 및 형태별로 계산합니다.

참조된 균주는 시험관 내에서 빠르게 필라멘트를 형성합니다. EFG1 Null은 필라멘트를 형성하지 못했습니다. EFG1 Null은 생체 내에서도 상당한 필라멘트 결함을 나타냅니다.

EFG1 Null 세포의 약 9%는 생체 내에서 필라멘트로 성장했습니다. 유사하게, CYR1 Null 돌연변이체 균주는 참조된 균주와 비교하여 시험관내에서 필라멘테이션 결함을 나타내었다. 대조적으로, CYR1 Null 돌연변이 세포의 53%는 생체 내에서 필라멘트로 성장했습니다.

CYR1 Null 돌연변이체에 의해 형성된 필라멘트는 참조된 균주보다 짧았다. 접종하는 동안 바늘을 피부와 평행하게 유지하는 것이 중요합니다. 목표는 접종 물을 피부의 바깥층 바로 아래에 놓는 것입니다.

이 기술은 또한 관심 숙주 세포에서 형광 단백질을 발현하는 마우스 균주와 함께 사용할 수 있어 생체 내에서 숙주 병원체 상호 작용을 연구할 수 있습니다.