Name: 인간 미세아교세포 유사 세포: 유도만능줄기세포로부터의 분화 및 인간 시냅토좀을 이용한 체외 생세포 식균작용 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-18T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: 배우세요 iPSC에서 미세아교세포 유사 세포로 분화하는 방법과 인간 시냅토좀을 이용한 생세포 식균작용 분석 기법을. 이 프로토콜은 신경염증 연구에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

저자들은 운동 뉴런 분화를 위한 WTC11 hNIL iPSC 라인을 제공한 마이클 워드와 미세아교세포 분화에 사용되는 KOLF2.1J WT 클론 B03 iPSC 라인을 공급한 잭슨 연구소에 감사를 표합니다. 또한 프로토콜 구현 과정에서 도움을 준 도로시 샤퍼, 생세포 이미징 시스템에 도움을 준 앤서니 지암페트루치와 존 랜더스, 개정 기간 동안 기술적 기여를 해준 헤이든 갓, 이 연구에서 협력한 조나단 정에게 감사드립니다. 이 연구는 UMASS Chan Medical School과 Angel Fund, Inc.의 Dan and Diane Riccio Fund for Neuroscience Fund의 지원을 받았습니다.

<ol><li>Heider, J., Vogel, S., Volkmer, H., Breitmeyer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+iPSC-derived+glia+as+a+tool+for+neuropsychiatric+research+and+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Human iPSC-derived glia as a tool for neuropsychiatric research and drug development.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (19), 10254(2021).</li>
<li>Muzio, L., Viotti, A., Martino, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+neuroinflammation+and+neurodegeneration%3A+from+understanding+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Microglia in neuroinflammation and neurodegeneration: from understanding to therapy.</a> Frontiers in Neuroscience. 15, 742065(2021).</li>
<li>Galatro, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+analysis+of+purified+human+cortical+microglia+reveals+age-associated+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes.</a> Nature Neuroscience. 20 (8), 1162-1171 (2017).</li>
<li>Gosselin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+environment-dependent+transcriptional+network+specifies+human+microglia+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity.</a> Science. 356 (6344), (2017).</li>
<li>Haimon, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-evaluating+microglia+expression+profiles+using+RiboTag+and+cell+isolation+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Re-evaluating microglia expression profiles using RiboTag and cell isolation strategies.</a> Nature Immunology. 19 (6), 636-644 (2018).</li>
<li>Abud, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPSC-derived+human+microglia-like+cells+to+study+neurological+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">iPSC-derived human microglia-like cells to study neurological diseases.</a> Neuron. 94 (2), 278-293 (2017).</li>
<li>Brownjohn, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+studies+of+missense+TREM2+mutations+in+human+stem+cell-derived+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Functional studies of missense TREM2 mutations in human stem cell-derived microglia.</a> Stem Cell Reports. 10 (4), 1294-1307 (2018).</li>
<li>Haenseler, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+efficient+human+pluripotent+stem+cell+microglia+model+displays+a+neuronal-co-culture-specific+expression+profile+and+inflammatory+response%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A highly efficient human pluripotent stem cell microglia model displays a neuronal-co-culture-specific expression profile and inflammatory response.</a> Stem Cell Reports. 8 (6), 1727-1742 (2017).</li>
<li>McQuade, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+a+simplified+method+to+generate+human+microglia+from+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">Development and validation of a simplified method to generate human microglia from pluripotent stem cells.</a> Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 1-13 (2018).</li>
<li>Muffat, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+derivation+of+microglia-like+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Efficient derivation of microglia-like cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Medicine. 22 (11), 1358-1367 (2016).</li>
<li>Haenseler, W., Rajendran, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+modeling+neurodegenerative+diseases+with+human+pluripotent+stem+cell-derived+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: modeling neurodegenerative diseases with human pluripotent stem cell-derived microglia.</a> Stem Cells. 37 (6), 724-730 (2019).</li>
<li>Wilgenburg, B. v, Browne, C., Vowles, J., Cowley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient%2C+long+term+production+of+monocyte-derived+macrophages+from+human+pluripotent+stem+cells+under+partly-defined+and+fully-defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Efficient, long term production of monocyte-derived macrophages from human pluripotent stem cells under partly-defined and fully-defined conditions.</a> PloS One. 8 (8), 71098(2013).</li>
<li>Hoeffel, G., Ginhoux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+of+tissue-resident+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Ontogeny of tissue-resident macrophages.</a> Frontiers in Immunology. 6, 486(2015).</li>
<li>Janda, E., Boi, L., Carta, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+phagocytosis+and+its+regulation%3A+a+therapeutic+target+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Microglial phagocytosis and its regulation: a therapeutic target in Parkinson's disease.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 144(2018).</li>
<li>Schafer, D. P., Stevens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+function+in+central+nervous+system+development+and+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Microglia function in central nervous system development and plasticity.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (10), 020545(2015).</li>
<li>Nau, R., Ribes, S., Djukic, M., Eiffert, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+to+increase+the+activity+of+microglia+as+efficient+protectors+of+the+brain+against+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Strategies to increase the activity of microglia as efficient protectors of the brain against infections.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 138(2014).</li>
<li>Fernandopulle, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor-mediated+differentiation+of+human+iPSCs+into+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Transcription factor-mediated differentiation of human iPSCs into neurons.</a> Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 51(2018).</li>
<li>Gutbier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+production+of+human+IPSC-derived+macrophages+for+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Large-scale production of human IPSC-derived macrophages for drug screening.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (13), 4808(2020).</li>
<li>Sellgren, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-specific+models+of+microglia-mediated+engulfment+of+synapses+and+neural+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Patient-specific models of microglia-mediated engulfment of synapses and neural progenitors.</a> Molecular Psychiatry. 22 (2), 170-177 (2017).</li>
<li>Schmidt, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALS-linked+PFN1+variants+exhibit+loss+and+gain+of+functions+in+the+context+of+formin-induced+actin+polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">ALS-linked PFN1 variants exhibit loss and gain of functions in the context of formin-induced actin polymerization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (23), (2021).</li>
<li>Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+to+determine+the+engulfment+of+apoptotic+cells+by+macrophages+using+pHrodo+succinimidyl+ester%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester.</a> Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).</li>
</ol>

저자는 선언 할 이해 상충이 없습니다.

여기에 설명된 분화 프로토콜은 ~6-8주 내에 iPSC 유래 미세아교세포 유사 세포를 고순도로 충분한 수율로 얻을 수 있는 효율적인 방법을 제공하여 면역형광 실험 및 더 많은 수의 세포가 필요한 기타 분석을 수행할 수 있습니다. 이 프로토콜은 1주일 동안 최대 1× 10,6개의 iMG를 산출하여 단백질 및 RNA 추출 및 해당 다운스트림 분석(예: RNASeq, qRT-PCR, 웨스턴 블롯, 질량 분석법)을 가능하게 합니다. 즉, 이 프로토콜의 한계는 iMG의 수율이 특정 애플리케이션을 제한할 수 있다는 것입니다. 상이한 주로부터의 PMP를 축적하고, 분화 과정을 한 번에 진행하기에 충분한 전구체가 수집될 때까지 현탁액에서 균질한 배양물을 유지하기 위해 추가의 변형이 구현될 수 있다(18). 대안적으로, EB의 분화는 PMP의 생산을 증가시키기 위해 더 높은 면적의 세포 배양 플레이트를 사용하여 확장될 수 있다.
분화...

미세아교세포는 중추신경계(CNS)에 상주하는 면역 세포이며 CNS 발달에 중요한 역할을 합니다. 미세 아교 세포는 항상성을 유지하고 외상 및 질병 과정에 적극적으로 반응하기 위해 성인 뇌에서도 중요합니다. 누적 증거에 따르면 미세아교세포는 여러 신경 발달 및 신경 퇴행성 질환의 발병 기전에 주요 기여를 합니다1,2. 미세아교세포 생물학에 대한 현재의 지식은 주로 마우스 모델에서 파생되었지만 최근 연구에서는 쥐와 인간 미세아교세포 사이의 중요한 차이점을 밝혀냈으며 인간 미세아교세포의 유전학 및 생물학적 기능을 연구하기 위한 기술 개발의 필요성을 강조했습니다.3,4. 해부된 1차 조직으로부터 미세아교세포를 분리하면 미세아교세포 특성5이 심각하게 변형될 수 있으며, 잠재적으로 그러한 세포로 얻은 결과를 교란시킬 수 있다. 이 방법의 전반적인 목표는 인간 iPSC를 iMG로 분화하여 기저 조건에서 인간 미세아교세포를 연구하기 위한 세포 배양 시스템을 제공하는 것입니다. 또한, 완전 인간 모델 시스템을 사용하는 식작용 분석은 품질 관리 측정으로서 및 질병의 맥락에서 iMG 기능 장애를 평가하기 위한 수단으로서 본 명세서에 포함된다.
iPSC로부터 미세아교세포 분화를 위한 다수의 프로토콜이 최근 문헌 6,7,8,9,10에 등장하였다. 일부 프로토콜의 잠재적 단점은 연장된 또는 장기간의 분화, 다중 성장 인자의 추가, 및/또는 복잡한 실험 절차(6,9,10)를 포함한다. 여기에서 iPSC를 원시 대식세포 전구체(PMP)라고 하는 전구체 세포로 분화하여 미세아교세포 개체 발생의 측면을 요약하는 "사용자 친화적인" 분화 방법이 입증되었습니다7,11. PMP는 이전에 설명된 대로 생성되며, 일부 최적화는 여기에 제시되어 있습니다12. PMP는 MYB 비의존적 난황낭 유래 대식세포를 모방하며, 이는 혈액-뇌 장벽 폐쇄 전에 뇌를 침범하여 배아 발달 동안 미세아교세포를 생성합니다13. PMP를 iMG로 최종 차별화하기 위해 Haenseler et al. 및 Brownjohn et al.의 프로토콜을 기반으로 하는 빠르고 단순화된 단일 배양 방법을 사용했으며, iMG가 미세아교세포가 풍부한 마커 7,8을 강력하게 발현하는 효율적인 미세아교세포 분화 방법을 생성하기 위해 일부 수정했습니다. 이 분화 방법은 iPSC 배양에 대한 전문 지식과 인간 모델 시스템을 사용하여 미세아교세포 생물학을 연구하는 것을 목표로 하는 연구 목표를 가진 실험실에서 재현할 수 있습니다.
iPSC 유래 미세아교세포는 시험관 내 실험을 위한 생물학적으로 관련된 인간 미세아교세포 공급원을 나타내며 식균작용을 포함한 미세아교세포 표준 기능을 조사하는 중요한 도구입니다. 미세아교세포는 뇌와 CNS의 전문 식세포로, 세포 파편, 응집된 단백질 및 분해된 미엘린14를 제거합니다. 미세아교세포는 또한 시냅스를 삼켜 시냅스 리모델링과 병원균의 식균작용을 통한 외부 감염에 대한 방어기능을 합니다 15,16. 이 프로토콜에서 iMG에 의한 식균 작용은 iMG 삼키기위한 재료로 인간 시냅 토좀을 사용하여 평가됩니다. 이를 위해, 인간i3LMNs로부터 유래된 시냅토좀을 단리하기 위한 설명이 기술된다. i3LMN-유래된 인간 시냅토좀은 pH에 민감한 염료로 표지되어 시험관 내에서 포식체 처리 및 분해 중에 산성 구획 내에 국한된 시냅토좀의 정량화를 가능하게 한다. 생세포 현미경을 사용한 식균 작용 분석은 미세아교세포 삼킴의 동적 과정을 실시간으로 모니터링하기 위해 표시됩니다. 이 기능 분석은 완전한 인간 시스템을 사용하여 건강 및 질병에서 소교 세포 식균 작용의 가능한 결함을 조사하기위한 기초를 설정합니다.

<table><tbody><tr><td>면역형광 분석을 위한 항체</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-IBA1 토끼 항체</td><td>Wako Chemical USA</td><td>NC9288364</td><td>1:350 희석</td></tr><tr><td>anti-P2RY12 토끼 항체</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HPA014518</td><td>1:50 희석</td></tr><tr><td>항TMEM119 토끼 항체</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HPA051870</td><td>1:100 희석</td></tr><tr><td>Western blot 분석을 위한 항체</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-&beta;-Tubulin rabbit antibody</td><td>Abcam</td><td>ab6046</td><td>1:500 dilution</td></tr><tr><td>anti-Synaptophysin (SYP) rabbit antibody</td><td>Abclonal</td><td>A6344</td><td>1:1,000 dilution</td></tr><tr><td>anti-PSD95 mouse antibody</td><td>Millipore</td><td>MAB1596</td><td>1:500 dilution</td></tr><tr><td>borate buffer 구성 요소</강></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>붕산 (100 mM)</td><td>Sigma</td><td>B6768</td><td></td></tr><tr><td>소듐 바이카보네이트 (NaHCO3) BioXtra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297-250G</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨 (75 mM)</td><td>Sigma</td><td>&nbsp; S7653</td><td></td></tr><tr><td>소듐 테트라보레이트 (25 mM)</td><td>시그마</td><td>221732</td><td></td></tr><tr><td><강>세포 배양 재료</강></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6웰 플레이트</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; m 세포 스트레이너</td><td>&nbsp; Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>100mm x 20mm 조직 배양 처리</td><td>CELLTREAT</td><td>229620</td><td></td></tr><tr><td>세포 리프터, 더블 엔드, 플랫 블레이드 및 내로우 블레이드, 멸균</td><td>CELLTREAT</td><td>229305</td><td></td></tr><tr><td>저접착성 라운드 바텀 96웰 플레이트</td><td>Corning</td><td>7007</td><td></td></tr><tr><td>Primaria 24웰 플랫 바닥 표면 개질 멀티웰 세포 배양 플레이트</td><td>Corning</td><td>353847,</td><td></td></tr> <tr><td>Primaria 6웰 셀 클리어 플랫 바닥 표면 변성 멀티웰 배양 플레이트</td><td>Corning</td><td>353846</td><td></td></tr><tr><td>Primaria 96웰 클리어 플랫 바닥 마이크로플레이트</td><td>코닝</td><td>353872</td><td></td></tr><tr><td>세포 해리 시약</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>&nbsp; 코닝</td><td>25058CI</td><td>하부 운동 뉴런 분화에 사용되는 해리 시약</td></tr><tr><td>TrypLE 시약</td><td>Life Technologies</td><td>12-605-010</td><td>미세아교세포 분화에 사용되는 해리 시약</td></tr><tr><td>UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양용 코팅 시약</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matrigel GFR 멤브레인 매트릭스</td><td>Corning&trade;</td><td>354230</td> 세포<td>외 매트릭스 코팅 시약</td></tr><tr><td>CellAdAdmise Laminin-521</td><td>STEMCELL Technology</td><td>77004</td><td>라미닌 521</td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine</td><td>Sigma</td><td>P7405</td>로 참조 붕산염 완충액 Poly-L-Ornithine Sigma<td>에서 0.1 mg/mL로 재구성</td></tr>&<tr><td></td><td></td><td>nbsp; P3655</td><td>붕산염 완충액에서 1 mg/mL로 재구성</td></tr><tr><td>iPSC 배지의 성분</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; mTeSR Plus Kit</td><td>STEMCELL Technology</td><td>100-0276</td><td>iPSC 배지 </td></tr>mixed를 <tr><td>EB 배지의 1x성분</td>으로 준비하기 위해<><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BMP-4</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>PHC9534 최종 농도 50ng/mL</td></tr><tr><td>iPSC 배지</td><td></td><td></td><td>최종 농도 1x</td></tr><tr><td>ROCK 억제제 Y27632</td><td>Fisher Scientific</td><td>BD 562822</td><td>최종 농도 10 &마이크로; M</td></tr><tr><td>SCF</td><td>PeproTech</td><td>300-07</td><td>최종 농도 20ng/mL</td></tr><tr><td>VEGF</td><td>PeproTech</td><td>100-20A</td><td>최종 농도 50ng/mL</td></tr><tr><td>PMP 기본 매체의 구성 요소</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>최종 농도 1x</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>최종 농도 100 U/mL</td></tr><tr><td>X-VIVO 15</td><td>Lonza</td><td>12001-988</td><td>최종 농도 1x</td></tr><tr><td>PMP 완전 매체의 구성 요소</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>55 mM 2-메르캅토에탄올</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td>최종 농도 55 &micro; M</td></tr><tr><td>IL-3</td><td>PeproTech</td><td>200-03</td><td>최종 농도 25ng/mL</td></tr><tr><td>M-CSF</td><td>PeproTech</td><td>300-25</td><td>최종 농도 100ng/mL</td></tr><tr><td>PMP 기본 매체</td><td></td><td></td> <td>최종 농도 1x</td></tr><tr><td>iMG 기본 매체의 구성 요소</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td></td><td>12634010 최종 농도 1x</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>최종 농도 1x</td></tr><tr><td>N2 보충제, 100x</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td>최종 농도 1x</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>최종 농도 100 U/mL</td></tr><tr><td> iMG complete media의 성분</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>55 mM 2-메르캅토에탄올</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td>최종 농도 55 &마이크로; M</td></tr><tr><td>IL-34</td><td>PeproTech 또는 Biologend</td><td>200-34 또는 577904</td><td>최종 농도 100ng/mL</td></tr><tr><td>iMG 기본 매체</td><td></td><td></td><td>최종 농도 1x</td></tr><tr><td>M-CSF</td><td>PeproTech</td><td>300-25</td><td>최종 농도 5ng/mL</td></tr><tr><td>TGF-&beta;</td><td>PeproTech</td><td>100-21</td><td>최종 농도 50ng/mL</td></tr><tr><td>유도 기본 매체의 구성 요소</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12(HEPES</td><td>Gibco</td><td>11330032</td><td>최종 농도 포함) 1x</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>최종 농도 1x</td></tr><tr><td>N2 보충제, 100x</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td>최종 농도 1x</td></tr><tr><td>비필수 아미노산(NEAA), 100x</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td>최종 농도 1x</td></tr><tr><td>완전한 유도 매체의 구성 요소</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Compound E</td><td>Calbiochem</td><td>565790</td><td>최종 농도 0.2 &mu; M 및 1:1 에탄올 및 DMSO</td></tr><tr><td>독시사이클린</td><td>시그마</td><td>D9891</td><td>최종 농도 2 &mu에서 2mM로 원료 시약을 재구성하고; g/mL 및 DPBS</td></tr><tr><td>유도 염기 배지</td><td></td><td></td><td>최종 농도</td></tr>에서 스톡 시약을 2mg/mL로 재구성 1x <tr><td>ROCK 억제제 Y27632</td><td>Fisher Scientific</td><td>BD 562822</td><td>최종 농도 10 &mu; M</td></tr><tr><td>Neuron 배지의 구성 요소</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B-27 Plus 신경 세포 배양 시스템</td><td>Gibco</td><td></td><td>A3653401 배지 및 보충용 최종 농도 1x</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>최종 농도 1x</td></tr><tr><td>N2 보충제, 100x</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td>최종 농도 1x</td></tr><tr><td>비필수 아미노산(NEAA), 100x</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td>최종 농도 1x</td></tr><tr><td>iPSC 라인이 이 연구에 사용되었습니다</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KOLF2.1J: WT 클론 B03</td><td>The Jackson Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>WTC11 hNIL</td><td>National Institute of Health</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Synaptosome 분리 시약</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BCA 단백질 분석 키트</td><td>Thermo Scientific Pierce</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Syn-PER Synaptic Protein Extraction Reagent</td><td>Thermo Scientific</td><td>87793</td> synaptosomesphagocytosis assay dyes</strong의 <td>분리를 위한 세포 용해 시약이라고 합니다</td></tr><tr><td>></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NucBlue Live Ready 시약</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp; R37605</td><td></td></tr><tr><td>pHrodo Red, succinimidyl ester</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>&nbsp; P36600</td><td>pH에 민감한 염료</td></tr><tr><td>기타 세포 배양 시약</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue, 0.4% 용액</td><td>AMRESCO INC</td><td>K940-100ML</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA)</td><td>Sigma</td><td>22144-77-0</td><td></td></tr><tr><td>BrdU</td><td>Sigma</td><td>B9285</td> 멸균수 Cytochalasin D Sigma<td>에서 40mM로 재구성</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>최종 농도 10 &micro; </td></tr><tr><td>칼슘과 마그네슘이 함유된 M DPBS</td> 칼슘과 마그네슘이 없는 <td>Corning</td><td>21-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td>는 DPBS KnockOut이라고 불립니다</td></tr><tr><td>. DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>12660012</td><td>인간 배아 및 유도 만능 줄기 세포의 성장에 최적화된 DMEM-F12 라</td></tr><tr><td>미닌 마우스 단백질, 천연</td><td>Gibco</td><td>23017015</td><td>라미닌</td></tr><tr><td>소프트웨어 및 장비</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>Model 5810R</td><td></td></tr><tr><td>Cytation 5 라이브 셀 이미징 리더</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gen5 Microplate 리더 및 이미저 소프트웨어</td><td>Biotek</td><td>버전 3.03</td><td></td></tr><tr><td>Multi-Therm Heat-Shake</td><td>벤치마크</td><td></td><td>는 튜브 셰이커,</td></tr><tr><td>물 초음파 발생기</td>, <td>Elma</td><td>Mode, Transsonic 310</td><td></td></tr>이라고 합니다</tbody></table>.

인간 미세아교세포 유사 세포: 유도만능줄기세포로부터의 분화 및 인간 시냅토좀을 이용한 체외 생세포 식균작용 분석

Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes

미세아교세포는 뇌 미세 환경에서 항상성을 유지하고 여러 신경계 질환의 핵심 역할을 하는 골수성 기원의 상주 면역 세포입니다. 건강과 질병에서 인간 미세아교세포를 연구하는 것은 인간 세포의 공급이 극히 제한되어 있기 때문에 어려운 일입니다. 인간 개체에서 유래 한 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)는이 장벽을 우회하는 데 사용할 수 있습니다. 여기에서는 시험관 내 실험을 위해 인간 iPSC를 미세아교세포 유사 세포(iMG)로 분화하는 방법을 보여줍니다. 이러한 iMG는 미세아교세포와 유사한 형태, 적절한 마커의 발현 및 활성 식균작용을 포함하여 미세아교세포의 예상 및 생리학적 특성을 나타냅니다. 추가적으로, 인간 iPSC 유래 하부 운동 뉴런(i3LMN)으로부터 유래된 시냅토좀 기질을 분리하고 표지하기 위한 문서가 제공된다. 살아있는 세포, 종단 영상 분석은 pH에 민감한 염료로 표지 된 인간 시냅 토좀의 삼킴을 모니터링하는 데 사용되어 iMG의 식세포 능력을 조사 할 수 있습니다. 본원에 기술된 프로토콜은 인간 미세아교세포 생물학 및 질병에 대한 미세아교세포의 기여를 조사하는 상이한 분야에 광범위하게 적용가능하다.

이 프로토콜을 사용하여 iMG를 생성하려면 잘 정의된 가장자리가 있는 콤팩트한 콜로니 형태를 보여주는 미분화 iPSC로 시작하는 것이 중요합니다(그림 2A). EB 형성 섹션에 설명된 대로 유지된 해리된 iPSC는 EB라고 하는 구형 응집체를 형성하며, 이는 분화 4일째까지 크기가 커집니다(그림 2B). EB가 수집되고 PMP 생성에 적합한 조건에서 도금되면 Matrigel로 코팅 된 플레이트에 부착되고 세포 층이 퍼지고 구형 응집체를 둘러 쌉니다 (그림 2C). 건강에 해로운 EB는 플레이트에서 분리되므로 제거해야합니다. PMP 생성 14 일에서 21 일 사이에 잠재적으로 다른 세포 유형이 나타날 수 있으며 배지에 떠 있습니다. 이러한 셀은 매체 변경12 중에 폐기되어야 합니다. 28일째에 세포질 대 핵 비율이 큰 둥근 세포가...

이 프로토콜은 시험관 내 실험을 위해 인간 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)의 미세 아교 세포와 같은 세포로의 분화 과정을 설명합니다. 또한 라이브 셀 이미징 시스템을 사용하여 체외 식균 작용 분석의 기질로 사용할 수 있는 iPSC 유래 하부 운동 뉴런에서 인간 시냅토솜을 생성하는 자세한 절차도 포함되어 있습니다.

Microglia are the resident immune cells of myeloid origin that maintain homeostasis in the brain microenvironment and have become a key player in multiple ...

iPS 유래 미세아교세포는 시험관 내 실험을 위한 생물학적으로 관련된 인간 미세아교세포 공급원을 나타내며 건강 및 질병 분야에서 미세아교세포 생물학을 조사하는 중요한 도구입니다. 우리는 성장 인자를 최소한으로 사용하고 높은 순도와 수율을 달성하는 간단한 미세아교세포 분화 프로토콜을 제시합니다. 또한, 우리는 완전히 인간화 된 식균 작용 분석을 입증합니다.iPSC 유래 미세아교세포 유사 세포는 배지 증발에 매우 민감합니다. 세포 배양 접시 모서리에 있는 우물을 사용하지 말고 모든 빈 우물을 물로 채워 생존율을 높여야 합니다. 유도 만능 줄기 세포 또는 iPSC가 80 % confluency에 도달하면 1 밀리리터의 DPBS로 세척하고 1 밀리리터의 해리 시약을 섭씨 37도에서 2 분 동안 추가하여 콜로니를 해리합니다.세포 리프터를 사용하여 여러 번 긁어 단일 세포 현탁액을 만들어 콜로니를 제거합니다. 현탁액을 모아서 9 밀리리터의 DPBS가 들어있는 15 밀리리터의 원추형 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 세포를 500배 g에서 1분 동안 원심분리하고, 상청액을 제거하고, 배아체 또는 EB 배지의 1밀리리터에 재현탁시킨다.10 마이크로 리터의 세포를 취해 트리 판 블루로 1-2 개를 희석하십시오. 혈구계에서 세포를 계수하고 세포 수에 따라 세포 스톡을 100 마이크로 리터 당 10, 000 세포의 최종 희석액으로 희석합니다. 도금 세포의 경우 웰당 희석된 세포 100마이크로리터를 저접착 둥근 바닥 96웰 플레이트에 추가합니다.플레이트를 125배 g에서 3분 동안 원심분리하고 섭씨 37도 및 5%이산화탄소에서 4일 동안 배양합니다. 둘째 날에는 다중 채널 피펫을 사용하여 기존 half-EB 배지를 새 배지로 교체하십시오. 원시 대식세포 전구체 또는 PMP를 생성하려면 얼음처럼 차가운 Matrigel 코팅 용액 1밀리리터를 추가하여 6웰 플레이트의 웰을 코팅합니다.그런 다음 플레이트를 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소에서 2시간 동안 또는 밤새 배양합니다. EB 분화 4일째에 1밀리리터 피펫 팁을 사용하여 EB를 Matrigel이 코팅된 웰로 옮깁니다. 우물에서 EB를 제거하기 위해 위아래로 피펫을 사용합니다.그런 다음 EB가 우물 가장자리에 정착 할 수 있도록 플레이트를 기울인 상태로 유지하십시오. 모든 EB가 안정되면 부드럽게 피펫팅하고 기존 배지를 교체하고 EB를 우물 가장자리에 3ml의 새로 준비된 PMP 완전 배지

human-microglia-like-cells-differentiation-from-induced-pluripotent

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오에서는 유도 만능 줄기 세포를 사용하여 신경모세포종에 대한 미세아교세포 형성 분석을 수행합니다. 이 분석은 신경퇴행성 질환에서 미세아교세포 기능의 손상을 평가하는 데 도움이 됩니다.

미세아교세포작용 분석법: iPSC 대식세포를 사용하여 신경모세포종 세포에 대한 미세아교세포작용 모델을 확립하기 위한 체외 분석

이 비디오는 인간 만능 세포를 미세아교세포와 같은 세포로 분화하는 과정을 보여줍니다. 이 과정에는 배아체를 형성하고, 코팅된 우물로 옮기고, 특정 성장 인자를 사용하여 원시 대식세포 전구체로 분화를 유도하고, 최종적으로 미세아교세포와 같은 세포로 분화하는 것이 포함됩니다.

human-induced pluripotent stem cells into microglia-like cells (인간 유도 만능 줄기 세포를 Microglia-like cells로 분화)

출처: Funes, S., et. al., Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes(인간 시냅토솜을 사용한 유도 만능 줄기세포 및 체외 생세포 식세포작용 분석의 분화). J. Vis. Exp. (2022)이 비디오는 pH에 민감한 형광 염료 표지 시냅토솜을 사용하여 미세아교세포와 같은 세포의 식세포 능력을 연구하는 분석을 보여줍니다.

인간 시냅토솜을 이용한 미세아교세포 유사 세포의 생세포 식세포작용 분석

미세 아교 세포는 세포 외 환경에서 소재를 탐식거나 삼키는 고용량으로 중추 신경계 (CNS)의 상주 면역 세포이다. 여기 시냅스 구성 요소의 미세 아교 세포 - 매개 말림을 시각화 및 측정 광범위하게 적용, 신뢰성, 높은 정량 분석​​은 설명한다.

말림 분석 : CNS 식세포와 신경 세포 사이의 상호 작용을 평가하기위한 프로토콜

이 프로토콜 생체 외에서 라이브 이미징 먹어서 분석 결과 이다 phagocytic 용량의 측정을 제공 합니다. Microglia 및 순화 된 쥐 이다 pH 지시자 활용 된 synaptosomes 함께 사용 됩니다. 이 방법은 실시간 engulfment과 저하 속도 검색할 수 있습니다 하 고 사이토 식 균 작용을 조절 하는 요소를 식별 하는 적합 한 심사 플랫폼을 제공 합니다.

소설 체 외에 라이브 이미징 분석 결과의 사이토 중재 먹어서 사용 하 여 pH 지시자 활용 Synaptosomes

이 프로토콜은 살아있는, 성인, 인간의 뇌 조직에서 기본 microglia를 격리하는 효율적이고 비용 효율적이며 강력한 방법입니다. 고립 된 1 차적인 인간 microglia는 항상성 및 질병에 있는 세포 프로세스를 공부하기 위한 공구역할을 할 수 있습니다.

성인 인간 뇌 조직에서 인간 마이크로글리아 획득

신경 퇴행성 질환은 dysregulated 마이크로글리아 기능과 관련이 있습니다. 이 문서는 iPSC-대식세포에 의한 신경 모세포종 세포의 phagocytosis의 체외 분석방법을 설명합니다. 정량현미경 판독은 살아있는 세포 시간 경과 화상 진찰 과 고정 세포 고함량 화상 진찰을 위해 기술됩니다.

iPSC-대식세포에 의한 죽은 신경 모세포종 세포의 식증에 대한 체외 정량적 이미징 분석

여기에 제시된 프로토콜은 면역적격 마우스에서 경비강 경로를 통해 유도된 만능 줄기 세포 유래 인간 미세아교세포(iPSMG)를 뇌로 이식하는 것을 허용한다. iPSMG의 유지를 위한 세포의 제조 및 경비강 이식 및 사이토카인 혼합물의 투여를 위한 방법이 제시된다.

비침습적 경비강 경로를 통한 면역적격 마우스 뇌에서 인간 유도 만능 줄기세포 유래 미세아교세포의 이식

이 연구는 뇌 염증의 간접 평가를 가능하게 하는 인간 단핵구 유래 미세아교세포(iMG) 세포의 확립을 위한 새로운 접근 방식을 설명합니다. 이는 뇌의 잠재적 염증 및 관련 신경 정신 질환에 초점을 맞춘 연구에 도움이 될 수 있는 세포 모델을 제시합니다.

역번역 뇌 연구를 위한 인간 혈액 유도 미세아교세포 유사 세포 엔지니어링

우리는 유도만능줄기세포(iPSC) 유래 조혈전구세포(HPC)를 오가노이드 개발에 통합하여 상주 미세아교세포를 가진 인간 뇌 오가노이드를 생성하는 프로토콜을 제시합니다.

Microglia 발달을 통한 인간 뇌 오가노이드의 유도

배우세요 iPSC에서 미세아교세포 유사 세포로 분화하는 방법과 인간 시냅토좀을 이용한 생세포 식균작용 분석 기법을. 이 프로토콜은 신경염증 연구에 활용됩니다.

인간 미세아교세포 유사 세포: 유도만능줄기세포로부터의 분화 및 인간 시냅토좀을 이용한 체외 생세포 식균작용 분석

더 많은 동영상 탐색