Name: 약물 전달 시스템과 체 외 세포 간의 상호 작용에 대한 실험적 정량화: 전임상 나노의학 평가를 위한 가이드 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: 학습하세요 유세포분석을 이용한 약물 전달 시스템과 세포 간 상호 작용의 정량적 분석 방법. 이 기술은 전임상 나노의학 평가에서 정성적 결과를 정량적 데이터로 변환하여 약물 운반체의 최적화와 공학적 설계에 필수적인 통찰을 제공합니다.

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이 연구는 호주 국립 보건 및 의학 연구위원회 (NHMRC; 프로그램 보조금 번호 GNT1149990), 호주 HIV 및 간염 바이러스 연구 센터 (ACH2) 및 Réjane Louise Langlois의 재산에서 선물. FC는 NHMRC(National Health and Medical Research Council) 수석 수석 연구 펠로우십(GNT1135806)의 상을 수상했습니다. 그림 1 과 그림 2 는 BioRender.com 사용하여 만들었습니다.

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<li>Cheng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+ORgan+Targeting+%28SORT%29+nanoparticles+for+tissue+specific+mRNA+delivery+and+CRISPR%2FCas+gene+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Selective ORgan Targeting (SORT) nanoparticles for tissue specific mRNA delivery and CRISPR/Cas gene editing.</a> Nature Nanotechnology. 15 (4), 313-320 (2020).</li>
<li>Jackson, N. A. C., Kester, K. E., Casimiro, D., Gurunathan, S., DeRosa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+of+mRNA+vaccines%3A+A+biotech+and+industrial+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22npj+Vaccines%22%5BJournal%5D)">The promise of mRNA vaccines: A biotech and industrial perspective.</a> npj Vaccines. 5 (1), 1-6 (2020).</li>
<li>Press, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cargo-carrier+interactions+significantly+contribute+to+micellar+conformation+and+biodistribution%5BTitle%5D)+AND+%22NPG+Asia+Materials%22%5BJournal%5D)">Cargo-carrier interactions significantly contribute to micellar conformation and biodistribution.</a> NPG Asia Materials. 9 (10), 444(2017).</li>
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<li>Shin, H., Kwak, M., Geol Lee, T., Youn Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+the+level+of+nanoparticle+uptake+in+mammalian+cells+using+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Quantifying the level of nanoparticle uptake in mammalian cells using flow cytometry.</a> Nanoscale. 12 (29), 15743-15751 (2020).</li>
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<li>Schwartz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formalization+of+the+MESF+unit+of+fluorescence+intensity%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+B%2C+Clinical+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Formalization of the MESF unit of fluorescence intensity.</a> Cytometry. Part B, Clinical Cytometry. 57 (1), 1-6 (2004).</li>
<li>Faria, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+cell-particle+association+in+vitro%3A+A+quantitative+method+to+compare+particle+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Revisiting cell-particle association in vitro: A quantitative method to compare particle performance.</a> Journal of Controlled Release. 307, 355-367 (2019).</li>
<li>Chen, A. K., Cheng, Z., Behlke, M. A., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+the+sensitivity+of+commercially+available+fluorophores+to+the+intracellular+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Assessing the sensitivity of commercially available fluorophores to the intracellular environment.</a> Analytical Chemistry. 80 (19), 7437-7444 (2008).</li>
<li>Comfort, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticle+tracking+analysis+for+the+quantification+and+size+determination+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Nanoparticle tracking analysis for the quantification and size determination of extracellular vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments. (169), e62447(2021).</li>
<li>Cui, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilized+particle+imaging+for+quantification+of+nano-+and+microparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Immobilized particle imaging for quantification of nano- and microparticles.</a> Langmuir. 32 (14), 3532-3540 (2016).</li>
<li>Shang, J., Gao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticle+counting%3A+Towards+accurate+determination+of+the+molar+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Nanoparticle counting: Towards accurate determination of the molar concentration.</a> Chemical Society Reviews. 43 (21), 7267-7278 (2014).</li>
<li>Thomas, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ISD3%3A+A+particokinetic+model+for+predicting+the+combined+effects+of+particle+sedimentation%2C+diffusion+and+dissolution+on+cellular+dosimetry+for+in+vitro+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Particle+and+Fibre+Toxicology%22%5BJournal%5D)">ISD3: A particokinetic model for predicting the combined effects of particle sedimentation, diffusion and dissolution on cellular dosimetry for in vitro systems.</a> Particle and Fibre Toxicology. 15 (1), 6(2018).</li>
<li>Johnston, S. T., Faria, M., Crampin, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+the+sources+of+heterogeneity+in+nano-engineered+particle-cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+the+Royal+Society+Interface%22%5BJournal%5D)">Isolating the sources of heterogeneity in nano-engineered particle-cell interactions.</a> The Journal of the Royal Society Interface. 17 (166), 20200221(2020).</li>
<li>Ahmed-Cox, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatio-temporal+analysis+of+nanoparticles+in+live+tumor+spheroids+impacted+by+cell+origin+and+density%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Spatio-temporal analysis of nanoparticles in live tumor spheroids impacted by cell origin and density.</a> Journal of Controlled Release. 341, 661-675 (2022).</li>
<li>Faria, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimum+information+reporting+in+bio-nano+experimental+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Minimum information reporting in bio-nano experimental literature.</a> Nature Nanotechnology. 13 (9), 777-785 (2018).</li>
</ol>

저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

약물 운반체와 세포 간의 상호 작용을 특성화하는 것은 새로운 약물 전달 시스템의 개발에서 점점 더 중요해지고 있습니다. 구체적으로, 다양한 캐리어 구축물의 합리적인 평가 및 비교를 허용하기 위해, 표적 및 비표적 세포와 상호작용하는 상기 캐리어의 성능의 절대적인 정량화가 중요하다. 이 프로토콜은 약물 운반체와 함께 작업하는 모든 연구자가 세포-운반체 결합에 대한 상대적 반정량적 유세포분석 데이터를 절대 정량적 결과로 변환할 수 있도록 하는 2-스트림 방법론을 설명합니다. 윤곽이 잡힌 공정은 모든 유형의 담체(소형, 대형, 유기물, 무기물)에 적용할 수 있으며 형광 라벨이 부착된 경우 적용할 수 있습니다. 그러나 다른 캐리어는 셀당 캐리어를 계산하기 위해 다른 접근 방식을 필요로합니다. 이는 필요한 특성화 측정에 사용되는 다양한 기기의 한계 때문입니다.
따라서 이 프로토콜은 세포분석기 스트림과 벌크 스트림의 두 스트림으로 나뉩니다. 첫 번째인 Cytometer Stream은 보다 ...

만나는 세포 유형에 따라 특이적이고 설계된 행동을 나타내는 약물 전달 구조체의 설계는 상당한 연구 관심을 끌었습니다. 잠재적인 약물 전달 구축물 또는 "담체"는 지질 제형, 나노성장 무기물, 중합체 어셈블리, 세포외 소포, 기능화된 박테리아 세포, 또는 변형된 바이러스를 포함한다. 이들 모두는 물리적 특성, 표면 특성 또는 항체 부착 1,2와 같은 공학적 화학적 기능화로 인해 장기, 조직 또는 세포 특이성을 나타낼 수 있습니다.
시험관내 담체 평가에서 거의 유비쿼터스 단계는 상기 약물 로딩 담체를 함유하는 현탁액으로 세포를 배양하는 것이다. 인큐베이션 후, 담체 성능은 약물 화물의 성능, 예를 들어 형질주입 효율 또는 독성의 기능적 판독을 통해 측정된다. 기능 판독값은 캐리어 효율성의 다운스트림 척도이므로 유용합니다. 그러나 더 복잡한 약물 전달 구조체의 경우 기능적 판독을 넘어 관심 세포와의 캐리어 상호 작용 정도를 개별적으로 정량화하는 것이 점점 더 중요해지고 있습니다. 여기에는 몇 가지 이유가 있습니다.
첫째, 다양한화물을 운반 할 수있는 "플랫폼"운송 기술을 발견 (및 반복적으로 개선)하는 데 대한 관심이 증가하고 있습니다. 예를 들어, RNA를 캡슐화하도록 설계된 지질 나노 입자 (LNP)는 몇 가지주의 사항없이 하나의 RNA 서열을 다른 RNA 서열로 교환 할 수 있습니다3. 따라서 캐리어 기술을 반복적으로 개선하려면 화물 기능과 관계없이 성능을 정량화하는 것이 중요합니다. 둘째, 기능적 판독은 관심 화물에 대해 간단하지 않을 수 있으며, 캐리어 제형을 신속하게 반복하고 평가하는 능력을 손상시킬 수 있습니다. 간단한 기능 판독(예: 형광)이 있는 모델 화물을 사용하여 시험관 내 최적화를 수행할 수 있는 반면, 화물을 변경하면 캐리어(4 )에 대한 생물학적 반응이 변경될 수 있으므로 대표 결과를 산출하지 못할 수 있습니다. 셋째, 많은 운반체는 특정 세포 유형과 상호 작용하고 흡수되도록 설계되었습니다. 담체의 이러한 타겟팅 능력은 그의 치료적 화물 포스트 타겟팅의 성능과 구별될 수 있고 구별되어야 한다. LNP 예를 계속하기 위해 RNA 화물은 매우 강력할 수 있지만 LNP가 세포에 결합하여 내재화되고 RNA를 방출할 수 없는 경우 다운스트림 기능 효과가 관찰되지 않습니다. 이는 특히 T 세포5와 같이 형질감염하기 어려운 세포 유형을 표적으로 하는 담체에게 문제가 될 수 있습니다. 반대로 LNP는 매우 효과적으로 표적화할 수 있지만 RNA 화물은 작동하지 않을 수 있습니다. 화물 기능만 측정하는 다운스트림 분석으로는 이 두 가지 상황을 구별할 수 없으므로 운반체 약물 전달 시스템의 개발 및 최적화가 복잡해집니다.
이 작업에서는 캐리어 연관성 을 절대적으로 정량화하는 방법에 대해 논의합니다. 연관성은 실험적으로 측정된 운반체와 세포 간의 상호 작용 정도를 나타내는 용어입니다. 결합은 막 결합과 내재화를 구별하지 않는다 - 담체는 세포 표면에 결합되어 있거나 세포가 그것을 내재화했기 때문에 연관될 수 있다. 연관성은 일반적으로 세포-담체 배양 실험의 일부로 측정됩니다. 역사적으로 연관성은 임의의 형광 단위 (일반적으로 "중간 형광 강도"또는 MFI) 또는 "퍼센트 연관성"으로보고되었으며, 그 한계는 이전에 논의되었습니다6. 요컨대, 이러한 측정은 실험 프로토콜, 유세포분석기 설정 및 다른 운반체의 라벨링 강도의 차이로 인해 실험, 실험실 및 약물 운반체 간에 비교할 수 없습니다. 세포 분석기를 보정하여 MFI의 상대적 측정을 형광7의 절대 정량적 측정으로 변환함으로써 전자를 극복하기위한 노력이 이루어졌습니다. 그러나, 이 방법은 다양한 캐리어의 라벨링 강도에서의 가변성을 설명하지 않으며, 따라서, 선택(8)의 타겟 셀에서 다양한 캐리어 성능의 합리적인 비교를 허용하지 않는다.
여기서, 상대적이고 임의의 형광 단위로부터 "세포당 운반체의 수"의 절대 정량적 메트릭으로 실질적으로 변환하는 방법은 소수의 추가 특성화 실험을 수행하여 입증된다. 캐리어 농도의 다른 메트릭이 필요한 경우(예: 셀당 캐리어 질량 또는 셀당 캐리어 부피), 캐리어 특성화가 수행된 경우 셀당 캐리어에서 변환하는 것이 간단합니다. 간결함과 전문 용어를 피하기 위해 이 작업에서 "운반체"라는 단어는 방대한 약물 전달 구조를 지칭하는 데 사용됩니다. 이러한 정량화 기술은 나노 공학 금 입자 또는 생체 공학 박테리아에 적용되는지 여부에 관계없이 동일하게 적용됩니다.
몇 가지 사실은 임의의 형광 단위에서 세포당 운반체로의 변환을 가능하게 합니다. 첫째, 측정된 형광 강도는 형광단9(또는 형광 표지된 담체)의 농도에 비례하며, 형광이 기기의 검출 한계 내에 있고 기기 설정이 동일하다고 가정합니다. 따라서 캐리어의 형광과 샘플의 형광을 알고 있으면 모든 측정이 동일한 설정 및 조건에서 수행되면 해당 샘플에 얼마나 많은 캐리어가 존재하는지 확인할 수 있습니다. 그러나 특히 더 작은 캐리어의 경우 동일한 설정으로 동일한 기기에서 캐리어 형광, 세포 자가형광 및 캐리어와 연결된 세포 형광을 측정하는 것이 불가능할 수 있습니다. 이 경우 한 기기에서 측정된 형광과 다른 기기에서 측정된 형광 간에 변환할 수 있도록 하는 두 번째 요구 사항이 있습니다. 이를 위해 형광단 농도의 표준 곡선을 설정하여 등가 가용성 형광체 분자(MESF) 표준9를 활용하여 두 기기의 형광 강도를 측정할 수 있습니다. 그런 다음 비세포분석기에서 대량으로 운반체 형광을 측정할 수 있으며, 이는 모든 크기 또는 특성의 운반체에서 수행할 수 있는 측정입니다. 이러한 벌크 정량화가 알려진 농도의 담체 현탁액에 대해 수행될 때, 샘플의 세포당 담체의 수가 다시 한번 계산될 수 있다.
이 작업은 캐리어 연관성을 측정하는 프로세스 (측정 된 형광 강도에 의해 결정됨)를 보여 주지만, 유사한 프로토콜이 세포-캐리어 상호 작용의 다른 측정 (예 : 내재화 된 캐리어와 막 결합 캐리어를 구별하는 실험 프로토콜)에 대해 수행 될 수 있습니다. 또한, 이 프로토콜은 연관성이 비형광 분석(예: 질량 세포분석을 통해)을 통해 측정된 경우 대체로 동일합니다.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 647 C2 Maleimide</td><td>Invitrogen</td><td>A20347</td><td>150 nm, 235 nm 또는 633 nm PMA<>subSH 캐리어를 라벨링하는 데 사용되는 pH 안정성 염료; 세포-캐리어 연관 연구에 사용할 수 있는 좋은 염료의 예</td></tr><tr><td>Apogee A50 Microflow</td><td>Apogee</td><td></td> Sensitive <td>유세포분석기 계수를 위한 소형 캐리어를 검출할 수 있는</td></tr><tr><td>CytoFLEX S 유세포분석기</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>카운팅을 위해 작은 캐리어를 검출하고 최종 세포 장벽 실험을 위해 판독할 수 있는 민감한 유세포 분석기</td></tr><tr><td>FCS Express</td><td>De Novo 소프트웨어</td><td></td><td>소프트웨어는 유세포 분석 데이터를 분석하는 데 사용됩니다(예: 게이팅을 수행하고 선택한 집단의 중앙값 형광 강도 값을 도출합니다). 대안으로는 FlowJo, OMIQ, Python</td></tr><tr><td>Infinite 200 PRO</td><td>Tecan Lifesciences</td><td></td><td>용액에서 캐리어의 벌크 형광 측정에 사용되는 표준 마이크로플레이트 리더 기기</td></tr>, <tr><td>LSRFortessa 세포 분석기</td><td>BD Biosciences,</td><td></td><td>덜 민감한 유세포 분석기, 그러나 연구자가 일반적으로 사용할 수 있는 분석기가 있습니다. 최종 세포 캐리어 실험을 판독하는 데 사용할 수 있습니다</td></tr>: <tr><td>NanoSight NS300</td>, <td>Malvern Panalytical</td><td></td><td>Instrument, 나노 입자 추적 분석에 사용되는</td></tr><tr><td>기기, Prism 8</td>, 표준 곡선을 그래프로 표시하고 계산하는 데 사용되는 <td>GraphPad</td><td></td><td>소프트웨어. 대안으로는 Microsoft Excel, Origin, Minitab, Python 등이 있습니다</td></tr><tr><td>: Quantum MESF 키트, Alexa Fluor 647</td>, <td>Bangs Laboratories</td><td>647</td>, <td>유세포 분석기용 절대 정량 분석 비드. 마이크로플레이트 리더에서 대량으로 측정한 형광 강도를 MESF 표준을 사용하여 유세포 분석기에서 측정한 형광 강도로 변환하는 데 사용됩니다.</td></tr></tbody></table>

약물 전달 시스템과 체 외 세포 간의 상호 작용에 대한 실험적 정량화: 전임상 나노의학 평가를 위한 가이드

Experimental Quantification of Interactions Between Drug Delivery Systems and Cells In Vitro: A Guide for Preclinical Nanomedicine Evaluation

약물 전달 시스템 설계의 주요 구성 요소는 특정 세포 유형과의 상호 작용을 증폭하거나 약화시키는 방법에 관한 것입니다. 예를 들어, 화학 요법은 암세포에 대한 결합을 향상시키는 항체로 기능화 ( "표적화") 또는 면역 세포 인식을 회피하는 데 도움이되는 폴리에틸렌 글리콜로 기능화 될 수 있습니다 ( "스텔스"). 세포 수준에서도 약물 운반체의 결합 및 흡수를 최적화하는 것은 복잡한 생물학적 설계 문제입니다. 따라서 새로운 담체가 세포와 얼마나 강하게 상호 작용하는지와 일단 해당 세포로 전달되면 담체의화물의 기능적 효능을 분리하는 것이 중요합니다.
화학 요법의 예를 계속하기 위해 "암세포에 얼마나 잘 결합하는지"는 "암세포를 얼마나 잘 죽이는지"와는 별개의 문제입니다. 후자에 대한 정량적 체외 분석은 잘 확립되어 있으며 일반적으로 생존력 측정에 의존합니다. 그러나 세포-운반체 상호 작용에 대한 대부분의 발표 된 연구는 정 성적 또는 반 정량적입니다. 일반적으로 이러한 측정은 캐리어의 형광 표지에 의존하며 결과적으로 상대적 또는 임의의 단위로 세포와의 상호 작용을 보고합니다. 그러나이 작업은 표준화 될 수 있으며 소수의 특성화 실험으로 절대적으로 정량적으로 만들 수 있습니다. 이러한 절대 정량화는 나노입자, 마이크로입자, 바이러스, 항체-약물 접합체, 조작된 치료 세포 또는 세포외 소포와 같은 다양한 약물 전달 시스템의 합리적, 클래스 간 및 클래스 내 비교를 용이하게 하기 때문에 가치가 있습니다.
또한 정량화는 후속 메타 분석 또는 인실리코 모델링 접근 방식의 전제 조건입니다. 이 기사에서는 캐리어 크기 및 라벨링 양식의 차이를 고려한 캐리어 약물 전달 시스템에 대한 체외 정량화를 달성하는 방법에 대한 의사 결정 트리와 비디오 가이드를 제공합니다. 또한 고급 약물 전달 시스템의 정량적 평가에 대한 추가 고려 사항이 논의됩니다. 이것은 차세대 의학을위한 합리적인 평가와 설계를 향상시키는 귀중한 자원으로 사용하기위한 것입니다.

이전에 논의된 바와 같이, 상이한 약물 담체 유형은 세포-담체 결합의 절대 정량화를 위해 상이한 기술의 사용을 필요로 한다. 예를 들어, 633nm 디설파이드 안정화 폴리(메타크릴산)(PMASH) 코어쉘 입자는 민감한 유세포분석기를 사용하여 검출하기에 충분히 크고 밀도가 높습니다. 따라서 이러한 입자는 형광으로 표지 된 다음 측면 각도 광산란 (SALS, SSC와 유사)과 적절한 형광 채널을 사용하여 게이팅되고 계수되었습니다 (그림 3). 두 채널의 이벤트 수 차이는 1.98%로 허용 범위 내에 있었습니다.
대조적으로, 100nm 초상자성 산화철 나노입자는 너무 작아서 개별적으로 검출할 수 없으므로 Bulk Stream을 사용하여 분석했습니다. 이러한 나노 입자는 나노 입자 추적 분석을 사용하여 계수되고 특성화되었습니다 (그림 4). 136 nm의 평균 ...

유세포분석을 사용하여 약물 운반체-세포 상호 작용의 절대 정량화를 위한 워크플로우를 입증하여 새로운 약물 전달 시스템을 보다 합리적으로 평가할 수 있습니다. 이 워크 플로우는 모든 유형의 약물 운반자에게 적용 할 수 있습니다.

A major component of designing drug delivery systems concerns how to amplify or attenuate interactions with specific cell types. For instance, a ...

이 프로토콜은 캐리어 시스템이 세포와 상호 작용하는 방식에 대한 정량적 데이터를 제공합니다. 정량적 데이터는 엔지니어링 및 최적화의 핵심입니다. 그것은 우리가 예 또는 아니오 생물학적 질문에서 얼마나 많은 질문으로 이동할 수있게합니다.이 기술은 정성적이었던 전임상 약물 운반체 성능의 결과를 정량적 결과로 변환하는 데 유용합니다. 그리고 이것은 세포를 특성화하는 것과 다른 시스템에서 캐리어를 특성화하는 경우에도 작동합니다. 나노 측의 선형 또는 정량적 범위 내에 속하는 최적의 캐리어 희석을 찾기 위해 몇 번의 반복이 필요할 수 있습니다.올바른 조건을 찾는 데 시간을 할애하십시오. 시작하려면 플로우 셀을 레이저 모듈에 장착하십시오. 1 밀리리터의 증류수로 초당 0.1 밀리리터의 속도로 플로우 셀을 천천히 세척하십시오.플로우 셀 내에 기포가 형성되면 진행하기 전에 현탁액을 부분적으로 수축시켜 기포를 공기-액체 계면과 병합합니다. 그런 다음 전체 레이저 모듈을 기기 내부의 제자리에 잠급니다. 플러싱의 중간쯤에 카메라를 시작합니다.캐리어 파편이 씻겨 나갔는지 확인하십시오. 캡처를 선택하여 캡처 설정 탭을 열고 카메라 시작을 클릭합니다. 1 밀리리터의 공기로 시스템을 구동하십시오.화면에 정전기 캐리어가 보이면 제조업체의 지침에 따라 플로우 셀을 청소하십시오. 관련된 캐리어 시스템에 따라 캐리어가 초음파 처리 또는 와류를 통해 잘 중단되도록 하여 나노입자 추적 분석을 위한 캐리어를 준비합니다. 담체를 물에 희석하여 밀리리터당 1x10 내지 7번째 담체 및 1x10 내지 9번째 담체 농도를 갖는 각 샘플의 적어도 0.6 내지 1 밀리리터를 제조한다.레이저 모듈을 꺼내 똑바로 세우십시오. 첫 번째 캐리어 샘플을 1 밀리리터 주사기에 떨어 뜨리고 주사기를 튜브 입구에 부착합니다. 그런 다음 샘플을 플로우 셀에 조심스럽게 로드합니다.플로우 셀 내에 기포가 형성되면 계속하기 전에 현탁액을 부분적으로 수축시켜 기포를 공기-액체 인터페이스와 병합합니다. 전체 플로우 셀이 액체로 채워져 있는지 확인한 다음 로딩을 일시 중지합니다. 개별 캐리어를 시각화하기 위해 필요한 경우 카메라 초점을 조정합니다.악기의 오른쪽에 있는 회전 손잡이로 초점을 거칠게 조정합니다. 하드웨어 탭을 선택하여 더 세밀하게 조정합니다. 초점 슬라이더를 조정하여 초점을 변경합니다.과포화가 없는지 확인하려면 캡처 탭에서 슬라이더를 조정하여 최적의 카메라 레벨을 선택합니다. 기기에 이 액세서리가 장착되어 있는 경우 캐리어 샘플이 포함된 주사기를 주사기 펌프에 로드합니다. SOP 탭에서 표준 측정을 선택하여 각각 30초씩 5회 캡처합니다.기본 파일 이름을 입력하고 원하는 경우 고급 버튼을 클릭하여 샘플 정보를 추가하면 다양한 선택 항목이 있는 모달 대화 상자가 열립니다. 스크립트 만들기 및 실행을 누르고 샘플을 진행하라는 팝업이 나타날 때까지 기다립니다. 주사기 펌프를 사용하는 경우 하드웨어 탭을 선택한 다음 주사기 펌프 탭을 선택합니다.원하는 주입 속도를 설정하고 주입을 누릅니다. 주사기 펌프를 사용하지 않는 경우 샘플을 수동으로 진행하십시오. 팝업 창에서 확인을 선택하여 캡처를 시작합니다.5개의 캡처 각각이 완료된 후 고급 샘플 팝업이 다시 나타나면 샘플이 여전히 플로우 셀을 통해 이동하고 있는지 확인합니다. 그런 다음, 확인을 선택하여 다음 캡처를 진행합니다. 프로세스 탭에서 감지 임계값 슬라이더를 4에서 8 사이로 조정하여 화면에 표시되는 개별 캐리어를 올바르게 식별합니다.시각화를 돕기 위해 화면 게인을 조정할 수 있으며 다운스트림 분석에는 영향을 미치지 않습니다. 팝업에서 확인을 눌러 추적 분석을 시작합니다. 단일 분석에서 분석 탭을 클릭하여 분석 진행률을 모니터링합니다.분석이 완료되면 내보내기 설정 프롬프트가 나타나는지 확인합니다. PDF 포함 및 실험 요약 포함이 선택되어 있는지 확인합니다. 원하는 대로 다른 내보내기 형식을 선택합니다.PDF 데이터 내보내기의 결과 섹션에서 측정된 농도를 신뢰할 수 있는지 확인하려면 측정된 캐리어 농도가 밀리리터당 1x10에서 7번째, 1x10에서 9번째 캐리어 사이인지 확인하고 농도 측정 결과 아래에 오류 메시지 또는 주의 메시지가 있는지 확인합니다. 스톡에서 다른 희석액으로 절차를 두 번 이상 반복하고 각 샘플의 농도가 기기의 선형 범위 내에 있는지 확인하십시오. 텍스트 원고에 설명된 대로 재고 운반선 농도를 계산합니다.유리 또는 항체 접합 형광 색소 용액을 텍스트 원고에 기재된 대로 준비한다. 방정식과 같이 농도, 분자량 및 Avogadro의 수로부터 원액의 농도를 계산하십시오. 그런 다음 캐리어 희석제에서 염료의 연속 희석을 수행하여 표준 곡선 샘플을 생성합니다.그런 다음 캐리어 샘플을 측정 플레이트에 추가하고 마이크로플레이트 리더를 사용하여 형광을 측정합니다. 텍스트 원고에 설명된 대로 표준 곡선을 생성합니다. 운반체당 절대 형광 강도는 벌크 형광을 운반체 농도로 나누어 계산합니다.관련 채널에서 최적의 PMT 전압 설정을 결정하여 최종 캐리어 셀 실험을 위한 유세포분석기를 설정합니다. 배경 형광을 결정하기 위해 세포가 담체와 함께 배양되지 않은 음성 대조군 샘플을 실행합니다. 유세포분석 정량 비드를 준비하고 다시 현탁시킨다.세포 샘플에 사용된 것과 동일한 완충액을 사용합니다. 비드 개체군이 별도로 제공되는 경우 함께 당깁니다. 유세포 분석 비드 및 담체 세포 샘플을 실행하여 세포 당 형광 강도를 결정한다.유세포분석기 정량 비드를 실행하여 표준 곡선을 생성하고 절대 형광 강도를 MFI로 변환합니다. 이것을 사용하여 텍스트 원고에 설명 된대로 캐리어의 이론적 MFI를 계산합니다. 세포 담체 샘플을 실행하여 각 샘플의 셀당 형광 강도를 결정합니다.마지막으로, 측정된 샘플의 형광에서 배경 형광을 뺀 다음 입자당 형광으로 나누어 각 샘플에 대한 세포당 운반체 수를 계산합니다. 633 나노미터 폴리메타크릴산 코어 쉘 입자의 경우, 담체당 농도 및 형광 강도를 세포분석기 스트림을 사용하여 직접 정량화할 수 있었다. 대조적으로, 100 나노 미터 초 상자성 산화철 나노 입자는 너무 작아서 개별적으로 검출 할 수 없었고 벌크 스트림을 사용하여 분석되었습니다.표지된 정량 비드를 유세포분석기 상에서 표준 곡선을 생성하기 위해 여러 날에 걸쳐 사용하였다. 측정된 MFI와 정량 비드의 MESF 값 사이의 상관관계는 선형이었고 측정된 날짜 간에 대체로 유사했습니다. 형광 표지된 HeLa 세포를 235나노미터 폴리메타크릴산 캡슐과 함께 0시간에서 24시간까지 사용한 시간 과정 실험은 시간이 지남에 따라 MFI의 증가를 보여주었고, 이는 캡슐이 HeLa 세포와 결합하고 있음을 나타냅니다.운반체에 대한 명백한 세포 반응의 차이는 상대적 또는 절대적 정량화에 따라 뚜렷했습니다. 절대 정량화는 라벨링 강도와 무관하여 더 비교할 수 있습니다. 이러한 기술은 입자 성능의 심층 분석 및 비교를 위한 기초입니다.우리는 이러한 기술을 사용하여 특정 실험과 독립적으로 입자 성능을 특성화할 수 있는 수학적 모델을 매개변수화하게 되어 기쁩니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

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진단 및 치료 모니터링을위한 Nanomaterials 등록 Bioimaging

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