Name: 리슈만편모충 전공을 이용한 기공 형성 독소의 분자 메커니즘과 기능 해독 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: 배우세요 리슈만편모충을 이용한 기공 형성 독소의 기능과 메커니즘을 실시간 세포독성 분석으로 연구하는 방법입니다. 이 기법은 독소 저항성 메커니즘과 막 복구 반응을 이해하는 데 활용됩니다.

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저자는 원고에 대한 비판적 검토에 대해 Keyel 및 Zhang 연구실 구성원에게 감사하고 싶습니다. 저자는 시설 사용에 대해 예술 과학 대학 현미경에 감사드립니다.

<ol><li>Thapa, R., Ray, S., Keyel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+macrophages+and+cholesterol-dependent+cytolysins%3A+The+impact+on+immune+response+and+cellular+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins%22%5BJournal%5D)">Interaction of macrophages and cholesterol-dependent cytolysins: The impact on immune response and cellular survival.</a> Toxins. 12 (9), 531(2020).</li>
<li>Limbago, B., Penumalli, V., Weinrick, B., Scott, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+streptolysin+O+in+a+mouse+model+of+invasive+group+A+streptococcal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+%26+Immunity%22%5BJournal%5D)">Role of streptolysin O in a mouse model of invasive group A streptococcal disease.</a> Infection & Immunity. 68 (11), 6384-6390 (2000).</li>
<li>Farrand, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cholesterol-dependent+cytolysin+membrane-binding+interface+discriminates+lipid+environments+of+cholesterol+to+support+beta-barrel+pore+insertion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The cholesterol-dependent cytolysin membrane-binding interface discriminates lipid environments of cholesterol to support beta-barrel pore insertion.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (29), 17733-17744 (2015).</li>
<li>Soltani, C. E., Hotze, E. M., Johnson, A. E., Tweten, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+elements+of+the+cholesterol-dependent+cytolysins+that+are+responsible+for+their+cholesterol-sensitive+membrane+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Structural elements of the cholesterol-dependent cytolysins that are responsible for their cholesterol-sensitive membrane interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (51), 20226-20231 (2007).</li>
<li>Schoenauer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Down-regulation+of+acid+sphingomyelinase+and+neutral+sphingomyelinase-2+inversely+determines+the+cellular+resistance+to+plasmalemmal+injury+by+pore-forming+toxins%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Down-regulation of acid sphingomyelinase and neutral sphingomyelinase-2 inversely determines the cellular resistance to plasmalemmal injury by pore-forming toxins.</a> FASEB Journal. 33 (1), 275-285 (2019).</li>
<li>Ray, S., Roth, R., Keyel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+repair+triggered+by+cholesterol-dependent+cytolysins+is+activated+by+mixed+lineage+kinases+and+MEK%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Membrane repair triggered by cholesterol-dependent cytolysins is activated by mixed lineage kinases and MEK.</a> Science Advances. 8 (11), (2022).</li>
<li>Babiychuk, E. B., Monastyrskaya, K., Draeger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+annexin+A1+reveals+dynamics+of+ceramide+platforms+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Fluorescent annexin A1 reveals dynamics of ceramide platforms in living cells.</a> Traffic. 9 (10), 1757-1775 (2008).</li>
<li>Jimenez, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ESCRT+machinery+is+required+for+plasma+membrane+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">ESCRT machinery is required for plasma membrane repair.</a> Science. 343 (6174), 1247136(2014).</li>
<li>Demonbreun, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+actin-dependent+annexin+complex+mediates+plasma+membrane+repair+in+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">An actin-dependent annexin complex mediates plasma membrane repair in muscle.</a> Journal of Cell Biology. 213 (6), 705-718 (2016).</li>
<li>Wolfmeier, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca%282%29%28%2B%29-dependent+repair+of+pneumolysin+pores%3A+A+new+paradigm+for+host+cellular+defense+against+bacterial+pore-forming+toxins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Ca(2)(+)-dependent repair of pneumolysin pores: A new paradigm for host cellular defense against bacterial pore-forming toxins.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1853 (2), 2045-2054 (2015).</li>
<li>Bravo, F., Sanchez, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+and+re-emerging+cutaneous+infectious+diseases+in+Latin+America+and+other+geographic+areas%5BTitle%5D)+AND+%22Dermatologic+Clinics%22%5BJournal%5D)">New and re-emerging cutaneous infectious diseases in Latin America and other geographic areas.</a> Dermatologic Clinics. 21 (4), 655-668 (2003).</li>
<li>Manfredi, M., Iuliano, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutaneous+leishmaniasis+with+long+duration+and+bleeding+ulcer%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Open+Access%22%5BJournal%5D)">Cutaneous leishmaniasis with long duration and bleeding ulcer.</a> Clinical Microbiology Open Access. 05, 2-6 (2016).</li>
<li>Zhang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingolipids+are+essential+for+differentiation+but+not+growth+in+Leishmania%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Sphingolipids are essential for differentiation but not growth in Leishmania.</a> EMBO Journal. 22 (22), 6016-6026 (2003).</li>
<li>Zhang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balancing+de+novo+synthesis+and+salvage+of+lipids+by+Leishmania+amastigotes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinions+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Balancing de novo synthesis and salvage of lipids by Leishmania amastigotes.</a> Current Opinions in Microbiology. 63, 98-103 (2021).</li>
<li>Kaur, P., Goyal, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenic+role+of+mitogen+activated+protein+kinases+in+protozoan+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Pathogenic role of mitogen activated protein kinases in protozoan parasites.</a> Biochimie. 193, 78-89 (2022).</li>
<li>Wiese, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leishmania+MAP+kinases--Familiar+proteins+in+an+unusual+context%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Leishmania MAP kinases--Familiar proteins in an unusual context.</a> International Journal of Parasitology. 37 (10), 1053-1062 (2007).</li>
<li>Brumlik, M. J., Pandeswara, S., Ludwig, S. M., Murthy, K., Curiel, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parasite+mitogen-activated+protein+kinases+as+drug+discovery+targets+to+treat+human+protozoan+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Signal+Transduction%22%5BJournal%5D)">Parasite mitogen-activated protein kinases as drug discovery targets to treat human protozoan pathogens.</a> Journal of Signal Transduction. 2011, 971968(2011).</li>
<li>Wiese, M., Kuhn, D., Grunfelder, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+involved+in+flagellar-length+control%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Protein kinase involved in flagellar-length control.</a> Eukaryotic Cell. 2 (4), 769-777 (2003).</li>
<li>Agron, P. G., Reed, S. L., Engel, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential%2C+putative+MEK+kinase+of+Leishmania+major%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biochemistry+of+Parasitology%22%5BJournal%5D)">An essential, putative MEK kinase of Leishmania major.</a> Molecular Biochemistry of Parasitology. 142 (1), 121-125 (2005).</li>
<li>Ray, S., Thapa, R., Keyel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+parameters+beyond+lipid+binding+affinity+drive+cytotoxicity+of+cholesterol-dependent+cytolysins%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins%22%5BJournal%5D)">Multiple parameters beyond lipid binding affinity drive cytotoxicity of cholesterol-dependent cytolysins.</a> Toxins. 11 (1), (2018).</li>
<li>Beneke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CRISPR+Cas9+high-throughput+genome+editing+toolkit+for+kinetoplastids%5BTitle%5D)+AND+%22Royal+Society+Open+Science%22%5BJournal%5D)">A CRISPR Cas9 high-throughput genome editing toolkit for kinetoplastids.</a> Royal Society Open Science. 4 (5), 170095(2017).</li>
<li>Kapler, G. M., Coburn, C. M., Beverley, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+transfection+of+the+human+parasite+Leishmania+major+delineates+a+30-kilobase+region+sufficient+for+extrachromosomal+replication+and+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Stable transfection of the human parasite Leishmania major delineates a 30-kilobase region sufficient for extrachromosomal replication and expression.</a> Molecular and Cellular Biology. 10 (3), 1084-1094 (1990).</li>
<li>Moitra, S., Pawlowic, M. C., Hsu, F. F., Zhang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylcholine+synthesis+through+cholinephosphate+cytidylyltransferase+is+dispensable+in+Leishmania+major%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylcholine synthesis through cholinephosphate cytidylyltransferase is dispensable in Leishmania major.</a> Scientific Reports. 9, 7602(2019).</li>
<li>Keyel, P. A., Heid, M. E., Watkins, S. C., Salter, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+bacterial+toxin+induced+responses+using+live+cell+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Visualization of bacterial toxin induced responses using live cell fluorescence microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (68), 4227(2012).</li>
<li>Romero, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+repair+protects+cells+from+pore-forming+toxins+by+microvesicle+shedding%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Intrinsic repair protects cells from pore-forming toxins by microvesicle shedding.</a> Cell Death & Differentiation. 24 (5), 798-808 (2017).</li>
<li>Keyel, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptolysin+O+clearance+through+sequestration+into+blebs+that+bud+passively+from+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Streptolysin O clearance through sequestration into blebs that bud passively from the plasma membrane.</a> Journal of Cell Science. 124, 2414-2423 (2011).</li>
<li>Dong, Z., Patel, Y., Saikumar, P., Weinberg, J. M., Venkatachalam, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+porous+defects+in+plasma+membranes+of+adenosine+triphosphate-depleted+Madin-Darby+canine+kidney+cells+and+its+inhibition+by+glycine%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigations%22%5BJournal%5D)">Development of porous defects in plasma membranes of adenosine triphosphate-depleted Madin-Darby canine kidney cells and its inhibition by glycine.</a> Laboratory Investigations. 78 (6), 657-668 (1998).</li>
<li>Loomis, W. P., den Hartigh, A. B., Cookson, B. T., Fink, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+small+molecules+prevent+macrophage+lysis+during+pyroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Diverse small molecules prevent macrophage lysis during pyroptosis.</a> Cell Death & Disease. 10 (4), 326(2019).</li>
</ol>

이 연구는 국립 보건원의 국립 알레르기 및 전염병 연구소가 PAK 및 KZ (co-I)에 R21AI156225를, KZ (co-I)에 R01AI139198을 부여했습니다. CH는이 연구 기간 동안 제공된 조교에 대해 생물 과학과를 인정하고자합니다.
자금 지원 기관은 연구 설계에 아무런 역할도 하지 않았습니다. 데이터의 수집, 분석 또는 해석; 원고 작성시; 결과를 발표하기로 한 결정도 아닙니다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 자금 지원 기관의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다. 저자는 경쟁적인 이해 상충이 없다고 선언합니다.

본 연구에서는 인간 병원균 리슈만편모충 전공 을 모델 시스템으로 사용하여 PFT의 분자 메커니즘과 기능을 연구하는 방법을 설명했습니다. 단일 세포 생존율을 측정하기 위한 배지-처리량 유세포분석-기반 세포독성 분석법이 개발되었다. LC50 값은 로지스틱 모델링을 사용하여 용량-반응 곡선에서 계산할 수 있기 때문에 모집단 수준에서 생존력이 정량적입니다. 원리 증명으로 유세포 분석 분석을 사용하여 배지의 선택이 SLO에 대한 야생형 및 스핑고지질 결핍 L.major 민감도를 변경할 수 있음을 설명하고 각 배지에서 과용해 독소 용량을 결정했습니다. 다운스트림 분석의 원리 증명으로, 포스포-MAPK 및 포스포-ERK 항체는 독소 챌린지 동안 L. 주요 프로마스티고테에서 테스트되었습니다. 전반적으로, L. 주요 프로마스티고테스는 세포에 대한 독소 매개 손상의 메커니즘과 기능을 더 잘 이해하는 데 사용할 수 있는 병원적으로 관련이 있고 유전적으로 다루기 쉬운...

기공 형성 독소(PFT)는 박테리아 독소의 가장 큰 계열이지만1, 세포를 천공하고 파괴하는 메커니즘은 잘 알려져 있지 않습니다. 가장 잘 연구된 모공 형성 독소 계열은 콜레스테롤 의존성 세포질(CDC)입니다. CDC는 주로 괴사 성 근막염의 원인균 인 Streptococcus pyogenes2를 포함한 그람 양성 박테리아에 의해 합성됩니다. S. pyogenes 는 숙주 세포의 원형질막에 있는 스테롤에 단량체로 결합하여 올리고머화하고 ~20-30nm 기공을 막1에 삽입하는 CDC 스트렙톨리신 O(SLO)를 분비합니다. 이 과정에서 지질이하는 역할은 아직 결정되지 않았습니다.
지질-CDC 상호작용을 연구하는 한 가지 접근법은 화학적으로 정의된 리포좀을 사용하는 것입니다. 정의된 리포좀은 독소 결합 및 기공 형성3,4을 유지하는 데 필요한 지질의 역치에 대한 정보를 제공하지만 세포 기능을 완전히 요약하지는 않습니다. 예를 들어, 재구성된 리포좀은 포유류 숙주의 지질 비대칭성과 독소에 대한 반응의 지질 변형이 부족합니다5. 리포좀에 대한 한 가지 대안은 포유류 세포주를 사용하는 것입니다. 이러한 세포주는 생리학적으로 더 관련이 있지만 독소 감지 및내성 메커니즘에는 상당한 수준의 중복성이 있습니다2. 결과적으로 CDC에 저항하는 데 사용되는 복구 경로는 제대로 결정되지 않은 상태로 남아 있습니다. 특히,Ca 2+ 유입은 막 복구1의 주요 활성화 제입니다. Ca 2+ 유입의 하류에는 세라마이드 의존적 복구 6,7 및 MEK 의존적 복구 경로6를 포함한 여러 경로가 참여합니다. 이러한 경로는 수송에 필요한 엔도솜 분류 복합체(ESCRT)8 및 부속신 6,9,10을 포함한 다른 단백질 이펙터와 상호 작용합니다. 포유류 세포에서 이러한 경로를 해부하는 것은 데이터 해석을 혼란스럽게 하는 중복성으로 인해 어렵습니다.
복구 경로를 해부하기 위해 복잡성과 단순성의 균형을 맞추는 한 가지 방법은 Leishmania 속의 원생 동물 병원체와 같은 더 간단한 유기체를 사용하는 것입니다. 리슈만편모충 sp. 인간과 다른 동물에서 리슈만편모충증을 유발합니다. 리슈만편모충증은 종 및 기타 요인에 따라 피부 리슈만편모충증(자가 제한된 피부 병변)에서 치명적인 내장 리슈만편모충증(간비장비대)에 이르기까지 다양합니다11. 피부 리슈만편모충증의 원인균인 리슈만편모충은 모래편모충 벡터를 통해 인간에게 전염되며 리슈만편모충 기능과 감염을 이해하는 데 사용됩니다12. 또한, 리슈만편모충 sp. 아르 디제닉12. 그들은 amastigotes라고 불리는 세포 내 포유류 대 식세포 기생충과 모래 파리12에서 자유롭게 수영하는 편모 모양의 프로 마스 티고트로 존재합니다. L. 주요 프로마스티고테는 M199와 같은 혈청 보충 배지에서 고밀도13으로 배양할 수 있습니다. 프로마스티고테는 또한 유전적으로 다루기 쉽습니다. 지질 생합성 경로를 표적으로 하는 것을 포함하여 많은 유전자 녹아웃이 존재합니다13. 이러한 녹아웃은 Balb/c 마우스13의 감염을 통해 감염성 및 병변 발달의 성장 및 차이에 대해 평가할 수 있습니다.
리슈만편모충 배양의 상대적 용이성과 지질 생합성 녹아웃의 범위 외에도 기생충은 포유류보다 더 단순한 게놈을 가지고 있습니다. 리슈만편모충의 가장 잘 특성화된 종은 L. major로, 지질 대사에 결함이 있는 돌연변이와 같은 기존의 많은 유전 도구를 가지고 있습니다14. 특히, 많은 복구 단백질이 없습니다. L. major는 아넥신과 같은 주요 포유류 복구 단백질에 대해 현재까지 확인된 동족체가 없습니다. 이것은 포유류 시스템의 복잡성없이 진화 적으로 보존 된 복구 경로의 특성화를 가능하게합니다. 그러나 수리 경로는 현재까지 리슈만편모충에서 특성화되지 않았습니다. 동시에 MEK 경로6과 같은 복구와 관련된 주요 신호 전달 경로는 리슈만편모충 sp.15,16에서 보존되지만 동족체를 검증해야 합니다. 미토 겐 활성화 단백질 키나아제 (MAPK) 경로는 L. mexicana에서 잘 연구되어 포유류 세포의 세포 내 생존 및 열 안정성에 기여하고 메타 사이클 생성을 제어합니다16. 리슈만편모충 sp.에서는 15개의 MAPK 중 10개가17개로 특성화되었습니다. LmMAPK9 및 LmMAPK13은 보존된 인산화 립 서열에서의 동일성에 기초하여 포유동물 ERK1/2와 가장 유사한 것으로 예측된다. 인산화 립 서열은 포유동물 ERK1/2 및 LmMAPK9 및 LmMAPK13 둘 다에 대해 TEY이다. 그러나, 리슈만편모충 MAPK 중 8개는 TDY 인산화 모티프15를 갖는다. 적어도 두 개의 MEK 동족체가 리슈만편모충 sp., LmxMKK18 및 MEKK-관련 키나아제(MRK1)19에서 확인되었다. 이것은 리슈만편모충에서 확인된 통찰력이 포유류 시스템으로 번역될 수 있음을 시사합니다. 포유류 시스템으로 번역되지 않는 경우 리슈만편모충증 치료를 위한 치료 표적을 나타냅니다.
L. major promastigotes를 사용하여 막 복구 및 독소와의 상호 작용을 연구하려면 중간 처리량 기술이 필요합니다. 고해상도 라이브 셀 이미징을 사용하면 표지된 단백질과 막을 실시간으로 시각화할 수 있지만 처리량이 적고 세포 생존을 측정하지 못할 수 있습니다. 중간 처리량 생존력 분석에는 유세포 분석으로 측정한 염료 흡수, 미토콘드리아 활성 측정 또는 젖산 탈수소효소(LDH)와 같은 세포 단백질의 방출이 포함됩니다. 포유류 세포에서, LDH 분석은 세포 사멸을 정량적으로 측정하지 않는다20. 또한, LDH 방출 또는 미토콘드리아 활성과 같은 인구 기반 분석은 강력한 단일 세포 또는 다중 파라미터 분석을 허용하지 않습니다20. 대조적으로, 유세포분석 기반 분석은 다중 파라미터 단일 세포 분석을 가능하게 합니다(20). 그러나 이러한 분석은 독소 생물학 또는 L. 주요 프로마스티고테의 독소에 대한 반응을 이해하는 데 적용되지 않았습니다.
이 연구에서 SLO는 L. major promastigotes와 더 간단한 Tyrode 완충액을 배양하는 데 일상적으로 사용되는 M199 배지의 두 가지 다른 완충액에서 L. major의 스핑고지질 널 돌연변이의 원형질막 섭동을 이해하는 도구로 사용됩니다. 중간 처리량 유세포 분석 분석이 설명되고 독소 용량-반응 곡선을 생성하는 데 사용됩니다. 유동 세포분석 분석으로부터의 데이터는LC50 값을 결정하기 위해 로지스틱 곡선으로 모델링된다. 이러한 정보를 이용하여, SLO의 전분해 용량을 결정하여 웨스턴 블롯팅을 사용하여 MAPK 항체를 검증할 수 있다.

<table><tbody><tr><td>1.2 mL 마이크로타이터 (마쉬) 튜브</td><td>Fisher</td><td>02-681-376</td><td>세포독성 분석</td></tr><tr><td>1.5 mL 마이크로원심분리기 튜브</td><td>Fisher</td><td>05-408-129</td><td>독소 희석</td></tr><tr><td>15 mL 원심분리기 튜브&nbsp;</td><td>Avantor VWR (Radnor, PA)</td><td>89039-666</td><td>세포와 매체를 보관하기 위해</td></tr><tr><td>1x 인산염 완충 식염수 (PBS)</td><td>Fisher</td><td>BP399</td><td>세포 처리용</td></tr><tr><td>3% H2O2&nbsp;</td><td>월마트&nbsp; (아칸소 주 페이엇빌)</td><td>N/A</td><td>ECL용</td></tr><tr><td>5x M199</td><td>Cell-gro</td><td>11150067</td><td>L. major promastigotes용 기저 성장 배지</td></tr><tr><td>Biosafety cabinet</td><td>Baker</td><td></td><td>멸균 조건에서 세포 배양</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA)</td><td>Fisher</td><td>BP1605-100</td><td>Fraction V 허용 순도</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher</td><td>BP510-100</td><td>재고 농도 100 mM</td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td>Heraeus Megafuge 40R</td><td>배양에서 세포를 펠릿화하려면</td></tr><tr><td>Cy5 Mono-reactive dye pack</td><td>Cytiva (Marlborough, MA)</td><td>PA25031</td><td>독소용 형광단 라벨</td></tr><tr><td>디지털 건식 수조</td><td>벤치마크</td><td>BSH1002</td><td>단백질 샘플을 변성시키기 위해</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Amresco</td><td>0732-100G</td><td>재고 농도 0.5 M</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft (Redmond, VA)</td><td></td><td>데이터 분석 </td></tr><tr><td>소프트웨어 유세포 분석기 (4-laser Attune NxT)</td><td></td><td>데이터 수집을 위한</td>Fisher <td></td> Cytometer</tr><tr><td>FlowJo</td><td>BD (Ashland, OR)</td><td></td><td>소프트웨어</td></tr><tr><td>포름알데히드</td><td>Fisher</td><td>BP531-500</td><td>세포 계수용 고정제</td></tr><tr><td>G418</td><td>Fisher</td><td>BP673-1</td><td>세포 선택제</td></tr><tr><td>Hellmanex III</td><td>Sigma</td><td>Z805939</td><td>희석 1:4 세포분석기 세척용</td></tr><tr><td>혈구계</td><td>Fisher</td><td>0267151B</td><td>세포 계수용</td></tr><tr><td>인간 적혈구</td><td>Zen-bio (Durham, NC)</td><td>SER-10MLRBC</td><td>독소 활성을 검증하기 위해</td></tr><tr><td>얼음 양동이</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>광학 현미경</td><td>Nikon</td><td>Eclipse 55i</td><td>세포를 시각화하기 위해</td></tr><tr><td>니트로셀룰로오스</td><td>Fisher</td><td>88018</td><td>프로빙용 항체를 통한 단백질</td></tr><tr><td>Pipettor 및 Tips</td><td>Avantor VWR</td><td></td><td>시약 분배</td></tr><tr><td>전원 공급 장치</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>SDS-PAGE 실행 및 전송</td></tr><tr><td>Propidium</td><td>iodide Biotium</td><td>40016</td><td>물 내 재고 농도 2 mg/mL</td></tr><tr><td>단백질 ladder</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0373</td><td>단백질의 분자량</td></tr><tr><td>측정 SDS-PAGE 실행 장치(Mini Protean III)</td><td>Bio-Rad</td><td>165-3302</td><td>크기에 따라 단백질을 분리하려면</td></tr> 밀봉 <tr><td>테이프</td><td>R& D</td><td>DY992</td><td>세포로 플레이트를 밀봉하기 위해</td></tr><tr><td>Streptolysin O C530A 플라스미드 삽입</td><td></td><td></td><td>pBAD-gIII 벡터로 복제 (참조: 7)</td></tr><tr><td>Streptolysin O C530A 독소</td><td>실험실 정제</td><td></td><td>특정 활성&nbsp; 4.34 x 105 HU/mg</td></tr><tr><td>스윙 버킷 로터</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td>75003607</td><td>세포 원심분리,</td></tr><tr><td>V-bottom plate</td><td>Greiner Bio-one</td><td>651206</td><td>세포독성 분석용</td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Benchmark</td><td>BV1000</td><td>세포 혼합용</td></tr><tr><td>웨스턴 블롯 이미징 시스템(Chemi-doc)</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>웨스턴 블롯으로 단백질 시각화</td></tr><tr><td>웨스턴 블롯 전달 장치(Mini Protean III)</td><td>Bio-Rad</td><td>170-3930</td><td>전송 단백질을 니트로셀룰로오스로</td></tr><tr><td>변환하는 Whatman 필터 종이</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>3030-700</td><td>단백질을 니트로셀룰로오스로 전달하는 데 사용됩니다</td></tr><tr><td><강한>항체</강한></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ERK 항체</td><td>세포 신호 기술&nbsp;</td><td>Cat# 9102S</td><td>Rabbit (1:1000 dilution)</td></tr><tr><td>Anti-lipophosphoglycan (LPG) 항체</td><td>CreativeBioLabs&nbsp;</td><td>Cat# WIC79.3</td><td>마우스 (1: 1000)</td></tr><tr><td>Anti-MEK 항체</td><td>세포 신호 기술&nbsp;</td><td>Cat# 9122L</td><td>Rabbit (1:1000)</td></tr><tr><td>안티-마우스 IgG, HRP 접합체</td><td>Jackson Immunoresearch&nbsp;</td><td>Cat#715-035-151</td><td>당나귀 (1:10000)</td></tr><tr><td>Anti-phosphoERK 항체</td><td>세포 신호 기술&nbsp;</td><td>Cat# 9101S</td><td>Rabbit (1:1000)</td></tr><tr><td>Anti-pMEK 항체</td><td>세포 신호 기술&nbsp;</td><td>Cat# 9121S</td><td>Rabbit (1:1000)</td></tr><tr><td>안티-토끼 IgG, HRP 접합체</td><td>Jackson Immunoresearch&nbsp;</td><td>Cat#711-035-152</td><td>당나귀 (1:10000)</td></tr><tr><td>안티-튜불린 항체</td><td>Sigma</td><td>Cat# T5168</td><td>마우스 (1: 2000)</td></tr><tr><td>Leishmania major Genotypes&nbsp; </td><td></td><td></td><td>Reference: 13</td></tr><tr><td>Episomal addback (spt2-/+SPT2)</td><td></td><td></td><td>&Delta; spt2::HYG/&델타; spt2:PAC/+pXG-SPT2</td></tr><tr><td>세린 팔미토일트랜스퍼라제 서브유닛 2 녹아웃(spt2-)</td><td></td><td></td><td>&델타; spt2::HYG/&델타; spt2::P AC&nbsp;</td></tr><tr><td>와일드 타입(WT)</td><td></td><td></td><td>LV39 클론 5(Rho/SU/59/P)</td></tr></tbody></table>

리슈만편모충 전공을 이용한 기공 형성 독소의 분자 메커니즘과 기능 해독

Deciphering the Molecular Mechanism and Function of Pore-Forming Toxins Using Leishmania major

세포가 PFT로 인한 막 손상에 저항하기 때문에 기공 형성 독소(PFT)의 기능과 메커니즘을 이해하는 것은 어렵습니다. 생물 물리학 적 접근법은 기공 형성을 이해하는 데 도움이되지만, 종종 막 지질과 단백질의 완전한 보완이 부족한 환원 주의적 접근법에 의존합니다. 배양 된 인간 세포는 대체 시스템을 제공하지만 복구 메커니즘의 복잡성과 중복으로 인해 특정 메커니즘을 식별하기가 어렵습니다. 대조적으로, 피부 리슈만편모충증을 담당하는 인간 원생동물 병원체인 리슈만편모충은 복잡성과 생리학적 관련성 사이의 최적의 균형을 제공합니다. L. major 는 유전적으로 다루기 쉽고 시험관 내에서 고밀도로 배양될 수 있으며 섭동이 감염에 미치는 영향은 확립된 쥐 모델에서 측정할 수 있습니다. 또한 L. major 는 포유류와 구별되는 지질을 합성하여 막 역학을 변경할 수 있습니다. 막 역학의 이러한 변화는 가장 잘 특성화된 독소 계열인 콜레스테롤 의존성 세포용해제(CDC)의 PFT로 프로젝션할 수 있습니다. CDC는 리슈만편모충 막의 에르고스테롤에 결합하여 L. major 프로마스티고테를 죽일 수 있으며, 이는 L. major 가 PFT 기능의 세포 및 분자 메커니즘을 결정하는 데 적합한 모델 시스템임을 나타냅니다 . 이 연구는 기생충 배양, 지질 감수성 평가를위한 유전 도구, 막 결합 분석 및 세포 사멸 분석을 포함하여 L. 주요 프로마스티고트에서 PFT 기능을 테스트하는 방법을 설명합니다. 이러한 분석은 진화적으로 다양한 유기체와 지질 조직의 공통점에 걸쳐 PFT 기능을 이해하기 위한 강력한 모델 시스템으로 L. major 를 신속하게 사용할 수 있도록 합니다.

M199에 비해 Tyrode의 버퍼에서 SLO에 대한 프로마스티고트 민감도 증가 L. 주요 프로마스티고테의 SLO 민감도를 상이한 분석 완충액 간에 비교하였다. 야생형, spt2- 및 spt2-/+SPT2 프로마스티고테는 유세포분석기에서 분석하기 전에 30분 동안 2mMCaCl2가 보충된 무혈청 M199 또는 Tyrode의 완충액에서 SLO로 도전되었습니다. 분석에 적합한 기생충은 전방/측면 산란 프로파일에 의해 확인된 단일 세포였다(도 3A,B). 데이터는 채널 BL1 (488 여기, 530/30 방출 필터)을 자동 형광 대조군으로 사용하고 PI에 대해 YL1 (561nm 여기, 585/16 방출 필터)을 사용하여 수집하였다. BL1은 잠재적인 자가형광 또는 보상 문제를 식별하는 데 사용되었습니다(<st...

여기에 제시된 것은 리슈만편모충 주요 프로마스티고테를 사용하여 기공 형성 독소에 의해 유도된 결합, 세포독성 및 신호전달을 결정하는 프로토콜입니다. 스트렙톨리신 O를 사용한 개념 증명이 제공됩니다. 다른 독소는 또한 독소 내성의 새로운 메커니즘을 정의하기 위해 L. major에서 사용할 수 있는 유전적 돌연변이를 활용하는 데 사용될 수 있습니다.

Understanding the function and mechanism of pore-forming toxins (PFTs) is challenging because cells resist the membrane damage caused by PFTs. While ...

기공 형성 독소에 대한 내성 메커니즘은 잘 알려져 있지 않습니다. 우리의 프로토콜은 유전적으로 다루기 쉽고 생리학적으로 관련된 시스템인 Leishmania major를 사용하여 독소를 기공에 형성하는 기능과 메커니즘을 가능하게 합니다. 세포독성 분석의 주요 장점은 실시간으로 독소에 도전할 때 중간 처리량 분석에서 단일 세포 수준에서 여러 표현형의 세포 생존율을 비교하는 것입니다.암포테리신 B와 같은 막 교란 작용제는 리슈만편모충의 최전선 치료법입니다. 이 분석은 암포테리신 B 및/또는 새로운 막 손상 제제를 강화시키는 작용제의 식별을 가능하게 합니다. 이 분석은 수리 반응과 관련된 수리 반응 및 신호 경로와 같은 영역에 대한 통찰력을 제공합니다.이 분석은 Trypanosoma 및 Naegleria fowleri와 같은 원생 동물에 적용될 수 있습니다. 사람들은 독소 연속 희석 시리즈를 이해하기 어렵다고 생각합니다. 그래서 제가 드릴 수있는 최선의 조언은 실험을 설정하기 전에 직렬 희석 시리즈의 개략도를 그리는 것입니다.시작하려면 0.5 밀리리터의 가공 된 프로 마스티고트를 별도의 튜브에 염색되지 않은 대조군으로 예약하십시오. 밀리리터당 2밀리그램의 프로피듐 요오드화물 또는 PI를 나머지 프로마스티고테에 밀리리터당 10마이크로그램의 최종 농도로 추가합니다. 3 초 동안 소용돌이.V- 바닥, 96 웰 플레이트 또는 습지 튜브의 각 웰에 가공 된 프로 마스티 고트를 추가하고 플레이트 또는 튜브 랙을 얼음 위에 약 45도 각도로 놓습니다. 프로피듐 요오드화물이 포함된 100마이크로리터의 분석 완충액을 각 무독소 대조군에 추가합니다. 색상이 더 어둡게 표시되는 총 부피가 200마이크로리터인 튜브를 시각적으로 식별하여 컨트롤이 올바르게 추가되었는지 확인합니다.독소의 양을 가장 높은 희석액에 첨가하십시오. 그런 다음 독소를 연속적으로 희석하십시오. 혼합을 보장하기 위해 적어도 8 번 위아래로 피펫.가장 낮은 독소 농도에서 시작하여 100 마이크로 리터의 독소를 올바른 행에 빠르게 추가하고 모든 독소가 세포에 추가 될 때까지 계속하십시오. 밀봉 테이프로 플레이트를 밀봉하십시오. 섭씨 37도에서 30분 동안 배양한 후, 플레이트를 포장하고 유세포분석기로 운반한다.데이터 수집의 경우, 제조업체의 지침과 시설 정책에 따라 유세포분석기 및 수집 소프트웨어를 설정하는 것부터 시작하십시오. 염색되지 않은 L.major 프로마스티고트 샘플을 사용하여 전방 및 측면 산란에 대한 게이트와 선택한 염료를 기반으로 초기 형광 매개변수를 설정합니다. 단일 염색 대조군을 사용하여 생존 염료 및 형광 표지 독소에 대한 게이트를 설정합니다.마이크로클로그에 대한 순방향 산란 대 시간을 모니터링하고 세포분석기의 각 샘플에 대해 10, 000개 이상의 게이트 이벤트를 수집합니다. 데이터 분석을 위해, 전방 및 측면 산란에 게이팅하여 총 단일 세포 L.major 프로마스티고테를 게이트하고 필요에 따라 시간을 보냅니다. 유세포분석기에 권장되는 높이 또는 면적을 사용하십시오.죽은 세포를 PI 높음으로 식별하고 게이트합니다. 분석을 위해 Excel에서 용량-반응 곡선을 구성합니다. 두 기술 반복실험 사이의 각 조건에 대한 평균 PI 높음 백분율을 결정합니다.독소 농도 및 평균 백분율 특이적 용해와 실험 세부 정보 및/또는 원시 백분율 PI 높은 계산을 포함합니다. 4개 이상의 열에 모델링됨, 잔차, 매개변수 및 매개변수 값으로 레이블을 지정합니다. 첫 번째 열이 실험 매개 변수, 독소 농도 및 백분율 특이적 용해와 일치하는지 확인합니다.매개 변수 값 열에 값을 입력하여 매개 변수 L, k 및 c를 초기화합니다. 모델링됨 열에서 로지스틱 모델을 생성합니다. 잔차 열에서 모델링된 수와 실제 특정 용해 사이의 차이의 제곱을 계산합니다.파라미터 값 열의 SUM 옆에서 잔차 열의 모든 값을 합산합니다. 매개 변수 값 열에서 LC50 옆에 방정식을 초기화하여 결정된 값에서 LC50을 계산합니다. 데이터 탭에서 해 찾기를 엽니다.계산된 잔차의 합을 포함하는 셀이 되도록 설정된 목표를 선택합니다. 최소로 설정합니다. L, k 및 c의 매개 변수 값에 대한 변수 셀을 변경합니다.음수 k 값의 경우 k에서 음수를 빼내어 k를 양수로 변경하여 방정식을 수정합니다. GRG 비선형 해결 방법을 사용하고 해결을 클릭합니다. 곡선을 확인하고 LC50이 자동으로 계산되는지 확인합니다.백분율 특이적 용해와 독소 농도에 대한 모델링을 그래픽으로 플로팅하여 적합성을 확인합니다. 스핑고지질이 결핍된 SPT2 녹아웃 프로마스티고테는 무혈청 M199와 Tyrode의 완충액 모두에서 SLO에 민감했습니다. 야생형 및 SPT2 추가 프로마스티고테는 무혈청 M199에서 SLO에 내성이 있었지만 Tyrode의 완충액에서는 20% 미만의 특이적 용해를 보였습니다.SPT2 녹아웃 프로마스티고테는 M199보다 Tyrode의 완충액에서 SLO에 약 8배 더 민감했습니다. 이러한 데이터는 독소 민감도가 사용된 완충액에 따라 달라질 수 있음을 보여줍니다. L.major 프로마스티고테스에서 포스포-MEK에 대해 120킬로달톤 밴드가 관찰되었습니다.전체 MEK의 경우 약 120킬로달톤 및 55킬로달톤의 대역이 관찰되었으며 이는 각각 MRK1 및 LmxMKK의 크기와 일치합니다. Phospho-ERK는 유사한 밴드를 검출한 반면, ERK 항체 염색은 이 분석에서 견고하지 않았습니다. 이 절차를 시도 할 때 기억해야 할 가장 중요한 것은 독소의 적절한 취급을 보장하는 것입니다.리슈만편모충은 원형질막 복구를 연구하기 위한 유전적으로 다루기 쉬운 모델로 활용될 수 있으며, 모래파리 중추에서 리슈만편모충 박테리아가 상호 작용하는 동안 막 복구 역학에 대한 새로운 통찰력을 제공합니다.

deciphering-molecular-mechanism-function-pore-forming-toxins-using

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

라이브 호스트에 트렌스 제닉 Leishmania의 기생충의 생체내 이미징에서

감염 THP1 셀과 기생충 - 구조 및 변화...

세포에 붙어 Antileishmanial 검사에 대한 기생충 구조 및 변화 분석<em&gt; Leishmania donovani</emTHP1 인간 급성 백혈병 Monocytic 셀 라인에서&gt; Amastigotes

동일한 순서로 양이온 기능이 혼합된 펩토이드를 합성하는 프로토콜이 제시됩니다(라이신 및 아르기닌 유형 단량체). 피부 리슈마니아증을 일으키는 원생동물 기생충인 Leishmania mexicana에 대한 이러한 화합물의 후속 테스트도 설명됩니다.

이들 안티 leishmanial 역가의 혼합 리신 형 / 아르기닌 형 단량체 및 평가를 펩 토이 드의 합성을위한 효과적인 방법

모든 병원 성 Leishmania 종 있으며 그들의 척추 호스트의 세포 내부 복제. 여기, 선물이 Leishmania, 세포내 성장 속도의 정확한 정량화 다음으로 문화 murine 골 수 유래 세포를 감염 하는 프로토콜. 이 메서드는 호스트 병원 체 상호 작용 및 Leishmania 독성에 영향을 미치는 개별 요소를 공부 하는 데 유용.

대 식 세포 안의 세포내 성장의 정량화는 빠르고 Leishmania 기생충의 독성을 평가 하기 위한 신뢰할 수 있는 방법

여기 선물이 조립과 해체 biolayer 간섭계 (씨)를 사용 하 여 탄 저 균 독 소의 모니터링 하는 프로토콜. 조립/분해 바이오 센서 표면에, 다음 큰 단백질 복합물 시각화 및 각각 전자 현미경 검사 법 및 질량 분석를 사용 하 여 단지의 구성 요소 식별에 대 한 표면에서 해제 됩니다.

동적 단백질 복합물 분석에 조립 하 고 질량 분석 및 전자 현미경을 사용 하 여 Biolayer 간섭계 바이오 센서에서 발표

여기에서, 우리는 Leishmania amazonensis를가진 마우스의 절단 감염을 평가하기 위하여 컴파일된 프로토콜을 제출합니다. 이것은 기생충 바이러스를 공부하기 위한 믿을 수 있는 방법, 감염에 척추동물 호스트 반응의 체계적인 보기를 허용하.

리슈마니아 아마존과 생체 감염에서 마우스에서 기생충 독성을 평가하기 위해

Leishmania 감염에서 식균작용과 관련된 메커니즘은 잘 이해되지 않고 있습니다. 여기에서, 우리는 숙주 세포와의 리슈마니아 상호작용 동안 발생하는 초기 사건을 평가하는 방법을 설명한다.

공초점 현미경을 사용하여 리슈마니아 의 식균작용 조사

여기에서는 pLEXSY 시스템을 사용하여 안정적인 통합 이식 유전자로서 eGFP에 대한 유전자를 발현하는 L . panamensis 및 L . donovani 균주를 생성하는 데 사용되는 방법론을 설명합니다. 형질주입된 기생충은 희석을 제한하여 클로닝하고, 두 종 모두에서 가장 높은 형광 강도를 갖는 클론을 약물 스크리닝 분석에 추가로 사용하기 위해 선택했습니다.

eGFP의 구성적 발현을 통한 리슈만편모충 종 균주의 개발

여기에서는 테트라사이클린 제어 기반 유도 합성 회로를 설계, 구축 및 전달하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 기생충 제거 및 사이토카인 발현에 대한 합성 회로의 영향은 제시된 파이프라인을 채널화하여 연구할 수 있습니다. 이 프로토콜은 전염병의 합성 회로 기반 치료법을 연구하는 연구자와 관련이 있습니다.

Immunometabolic Circuits in Infection for Advancing Host Directed Therapies(숙주 지향 치료법 발전을 위한 감염의 면역대사회로)

여기에서는 생물 발광 이미징 및 PCR에 의해 L. infantum-Luc에 복강내(IP) 또는 치은내(IG)를 통해 감염된 골든 햄스터에 대한 종단 평가를 제시합니다. 햄스터는 감염 후 1일(1dpi), 감염 1주일(8dpi), 감염 후 3주(22dpi)에 평가를 받고 50번째 dpi와 감염 후 8개월에 안락사시켰다.

생체 내 루시페라아제를 발현하는 Axenic Amastigotes의 치은 접종에 의한 Leishmania infantum-infected Hamsters의 이미징

배우세요 리슈만편모충을 이용한 기공 형성 독소의 기능과 메커니즘을 실시간 세포독성 분석으로 연구하는 방법입니다. 이 기법은 독소 저항성 메커니즘과 막 복구 반응을 이해하는 데 활용됩니다.

리슈만편모충 전공을 이용한 기공 형성 독소의 분자 메커니즘과 기능 해독

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