Name: 선천면역세포사멸을 평가하기 위한 카스파아제 활성화 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: 배우세요 선천면역세포사멸에서 카스파아제 활성화를 평가하는 방법을. 조골수 유래 대식세포를 분화시키고 인플루엔자 A 바이러스로 감염시킨 후 웨스턴 블롯팅으로 다중 카스파아제 활성을 분석합니다. 이 기법은 질병 기전 연구와 치료 전략 수립에 필수적인 세포사멸 경로 이해를 제공합니다.

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의견과 제안을 해주신 Kanneganti 연구실 구성원들에게 감사드리며, 과학 편집 지원을 해주신 J. Gullett 박사님께도 감사드립니다. 우리 연구실의 작업은 국립 보건원 (NIH) 보조금 AI101935, AI124346, AI160179, AR056296 및 CA253095 (T.-D.K.) 및 미국 레바논 시리아 연합 자선 단체 (T.-D.K.). 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.

T.-D.K.는 화이자의 컨설턴트입니다.

카스파제 절단 및 활성화를 모니터링하면 선천성 면역 반응의 일부로서 선천성 면역 PCD 활성화에 대한 가장 포괄적인 사진 중 하나를 얻을 수 있습니다. 여기에 기술된 프로토콜은 IAV, HSV1 및 F. novicida 감염 및 멸균 트리거 LPS + ATP에 대한 반응으로 카스파제 활성화를 모니터링하는 전략을 보여주지만, 다수의 다른 자극이 PCD를 유도할 수 있고, 여러 간행물 44,48,49,50,51,52,53,54,56에 제시된 바와 같이, 이 방법에서 사용될 수 있고<sup class=...

선천성 면역 체계는 감염 중 및 조직 손상 및 항상성 변화와 같은 무균 자극에 대한 반응으로 첫 번째 방어선 역할을 합니다. 세포 표면과 세포질의 선천성 면역 센서는 병원체 또는 손상 관련 분자 패턴(각각 PAMP 또는 DAMP)에 반응하여 염증 신호 전달 경로 및 세포 반응을 유발합니다. 선천성 면역 반응의 핵심 과정 중 하나는 감염되거나 손상된 세포를 제거하고 추가 선천성 및 적응성 면역 반응을 유도하기 위한 세포 사멸을 유도하는 것입니다. 프로그램된 세포 사멸(PCD)은 종 전반에 걸쳐 고도로 보존된 과정으로, 타고난 면역 메커니즘으로서의 진화적 중요성을 강조합니다.
모든 세포 유형에서 활성화될 수 있는 몇 가지 선천성 면역 PCD 경로가 있습니다. 카스파제는 고도로 보존된 세포내 시스테인 의존성 프로테아제의 핵심 계열로, 전통적으로 비염증성 세포자멸사 경로뿐만 아니라 파이롭토시스, 괴사증 및 PANoptosis와 같은 염증성 PCD 경로를 포함한 많은 PCD 경로에서 중요합니다 1,2,3,4,5 . 잘 정의 된 11 개의 인간 카스파제와 10 개의 뮤린 카스파제뿐만 아니라 기능적 일 수있는 유사 카스파제가 있으며, 대부분은 활성화를 위해 절단을 필요로하는 비활성 단량체 또는 이량체 프로 카스파제로 구성 적으로 표현됩니다 6,7. 카스파제는 또한 다단백질 복합체의 모집 및 형성을 위한 중요한 영역을 포함합니다. 여기에는 카스파제-1, 카스파제-2, 카스파제-4, 카스파제-5, 카스파제-9 및 카스파제-11에서 찾을 수 있는 카스파아제 활성화 및 모집 도메인(CARD) 또는 카스파제-8 및 카스파제-10에서 발견되는 사멸 이펙터 도메인(DED)이 포함됩니다. 단백질 분해 활성과 다단백질 복합체 형성 능력을 통해 카스파제는 선천성 면역 PCD의 중요한 동인입니다.
선천성 면역 PCD에서 카스파제의 역할은 세포자멸사에서 처음 확인되었으며, 개시제 카스파제, 카스파제-2, 카스파제-8, 카스파제-9 및 카스파제-10이 사형집행자 카스파제, 카스파제-3, 카스파제-6 및 카스파제-7을 활성화시켜 세포 사멸을 유도합니다 8,9,10,11,12. 개시제 카스파제는 다양한 신호 캐스케이드에 의해 활성화될 수 있습니다. 외인성 경로는 세포외 리간드 유도 사멸 수용체 신호전달을 통해 카스파제-8을 활성화시키고, 내인성 경로는 미토콘드리아 완전성의 파괴를 통해 카스파제-9를 활성화한다13. 활성화된 개시제 카스파제는 링커를 절단하여 사형집행인 카스파제의 크고 작은 촉매 서브유닛을 분리하여 활성 형태를 생성합니다. 그런 다음 사형 집행인 카스파제는 기질을 쪼개어 세포를 분해하여 DNA 분해, 막 블레빙, 핵 단편화 및 세포자멸사 방출을 초래합니다14,15. 이 과정은 전형적으로 비용해성 및 비염증성 형태의 세포 사멸로 끝나며, 이는 efferocytosis에 의한 죽어가는 세포의 즉각적인 제거와 결합될 때 이루어진다16. 그러나, efferocytosis의 결함 또는 식세포의 부족은 세포 사멸 세포의 축적으로 이어질 수 있으며, 이는 용해 및 염증 세포 사멸을 겪는다17,18.
카스파제-1(인간 및 마우스), 카스파제-4 및 카스파제-5(인간), 카스파제-11(마우스)을 포함한 염증성 카스파제는 파이롭토시스라고 하는 염증성 선천성 면역 PCD(III-PCD)의 한 형태 동안 활성화되는 것으로 밝혀졌습니다. 카스파제-1 활성화는 세포질 선천성 면역 센서, 어댑터 분자(CARD[ASC]를 포함하는 세포자멸사 관련 반점 유사 단백질) 및 카스파제-1을 포함하는 다단백질 복합체인 인플라마솜의 형성과 관련이 있습니다. 이 복합체의 형성은 카스파제-1이 근접 매개 자가단백질 분해를 거쳐 활성 형태를 방출할 수 있도록 하며, 이는 전염증성 사이토카인인 인터루킨(IL)-1β 및 IL-18과 기공 형성 분자 gasdermin D(GSDMD)19,20,21,22,23를 포함한 표적 기질을 절단할 수 있습니다 . 카스파제-11, 카스파제-4 및 카스파제-5는 또한 지질다당류(LPS)19,20와 같은 PAMP를 감지한 후 인플라마솜의 상류 형성 없이 GSDMD를 활성화할 수 있습니다. 이들 카스파제는 이량체화에 이어 세포질 LPS에 결합할 때 활성화를 위한 올리고머화 및 자가절단을 거치며, 이는 IL-1β 및 IL-18 성숙을 유도하기 위해 세포 내재적 방식으로 비정준 인플라마좀 활성화 24,25,26 및 카스파제-1 활성화를 유도한다 20. 이러한 전염증성 사이토카인의 성숙과 방출은 이러한 카스파제를 "염증성"으로 특징짓습니다. 또한, 아폽토시스 카스파제-8은 인플라마솜에 국한되어 아폽토시스와 파이롭토시스 과정 사이의 연관성을 제공하는 것으로 밝혀졌습니다. 연구에 따르면 아폽토시스 카스파제-8은 괴사라고 하는 또 다른 형태의 PCD를 조절하는 데에도 중요합니다. 카스파제-8의 손실은 자발적인 수용체 상호작용 세린-트레오닌 키나아제 3(RIPK3) 매개 혼합 계통 키나아제 도메인 유사 슈도키나아제(MLKL) 활성화를 초래하여 괴사 27,28,29,30,31,32,33,34,35의 III-PCD 경로를 구동합니다.
카스파제는 역사적으로 카스파제에서 발생하는 세포 사멸 유형에 따라 "세포사멸" 또는 "염증성"으로 분류되어 왔지만, 카스파제를 통한 선천성 면역 PCD 경로 사이에 광범위한 혼선이 있음을 시사하는 증거가 늘어나고 있습니다 3,4. 예를 들어, inflammasomes의 염증성 카스파제-1은 표준 활성화 부위34에서 세포사멸 카스파제-7을 절단합니다. 카스파제-1 활성화는 또한 폴리(ADP-리보스) 중합효소 1 (PARP1)36과 같은 아폽토시스 기질의 절단을 유도할 수 있다. GSDMD가 결핍된 세포에서 카스파제-1은 또한 카스파제-337,38을 절단할 수 있습니다. 추가적으로, 정준적으로 아폽토시스 카스파제-3은 가스더민 E(GSDME)를 절단하여 PCD17,18을 유도할 수 있고, 또한 GSDMD를 비활성 형태40으로 처리할 수 있다. 또한, 인플라마좀 복합체에 대한 카스파제-8 모집은 39,40,41,42,43,44,45로 관찰되었으며, 카스파제-8은 정준 및 비정준 인플라마좀 활성화의 핵심 조절자이다 39. 또한 많은 염증 조건에서 카스파제-8 및 카스파제-1에 대한 중복되고 중복된 역할이 존재하며, 발열, 세포사멸 및 괴사 성분의 활성화를 특징으로 하는 선천성 면역 PCD는 질병 스펙트럼 39,46,47,48,49,50에 걸쳐 발생합니다.
염증성 카스파제와 세포자멸사 카스파제 사이의 이러한 혼선을 기반으로 선천성 면역과 PCD에 대한 기계론적 이해의 주요 격차가 확인되어 PANoptosis의 발견으로 이어졌습니다. PANoptosis는 병원체, PAMP, DAMP 및 항상성의 변화에 반응하여 활성화되는 독특한 형태의 III-PCD이며 다른 세포 사멸 경로의 구성 요소를 통합하는 다면적 거대분자 복합체인 PANoptosomes에 의해 조절됩니다 44,50,51,52,53,54,55 . PANoptosis는 카스파제-1, 카스파제-11, 카스파제-8, 카스파제-9, 카스파제-3 및/또는 카스파제-7을 포함한 다중 카스파제의 활성화를 특징으로 하기 때문에 PANoptosis에서 생물학적 효과의 총체는 pyroptosis, apoptosis또는 necroptosis 단독으로 개별적으로 설명될 수 없습니다 3,4,35,36,39,46,47,48, 문맥에 따라 44,48,49,50,51,52,53,54,56,57,58,59,60,61,62 . PANoptosis는 감염성 및 염증성 질환뿐만 아니라 암 및 암 치료법에 점점 더 연루되어 왔습니다 3,4,35,36,39,44,46,47,48,49,50,51,52,53 ,54,56 ,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66.
세포자멸사, 파이롭토시스, 괴사증 및 PANoptosis를 포함한 세포 사멸 경로 전반에 걸쳐 카스파제의 필수적인 역할을 감안할 때, 카스파제의 활성화를 특성화하고 PCD 경로의 전체 복잡성을 이해하는 기술을 개발하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜은 세포를 자극하고 카스파제의 후속 활성화를 측정하는 방법을 자세히 설명합니다(그림 1). 이 방법은 일반적으로 활성화에 필요한 카스파제의 단백질 분해 절단을 연구 수단으로 활용합니다. 웨스턴 블로팅을 통해 단백질 크기를 측정할 수 있으며, 이를 통해 비활성 프로카스파제와 활성화된 절단 형태를 명확하게 시각화하고 구별할 수 있습니다.
이 프로토콜의 주요 이점은 1) PCD 활성화를 보다 정확하게 결정하기 위해 내인성 세포의 단일 집단에서 병렬로 여러 카스파제의 활성화를 평가하는 능력과 2) 광범위한 교육이나 값비싼 장비가 필요하지 않은 비교적 간단한 실험실 기술의 사용입니다. 이전 프로토콜은 배양 상층액, 세포 및 조직 용해물, 현미경을 통한 전체 세포 및 생체 내 67,68,69,70,71에서 카스파아제 활성화를 모니터링하기 위해 웨스턴 블로팅, 형광 리포터 또는 항체 염색을 사용했지만 이러한 기술은 일반적으로 샘플에서 하나 또는 두 개의 카스파제만 모니터링합니다. 또한, 절단 시 형광을 발하는 카스파제 절단 부위를 함유하는 합성 펩타이드 기질이 세포 또는 조직 용해물에서 카스파제 활성화를 모니터링하기 위해 사용되어 왔지만(69), 이들 기질은 종종 하나 이상의 카스파제에 의해 절단될 수 있어, 이 시스템에서 개별 카스파제의 특이적 활성화를 결정하기 어렵게 만든다. 또한 형광 리포터 또는 기타 태그 기반 방법을 사용하는 대신 웨스턴 블로팅을 사용하면 연구자가 리포터 유전자로 특정 세포주를 만드는 대신 내인성 세포를 사용할 수 있습니다. 내인성 세포를 사용하는 데에는 많은 불멸화 된 세포주가 주요 세포 사멸 분자72,73이 결핍되어 결과에 영향을 미칠 수 있다는 사실을 포함하여 여러 가지 이점이 있습니다. 또한 내인성 세포를 사용하면 단일 계통이 아닌 대식세포, 상피 세포 및 내피 세포와 같은 다양한 세포 유형을 평가할 수 있습니다. 웨스턴 블로팅은 또한 크고 값비싼 장비나 복잡한 설정 없이 전 세계 실험실에서 수행할 수 있는 비교적 간단하고 비용 효율적인 기술입니다.
이 프로토콜은 다른 염증 신호 전달 경로에서의 스캐폴딩 역할 및 기능을 포함하여 카스파제의 세포 사멸 의존성 및 세포 사멸 비의존적 기능을 모두 이해하기 위해 생물학 전반에 걸쳐 광범위하게 적용할 수 있습니다74. 이 방법을 적용하면 질병 및 상태 전반에 걸친 선천성 면역 PCD 경로 및 염증 신호 연구에서 통합된 접근 방식이 가능하며, 이 프로토콜은 미래 치료 전략의 개발을 알릴 중요한 조절 과정과 기계론적 연결을 식별하는 데 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>0.45 &무; m 필터</td><td>Millipore</td><td>SCHVU05RE</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 주사기</td><td>BD Biosciences</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>12% 폴리아크릴아미드 젤 10 웰&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>4561043</td><td></td></tr><tr><td>12웰 플레이트&nbsp;</td><td>코닝</td><td>07-200-82</td><td></td></tr><tr><td>18G 바늘&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>305195</td><td></td></tr><tr><td>25G 바늘&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 튜브&nbsp;</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>50-809-218</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; M 세포 스트레이너&nbsp;</td><td>Corning</td><td>431751</td><td></td></tr><tr><td>150 mm 조직 배양 접시</td><td>Corning</td><td>430597</td><td></td></tr><tr><td>182-cm2 조직 배양 플라스크</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-211</td><td></td></tr><tr><td>액세서리 흰색 트랜스 트레이</td><td>Cytiva</td><td>29-0834-18</td><td></td></tr><tr><td>Anti&ndash; 카스파제-1 항체</td><td>AdipoGen</td><td>AG-20B-0042-C100</td><td></td></tr><tr><td>항&ndash; caspase-11 항체</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB120-10454</td><td></td></tr><tr><td>항&ndash; 카스파제-3 항체</td><td>세포 신호 기술</td><td>9662</td><td></td></tr><tr><td>항&ndash; caspase-7 항체</td><td>세포 신호 기술</td><td>9492</td><td></td></tr><tr><td>항&ndash; caspase-8 항체</td><td>세포 신호 기술</td><td>4927</td><td></td></tr><tr><td>항&ndash; caspase-9 항체</td><td>세포 신호 기술</td><td>9504</td><td></td></tr><tr><td>항&ndash; cleaved caspase-3 항체&nbsp;</td><td>세포 신호 기술</td><td>9661</td><td></td></tr><tr><td>항&ndash; cleaved caspase-7 항체&nbsp;</td><td>세포 신호 기술</td><td>9491</td><td></td></tr><tr><td>항&ndash; cleaved caspase-8 항체&nbsp;</td><td>세포 신호 기술</td><td>8592</td><td></td></tr><tr><td>안티-마우스 HRP-conjugated secondary antibody&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>315-035-047</td><td></td></tr><tr><td>항토끼 HRP-conjugated secondary antibody&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>111-035-047</td><td></td></tr><tr><td>항쥐 HRP-conjugated secondary antibody&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>112-035-003</td><td></td></tr><tr><td>항&ndash; &beta;-Actin 항체 (C4) HRP</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-47778 HRP</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>InvivoGen</td><td>tlrl-atpl</td><td></td></tr><tr><td>BBL Trypticase Soy Broth</td><td>BD Biosciences</td><td>211768</td><td></td></tr><tr><td>Bead</td><td>bath Chemglass Life Sciences</td><td>CLS-4598-009</td><td></td></tr><tr><td>Biophotometer D30</td><td>Eppendorf</td><td>6133000010</td><td></td></tr><tr><td>BME</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>브로모페놀 블루&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>BO126</td><td></td></tr><tr><td>세포 스크레이퍼</td><td>CellTreat Scientific 제품</td><td>229315</td><td></td></tr><tr><td>화학발광 이미저(Amersham 600)&nbsp;</td><td>싸이티바</td><td>29083461</td><td></td></tr><tr><td>CO2&nbsp; 챔버</td><td>VetEquip</td><td>901703</td><td></td></tr><tr><td>큐벳</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-129</td><td></td></tr><tr><td>해부 가위</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>221S</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995-073</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>Eelectrophoresis 장치&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1658004</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Pharmco</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 혈청&nbsp;</td><td>Biowest</td><td>S1620</td><td></td></tr><tr><td>필터 페이</td>퍼 <td>Bio-Rad</td><td>1703965</td><td></td></tr><tr><td>펜치</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-327379</td><td></td></tr><tr><td>Francisella novicida (U112 스트레인)</td><td>BEI 리소스</td><td>NR-13</td><td></td></tr><tr><td>젤 방출기&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1653320</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>Gibco</td><td>15750060</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G7893</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma</td><td>H9892</td><td></td></tr><tr><td>Heat block</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-043-160</td><td></td></tr><tr><td>단순 헤르페스 바이러스 1 (HF 균주)</td><td>ATCC</td><td>VR-260</td><td></td></tr><tr><td>고혈당 DMEM&nbsp;</td><td>시그마</td><td>D6171</td><td></td></tr><tr><td>인간 안티&ndash; 카스파제-1 항체</td><td>R& D 시스템</td><td>MAB6215</td><td></td></tr><tr><td>인간 anti&ndash; caspase-8 항체</td><td>Enzo</td><td>ALX-804-242</td><td></td></tr><tr><td>가습 인큐베이터&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51026282</td><td></td></tr><tr><td>이미지 분석 소프트웨어</td><td>ImageJ</td><td>v1.53a</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12440-053</td><td></td></tr><tr><td>인플루엔자 A 바이러스 (A/Puerto Rico/8/34, H1N1 [PR8])&nbsp;</td><td>Hoffmann et al.에 따라 건설되었습니다.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L929 세포</td><td>ATCC</td><td>CCL-1</td><td>세포주: L929 조건 매체</td></tr><tr><td>L-시스테인 생성을</td> 위한 세포주;<td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP376-100</td><td></td></tr>, <tr><td>Luminata Forte, Western HRP 기질</td>, <td>Millipore</td><td>WBLUF0500</td>, <td>표준 감도 HRP 기질</td></tr>, <tr><td>MDCK 셀</td>, <td>IAV 바이러스 역가 측정을 위한</td><td>ATCC</td>, <td>CCL-34</td> 세포주</tr>, <tr><td>메탄올</td><td></td><td>322415</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기</td>, <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75002401</td><td></td></tr><tr><td>비필수 아미노산&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>무지방 분유</td><td>Kroger</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NP-40 솔루션&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>492016</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>페니실린과 스트렙토마이신&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>페트리 디쉬</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-202-011</td><td></td></tr><tr><td>PhosSTOP</td><td>Roche</td><td>PHOSS-RO</td><td></td></tr><tr><td>전원&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>164-5052</td><td></td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 정제</td><td>Sigma</td><td>S8820</td><td></td></tr><tr><td>PVDF 멤브레인&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>락킹 쉐이커</td><td>Labnet</td><td>S2035-E</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>시그마</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>소듐 데옥시콜레이트</td><td>Sigma</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>소듐 하이드록사이드</td><td>Sigma</td><td>72068</td><td></td></tr><tr><td>소듐 피루베이트&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>사각 페트리 접시</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875711A</td><td></td></tr><tr><td>스트리핑 버퍼</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21059</td><td></td></tr><tr><td>슈퍼 신호 펨토 HRP 기질</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>34580</td><td>고감도 HRP 기질</td></tr><tr><td>탁상용 원심분리기</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75004524</td><td></td></tr><tr><td>트랜스-블롯 반건조 시스템&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>170-3940</td><td></td></tr><tr><td>트리스</td><td>시그마</td><td>TRIS-RO</td><td></td></tr><tr><td>트윈 20&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr>대장균 0111:B4 <td>InvivoGen</td><td>tlrl-3pelps</td><td></td>Vero 세포에서<td>추출한 초순수 지질다당류(LPS)</td></tr><tr><td></td><td>HSV1 바이러스 역가를 결정하기 위한</td> <td>ATCC</td><td>CCL-81</td> 세포주</tr></tbody></table>

선천면역세포사멸을 평가하기 위한 카스파아제 활성화 평가

Evaluation of Caspase Activation to Assess Innate Immune Cell Death

선천성 면역은 병원균과 무균 모욕에 대응하여 중요한 첫 번째 방어선을 제공합니다. 이 반응의 주요 기계적 구성 요소는 감염되거나 손상된 세포를 제거하고 면역 반응을 전파하기 위한 선천성 면역 프로그램 세포 사멸(PCD)의 시작입니다. 그러나 과도한 PCD는 염증 및 병리와 관련이 있습니다. 따라서 PCD의 활성화 및 조절을 이해하는 것은 선천성 면역 반응을 특성화하고 질병 스펙트럼 전반에 걸쳐 새로운 치료 표적을 식별하는 데 핵심적인 측면입니다.
이 프로토콜은 세포자멸사, 파이롭토시스, 괴사증 및 PANoptosis를 포함하는 다양한 PCD 경로와 종종 연관되는 시스테인 의존성 프로테아제 계열인 카스파제를 모니터링하여 선천성 면역 PCD 활성화를 특성화하는 방법을 제공합니다. 초기 보고서에서는 카스파제-2, 카스파제-8, 카스파제-9 및 카스파제-10을 개시제 카스파제로, 카스파제-3, 카스파제-6 및 카스파제-7을 세포자멸사에서 이펙터 카스파제로 특성화한 반면, 이후 연구에서는 염증성 카스파제, 카스파제-1, 카스파제-4, 카스파제-5 및 카스파제-11이 파이롭토시스를 유발합니다. 이전에 정의된 PCD 경로 전반에 걸쳐 카스파제와 기타 선천성 면역 및 세포 사멸 분자 사이에 광범위한 누화가 있는 것으로 알려져 있으며, 선천성 면역 및 PCD에 대한 기계론적 이해에서 핵심 지식 격차를 식별하고 PANoptosis의 특성화로 이어집니다. PANoptosis는 다른 세포 사멸 경로에서 카스파제를 포함한 구성 요소를 통합하는 PANoptosome 복합체에 의해 조절되는 독특한 선천성 면역 염증 PCD 경로입니다.
여기서, 다양한 자극에 반응하여 카스파제의 활성화를 평가하기 위한 방법이 제공된다. 이러한 방법은 활성화된 카스파제가 최적의 항체 및 블로팅 조건을 사용하여 웨스턴 블로팅으로 시각화할 수 있는 단백질 분해 절단을 거치기 때문에 시험관 내 및 생체 내 모두에서 PCD 경로의 특성화를 허용합니다. 동일한 세포 집단에서 여러 카스파제의 활성화를 평가할 수 있는 프로토콜 및 웨스턴 블로팅 워크플로우가 확립되어 PCD 프로세스의 포괄적인 특성화를 제공합니다. 이 방법은 발달, 항상성, 감염, 염증 및 암의 연구 영역 전반에 걸쳐 적용하여 건강 및 질병의 세포 과정 전반에 걸쳐 PCD 경로를 평가할 수 있습니다.

PANoptosis는 수많은 박테리아, 바이러스 및 곰팡이 감염 및 기타 염증 자극뿐만 아니라 암세포에서도관찰되었습니다 44,48,49,50,51,52,53,54,56,57,58,60,61,62 </s...

이 프로토콜은 시험관 내 및 생체 내 (마우스내) 감염, 무균 손상 및 암 모델 모두에 대한 반응으로 카스파제 활성화(카스파제-1, 카스파제-3, 카스파제-7, 카스파제-8, 카스파제-9 및 카스파제-11)를 평가하여 파이롭토시스, 세포자멸사, 괴사 및 PANoptosis와 같은 세포 사멸 경로의 개시를 결정합니다.

Innate immunity provides the critical first line of defense in response to pathogens and sterile insults. A key mechanistic component of this response is ...

이 프로토콜은 세포 사멸 과정의 활성화에 대한 다면적인 이해를 제공하여 질병 메커니즘에 대한 중요한 통찰력을 제공하고 치료 전략을 알릴 수 있습니다. 이 프로토콜은 더 간단한 기술의 사용에 의존하고 활성화를 크게 결정하기 위해 내인성 세포의 단일 집단에서 필수적인 여러 카스파제의 활성화에 액세스합니다. 선천성 면역 세포 사멸은 감염에서 염증성 질환, 암에 이르기까지 질병 스펙트럼 전반에 걸쳐 연루되어 있습니다.카스파아제 활성화를 통한 세포 사멸의 분자 메커니즘을 이해하면 질병 과정에 대한 중요한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 실험실의 박사후 연구원인 Dr.Julieann이 절차를 시연할 것입니다. 골수를 분리하고 BMDM을 분화시킨 후 세포를 인플루엔자 A 바이러스로 감염시킵니다.20 개의 플라크 형성 단위의 감염 다중도에서 필요한 바이러스 부피를 계산하십시오. BMDM에서 배지를 제거하고 500 마이크로리터의 PBS로 세포를 한 번 세척합니다. 열 비활성화 FBS가 없는 고포도당 DMEM에 450 마이크로리터의 인플루엔자 A 바이러스를 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 섭씨 37도에서 1시간 동안 가습 인큐베이터에서 1시간 동안 배양하여 흡수되도록 합니다.1 시간의 배양이 끝나면 50 마이크로 리터의 열 비활성화 FBS를 추가하고 총 12 시간 동안 섭씨 37 도의 인큐베이터로 플레이트를 되돌립니다. 배양 12 시간 후, 배양기에서 플레이트를 제거한다. 150마이크로리터의 상층액을 흡인하고 이를 버리거나 상층액 분석을 위해 저장합니다.나머지 상층액을 제거하지 마십시오. 이제 웰당 50 마이크로리터의 카스파제 용해 완충액과 100 마이크로리터의 4개의 XSDS 완충액을 결합하여 단백질 수집 용액을 만듭니다. 그런 다음 150 마이크로 리터의 혼합물을 각 웰에 첨가하십시오.각각의 웰에 대해, 용해된 세포 및 상청액을 수집하기 위해 혼합물을 피펫팅한다. 피펫팅하는 동안 피펫 팁으로 웰 바닥을 긁어 세포를 파쇄합니다. 긁어내고 피펫팅한 후 단백질 용해물을 라벨이 붙은 1.5밀리리터 튜브에 수집합니다.열 블록을 사용하여 모든 튜브를 섭씨 100도까지 12분 동안 가열합니다. 열 블록에서 튜브를 제거하고 실온에서 30초 동안 14, 500G에서 원심분리하여 불용성 성분을 펠릿화합니다. 10웰이 있는 12% 폴리아크릴아미드 겔로 전기영동 장치를 준비합니다.전기 영동 장치에 실행 버퍼를 채우고 젤 빗을 제거합니다. 그런 다음 샘

evaluation-of-caspase-activation-to-assess-innate-immune-cell-death

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오는 이분자 형광 보완 리포터 단백질을 사용하여 인간 대식세포에서 카스파아제 단백질의 활성화를 보여줍니다. 카스파제-1의 프로 도메인은 비너스 단백질의 비형광 단편과 융합되며, 이 단백질은 인플라마솜 복합체에 동원됩니다. 인플라마솜의 근접성은 금성 단편의 재접힘과 형광을 유도하여 대식세포에서 카스파아제 활성화를 확인합니다.

Visualization of Caspase Activation in Human Monocyte-Derived Macrophages

이 비디오는 인플루엔자 바이러스를 자극하여 골수 유래 대식세포에서 여러 카스파아제 활성화를 평가하는 방법을 보여줍니다. 대식세포 용해, 용해물의 열 불활성화 및 원심분리 후 후속 면역학적 분석을 위해 세포 내 카스파제를 수집합니다.

대식세포에서 다중 카스파제의 활성화에 대한 평가

멀티 플렉스 분석은 기본 세포 메커니즘에 대한 유익한 정보를 제공하고 시약 및 불필요한 반복 실험의 낭비를 제거 할 수 있습니다. 우리는 팔 미트 산으로 산화 반칙으로 체외 시상 하부 모델에서 세포 생존을 결정하기 위해, 형광 및 발광 기반의 방법을 사용하여, 여기에 멀티 플렉스 카스파 3 / 7 활동 분석에 대해 설명합니다.

시상 하부 세포 모델에서 세포 사멸을 결정하는 카스파 다중 분석의 사용

카스파 제 활성의 낮은 농도를 포함하는 전체 동물의 건강한 세포를 검출하기 위해, CaspaseTracker 지정된 고감도 바이오 센서 초파리에 대해 생성 하였다. 카스파 따라 바이오 활성 데스 자극의 부재 하에서 최적 조건 하에서 사육 성인 동물의 내부 장기에 걸쳐 긴 수명이 건강한 세포에서 검출된다.

생체 내에서 바이오 센서는 초파리에서 비 세포 사멸 카스파 활동을 추적

형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 및 활성 caspase-1와 어댑터, ASC에 대 한 얼룩 세포질 기준 NLRP3 inflammasome 활성화의 탐지를 설명 합니다. 젖 산 효소 자료 분석 결과 인구 기준 pyroptotic 세포를 감지 하 여. 이 기술은 inflammasome 생물학의 여러 측면을 연구 적응 될 수 있다.

Inflammasome 활성화 및 Pyroptotic 세포 죽음 Murine 골 수 유래 세포에서의 검출

여기서, 죽음을 유도하는 신호 복합체(DISC)에서 직접 카스파제-8 처리를 감지하고 이 복합체의 조성을 결정하는 실험 워크플로우가 제시된다. 이 방법론은 세포 사멸 경로의 분자 메커니즘을 해명에서 세포 사멸 네트워크의 동적 모델링에 이르기까지 광범위한 응용 프로그램을 가지고 있습니다.

이 단지에서 CD95 사망 유도 신호 복합체 및 프로카스파스-8의 처리 구성 측정

이 프로토콜은 인간 혈액 샘플로부터 단핵구 유래 대식세포 (MDM)를 얻는 워크 플로우, 세포 생존력과 행동을 손상시키지 않고 염증성 카스파제 BiFC (BiFC) 리포터를 인간 MDM에 효율적으로 도입하는 간단한 방법, 살아있는 세포에서 염증성 카스파제 활성화를 측정하기위한 이미징 기반 접근법을 설명합니다.

인간 단핵구 유래 대식세포에서 근접성을 유도한 염증성 카스파제의 시각화

인플루엔자 A 바이러스 (IAV) 감염은 숙주 및 바이러스 단백질을 절단하는 카스파 제를 활성화시켜 프로 바이러스 및 항 바이러스 기능을 갖습니다. 억제제, RNA 간섭, 부위 지향 돌연변이 유발, 웨스턴 블로팅 및 RT-qPCR 기술을 사용하여 숙주 코르탁틴 및 히스톤 탈아세틸라제를 절단하는 감염된 포유류 세포의 카스파제를 식별했습니다.

인플루엔자 A 바이러스 감염 동안 단백질을 절단하는 카스파아제와 그 모티프 식별

본 프로토콜은 유동 세포분석 또는 분광형광계를 사용하여 형광 기질을 통해 카스파아제 활성을 측정하는 두 가지 방법을 설명합니다.

형광 분석 또는 유세포분석을 사용한 카스파제 활성 측정

셀 - 중재의 lymphocytotoxicity (CML) assays는 체외에서 autoreactive 반응 및 세포 사망의 학습 메커니즘을 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나, 형광 염료, 타입 및 세포 죽음뿐만 아니라 활용 경로의 반응 속도론 살 세포 공촛점 미세한 이미징 기술을 사용하여 더 자세히 공부하실 수 있습니다.

세포 독성 T Lymphocytes에 의해 베타 세포 죽음의 중재를 평가하는 방법

배우세요 선천면역세포사멸에서 카스파아제 활성화를 평가하는 방법을. 조골수 유래 대식세포를 분화시키고 인플루엔자 A 바이러스로 감염시킨 후 웨스턴 블롯팅으로 다중 카스파아제 활성을 분석합니다. 이 기법은 질병 기전 연구와 치료 전략 수립에 필수적인 세포사멸 경로 이해를 제공합니다.

선천면역세포사멸을 평가하기 위한 카스파아제 활성화 평가

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