Name: 국소 콜라겐 구조와 죽상경화반 섬유조직의 기계적 특성 사이의 상관관계를 연구하는 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-11T13:50:00.000+00:00
Duration: 13 min 45 s
Description: 배우세요 죽상경화반 섬유조직의 콜라겐 구조와 기계적 특성을 연관짓는 방법을. 다중광자 현미경과 단축 인장 시험을 활용하여 파열 위험을 예측하고 심혈관 사건을 예방하는 데 필수적인 통합 평가 기법을 제공합니다.

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저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

현재 연구는 섬유성 죽상경화성 플라크 조직의 국소 콜라겐 방향과 분산, 국소 기계적 특성 및 파열 거동 사이의 상관관계를 연구하기 위한 기계 이미징 파이프라인 개발에 중점을 두었습니다. 본 명세서에 기술된 프로토콜은 몇 가지 이유로 혁신적이다. 첫째, 기계적 하중 하에서 섬유상 플라크 조직의 국소 변형을 측정하기 위해 디지털 이미지 상관관계가 적용된 것은 이번이 처음입니다. 둘째, 이 프로토콜은 국소 변형 패턴과 섬유성 플라크 조직의 국소 콜라겐 구조 사이의 연관성을 분석하는 데 필요한 정보를 제공합니다. 국소 평가의 중요성은 조직의 이질적인 특성을 보여주는 결과 섹션에 제시된 균주 데이터와 콜라겐 데이터 모두에 의해 강조됩니다. 따라서 이 프로토콜에서 사용되는 것과 같은 국소 평가를 가능하게 하는 기술의 사용은 섬유질 플라크 특성에 대한 향후 연구에 권장됩니다.
테스트 샘플 준비는 이 프로토콜의 중요한 단계 중 하나입니다. 경동맥 플라크는 주로 콜라겐 조직입니다. 그러나, 이들은 전체 플라크 기계적 거동에 영향을 미치는 것으로 간주되는 석회화를 함유할 수 있다36,37. 이 연구는 플라크의 섬유 조직 구성 요소에 초점을 맞추기 때문에 μCT 이미징38을 사용하여 테스트 샘플에서 석회화를 피할 수 있습니다. μCT를 사용할 수 없는 경우 플라크의 석회화된 영역을 감지하기 위해 MRI 또는 OCT39와 같은 다른 이미징 기술을 고려할 수 있습니다. 석회화가 없고 기계적 검사에 사용할 수 있을 만큼 충분히 큰 섬유질 조직 검사 샘플을 얻는 것은 심하게 석회화되거나 분산된 석회화를 포함하는 플라크에 대해 어려운 작업일 수 있습니다. 프로토콜의 또 다른 과제는 디지털 이미지 상관관계를 위한 최적의 스페클 패턴을 생성하는 것입니다. 최적의 DIC는 50:5028의 흑백 비율이 필요하며, 적절한 품질을 보장하기 위해 3-5픽셀(29)의 스페클 사이즈를 필요로 한다. 이러한 요구 사항을 충족하지 못하면 부정확한 국부 변형률 측정이 발생할 수 있습니다. 마지막으로, 조직의 자연적 랜드마크가 명확하지 않은 경우 파열 위치를 SHG 이미지에 매핑하는 것이 어려울 수 있습니다. 이러한 샘플의 경우 이미징 전에 조직에 여러 기준 마커를 적용하는 것이 도움이 될 것입니다.
현재 프로토콜에 사용되는 MPM-SHG 기술은 상대적으로 침투 깊이가 큰 고해상도 및 비파괴 기술이기 때문에 다른 많은 콜라겐 이미징 기술보다 우수합니다. 그러나 MPM-SHG의 침투 깊이(<400μm)는 0.5mm에서 2mm 사이의 테스트 샘플의 전체 두께를 이미징할 수 없기 때문에 한계가 있습니다. 확산 텐서 자기 공명 영상(diffusion tensor magnetic resonance imaging, DT-MRI)을 이용한 최근 연구에서, 우리는 플라크 조직의 더 깊은 부분에서의 우세한 섬유 배향이 조직의 보다 표면적인 내강 부분에서의 배향과 다를 수 있음을 입증하였다14. 따라서 두꺼운 섬유질 플라크 조직 샘플의 더 깊은 부분에서 국소 콜라겐 구조와 국소 조직 역학과의 관계를 조사하기 위한 추가 연구가 필요합니다. 이를 위해 편광 공간 주파수 영역 이미징(pSFDI)을 활용할 수 있습니다. 최근에 개발된 이 광학 이미징 기술은 승모판막 첨판에서 0.8mm 깊이의 섬유 배향을 측정할 수 있는 잠재력이 있는 것으로 보고되었다12. 또한 pSFDI는 빠른 획득을 제공하므로 현재 프로토콜의 경우처럼 타일을 선택하는 대신 전체 샘플 영역을 쉽게 시각화할 수 있습니다. 현재 프로토콜의 또 다른 한계는 표면 변형만 식별할 수 있다는 것입니다. 향후 연구에서, 미러 어시스트 멀티뷰 DIC40 또는 디지털 체적 상관관계(DVC)41 가 체적, 지하 변형에 대한 추가 정보를 얻기 위해 이 프로토콜에 포함될 수 있다.
현재의 실험 프로토콜은 플라크 파열 역학 및 기본 미세 구조와의 관계에 대한 추가 정보를 얻기 위해 여러 가지 방법으로 추가로 확장되거나 수정될 수 있습니다. 첫째, 현재 프로토콜에는 원주 방향의 단축 인장 시험이 포함됩니다. 이러한 유형의 기계적 테스트는 플라크가 생체 내에서 주로 원주 방향으로 인장 스트레칭을 경험하기 때문에 선택되었습니다. 보다 포괄적인 기계적 특성화를 위해 이 프로토콜을 추가로 확장하여 팽창 테스트, 이축 테스트 또는 길이 방향의 단축 인장 테스트를 통합할 수 있습니다. 둘째, 현재 프로토콜은 DIC를 통해 국소 균주를 얻는 데에만 초점을 맞추고 있습니다. 그러나 플라크 기계적 거동에 대한 보다 완전한 관점은 프로토콜에 국소 응력 분석을 포함함으로써 얻을 수 있지만 이를 위해서는 국소 강성의 특성화가 필요합니다. 현재로서는 도전적이지만, 이것은 역유한요소법(42,43) 및 가상필드법(44)과 같은 계산 기술에 의해 달성될 수 있다. 실험적 적응 외에도 몇 가지 추가 후처리 단계를 현재 프로토콜에 추가할 수도 있습니다. 첫째, 파열 위치만 식별하는 것이 아니라 획득한 고속 카메라 영상을 통해 균열 전파 경로를 식별할 수 있습니다. 이 전파 경로는 국부적 구조적 및 기계적 파라미터와 상관될 수 있습니다. 둘째, 파열 개시 위치는 설명된 프로토콜에서 시각적으로 확인되었습니다. 비생물학적 조직에 대한 이전 연구에서는 파열45를 감지하기 위해 DIC 변형률 측정의 불연속성을 사용했습니다. 이러한 자동 파열 감지를 플라크 조직에 적용하면 파열 감지의 정확도를 향상시킬 수 있습니다. 마지막으로, 다른 콜라겐 이미징 기술에 비해 MPM-SHG의 가장 큰 장점은 개별 콜라겐 섬유를 시각화한다는 것입니다. 따라서 이 프로토콜을 통해 얻은 데이터는 콜라겐 함량과 같은 추가 국소 콜라겐 특성을 조사하는 데에도 사용할 수 있습니다.
이 프로토콜은 생체 내에서 플라크 파열에서 기계적으로 실패하는 구성 요소인 섬유성 플라크 조직의 국소 특성에 대한 더 나은 이해를 제공하는 데 사용할 수 있습니다. 이 정보는 환자의 플라크 파열을 예측하는 새로운 구조적 및 기능적 이미징 마커를 설정하는 데 필요합니다. 이전에 제안된 위험 바이오마커가 향후 임상 사건에 대해 차선의 예측 가치를 갖는 것으로 나타났기 때문에 이러한 새로운 마커가 필요합니다 5,6. 미래에, OCT 및 ps-OCT는 동맥계에서 섬유 조직을 확인하고 정량화할 수 있다(46,47,48). 또한, 균주는 국소 플라크 조성물49에 대한 대리 마커로 간주되었다. 따라서, 생체내 변형률 측정치(49)는 잠재적으로 환자에서 플라크 안정성의 식별에 도움이 될 수 있다. 그러나 얻은 결과를 생체 내 플라크 파열로 직접 번역하는 데는 주의해야 합니다. 첫째, 섬유상 플라크 조직은 이 프로토콜에서 사용되는 단방향 인장 하중보다 생체 내에서 더 복잡한 하중을 경험합니다. 둘째, 죽상동맥경화반은 다성분 구조입니다. 섬유상 플라크 조직 내의 생체내 스트레스 및 변형률 분포는 석회화와 같은 다른 플라크 성분의 존재 및 위치에 의해 영향을 받을 수 있다(37).
이 기계 이미징 파이프라인은 다른 콜라겐 조직을 연구하는 데에도 사용할 수 있습니다. 콜라겐의 글로벌 기계적 테스트 및 구조 이미징은 이미 생물학적 조직에 널리 사용되고 있습니다. 그러나 콜라겐 구조뿐만 아니라 사전 고장 및 고장 특성에 대한 국소 평가는 이질적인 섬유 조직의 정확한 기계적 특성화에 중요합니다. 우리는 이 새로운 프로토콜의 구조가 여러 생물학적 조직의 미세 구조와 역학 사이의 상호 작용에 대한 추가 통찰력을 제공할 것으로 기대합니다.

종종 경동맥의 죽상동맥경화반 파열에 의해 유발되는 허혈성 뇌졸중은 전 세계적으로 사망률과 이환율의 주요 원인 중 하나입니다1. 그러나 경동맥 죽상동맥경화증 관련 뇌졸중을 예방하기 위한 현재의 외과적 치료 계획 전략에는 플라크 파열 위험 평가가 포함되어 있지 않다2. 이는 주로 플라크캡 두께3 및 지질 코어 크기4와 같은 이전에 제안된 위험 바이오마커가 향후 임상 사건에 대해 차선의 예측 값을 갖는 것으로 나타났기 때문입니다 5,6. 플라크 역학 및 파열 메커니즘에 대한 더 나은 이해는 플라크 파열 위험 평가를 최적화하고 죽상동맥경화성 플라크의 새로운 위험 마커를 식별하는 데 필요합니다.
플라크 파열은 섬유질이 많은 플라크 조직이 혈압에 의해 가해지는 기계적 부하를 견디지 못하고 구조적 완전성을 잃는 국소적인 기계적 사건이다7. 그럼에도 불구하고, 플라크 파열 사건의 역학과 기본 미세 구조와의 연관성은 잘 이해되지 않고 있습니다8. 플라크 조직 파괴를 특징으로 하는 소수의 실험적 연구는 조직의 구조적 균질성을 가정하여 파생된 9,10,11,12,13개의 보고된 총 기계적 파열 특성(즉 , 극한 인장 파괴 변형률 및 강도)을 특징으로 합니다. 그러나, 섬유상 플라크 조직은 구조적으로 이질적이며, 틀림없이 주로 콜라겐 섬유 구조의 국부적 변이에 기인한다(14). 또한, 플라크 조직의 기계적 고장 특성과 콜라겐 구조 사이의 연관성은 Johnston et al.의 최근 연구에서만 조사되었습니다. 저자들은 우세한 섬유 방향에서 플라크 간 차이를 보였고 주로 원주 섬유 배향을 가진 섬유질 플라크 캡 샘플에 대해 더 높은 극한 응력과 더 낮은 극한 변형을 보고했습니다15. 그러나 이 연구는 또한 총체적인 기계적 및 구조적 특성에 국한되었습니다.
국소 콜라겐 구조와 섬유질 플라크 조직의 국소 기계적 특성에 대한 필수 정보를 밝히기 위해 현재 연구에서 우리는 기계 이미징 파이프라인을 개발했습니다. 이 생체 외 파이프라인을 사용하면 국소 콜라겐 섬유 방향 및 분산뿐만 아니라 국소 파열 변형률의 정량화가 가능합니다. 파이프라인에는 플라크 조직의 콜라겐 섬유를 이미지화하기 위한 SHG를 사용한 MPM 이미징과 조직의 파열 특성을 정량화하기 위한 DIC 및 단축 인장 테스트가 포함됩니다.
다광자 현미경-초고조파 생성(MPM-SHG)은 생체 조직에서 콜라겐을 연구하는 데 널리 사용되는 기술이 되었다16. 이 기술은 조직학(histology)17, 확산 텐서 이미징(diffusion tensor imaging, DTI)14 및 소각 광 산란(small-angle light scattering)15과 같은 다른 콜라겐 이미징 기술에 비해 많은 장점이 있습니다. 첫째, MPM-SHG 이미징은 비파괴적이므로 기계적 테스트18과 결합하는 것이 이상적입니다. 둘째, SHG 신호는 콜라겐에 특이적이므로 조직의 염색이 필요하지 않습니다. 긴 여기 파장(근적외선)으로 인해, 투과 깊이는 다른 현미경 기술보다 크다16. SHG 이미징으로 달성한 고해상도(μm 수준)는 개별 섬유의 시각화도 가능하게 합니다. 이는 콜라겐 섬유의 수, 콜라겐 섬유의 배향, 분포의 국소 정량화와 같은 많은 가능성을 제공한다19.
기계적 테스트와 결합된 디지털 이미지 상관관계(DIC)는 생물학적 조직(20)의 국소적인 기계적 특성을 얻기 위해 널리 사용되는 방법이다. DIC를 이용하면, 조직 표면에 적용된 스페클의 변위는 기계적 테스트(20) 동안 획득된 고속 카메라 이미지를 비교함으로써 추적된다. 이 이미지 후처리 방법은 시편(20 )의 전장 표면 변형을 추정하는 데 사용되며 조직(21)의 파열 거동을 연구하는 데에도 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>10mm 확장 링</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>CML10</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 튜브</td><td>VWR</td><td>525-0150</td><td></td></tr><tr><td>20x APO 침수 대물렌즈</td><td>Leica</td><td>507701</td><td></td></tr><tr><td>3D 슬라이서 소프트웨어</td><td>N/A</td><td>버전 4.11</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 튜브</td><td>VWR</td><td>525-0156</td><td></td></tr><tr><td>에어브러시 권총 AB 430- 노즐 직경 0.3 mm</td><td>Conrad</td><td>4.01614E+12</td><td></td></tr><tr><td>블랙아웃, 나일론 패브릭 포함 폴리우레탄 코팅</td><td>Thorlabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>블랙 티슈 염료</td><td>Polysciences inc</td><td>24113-2</td><td></td></tr><tr><td>카메라 렌즈, 초점 거리 50 mm</td><td>Thorlabs Inc.</td><td></td><td></td>MVL50M1</tr><tr><td>카메라 스탠드</td><td>VWR</td><td>241-0093, 241-7311</td><td></td></tr><tr><td>카멜레온 울트라 다광자 레이저</td><td>코히런트</td><td></td><td></td></tr><tr><td>압축기 + 에어 호스</td><td>JUN-AIR, Conrad</td><td>B07GB9HC62, 4016138577198</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td>버전 2208</td><td></td></tr><tr><td>폼 테이프 양면, 1.9 x 150 cm</td><td>패텍스</td><td></td><td></td></tr><tr><td>가열 수조</td><td>N/A</td><td></td><td>맞춤형</td></tr><tr><td>고속 카메라 + 이미징 소프트웨어</td><td>Pixelink-Navitar Inc.</td><td>PL-D725</td><td></td></tr><tr><td>인간 경동맥 죽상경화성 플라크 (경동맥 내막 절제술에서)</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image J</td><td>National Institute of Health</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>LAS-AF</td><td>Leica</td><td>버전 2.3</td><td>이미징 소프트웨어 다광자 현미경</td></tr><tr><td>LEICA TCS SP5 II</td><td>SHG 이미징에 사용되는</td><td>라이카</td><td></td> 현미경</tr><tr><td>조명 시스템</td><td>AMZ instruments</td><td>LED-60TB</td><td>고속 카메라로 선명한 이미지를 얻는 데 사용됨</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>버전 R2021A</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB 기반 FibLab 소프트웨어</td><td>Eindhoven University of Technology</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB 기반 FOA (Fiber Orientation Analysis) 도구</td><td>Eindhoven University of Technology</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB 기반 Ncorr 소프트웨어</td><td>Georgia Institute of Technology</td><td>버전 1.2</td><td></td></tr><tr><td>바늘</td><td>에메랄드</td><td>BDAM302986</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시 (지름 10cm)</td><td>VWR</td><td>BRND452000</td><td></td></tr><tr><td>파라필름</td><td>VWR</td><td>291-1214</td><td></td></tr><tr><td>파스퇴르 피펫</td><td>VWR</td><td>ELKA127-P511-000</td><td></td></tr><tr><td>Quantum GX2 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 (&mu; CT) 스캐너 + Cu 0.06 mm + Al 0.5 mm</td><td>PerkinElmer</td><td>CLS149276</td><td></td></tr>자 <tr><td></td><td>정밀 과학 도구</td><td>1800030</td><td></td></tr><tr><td>사포 (P180)</td>의 X 선 필터 <td>Conrad</td><td>4.00932E + 12</td><td></td></tr><tr><td>사이드 커터</td><td>Conrad</td><td>4.25084E + 12</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 엘라스토머 기반 및 경화제 (Sylgard 184)</td> <td>VWR</td><td>634165S</td><td></td></tr><tr><td>인장 시험기 + 소프트웨어 + 클램프</td><td>N/A</td><td></td><td>원통형 선형 액추에이터(EACM2E10AZAK, Oriental Motor Ltd.) 및 10N 로드셀(LCMFD-10N, Omega Engineering Inc.)을 사용하여 자체 제작</td></tr><tr><td>토크 스크루 드라이버</td><td>Garant, Hoffman 그룹</td><td>659906</td><td></td></tr></tbody></table>

국소 콜라겐 구조와 죽상경화반 섬유조직의 기계적 특성 사이의 상관관계를 연구하는 방법

A Method to Study the Correlation Between Local Collagen Structure and Mechanical Properties of Atherosclerotic Plaque Fibrous Tissue

관상 동맥 및 경동맥의 죽상 경화성 플라크의 파열은 치명적인 심혈관 사건의 주요 원인입니다. 그러나 이질적이고 콜라겐이 많은 플라크 조직의 파열 역학과 이것이 조직의 섬유 구조와 어떻게 관련되어 있는지는 아직 알려져 있지 않습니다. 플라크 역학을 연구하기 위한 기존 파이프라인은 조직의 구조적 균질성을 가정하여 플라크 조직의 총체적인 기계적 특성만을 얻는 것으로 제한됩니다. 그러나, 섬유질 플라크 조직은 구조적으로 이질적이며, 틀림없이 주로 콜라겐 섬유 구조의 국부적 변이로 인한 것입니다.
여기에 설명된 기계 이미징 파이프라인은 이질적인 구조적 및 기계적 플라크 특성을 연구하기 위해 개발되었습니다. 이 파이프라인에서 조직의 국소 콜라겐 구조는 2차 고조파 생성(SHG)이 있는 다광자 현미경(MPM)을 사용하여 특성화되고 조직의 실패 거동은 디지털 이미지 상관관계(DIC) 분석을 사용하는 단축 인장 테스트 조건에서 특성화됩니다. 이 실험 파이프라인은 콜라겐 섬유 배향의 국소 우세 각도와 분산, 파열 거동 및 섬유질 플라크 조직의 변형 지문의 상관 관계를 가능하게 합니다. 얻은 지식은 죽상경화성 플라크 파열 사건을 더 잘 이해, 예측 및 예방하는 데 중요합니다.

조직 수집 및 테스트 샘플 준비 조직 수집은 구조 이미징 및 단축 인장 테스트를 위해 개별 테스트 샘플로 해부할 수 있는 플라크 섬유 조직 표본을 생성합니다. 이상적으로, 수집된 섬유 조직 샘플에는 눈물이 거의 또는 전혀 없는 영역(그림 5A)과 거대 석회화(그림 5B)가 포함됩니다. 이러한 과도한 눈물과 석회화(그림 5C)는 앞서 언급한 WL 1의 샘플 치수 요구 사항을 충족하지 않는 플라크 샘플로 이어질 수 있습니다.
다광자 현미경 이미징 SHG 이미징 및 이미지 후처리는 이미지화된 각 타일에서 MIP를 제공합니다(그림 6A,B). 섬유 검출(그림 6C)에 의한 추가 후처리는 콜라겐 구조 매개변수를 추출할 수 있는 섬유 배향 히스토그램(그림 6D)을 산출합니다(그림 6E). 또한 시각적 분석을 위해 전체 플라크 샘플에 걸쳐 국소 구조적 콜라겐 매개변수를 보여주는 컬러 맵을 얻을 수 있습니다(그림 6F, G). 그림 6의 대표적인 테스트 샘플의 경우 구조적 콜라겐 매개변수의 큰 샘플 내 변동이 발견됩니다(μ p = -34° ± 32°의 평균 ± SD; σp = 21° ± 4°; Pani = 0.49 ± 0.14, 원주 방향이 0°로 정의된 경우). 이 샘플 내 변동은 균질성을 가정하는 대신 국소 구조 매개변수를 얻는 것의 중요성을 강조합니다.
기계적 테스트 파열 동작 고속 카메라는 기계적 테스트 중 플라크 샘플의 변형 및 파열 거동에 대한 이미지를 제공합니다(그림 7). 이러한 이미지에서 파열 개시 위치와 파열 전파 경로를 식별할 수 있습니다. 파열 식별 결과는 카메라 이미지에 기포 또는 반사가 존재하거나 파열이 너무 빠르게 전파되어 선택한 프레임 속도로 캡처할 수 없는 경우 최적이 아닙니다.
국소 변형 패턴 단축 인장 시험 중에 획득한 카메라 기록에 대한 디지털 이미지 상관 분석은 그림 8에 표시된 Green-Lagrange 변형 맵과 같은 국소 조직 변형 맵을 제공합니다. 이 맵은 파열이 시작되기 전에 프레임에서 세 가지 변형 성분(εxx, εxy 및 εyy)을 표시합니다. 이러한 변형 맵으로부터, 관심 영역에서의 평균 변형률 및 파열 위치와 같은 지점에서의 국소 변형률이 추출될 수 있다.
그림 8의 대표 샘플의 경우, 국소 변형률 데이터는 큰 샘플 내 변동을 보여줍니다. 그림 8의 대표적인 시험 샘플의 경우, 국소 균주에서 큰 샘플 내 변동이 발견됩니다 (관찰 된 균주의 범위는 다음과 같습니다 : εxx = -0.30-0.17; εxy = -0.13-0,20; εyy = 0-0.40). 이것은 조직 균질성을 가정하여 얻은 총체적인 평균값 대신 지역 데이터를 얻는 것의 중요성을 강조합니다.
기계적 및 구조적 조직 정보의 상관 관계 상기 언급된 결과는 조직의 국소 변형 및 파열 거동을 콜라겐 구조에 회상시킬 수 있게 한다. 파열 위치가 카메라 녹화(그림 9A)에서 식별되면 참조 카메라 이미지(그림 9B) 및 현미경 타일 스캔(그림 9C)에 다시 매핑할 수 있습니다. 이는 파열이 발생한 MPM-SHG 타일과 이 타일에서 발견된 구조적 매개변수를 제공합니다(그림 9D). 그림 9에 표시된 대표 샘플에서 파열이 발생한 타일에서 발견되는 구조 매개변수는μ p = 28°, σp = 19° 및 Pani = 0.6입니다. 파열되지 않은 조직 위치에도 동일한 절차를 적용할 수 있습니다. 파열 프레임의 참조 이미지에서 파열 위치를 매핑하는 것은 스페클 패턴이 좋지 않고 자연 랜드마크가 불분명한 경우 어려울 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 또한, 조직의 자연적 랜드마크가 충분히 명확하지 않은 경우, 타일 스캔 오버레이 및 고속 카메라 이미지의 공동 등록이 어려울 수 있다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64334/64334fig01.jpg"> 그림 1: 제시된 실험 프로토콜의 워크플로 차트. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64334/64334fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64334/64334fig02.jpg"> 그림 2: 타일 스캔에서 SHG 이미징을 위한 타일 선택 . (A) 테스트 샘플은 실리콘에 고정되어 있습니다. (B) 명시야 현미경으로 얻은 테스트 샘플의 타일 스캔. SHG 이미징을 위해 선택한 타일은 파란색 사각형으로 표시됩니다. (C) SHG를 사용한 MPM의 최대 강도 투영. 스케일 바 = 140 μm (C). 약어: SHG = 2차 고조파 생성; MPM = 다광자 현미경. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64334/64334fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64334/64334fig03.jpg"> 그림 3: 다광자 현미경의 대물렌즈 아래에 놓인 플라크 샘플. 플라크 샘플의 위치는 인산염 완충 식염수로 채워진 페트리 접시에 의해 고정됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64334/64334fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64334/64334fig04.jpg"> 그림 4: 맞춤형으로 설계된 단축 인장 시험기(다양한 구성품 표시). (A) 시스템의 전체 개요. 클램프의 사포 인서트는 하단 클램프만 부착되어 있으므로 볼 수 있습니다. (B) 시험 준비가 된 시험편이 있는 인장 시험기의 클램프 확대 이미지. 약어: PVC = 폴리염화비닐; LED = 발광 다이오드. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64334/64334fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64334/64334fig05.jpg"> 그림 5: 대표 샘플의 조직 수집 및 샘플 준비 결과 . (A) 경동맥 내막 절제술을 받은 동의한 환자로부터 채취한 신선하고 온전한 플라크 샘플. (B) μCT 스캔에서 3D 재구성. 석회화된 조직은 연한 파란색으로 표시되고 석회화되지 않은 조직은 빨간색으로 표시됩니다. 석회화된 조직이 없는 최적의 샘플은 파란색 선 사이의 영역에서 얻을 수 있습니다. (C) μCT 스캔에서 석회화된 조직이 과다한 최적이 아닌 플라크를 보여주는 3D 재구성. 스케일 바 = 3mm. 약어: μCT = 미세 컴퓨터 단층 촬영. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64334/64334fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64334/64334fig06.jpg"> 그림 6: MPM-SHG는 대표 샘플의 결과입니다. (A) 타일 스캔 개요; 이미징을 위해 선택한 타일은 파란색으로 표시됩니다. (B) 다양한 타일의 MIP. (C) 선택한 타일에서 FOA 도구에 의한 섬유 감지. (D) 선택한 타일의 섬유 배향 히스토그램. (E) 섬유 배향 히스토그램 + 가우시안 핏(Gaussian fit), 이로부터 콜라겐 구조 파라미터가 선택된 타일로부터 추출될 수 있다. (F) 전체 플라크 샘플에 걸쳐 μ p(배향 검정선) 및 σp(배경색)의 표현. (G) 전체 플라크 샘플에 걸쳐 μp(배향 검정선) 및p ani(배경색)의 표현. 스케일 바 = 140 μm (B,C). 약어: MPM-SHG = 다광자 현미경-2차 고조파 생성; MIPs = 최대 강도 예측; FOA = 섬유 배향 분석; μp = 우세한 섬유 각도; P ani = 이방성 분획; σp = 섬유 각도 분포의 표준 편차; Piso = 등방성 분획. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64334/64334fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64334/64334fig07.jpg"> 그림 7: 인장 시험 절차 중 플라크 조직 샘플에서 파열 시작 및 전파.1) 미리 늘어난 상태, 손상되지 않은 조직. 2) 파열 개시 - 파열이 관찰되는 첫 번째 프레임. 파열 개시 위치는 빨간색 사각형으로 표시됩니다. 3 ) 및 4) 파열 전파. 5) 플라크 샘플의 완전한 파열. 스케일 바 = 1mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64334/64334fig07large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64334/64334fig08.jpg"> 그림 8: 파열 전 프레임에서 대표 샘플(εxx, εxy 및 εyy)의 Green-Lagrange 변형 패턴, DIC 분석으로 얻은 것. 전체 플라크에 대한 평균 및 표준 편차가 파열 위치의 변형률과 함께 제공됩니다. 약어: DIC = 디지털 이미지 상관관계; εxx = 세로 변형률; εxy = 전단; εyy = 인장 변형률. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64334/64334fig08large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64334/64334fig09.jpg"> 그림 9: 이미지에 파열 위치(빨간색 사각형)의 오버레이 이미지. (A) 파열이 식별되는 고속 카메라 이미지(파열 프레임). (B) 프리스트레치만 적용된 고속 카메라 이미지(참조 프레임). (C) 현미경을 통해 얻은 타일 스캔 이미지. (D) 다양한 타일에서 국소 콜라겐 구조 파라미터를 보여주는 색상으로 구분된 지도. 전체 플라크 샘플에 걸쳐μ p(배향 검정선) 및p ani(배경색)가 제시된다. 약어: μp = 우세한 섬유 각도; Pani = 이방성 분획. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64334/64334fig09large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

우리는 이질적인 구조적 및 기계적 죽상경화성 플라크 특성을 연구하기 위해 기계 이미징 파이프라인을 개발했습니다. 이 파이프라인은 콜라겐 섬유 배향의 국소 우세 각도와 분산, 파열 거동 및 섬유질 플라크 조직의 변형 지문의 상관 관계를 가능하게 합니다.

The rupture of atherosclerotic plaques in coronary and carotid arteries is the primary cause of fatal cardiovascular events. However, the rupture ...

이 프로토콜은 콜라겐 구조와 섬유질 플라크 조직의 기계적 고장 특성 모두에 대한 국소 평가를 가능하게 합니다. 구조적 평가와 기계적 평가가 모두 동일한 조직 샘플에 대해 수행되었기 때문에 이 기술을 통해 조직의 구조적 평가와 기계적 평가 사이의 기능적 연관성을 밝힐 수 있습니다. 섬유성 플라크 조직 구조 및 실패 특성에 대한 이 프로토콜로 얻은 지식은 죽상경화성 플라크 파열에 의해 유발되는 임상적 치명적인 사건을 예방하고 예측하는 데 중요합니다.시작하려면 수술 용 가위와 핀셋을 사용하여 동맥의 세로축을 따라 플라크를 자릅니다. 플라크 표본에서 직사각형 테스트 샘플을 잘라내어 샘플이 가능한 한 커지도록 하면서 눈물이나 석회화가 포함된 조직 영역을 피합니다. 다음으로, 플라크 테스트 샘플을 채취하여 조직에 바늘을 고정하여 양쪽 끝을 실리콘에 고정합니다.기계적 시험 중 인장 시험 장치의 클램프에 들어갈 샘플 영역에 바늘을 삽입합니다. 보안경을 착용하십시오. 측면 커터를 사용하여 바늘이 현미경 대물렌즈가 손상되지 않도록 샘플 표면에서 몇 밀리미터 미만으로 튀어나오도록 바늘을 줄입니다.샘플이 잠길 때까지 페트리 접시에 PBS를 채웁니다. 그런 다음 현미경 시스템을 켜고 다광자 키를 돌린 다음 현미경의 작동 소프트웨어를 엽니다. 테스트 샘플이 들어 있는 페트리 접시를 대물렌즈 아래에 놓고 현미경 대물렌즈를 내립니다.라이브 스캔 모드를 켭니다. 스마트 패널의 노브를 사용하여 대물렌즈를 샘플의 모서리로 이동하고 타일 스캔 패널에서 마크 위치 기호를 클릭합니다. 올바르게 수행되면 이미징을 위해 선택한 모든 타일이 있는 그리드가 주황색으로 나타납니다.그런 다음 화면 오른쪽 하단 모서리에 있는 시작을 클릭하여 전체 샘플 표면의 타일 스캔을 생성하여 샘플 형상의 개요를 얻습니다. 타일 스캔 후 자동으로 표시되는 타일 스캔 패널에서 왼쪽 상단 타일의 왼쪽 위 모서리에 있는 X 및 Y 좌표를 관찰합니다. 스프레드시트에 이러한 좌표를 기록해 둡니다.타일 스캔 패널에서 ScanField라는 상자에서 X 및 Y 방향의 타일 수를 확인합니다. 스프레드시트에서 타일 스캔의 크기를 확인합니다. 타일의 크기를 더하거나 빼서 다른 타일의 좌표를 계산합니다.타일 스캔에서 2차 고조파 생성 또는 SHG 이미징으로 이미징할 타일을 선택합니다. 선택을 위해 클램프의 타일을 피하고 선택한 각 타일 사이에 세로 방향과 원주 방향 모두에 하나의 타일을 남겨 둡니다. 다음으로, 이 스프레드시트에서 계산된 좌표를 사용하여 이미지화할 타일의 위치를 식별합니다.지정된 상자에 좌표를 입력하고 Enter 키를 클릭하여 목표가 오른쪽 타일로 이동하도록 합니다. 라이브 스캔 모드를 켭니다. 상단 패널의 슬라이더와 빔 경로 설정을 사용하여 다광자 또는 MP 레이저 출력을 높이면 심각한 표백 없이 가능한 최고의 레이저 출력을 얻을 수 있습니다.그런 다음 스마트 패널의 노브를 사용하거나 감지기 이름과 빔 경로 설정 및 추가 채널을 클릭하여 포화 픽셀이 없는 밝은 이미지를 얻을 수 있도록 감지기 게인을 조정합니다. 검출기 이득의 일반적인 값은 500볼트에서 800볼트 사이입니다. 스마트 패널의 Z 위치 노브를 사용하여 초점 평면을 조정합니다.그런 다음 샘플의 맨 위로 이동하고 세 번째 패널의 획득 탭 아래에 있는 Z 스택 패널의 화살촉을 클릭하여 Z 스택 상단의 위치를 설정합니다. 그런 다음 SHG 신호가 더 이상 감지되지 않을 때까지 샘플에 초점을 맞춥니다. 다시 Z 스택 패널에서 화살촉을 클릭하여 이 위치를 설정합니다.완료되면 라이브 스캔 모드를 끕니다. 두 번째 패널의 획득 탭에서 드롭다운 목록을 사용하여 스캔 속도를 400Hz로 유지하고, 라인 평균을 2로 설정하고, 해상도를 이미지당 512 x 512픽셀로 설정합니다. 양방향 X 스캔 버튼을 켭니다.Z-스택 패널에서 z-스텝 크기를 클릭하고 상자에 3미크론의 z-스텝 크기를 입력합니다. 화면 오른쪽 하단 모서리에 있는 시작을 클릭하여 Z 스택을 생성합니다. 완료되면 타일의 좌표를 파일 이름에 저장하거나 각 타일에 번호를 지정합니다.이미징 후 샘플은 기계적 테스트에 노출됩니다. 스패클 패턴을 생성하려면 티슈 염료로 채워진 에어브러시를 테스트 샘플에서 약 30cm 떨어진 곳에 잡고 내강 표면에 뿌립니다. 다음으로, 단축 인장 시험의 경우, 샘플의 원주 방향이 인장 스트레칭 방향과 정렬되고 샘플의 내강 쪽이 위쪽을 향하도록 샘플을 인장 시험기의 클램프에 놓습니다.스트립의 너비 대 길이 비율이 1보다 작도록 초기 표점 거리가 설정되어 있는지 확인합니다. 토크 드라이버를 사용하여 20 센티미터 뉴턴 미터의 토크를 적용하여 그립의 나사를 조입니다. 샘플이 잠길 때까지 가열 수조에 PBS를 추가합니다.로드셀을 찢고 로드셀과 인장 시험기의 액추에이터에서 전체 힘 및 변위 측정값을 기록하기 시작합니다. 샘플의 느슨함을 제거하기 위해 0.05뉴턴의 사전 스트레치를 적용하여 샘플을 곧게 펴십시오. 사전 스트레칭을 적용한 후 액추에이터가 측정한 게이지 거리를 기준으로 최대 10% 변형률까지 10주기의 사전 컨디셔닝을 수행합니다.고속 카메라로 샘플 변형 비디오를 녹화하는 동안 샘플이 완전히 파손될 때까지 단축 인장 시험을 시작합니다. 실패 후 전체 힘 및 변위 측정 기록을 중지합니다. 이미지 J에서 SHG를 사용하여 다광자 현미경(MPM) 중에 얻은 Z-스택을 열고 각 Z-스택의 최대 강도 투영(MIP)을 생성합니다.오픈 소스 MATLAB 기반 섬유 배향 분석 툴로 각 MIP를 분석하여 타일에 존재하는 개별 콜라겐 섬유의 배향 각도를 측정합니다. 또 다른 MATLAB 기반 툴인 FibLab을 사용하여 가우스 분포를 각도 분포 히스토그램에 피팅합니다. 가우스 분포도에서 분포의 모드인 우세한 섬유 각도, 섬유 각도 분포의 표준 편차, 이방성 분율과 같은 구조적 파라미터를 추출합니다.파열이 시작되는 프레임을 식별하기 위해 카메라 이미지에 대한 육안 검사를 수행합니다. 파열 위치를 육안으로 식별합니다. 인장 시험 중에 기록된 카메라 이미지를 사용하여 MATLAB 기반 소프트웨어 ncorr로 디지털 이미지 상관관계(DIC) 분석을 수행합니다.실패할 때까지 최종 스트레칭 전의 마지막 프레임을 참조 이미지로 선택합니다. 현재 이미지의 경우 최종 스트레칭 시작부터 파열 시작이 발생한 프레임 전의 마지막 프레임까지 ll images를 선택합니다. 샘플 표면을 관심 영역 또는 ROI로 선택합니다.클램프 근처에 있는 영역을 제외합니다. 파라미터의 부분 집합 반지름을 30픽셀로, 부분 집합 간격을 3픽셀로, 반복 컷오프를 50으로, 차이 벡터 컷오프의 노름을 10의 5승으로, 변형 반경을 5로, 자동 전파 단계를 5로 설정하여 DIC를 수행합니다. ncorr을 사용한 DIC 분석에서 ROI의 Green-LaGrange 또는 Eulerian 변형률 분포를 얻습니다.이러한 변형률 분포를 사용하여 파열 전 마지막 프레임에서 전체 플라크 샘플 표면의 평균 Green-LaGrange 변형률을 계산합니다. 파열 위치에서 Green-LaGrange 변형률을 계산합니다. 테스트 샘플의 자연 랜드마크를 사용하여 참조 이미지와 타일 스캔의 오버레이를 만들어 타일 스캔의 파열 위치를 식별합니다.파열이 발생한 MPM-SHG 타일을 식별합니다. MPM-SHG로 스캔한 타일에 파열이 없는 경우 파열 위치에 가장 가까운 타일을 식별합니다. 파열이 발생한 타일에서 발견된 구조적 매개변수를 구합니다.눈물과 거대 석회화가 거의 또는 전혀 없는 신선하고 온전한 플라크 샘플이 여기에 표시됩니다. 플라크 샘플은 이러한 눈물과 석회화를 포함하지 않는 영역에서 회수할 수 있습니다. SHG 이미징 및 이미지 후처리는 이미지화된 각 타일에서 MIP를 제공합니다.섬유 검출에 의한 추가 후처리는 콜라겐 구조 파라미터를 추출할 수 있는 섬유 배향 히스토그램을 생성합니다. 또한, 전체 플라크 샘플에 걸쳐 국소 구조적 콜라겐 파라미터를 보여주는 컬러 맵이 시각적 분석을 위해 얻어진다. 이러한 테스트 샘플로부터, 구조적 콜라겐 파라미터의 큰 샘플 내 변동이 관찰되었다.인장 시험 중 플라크 조직 샘플의 파열 개시 및 전파가 여기에서 입증됩니다. 디지털 이미지 상관 분석은 Green-LaGrange 변형 맵과 같은 국소 조직 변형 맵을 제공합니다. 이러한 균주 맵에서 국소 균주의 큰 샘플 내 변동이 관찰되었습니다.카메라 녹화에서 파열 위치가 식별되면 참조 카메라 이미지 및 현미경 타일 스캔에 다시 매핑할 수 있습니다. 이것은 파열이 발생한 MPM-SHG 타일과 이 타일에서 발견된 구조 매개변수를 제공합니다. 석회화가 없고 기계적 테스트를 수행할 수 있을 만큼 충분히 큰 섬유 조직 샘플을 얻는 것은 심하게 석회화된 플라크에 대해 어려운 작업일 수 있습니다.기계적 또는 구조적 특징이 섬유성 플라크 조직 부전의 예측 인자로 확인되면 이 특징을 측정하는 생체 내 이미징 시스템을 통해 환자의 플라크 파열 위험을 예측할 수 있습니다.

a-method-to-study-correlation-between-local-collagen-structure

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

조직화학적 및 면역조직화학적 분석과 결합된 대동맥동 및 상행 대동맥의 정밀 절단을 사용하여 마우스 모델에서 죽상경화성 병변을 정량화하고 특성화하는 절차를 설명합니다.

쥐의 대동맥 부비동의 동맥 경화 병변의 정량 분석​​ 및 특성

우리는이 문서에서 복잡한 이방성 축 기계적 변형에 하나의 세포 반응을 조사하고 생체 조직의 기계적 특성을 정량화하는 데 사용할 수있는 새로운 스트레칭 플랫폼을 제시한다.

세포와 조직 Mechanobiology의 응용 프로그램에 대한 새로운 스트레칭 플랫폼

우리는 단축 인장 시험을 거친 혈관 조직 샘플의 국소 표면 변형장을 특성화하기 위해 디지털 이미지 상관관계를 사용하는 방법을 설명합니다. 이러한 측정은 샘플의 기계적 반응의 정확한 정량화와 구성적 응력-변형률 관계의 생성을 용이하게 합니다.

디지털 이미지의 상관 관계를 사용하면 혈관 조직 표본의 로컬 균주의 특성을

우리는 동시에 기계적 테스트 설명 하 고 절연, 동맥 벽의 3D 이미징 라이브 인간의 저항 동맥, 및 엘라 스 틴과 콜라겐 공간 조직 및 볼륨 밀도의 정량화에 대 한 피지 및 Ilastik 이미지 분석. 우리는 동맥 벽 역학의 수학적 모델에 이러한 데이터를 사용 하 여 논의.

레이블 없는 형광 현미경 검사 법에 의해, 인간의 저항 동맥에 콜라겐과 엘라 스 틴 압력 종속 마이크로아키텍처가 평가

우리 세포 단계의 murine 동맥 경 화성 병 변 포함 하 여 동물 해 부, 조직 포함, 단면, 얼룩, 및 brachiocephalic 동맥의 분석의 체계적인 방법을 구성 하는 표준화 된 프로토콜을 제안 atheroprone에서 부드러운 근육 세포 계보 추적 마우스.

부드러운 근육 세포 계보 추적 마우스의 고급 동맥 경 화성 병 변에서 세포 성분의 정량 분석

죽상 동맥 경화증의 뮤린 모형은 분자 수준에 병원성 통로를 조사하기 위하여 유용한 공구입니다, 그러나 병변 발달의 표준화한 정량화가 요구됩니다. 이 프로토콜은 대동맥 근, 대동맥 아치 및 brachiocephalic 동맥을 포함하여 주요 동맥 혈관에 있는 병변 크기를 결정하기 위하여 최적화된 방법을 기술합니다.

마우스에서 동맥 경화증의 정량화

심근 경색이 발생하기 전에 개입을 안내하기 위해 관상 동맥 경화성 병변이 관상 동맥 혈관에서 진행될 지 결정할 필요가 있습니다. 이 문서에서는 이러한 진행을 예측하는 데 도움이 되는 상용 유한 요소 솔버에서 유체 구조 상호 작용 기술을 사용하여 광학 일관성 단층 촬영에서 동맥의 생체 역학 모델링을 설명합니다.

관상 동맥 경화증 진행의 광학 일관성 단층 촬영 기반 생체 역학 유체 구조 상호 작용 분석

생체 내 cine 혈관 내 초음파 이미지는 다양한 압력 부하 조건에 해당하는 관상 동맥 단면 움직임을 보여줍니다. 유한 요소 모델을 기반으로 반복 계획을 사용하여 계산 모델과 의료 이미지의 관상 동맥 움직임을 일치시켜 생체 내에서 관상 동맥의 환자 특정 기계적 특성을 결정했습니다.

인간 관상동맥의 생체 내 기계적 특성을 정량화하기 위한 혈관 내 초음파 이미지 기반 유한 요소 모델링 접근 방식 

이 프로토콜은 죽상경화증의 메커니즘과 진행에 대한 보다 심층적인 연구를 용이하게 하기 위해 죽상경화성 플라크의 정량적 분석을 위한 포괄적인 방법론을 제공합니다.

Isolation and Analysis of Aortic Arch and Root Lesions in an Atherosclerotic Mouse Model(죽상경화성 마우스 모델에서 대동맥궁 및 뿌리 병변의 분리 및 분석)

생리학 및 병리 학적 압력 조건에 심장 밸브 조직을 쓰는 수있는 순환 압력 생물 반응기는 설계되었습니다. LabVIEW 프로그램은 사용자가 압력 크기, 진폭 및 주파수를 제어할 수 있습니다. 이 장치는 심장 밸브 조직이나 격리 세포의 mechanobiology을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

의 순환 압력 생물 반응기 설계 예 VIVO</em대동맥 심장 밸브> 학습

배우세요 죽상경화반 섬유조직의 콜라겐 구조와 기계적 특성을 연관짓는 방법을. 다중광자 현미경과 단축 인장 시험을 활용하여 파열 위험을 예측하고 심혈관 사건을 예방하는 데 필수적인 통합 평가 기법을 제공합니다.

국소 콜라겐 구조와 죽상경화반 섬유조직의 기계적 특성 사이의 상관관계를 연구하는 방법

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