Name: 포유류 숙주에서 활성 감염 중 칸디다 알비칸스 돌연변이 균주에서 형태형성 표현형을 스크리닝하기 위한 생체 내 이미징 사용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: 배우세요 포유류 숙주에서 Candida albicans 돌연변이 균주의 형태형성 표현형을 스크리닝하는 생체 내 공초점 현미경 기법. 이 방법은 감염 중 진균의 적응 메커니즘을 연구하는 데 필수적입니다.

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이 작업은 NIH 보조금 1R01AI33409와 아이오와 대학교 카버 의과 대학 소아과에서 지원했습니다.

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저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

이 모델은 컨포칼 현미경을 사용하여 포유류 숙주의 조직 내에서 성장하는 C. albicans 유기체의 이미지를 얻음으로써 활성 감염 동안 형태 형성 표현형을 평가할 수 있습니다. 형태 형성 과정은 C. albicans의 발병 기전의 중심이며 다양한 시험관 내 분석 2,3,4를 사용하여 널리 연구되었습니다. 그러나, 시험관내 분석은 숙주의 복잡한 생화학적 및 구조적 환경을 완전히 모델링할 수 없다.
여기에 설명된 프로토콜은 감염 중 형태형성에 관여하는 유전자를 확인하기 위해 C. albicans 돌연변이체의 시리즈/라이브러리를 스크리닝하기 위해 이 생체 내 이미징 시스템의 사용에 중점을 둡니다. 다른 형광 단백질을 발현하는 C. albicans 균주를 사용하면 기준 균주와 비교하여 C. albicans 돌연변이 균주의 생체 내 형태 형성을 정량화 할 수 있습니다. 돌연변이의 형태 형성을 동일한 감염 영역 내의 기준 균주와 비교하면 유기체가 동일한 환경에 노출됩니다. 이를 통해 필라멘테이션을 받는 세포의 비율과 필라멘테이션 정도를 정량적으로 측정할 수 있습니다. 돌연변이 균주의 측정값을 기준 균주의 측정값으로 정규화하면 한 돌연변이의 성능을 다른 돌연변이와 더 잘 비교할 수 있습니다.
여기에 제시된 대표적인 결과는 시험관 내 표현형과 생체 내 표현형 사이에 상당한 불일치의 가능성을 보여줍니다. C. albicans efg1ΔΔ 돌연변이 균주는 거의 모든 시험관 내 조건20에서 필라멘트에 실패하기 때문에 형태 형성 분석을위한 음성 대조군으로 자주 사용됩니다. 생체 내 결과는 시험관 내 결과와 매우 유사했지만,이 심하게 방해받은 균주조차도 때때로 숙주 조직 환경에서 필라멘트를 형성했습니다 (그림 3). 이것은 형태 형성을 유발하는 숙주 환경의 강도를 강조합니다.
대조적으로, cyr1ΔΔ 돌연변이체 균주는 시험관내 및 생체내 성장 사이에 실질적인 불일치를 입증하고; 돌연변이 세포 중 어느 것도 시험관 내에서 필라멘트를 거치지 않지만 세포의 약 절반은 생체 내에서 필라멘트로 성장합니다(그림 4)10,21. 흥미롭게도, 이들 필라멘트는 기준 균주에 의해 형성된 필라멘트보다 상당히 짧았으며, 이는 CYR1이 필라멘트 성장 속도 또는 필라멘트 표현형을 유지하는 능력에 기여한다는 것을 시사한다. 필라멘트 길이의 분석을 용이하게하기 위해, 필라멘트의 곡선 경로 길이는 이미지의 2 차원 투영을 사용하여 측정되었다. 3차원으로 성장하는 필라멘트의 2차원 투영에서 xy 평면과 평행하지 않은 축에서 성장하는 모든 필라멘트는 실제 길이보다 짧게 투영됩니다. 이러한 단축법은 기준 균주에 대해서도 발생하므로 2차원 투영에서 필라멘트 길이의 분포를 평가하면 기준 균주와 돌연변이 균주 간의 정량적 비교가 가능합니다. 필라멘트 길이를 3 차원이 아닌 2 차원으로 분석하려면 덜 집중적 인 이미지 분석이 필요합니다. 따라서 일반적인 데스크톱 컴퓨터에서 비교적 빠르게 수행할 수 있습니다. 이 간단한 분석을 사용하면 스크리닝 프로토콜의 일부로 필라멘트 길이 분포를 포함할 수 있으므로 처리량에 상당한 지연을 일으키지 않고 형태 형성을 겪을 수 있는 각 돌연변이의 능력에 대한 보다 미묘한 이해를 제공할 수 있습니다.
여기에 제시된 대표적인 연구는 보체 시스템에 결함이 있는 DBA2/N 마우스를 사용하여 수행되었으며, 이로 인해 C. albicans 감염 부위에 호중구를 모집하는 데 실패했습니다.22. 이 연구의 목표는 숙주 조직 내에서 C. albicans 필라멘트 조절 메커니즘을 조사하는 것이 었습니다. 따라서 DBA2/N 마우스는 개별 균주의 감수성 또는 호중구에 대한 저항성 때문에 결과를 혼동하지 않도록 사용했습니다. 호중구 항-C. 알비칸스 반응이 필라멘테이션23에 영향을 미칠 수 있기 때문에, 감염 부위로의 호중구 모집은 형태형성 분석의 결과에 영향을 미칠 수 있다. 균주가 생체 내에서 필라멘팅이 가능하지만 호중구가 존재할 때 필라멘트가 강하게 억제되는 경우 DBA2/N 마우스에서 필라멘트가 감지되지만 손상되지 않은 호중구 화학주성을 가진 마우스를 사용할 때는 나타나지 않을 것입니다. 따라서, 숙주로 사용되는 마우스의 변형은 이 프로토콜을 사용할 때 중요한 요소이다.
efg1ΔΔ 돌연변이 균주가 생체 내에서 필라멘트에 실패한다는 관찰은 숙주 호중구 반응과 관련이 없을 것인데, 이는 이 균주가 또한 시험관 내에서 필라멘트에 실패하기 때문이다. cyr1ΔΔ 균주와 함께 생체 내에서 관찰된 필라멘션은 시험관 내 필라멘테이션 실패와 불일치합니다. C. albicans의 제브라 피쉬 모델의 데이터는 반응하는 호중구가 형태 형성24의 예방에 중요하다는 것을 나타냅니다. 따라서, 호중구 반응이 없는 DBA2/N 마우스의 사용은 시험관내와 비교하여 생체내에서 cyr1ΔΔ의 필라멘테이션 증가를 설명할 가능성이 낮다. 그럼에도 불구하고, 생체내 환경은 cyr1ΔΔ 균주의 형태형성에 명백히 영향을 미치고; 따라서이 균주에 대한 추가 조사는 활성 감염 동안 C. albicans의 형태 형성 조절에 대한 중요한 정보를 제공 할 수 있습니다. 여기에 설명된 프로토콜은 향후 연구에 사용될 cyr1ΔΔ 균주와 같은 균주를 식별하기 위한 스크리닝 분석으로 설계되었습니다.
저유량 가스 마취 시스템의 사용은 이 프로토콜에 매우 유용합니다(그림 1A,B). 이 프로토콜의 초기 개발 동안, 마우스는 자일라진과 혼합 된 케타민의 주사 가능한 마취 칵테일을 사용하여 마취되었다. 이러한 마취 방법으로 제한된 영상을 수행할 수 있었지만 마취 기간을 예측할 수 없었기 때문에 영상화 중 마우스가 마취에서 회복되는 것을 방지하기 위해 영상 세션을 신속하게 종료해야 했습니다. 전통적인 흡입 마취 시스템은 부피가 크고 마취 가스의 높은 흐름 속도가 필요하며 종종 흄 후드 내에서 사용해야합니다. 따라서 기존의 흡입 마취 시스템은 조사자가 실수로 마취제에 노출되지 않고는 컨포칼 현미경의 공간 제약으로 사용하기가 매우 어렵습니다. 저 유량 흡입 마취 시스템을 사용하면 조사자에게 안전한 환경을 유지하면서 동물을 지속적으로 마취 할 수 있습니다. 저유량 노즈콘을 사용하면 접종과 현미경 검사를 위해 동물을 쉽게 배치할 수 있습니다. 소구경, 소량 전달 튜브는 비교적 긴 튜브를 사용할 수 있어 현미경 검사를 방해하지 않도록 마취 기계를 충분한 거리에 배치할 수 있습니다.
전형적인 마우스 차우에 존재하는 엽록소는 상당한 조직 자가형광을 유도한다(25). 이로 인해 이미지에 상당한 노이즈가 발생하여 고품질의 높은 공간 해상도 이미지를 얻기가 어렵습니다. 동물에게 이미징 전 7일 동안 엽록소가 없는 차우를 먹였을 때, 자가형광으로 인한 배경은 조직에서 실질적으로 감소했지만 모발에 침착된 엽록소는 계속해서 문제가 되었습니다. 처방전 없이 살 수 있는 화학 제모 크림을 사용하여 귓바퀴의 모발을 제거하면 모발의 자가형광을 최소화하는 데 효과적입니다(그림 1C,D). 따라서, 엽록소가 없는 차우와 적절한 제모의 조합은 자가형광을 실질적으로 감소시키고 이미지 품질을 극적으로 개선시켰다. 이미징 전에 머리카락이 귀에서 제거되기 때문에 동물의 머리카락 색깔은이 시스템에 영향을 미치지 않습니다. 이 프로토콜은 BALB / c (흰색), C57BL / 6 (검은 색) 및 DBA2 / N (갈색) 마우스에서 C. albicans의 감염을 연구하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 이 프로토콜은 다양한 숙주 유전자가 결핍된 C57BL/6 녹아웃 마우스에도 사용할 수 있습니다. 이를 통해 포유류 숙주 면역 체계가 필라멘트에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 향후 조사가 가능합니다. 이 프로토콜에서 논의되지 않은이 모델의 한 가지 특징은이 이미징 시스템이 비 침습적이기 때문에 동일한 동물을 며칠에 걸쳐 반복적으로 이미징 할 수 있으므로 시간이 지남에 따라 개별 감염의 진행 상황을 추적 할 수 있다는 것입니다. 이 기능은 숙주-병원체 상호 작용에 대한 향후 연구에서 중요한 역할을 할 것입니다.
요약하면, 이 프로토콜은 살아있는 포유류 숙주의 조직에서 자라는 C. albicans의 고공간 해상도 이미지를 생성하여 돌연변이 균주 8,9,10에서 형태 형성을 정확하게 평가할 수 있습니다. 여기에 제시된 결과는 이 프로토콜이 C. albicans 돌연변이체 라이브러리를 스크리닝하는 데 어떻게 사용될 수 있는지 보여줍니다. 현재까지 시험된 C. albicans의 돌연변이체 중, 시험관 내에서 형태형성에 공지된 결함이 있는 돌연변이체의 상당 부분이 생체내필라멘테이션을 쉽게 겪는다 9,10. 이것은 C. albicans의 발병 기전의 메커니즘을 밝히기 위해 고안된 실험에서 이와 같은 생체 내 시스템을 포함하는 것의 중요성을 강조합니다.

칸디다 알비칸스는 점막 피부 질환, 파종성 질환 및 국소 조직 감염을 일으키는 일반적인 인간 곰팡이 병원체입니다1. C. albicans의 주요 특징은 복잡한 다형성 성장이며, 이는 공생 및 병원체 2,3,4로서의 역할과 관련이 있습니다. 30°C에서 시험관내 풍부한 영양 조건 하에서, 전형적으로 난형 출아 효모로서 성장한다. 영양소 결핍, pH 변화, 37°C에서의 성장, 혈청 노출 및 한천에 매립될 때의 성장을 포함한 다양한 환경 유발 요인은 분극화된 성장 패턴으로 전환하여 진정한 균사 및/또는 가성 균사5의 형성을 초래합니다. 분극화 된 성장의 시작과 그에 따른 사상 유기체의 성장을 형태 형성이라고합니다.
유기체의 독성에서 형태 형성의 중요성 때문에 균사 형성의 조절이 광범위하게 연구되었습니다 6,7. 형태 형성을 유발하는 신호 전달 경로와 전사 조절의 복잡한 네트워크가 있습니다. C. albicans의 형태 형성과 병인의 관계에도 불구하고, 형태 형성을 조사하는 대부분의 연구는 균사 형성을 유발하기 위해 시험관 내 자극을 사용했습니다. 필라멘트의 다양한 시험관 내 모델이 자극 된 개별 조절 경로의 관점에서 동일하지 않다는 것이 점점 더 분명 해지고 있습니다. 또한, 시험관 내 성장 조건은 숙주의 복잡한 환경과 밀접하게 일치하지 않습니다. 인간 병원체로서 C. albicans의 중요성을 감안할 때, 이 프로토콜의 목표는 중간 처리량의 시스템을 사용하여 포유류 숙주에서 활성 감염 중 형태 형성을 조사하여 조사자가 C. albicans의 돌연변이 라이브러리를 스크리닝할 수 있도록 하는 것입니다.
이러한 조사를 용이하게하기 위해 도 립 컨 포칼 현미경 8,9,10을 사용하여 마취 된 마우스의 귓바퀴에 감염되는 동안 C. albicans 세포의 높은 공간 해상도 이미지를 얻을 수있는 생체 내 이미징 시스템이 개발되었습니다. 귓바퀴의 피부는 매우 얇기 때문에 조직 해부 없이 이러한 이미지를 얻을 수 있습니다. 따라서, 정량적 표현형 데이터는 숙주 조직 내의 활성 감염 부위에서 측정될 수 있다. 여기에 설명된 프로토콜은 기준 균주 및 하나 이상의 돌연변이 균주를 상이한 형광 단백질 발현 카세트(11,12)로 형질전환시키는 것을 포함한다. 형광 단백질 발현 균주는 혼합되고 피내 동시 주사됩니다. 감염이 확립 된 후, 컨 포칼 이미징은 필라멘트의 빈도와 형성된 필라멘트의 길이를 정량화하는 데 사용됩니다. 돌연변이 균주로부터 수득된 데이터는 동일한 조직 영역에 존재하는 기준 균주로부터 수득된 것으로 정규화되어, 내부 대조군을 제공한다. 이 시스템을 통해 우리는 여러 일련의 C. albicans 돌연변이 균주를 성공적으로 스크리닝 할 수 있었으며, 그 중 다수는 시험관 내 9,10에서 형태 형성 결함을 가지고 있습니다. 이러한 균주의 대부분은 생체 내에서 쉽게 필라멘트되며, 형태 형성 조사를 위한 생체 내 모델의 중요성을 강조합니다.

<table><tbody><tr><td>#1.5 커버슬립</td><td>Thermo-Fisher</td><td>20811</td>은 <td>유니버설 스테이지 오프닝을 커버할 만큼 충분히 큽니다.</td></tr><tr><td>0.1 mL 인슐린 주사기</td><td>EXELint</td><td>26018</td> 5<td>/16"&ndash의 주사기를 사용할 수 있습니다; 1/2" 길이와 29&ndash; </td></tr><tr>32 dPBS <td>Sigma-Aldrich</td><td>SHBJ5734</td><td></td>70% 에탄올/30% 물에<td>3.7% 포름알데히드</td></tr><tr><td></td><td>Decon Laboratories</td><td>A05061001A</td><td></td></tr><tr><td>알코올 준비 패드</td><td>Covidien</td><td>5110</td><td>대안: 70% 이소프로필 알코올에 담근 거즈 패드</td></tr><tr><td>C.albicans 참조 균주 및 실험 균주</td><td>SN250</td><td>FGSC 온라인 카탈로그</td><td>특정 C. albicans 균주는 실험 및 연구자의 목표에 따라 다릅니다. 당사는 SC5314에서 파생된 균주와 다른 임상 분리물을 사용했습니다.</td></tr><tr><td>엽록소 무료 마우스 차우</td><td>Envigo</td><td>2920x</td><td></td></tr><tr><td>컴퓨터</td><td>Dell</td><td>Optiplex 7050</td><td>이미지 수집 및 분석을 위해 이미징 소프트웨어를 실행할 수 있는 컴퓨터. 다양한 이미징 소프트웨어를 사용할 수 있으며 특정 현미경 및 사용자 시스템에 따라 다릅니다.</td></tr><tr><td>면 팁 애플리케이터</td><td>Pro Advantage</td><td>76200</td><td></td></tr><tr><td>DBA2/N (6-12주 된 마우스)</td><td></td><td></td><td>BALB/c 및 C57/BL6 마우스도 사용할 수 있습니다. 후자는 널리 사용 가능한 녹아웃 마우스 모델뿐만 아니라 식세포와 같은 개별 세포 유형이 형광 단백질의 발현으로 식별되는 마우스 모델을 사용할 수 있도록 합니다.</td></tr><tr><td>직물을 피부에 고정하도록 설계된 양면 테이프 (패션 테이프)</td> <td>현지 약국 또는 식료품점</td><td></td><td>양면 접착 테이프는 인간의 피부 위에 옷을 제자리에 고정하도록 설계되었습니다. 이것은 일반적으로 약국 및 잡화점에서 처방전 없이 구입할 수 있습니다.&nbsp; 피부에 부드럽게 밀착되도록 설계된 이러한 유형의 테이프를 사용하는 것이 중요합니다.&nbsp; 예:&nbsp; https://www.amazon.com/Womens-Fashion-Clothing-Transparent-Suitable/dp/B08S3TWR3H/ref=sr_1_40?crid=2UWFL8FMFAKGM&keywords =패션+테이프& qid=1649174406& sprefix= fashion+tape%2Caps%2C70& SR = 8-40 < / > https://www.amazon.com/Fearless-Tape-Sensitive-Clothing-Transparent/dp/B07QY8V5XT/ref=sr_1_26?crid=2UWFL8FMFAKGM&keywords< / > =패션+테이프& qid=1649174320& sprefix= fashion+tape%2Caps%2C70& sr=8-26 https://www.amazon.com/Hollywood-Fashion-Secrets-Tape-Floral/dp/B009RX77MK/ref=sr_1_29?crid=2UWFL8FMFAKGM&keywords =패션+테이프& qid=1649174406& sprefix= fashion+tape%2Caps%2C70& sr=8-29</td></tr><tr><td>Dulbecco의 인산염 완충 식염수</td><td>Gibco / Thermo-Fisher</td><td>14190-144</td><td>멸균되어야 합니다. 모든 실험에 대해 새 용기를 열어주세요</td></tr>. <tr><td>태아 소 혈청</td><td>Gibco / Thermo-Fisher</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>거즈 패드</td><td>Pro Advantage</td><td>P157112</td><td></td></tr><tr><td>젤 눈 lurbicant</td><td>지역 약국 또는 식료품점</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ 또는 FIJI 분석 소프트웨어</td><td>NIH</td><td>ImageJ (FIJI)</td><td></td></tr><tr><td>Ioflurane</td><td>Akorn</td><td>J119005</td><td></td></tr><tr><td>Leica DMi8 (SP8 플랫폼) with Leica 11506375 대물 렌즈</td><td>Leica</td><td>DMi8 (SP8)</td><td>대물 렌즈&nbsp; (라이카 11506375)는 여기에서 사용 되 고 있습니다&nbsp; 는 귀 조직의 굴절률을 근사화하면서 높은 개구수 (0.95)를 가질 수 있게 해주는 25x 수침 렌즈입니다. 현미경 (Leica DMi8 (SP8 플랫폼)은 488 nm 및 638 nm 다이오드 레이저 라인을 가지고 있으며, 방출광 감지를 위한 컴퓨터 제어 조정 가능한 대역폭을 갖춘 필터 없는&nbsp; 스펙트럼 감지 기능이 장착되어 있습니다. 스테이지는 목표가 다음을 수행할 수 있도록 충분한 여유 공간이 있어야 합니다. 스테이지에 부딪히지 않고 하단 커버슬립에 도달합니다.</td></tr><tr><td>저유량 마취 시스템 또는 기존 마취 기화기</td><td>Kent Scientific International</td><td>SomnoSuite</td><td></td></tr><tr><td>Nair 제모 로션</td><td>지역 약국 또는 식료품점</td><td></td> 처방<td>전 없이 구입할 수 있는 제모 크림</td></tr><tr><td>Nourseothricin</td><td>Jena Bioscience</td><td>AB-101L</td><td></td></tr><tr><td>pENO1-NEON-NATR pENO1-iRFP-NATR 플라스미드</td><td></td><td></td><td>형광 단백질 발현 형질전환 구조체&nbsp; 로버트 휠러(Robert Wheeler) 박사(Seman, et al., 2018, Infection and Immunity; Bergeron, et al., 2017, Infection and Immunity)</td></tr><tr><td>감압 실험실 테이프</td><td>테이프 & Label Graphic Systems Inc</td><td>1007910</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640 세포 배양 배지</td><td>Gibco / Thermo-Fisher</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>골무, 플라스틱 15 mL 원뿔형 튜브 또는 Falcon 5 mL 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브</td><td>Falcon</td><td>352196</td><td>주사 중 동물의 귀를 안전하게 잡기 위해</td></tr></tbody></table>

포유류 숙주에서 활성 감염 중 칸디다 알비칸스 돌연변이 균주에서 형태형성 표현형을 스크리닝하기 위한 생체 내 이미징 사용

Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host

칸디다 알비 칸스는 중요한 인간 병원체입니다. 형태 학적 형태 사이를 전환하는 능력은 발병 기전의 핵심입니다. 이러한 형태학적 변화는 환경 자극에 반응하여 제어되는 복잡한 신호 네트워크에 의해 조절됩니다. 이러한 조절 성분은 고도로 연구되었지만 거의 모든 연구에서 다양한 체외 자극을 사용하여 필라멘트를 유발합니다. 병인 과정에서 형태 형성이 어떻게 조절되는지 확인하기 위해 우리는 포유류 숙주 내에서 균사 형성을 겪는 유기체의 높은 공간 해상도 이미지를 얻기 위해 생체 내 현미경 시스템을 개발했습니다. 여기에 제시된 프로토콜은 이 시스템을 사용하여 C. albicans의 돌연변이 균주의 작은 컬렉션을 스크리닝하여 감염 부위에서 발생하는 형태 형성의 주요 조절자를 식별할 수 있도록 하는 방법을 설명합니다. 대표적인 결과가 제시되어 전사 조절자 Efg1과 같은 형태 형성의 일부 조절자가 시험관 내 및 생체 내에서 일관된 표현형을 갖는 반면, 아데닐 사이클라제(Cyr1)와 같은 다른 조절자는 시험관 내와 비교하여 생체 내에서 상당히 다른 표현형을 갖는다는 것을 보여줍니다.

여기에 제시된 결과는 이전에 발표 된 보고서 9,10을 기반으로합니다. 이 분석의 목표는 돌연변이 C. albicans가 활성 감염 중에 형태 형성을 겪는 능력을 정량적으로 평가하는 것입니다. 유사 균사와 균사를 구별하는 전형적인 매개 변수는 복잡한 생체 내 환경에서 3 차원으로 성장하는 유기체에서 평가하기 어려울 수 있습니다. 이는 컨포칼 이미징으로 생성된 2차원 단면을 볼 때 특히 그렇습니다. 따라서이 선별 분석은 사상 대 효모로 성장하는 유기체를 식별하는 데 중점을 둡니다. 3차원 재구성을 포함하여 보다 심층적인 분석을 사용하는 후속 연구의 경우 이 방법을 효모, 균사 및 유사 균사를 구별하는 데 적용할 수 있습니다.
C. albicans의 기준 또는 돌연변이 균주에서 형광 단백질의 발현은 생체 내에서 균주 형태를 간단하게 검출 할 수있게합니다 (그림 3 및 그림 4). 일반적으로 정량적 광학 현미경 분석은 이미지의 픽셀이 거의 또는 전혀 포화되지 않을 때 가장 잘 수행됩니다. 그러나 이 프로토콜의 경우 이미지의 채도가 분석을 단순화하는 경우가 많습니다. 형광 단백질 국소화는 세포 전체에 걸쳐 균일하지 않으며 종종 필라멘트보다 모효모에서 더 높습니다. 다행스럽게도 형태 형성을 조사하기 위해서는 신호의 강도보다는 신호의 공간 분포가 결과를 정의합니다. 따라서 많은 픽셀이 포화 된 이미지를 얻음은이 분석에서 형태 형성을 정량화하는 능력을 향상시킵니다.
생체내에서 형태형성 평가의 중요성을 설명하기 위해, 참조 균주 (SN250) 및 2개의 돌연변이체에 대한 대표적인 결과가 제시된다: 하나는 전사 인자 Efg1이 결여되고 다른 하나는 아데닐릴 사이클라제 Cyr1이 결여된다. 시험관 내에서 이러한 균주 중 어느 것도 필라멘트20,21로 성장하지 않습니다. 10% 혈청이 보충된 RPMI 배지에서 시험관 내에서 성장하면 기준 균주가 빠르게 필라멘트를 형성하는 반면 efg1ΔΔ 및 cyr1ΔΔ 균주는 그렇지 않습니다(그림 3 및 그림 4). 이러한 조건 하에서, efg1ΔΔ 돌연변이체는 다소 분극화된 성장을 나타내며, 딸 세포는 모세포에 비해 약간 길다. 이것은 필라멘트에 대한 명확한 정의를 사용하는 것의 중요성을 강조합니다. 그러한 정의는 기본적으로 임의적이지만 표현형의 일관된 평가를 위해 필요합니다. 이러한 연구에서 필라멘트 성장 패턴은 딸 세포의 가장 긴 차원을 모세포의 두 배 이상 가진 유기체로 정의됩니다. 이 정의를 사용하여, 길쭉한 efg1ΔΔ 세포는 필라멘트가 아니다.
시험관내 표현형과 일치하게, efg1 ΔΔ는 생체내에서 현저한 필라멘테이션 결함을 나타낸다: efg1ΔΔ 세포의 약 9%가 생체내에서 필라멘트로 성장하였다(도 3). 대조적으로, cyr1ΔΔ 돌연변이 세포의 53%는 생체 내에서 필라멘트로 성장했습니다(그림 4). 생체내에서 필라멘테이션을 받는 cyr1 ΔΔ 돌연변이체 세포의 수는 기준 균주보다 현저히 낮았지만, 생체내에서 필라멘트를 형성하는 cyr1ΔΔ 돌연변이체의 능력은 시험관내에서 형태형성의 완전한 결핍으로부터 실질적인 변화를 나타낸다. 시각적으로, cyr1ΔΔ 돌연변이체에 의해 형성된 필라멘트는 기준 균주보다 짧은 것으로 나타났다. 이를 정량적으로 평가하기 위해, 필라멘트 세포의 곡선 경로 길이는 in vivo 이미지의 2차원 투영을 이용하여 측정하였다(도 4E). cyr1ΔΔ 필라멘트의 중간 길이는 기준 균주의 필라멘트보다 29 % 짧았습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64258/64258fig01.jpg"> 그림 1: 마취 및 접종 . (A) 유도 챔버를 이용한 마취 유도. (B) 마취는 코 원뿔을 사용하여 유지되어 필요에 따라 마우스를 재배치 할 수 있습니다. (C) 제모 크림은 면봉 어플리케이터를 사용하여 도포한다. 눈 윤활 젤은 마취 중에 눈을 보호하기 위해 적용되었습니다. (D) 오른쪽 귀의 효과적인 제모. 치료되지 않은 왼쪽 귀와 비교하십시오. (E) 마우스 귀에 C. albicans 의 피내 주사. 귀는 양면 피부 테이프 (패션 테이프)로 감싼 원추형 튜브의 끝을 사용하여 제자리에 고정됩니다. (F) 피내 주사의 클로즈업. 피부에 창백한 거품이 형성되어 성공적인 피내 배치의 신호입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64258/64258fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64258/64258fig02.jpg"> 그림 2: 이미징 준비 . (A) 이미징을 위해 준비된 현미경 스테이지. 마취 코 콘이 제자리에 고정됩니다. 커버 슬립은 렌즈 개구부를 덮는 무대에 테이프로 붙여져 있습니다. 추가 테이프 조각을 사용할 수 있습니다. 가열된 스테이지는 37°C로 예열된다(도시되지 않음). (b) 마취된 마우스를 마취된 코뿔 내로 배치하는 단계. (C) 접종된 귀의 측면이 하단 커버슬립/대물 렌즈를 향하도록 마우스를 약간 회전시킵니다. 그런 다음 귀를 하단 커버슬립에 대해 평평하게 만들고 두 번째 커버슬립을 귀 위에 놓아 제자리에 고정합니다. (D) 상단 커버 슬립은 현미경 스테이지를 기준으로 귀를 제자리에 고정하기 위해 스테이지에 테이프로 고정됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64258/64258fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64258/64258fig3v2.jpg"> 도 3: efg1ΔΔ 돌연변이 균주의 시험관내 및 생체내 형태. (a) 4시간 동안 37°C에서 RPMI + 10% 혈청에서 성장 세포에 의한 필라멘션의 시험관내 유도 후 WT 및 efg1ΔΔ 돌연변이 균주의 광시야 이미지. 스케일 바는 10μm를 나타냅니다. 보기 쉽도록 사진 편집 소프트웨어를 사용하여 이미지 대비를 조정했습니다. (B) WT 및 efg1ΔΔ 돌연변이체 균주에서 관찰된 시험관내 필라멘테이션의 백분율. Und = 감지할 수 없음(필라멘트가 감지되지 않음). 바 높이는 적어도 100개의 세포가 정량화된 3개의 독립적인 실험으로부터의 사상 세포의 중간 백분율을 나타낸다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다(스튜던트 t-검정으로 비교한 결과, p &lt; 0.001). (c) 접종 후 24시간 동안 생체내에서 성장하는 WT(녹색) 및 efg1ΔΔ 돌연변이체(적색)의 공초점 현미경 사진. 화살표는 "사상"의 정의를 충족하는 efg1ΔΔ 돌연변이 세포의 예를 나타냅니다. 스케일 바는 50 μm를 나타낸다. (D) WT 및 efg1ΔΔ 돌연변이체 균주에서 관찰된 생체내 필라멘션의 백분율. 막대 높이는 두 개의 독립적인 실험에서 나온 사상 세포의 중간 백분율을 나타냅니다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다(스튜던트 t-검정으로 비교한 결과, p &lt; 0.001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64258/64258fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64258/64258fig04v2.jpg"> 도 4: cyr1 ΔΔ 돌연변이 균주의 시험관내 및 생체내 형태. (A) 4시간 동안 37°C에서 RPMI + 10% 혈청에서 성장 세포에 의한 필라멘션의 시험관 내 유도 후 cyr1ΔΔ 돌연변이 균주의 광시야 이미지. 스케일 바는 10 μm를 나타냅니다. 보기 쉽도록 사진 편집 소프트웨어를 사용하여 이미지 대비를 조정했습니다. (B) WT 및 cyr1ΔΔ 돌연변이체 균주에서 관찰된 시험관내 필라멘테이션의 백분율. Und = 감지할 수 없음(필라멘트가 감지되지 않음). 바 높이는 적어도 100개의 세포가 정량화된 3개의 독립적인 실험으로부터의 사상 세포의 중간 백분율을 나타낸다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다(스튜던트 t-검정으로 비교한 결과, p &lt; 0.001). (c) 접종 후 24시간 생체내에서 성장하는 WT(녹색) 및 cyr1ΔΔ 돌연변이체(적색)의 공초점 현미경 사진. 스케일 바는 50μm를 나타냅니다. (d) WT 및 cyr1ΔΔ 돌연변이체 균주에서 관찰된 생체내 필라멘트의 백분율. 막대 높이는 두 개의 독립적인 실험에서 나온 사상 세포의 중간 백분율을 나타냅니다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다(스튜던트 t-검정으로 비교한 결과, p &lt; 0.001). (E) z-stack의 2차원 투영에서 곡선 경로 길이로 측정된 생체 내 필라멘트 길이의 분포. 각 점은 한 필라멘트의 길이를 나타냅니다. 효모로서 성장하는 세포는 이 분석에 포함되지 않았다. 막대는 중간 필라멘트 길이를 나타냅니다. 길이 분포는 Mann-Whitney U 검정을 사용하여 분석할 때 유의하게 다릅니다(p &lt; 0.001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64258/64258fig04largev2.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

이 원고는 비침습적 공초점 현미경을 사용하여 포유류 숙주에서 활성 감염 동안 형태 형성 표현형에 대해 중간 크기의 칸 디다 알비칸스 돌연변이 라이브러리를 스크리닝하는 방법을 설명합니다.

Candida albicans is an important human pathogen. Its ability to switch between morphologic forms is central to&#160;its pathogenesis; these morphologic ...

칸디다 알비칸스 형태 형성은 무수한 환경 신호에 의해 유발됩니다. 생체 내 형태 형성을 연구함으로써 우리는 유기체가 이러한 모든 환경 신호를 통합하고 반응하는 방법을 결정합니다. 이 기술의 주요 장점은 시험관 내 모델 시스템을 사용하여 도입 될 수있는 편견이나 인공물이없는 상태에서 형태 형성을 연구 할 수 있다는 것입니다.피내 주사 경험이있는 사람은 거의 없습니다. 이 기술을 처음 접하는 사람은 동물 자원 수의사에게 연락하여 배우는 데 도움을 받는 것이 좋습니다. 절차를 시연하는 것은 우리 실험실 그룹의 박사후 연구원 인 Rohan Wakade가 될 것입니다.접종 전 최소 7 일 동안 엽록소가없는 차우를 먹여 접종을 위해 동물을 준비하는 것으로 시작하십시오. 주사하기 하루 전에 이쑤시개를 사용하여 한 식민지에서 캐나다 알비 칸스 세포를 가볍게 치십시오. 25 밀리리터의 YPD를 접종하고이 과정을 여러 번 반복하여 여러 다른 콜로니에서 세포를 얻습니다.배양물을 섭씨 30도의 175RPM의 궤도 쉐이커 인큐베이터에서 밤새 배양합니다. 500 x g에서 2 분 동안 1 밀리리터의 배양 물을 원심 분리 한 다음 1 밀리리터의 멸균 DPBS로 효모를 3 번 씻습니다. 펠릿을 멸균 DPBS 1밀리리터에 재현탁하고 배양물을 1 내지 100으로 희석한다.혈구계를 사용하여 세포를 세고 그에 따라 세포 밀도를 조정하십시오. 다음으로, 동일한 부피의 참조 균주와 실험 균주를 혼합하여 주입용 접종물을 만듭니다. 면봉을 사용하여 처방전 없이 살 수 있는 제모 크림을 마취된 동물의 양쪽 귀 안쪽과 바깥쪽 표면에 자유롭게 바릅니다.2-3 분 후 마른 거즈로 귀를 부드럽게 닦은 다음 멸균 된 물에 적신 거즈 패드를 사용하여 탈모 크림 잔여 물을 완전히 제거하십시오. 귀 표면을 70 % 에탄올로 멸균 한 후 바이알을 여러 번 뒤집거나 볼텍싱하여 접종 물을 잘 혼합합니다. 인슐린 주사기에 20-30 마이크로 리터의 접종 물을 넣습니다.바늘을 똑바로 세우고 주사기를 부드럽게 두드려 배럴의 공기가 상단에 있는지 확인합니다. 플런저가 10마이크로리터 표시에 오도록 공기와 과도한 접종물을 접종 튜브 또는 폐 튜브로 조심스럽게 다시 배출합니다. 카운터 양면 스킨 테이프를 작은 원추형 또는 둥근 바닥 플라스틱 튜브에 바르고 테이프를 가로 질러 귀를 드레이프하여 마취 코 콘이 빠지지 않도록하십시오.주사기 바늘을 피부와 거의 평행하게 유지하고 큰 정맥을 피하면서 경사가 덮일 때까지 바늘 끝을 피부의 가장 바깥 쪽 층에 삽입하고 천천히 접종 물을 피내 주사합니다. 좋은 피내 주사는 피부에 작은 거품을 일으 킵니다. 누출을 최소화하기 위해 귀에서 바늘을 제거하기 전에 바늘을 15-20 초 동안 제자리에 유지하십시오.기관 프로토콜에 따라 케이지의 동물이 칸디다 알비 칸스에 감염되었음을 나타내는 생물학적 위험 라벨로 케이지를 표시하십시오. 접종물을 제조하는데 사용된 동일한 세척된 배양물을 사용하여, RPMI 1640에서 세포의 1 내지 50 희석액을 만들고, 10%열 및 활성화된 태아 소 혈청을 보충하고, 4시간 동안 텀블링과 함께 섭씨 37도에서 배양한다. 현미경을 사용하여 샘플을 검사합니다.적어도 100 개의 세포를 세고 각 균주에 대한 효모 및 사상 세포의 수를 기록합니다. 작동 거리가 긴 대물렌즈를 제자리로 돌리고 렌즈에 액침액 방울을 놓습니다. 커버 슬립을 놓을 때 발생할 수 있는 손상을 방지하기 위해 렌즈를 내립니다.1.5번 커버 슬립을 무대 개구부 위에 놓고 제자리에 테이프로 붙입니다. 침지액이 대물 렌즈와 커버 슬립에 닿도록 대물렌즈를 들어 올립니다. 현미경 스테이지에 마취 코 원뿔을 고정하여 이미징 위치에 있을 때 동물의 코를 완전히 덮습니다.마취 된 마우스의 코를 코 원뿔에 넣습니다. 대물 렌즈 위의 커버 슬립에 멸균수 한 방울을 놓습니다. 마취 코 콘을 조정하고 마우스의 귀가 물방울 위에 오도록 마우스를 배치합니다.다른 커버 슬립을 가져와 커버 슬립의 가장자리가 마우스 본체와 평행하도록 놓고 가장자리가 귀와 머리가 만나는 마우스에 닿도록 합니다. 힌지 동작을 사용하여 커버 슬립의 자유 가장자리를 현미경 스테이지로 내립니다. 커버 슬립이 현미경 스테이지에 닿으면 귀가 평평해집니다.상단 덮개 슬립을 테이프로 단단히 고정하여 귀를 평평하게 유지하고 테이프에 쥐의 머리카락이나 수염이 걸리지 않도록 충분한 압력을 유지합니다. 환경 챔버가 있는 현미경을 사용하지 않는 한 정상적인 열 환경을 유지하기 위해 멸균 드레이프로 마우스 몸을 느슨하게 덮으십시오. 백색광, 광시야 이미징을 사용하여 초점 평면을 귀 조직으로 조정하고 혈관에서 움직이는 적혈구에 초점을 맞춥니다.시야의 모든 세포에 대해 형태를 결정할 수 있도록 충분히 강한 신호 대 잡음비를 얻으려면 레이저 출력 또는 이미징 속도를 조정하십시오. 조직 손상을 방지하려면 가능한 가장 낮은 레이저 출력을 사용하십시오. 참조된 균주에서 명확한 필라멘트 형성이 있고 대부분의 유기체가 형태를 결정할 수 있을 만큼 충분히 퍼져 있는 시야를 선택하십시오.Z 스택의 상단 및 하단 초점 평면을 설정합니다. 감염된 영역의 전체 깊이를 덮을 필요는 없지만 이미징 된 볼륨의 상단 또는 하단에있는 유기체는 일반적으로 분석에서 제외됩니다. Z 스택 이미지를 획득하고 각 채널을 의사 색상으로 지정하여 각 변형을 구별하고 채널을 오버레이합니다.이미지를 저장합니다. 이미징 소프트웨어를 사용하여 Z 스택을 2차원 이미지로 최대 투영합니다. 최대 투영 이미지에서 볼 수 있는 각 유기체를 균주 유형 및 형태별로 계산합니다.참조된 균주는 시험관 내에서 빠르게 필라멘트를 형성합니다. EFG1 Null은 필라멘트를 형성하지 못했습니다. EFG1 Null은 생체 내에서도 상당한 필라멘트 결함을 나타냅니다.EFG1 Null 세포의 약 9%는 생체 내에서 필라멘트로 성장했습니다. 유사하게, CYR1 Null 돌연변이체 균주는 참조된 균주와 비교하여 시험관내에서 필라멘테이션 결함을 나타내었다. 대조적으로, CYR1 Null 돌연변이 세포의 53%는 생체 내에서 필라멘트로 성장했습니다.CYR1 Null 돌연변이체에 의해 형성된 필라멘트는 참조된 균주보다 짧았다. 접종하는 동안 바늘을 피부와 평행하게 유지하는 것이 중요합니다. 목표는 접종 물을 피부의 바깥층 바로 아래에 놓는 것입니다.이 기술은 또한 관심 숙주 세포에서 형광 단백질을 발현하는 마우스 균주와 함께 사용할 수 있어 생체 내에서 숙주 병원체 상호 작용을 연구할 수 있습니다.

use-vivo-imaging-to-screen-for-morphogenesis-phenotypes-candida

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

라이브 호스트에 트렌스 제닉 Leishmania의 기생충의 생체내 이미징에서

zebrafish의 급속한 발전, 소형 크기 및 투명성은 감염의 타고난 면역 제어 연구를위한 엄청난...

Zebrafish 애벌레의 분해해 칸디다 증의 비침습 이미징

신생아 인간의 사이토 메갈로 바이러스 (HCMV) 감염은 정신 지체의 중요한 원인을 나타내는, 아직 바이러스에 의한 발병으로 이어지는 분자 이벤트가 여전히 제대로 이해하고 있습니다. 뇌 감염의 역학을 조사하기 위해, 우리는 전체 - 동물의...

사용<em&gt; 생체 내</em&gt; 이미징 신생아의 실험 쥐 거대 세포 바이러스 감염의 진행 상황을 모니터링 할 수

이 비디오 기사는 성공적으로 전체 동물의 척추 생물을 사용하여 복합 검사 및 약물 발견을위한 새로운 강력한 도구를 제공하는 제브라 피쉬 배아 많은 수의 감염 및 분석하기 위해 설립 된 높은 처리 파이프 라인에 대해 설명합니다.

설립과 연구에 높은 처리량 설정 최적화<em&gt; 표피 포도 구균</em&gt;와<em&gt; Mycobacterium의 박테</em&gt; 감염 신약 개발의 모델로

마우스 피하 모델에서 칸디다 알비칸스 생물막 발달의 실험적 절차를 제시합니다. 진균 생물막은 군집 형성 단위의 수를 결정하고 생성되는 빛의 양이 생존 가능한 세포의 수와 일치하는 비침습적 생물 발광 이미징에 의해 정량화되었습니다.

생물 발광 영상에 이어 마우스 피하 모델의 의학 관련 외국 기관에 칸디다 알비 칸스 (Candida albicans)에 바이오 필름 ​​개발

여기, 선물이 미생물 상호 작용을 공부 하는 다양 한 호스트 모델로 선 충 류 꼬마 선 충 .

선 충 꼬마 선 충-모델을 다양 한 비보에 호스트-미생물 상호작용 연구

이 프로토콜의 목적은 포유류 위장관에서 칸디다 알비칸스 세포 모양 및 국소화를 시각화하는 것입니다.

시투 혼성화에서 형광을 사용하여 뮤린 위장에서 칸디다 알비칸스의 시각화

이 작품은 한 번의 하룻밤 실행에 80-100 C. 예쁜 꼬마 배아에서 배아의 동시 3D 시간 경과 영상을 허용하는 반 높은 처리량 프로토콜을 설명합니다. 또한 데이터 분석을 간소화하기 위해 이미지 처리 및 시각화 도구가 포함되어 있습니다. 사용자 정의 리포터 균주와 이러한 방법의 조합은 배아 발생의 상세한 모니터링을 가능하게.

C. elegans 배아 개발을 분석하는 세미 고처리량 이미징 방법 및 데이터 시각화 툴킷

이 연구에서 기장 균질 추출물과 면역형광 스테인링을 사용하여 기술된 전 생체 분석법은 기관에서 칸디다 알비칸스의 최면 형태 발생을 검사하는 새로운 방법을 나타낸다. 이 방법은 창자에 있는 형태유전학 전이를 통제하는 환경 신호를 조사하기 위하여 이용될 수 있습니다.

칸디다 알비칸스 위장관에서 최면 모포 발생을 연구하는 Ex vivo 분석

이 프로토콜은 구강 칸디다증의 쥐 모델에서 항균 광역학 요법(aPDT)의 적용을 설명합니다. aPDT는 커큐미노이드와 청색 LED 조명의 수용성 혼합물을 사용하여 수행되었습니다.

구강 칸디다증의 쥐 모델에 대한 커큐미노이드 매개 항균 광역학 요법

배우세요 포유류 숙주에서 Candida albicans 돌연변이 균주의 형태형성 표현형을 스크리닝하는 생체 내 공초점 현미경 기법. 이 방법은 감염 중 진균의 적응 메커니즘을 연구하는 데 필수적입니다.

포유류 숙주에서 활성 감염 중 칸디다 알비칸스 돌연변이 균주에서 형태형성 표현형을 스크리닝하기 위한 생체 내 이미징 사용

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