마우스 골세포에서 부하 유도 칼슘 신호 역학을 연구하기 위한 형광 생체 내 이미징 접근 방식
2023년 2월 24일
현재 논문에서는 마우스 세 번째 중족골의 조직 수준 기계적 부하에 대한 반응으로 생체 내에서 내장된 골세포의 기계적으로 유도된 칼슘 신호를 실시간으로 관찰하기 위해 생체 내 이미징 접근 방식을 수행하는 방법을 설명합니다.
이 프로토콜은 뼈 기계생물학 연구에서 중요한 발전을 나타내는 생체 내에서 내장된 골세포를 관찰하는 방법을 제공합니다. 이 기술의 주요 장점은 생체 내 골세포의 세포 및 분자 수준 사건을 관찰하고, 고유의 3D 공간 배열, 혈류 및 내분비 상태를 유지하고, 일반적으로 시험관 내 세포 실험에 의해 부과되는 한계를 극복할 수 있다는 것입니다. 이 기술은 마우스 모델의 기초 과학 조사를 위해 설계되었습니다. 아직 치료나 진단으로 확장되지는 않지만 차세대 뼈 치료를 정의하는 통찰력을 얻을 수 있는 기회를 제공합니다.
[해설자] 시작하려면 원위 끝에서 시작하여 뼈의 길이를 따라 근위부로 진행하면서 두 번째와 세 번째 중족골 사이의 진피를 통해 메스로 절개합니다. 겸자를 사용하여 피부를 내측 또는 외측 가장자리 쪽으로 당겨 수술 부위를 엽니다. 직선 Vannas 가위를 사용하여 신근 힘줄을 절제하여 세 번째 중족골을 노출시킵니다. 중족골 로딩 장치의 중앙 받침점 핀을 세 번째 중족골이 근위 지골과 만나는 원위 끝의 작은 공간에 삽입합니다. 그런 다음 핀이 세 번째 중족골의 중간 샤프트에 놓일 때까지 핀을 근위부로 움직입니다. 근육과 근막을 제외하고 뼈와 핀 사이의 직접적인 인터페이스를 보장하기 위해 특별한 주의를 기울이십시오. 집게로 발목을 잡고 DPBS로 채워진 수조에 발을 넣습니다. 로딩 브래킷으로 발을 제자리에 고정하고 브래킷을 액추에이터 로드셀 배열에 연결합니다. 마우스로 로딩 장치 설정을 조심스럽게 집어 현미경 플랫폼에 놓습니다. 낙광형광 모드에서 저배율 대물렌즈로 시작하여 뼈의 중간 골단을 찾아 중앙에 배치합니다. 관심 영역을 찾은 후 더 높은 침수 대물렌즈 배율로 전환하고 광학을 2개의 광자로 전환합니다. Galvo/Resonance 영역 제어 설정을 사용하여 픽셀 밀도를 설정합니다. 사진 표백을 방지하려면 전원 제어 옵션을 사용하여 전력을 줄이고 Galvo/Resonance 스캐너 제어 설정에서 PMT 증폭을 높이십시오. 525나노미터를 중심으로 대역 통과 필터를 사용하는 녹색 채널에서 섬유성 골막 자가형광을 찾아 2광자 모드에서 뼈 표면을 식별합니다. 로드하는 동안 뼈의 눈에 띄는 움직임이 있는 경우 Y 또는 Z 방향을 따라 다른 관심 영역을 선택하여 중앙 받침점 핀 바로 위에 있는지 확인합니다. 움직임이 지속되면 세 번째 중족골 아래에 있는 핀의 수술 위치를 수동으로 조정하십시오. 형태학적 신호 이벤트를 기록하기 위해 실험 설계에 따라 로딩으로 Z 스택 이미징을 수행한 다음 동적 부하 유도 신호 이벤트를 기록하기 위해 로딩으로 T 시리즈 이미징을 수행합니다. 생체 내에서 GCaMp6f를 발현하는 중족골 골세포의 단일 평면 2광자 이미지가 여기에 나와 있습니다. 칼슘 리포터 구조체의 내인성 발현은 배양할 필요 없이 형광 표적을 제공합니다. 두 개의 광자 현미경으로 캡처된 생체 내 골세포의 3D Z 투영이 이 그림에 나와 있습니다. XY 평면의 가로 절단과 시상 절단은 Z 스택의 깊이를 보여줍니다. 대표 이미지는 내장된 골세포에서 GCaMp6f 형광 신호의 시간 경과의 예를 보여줍니다. 휴식 시 낮은 수준의 시끄러운 변동이 나타납니다. 부하가 가해지면 칼슘 변동의 크기와 규칙성이 증가하며 종종 적용된 부하에 따라 발생합니다.
이 방법은 연구자들이 이전에는 시험관 내 또는 생체 외에서만 가능했던 생체 내 골세포 기계생물학에 관한 기능 기반 질문에 답할 수 있는 길을 열어줍니다.
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개요
본 논문은 생체 내 기계적 부하에 반응하는 골세포의 칼슘 신호 전달을 관찰하기 위한 생체 내 영상 촬영 프로토콜을 제시합니다. 이러한 기술적 진보를 통해 뼈의 천연 환경을 유지하면서 세포 내 사건들을 실시간으로 관찰할 수 있습니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 골 기계생물학
- 생체 내 이미징 기술
- 골세포의 칼슘 신호 전달
배경
- 골세포는 뼈의 기계생물학에서 중요한 역할을 합니다.
- 전통적인 인 비트로(in vitro) 방법으로는 천연 환경에서의 세포 반응을 이해하는 데 한계가 있습니다.
- 이 기술을 통해 골세포의 3D 공간 배열과 생리학적 조건을 유지하면서 관찰할 수 있습니다.
- 이를 통해 얻은 통찰력은 향후 뼈 치료 전략에 정보를 제공할 수 있습니다.
연구 목적
- 기계적 부하 가해지는 동안 생체 내에서 골세포를 관찰하기 위한 방법을 개발한다.
- 골세포 내 칼슘 신호 전달 역학에 대한 이해를 높인다.
- 뼈 건강 및 질환에 관한 향후 연구의 토대를 제공한다.
사용된 방법
- 마우스의 제3 중족골에 접근하기 위한 메스 절개.
- 기계적 응력을 가하기 위한 중족골 부하 장치의 사용.
- 골세포의 실시간 이미징을 위한 이광자 현미경 관찰.
- Z-stack 및 T-series 이미징을 통해 포착된 동적 부하 유도 신호 전달 사건.
주요 결과
- 실시간 이미징을 통해 하중 가해지는 동안 골세포 내의 칼슘 변동을 확인하였다.
- 기계적 스트레스가 증가함에 따라 형광 신호의 강도가 증가하였다.
- 3D 이미징을 통해 골세포의 공간적 배열에 대한 통찰을 얻었다.
- 골 기계생물학 연구에 있어 해당 기술의 유효성을 입증하였다.
결론
- 이 프로토콜은 골 기계생물학 연구의 상당한 진전을 가능하게 합니다.
- 골세포의 실시간 이미징은 골 건강에 대한 더 나은 이해로 이어질 수 있습니다.
- 이 기술은 향후 골 치료를 위한 치료 전략의 기틀을 마련할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
기계적 부하 하에서 골세포의 칼슘 신호 전달을 직접 생체 내(in vivo)로 이미징하는 것은 분자 수준에서 뼈의 기계적 자극 수용(mechanotransduction)을 이해하는 데 있어 중요한 공백을 메워줍니다. 이러한 기능은 고유한 생리학적 환경에서 기계적 감각 경로를 실시간으로 관찰할 수 있게 함으로써 초기 발견 단계의 예측 신뢰도를 높여줍니다. 이 접근 방식은 기전적 위험 제거(mechanistic de-risking)를 지원하며, 뼈 건강 및 골격 질환 포트폴리오의 타겟 검증에 필요한 정보를 제공합니다.
바이오 제약 R&D에서의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 생리학적으로 관련 있는 환경에서 골세포의 기계적 감각 경로 조사를 가능하게 합니다.
- 고유의 3D 구조와 시스템적 영향력을 유지함으로써 생물학적 리스크 감소를 지원합니다.
- 골 기계적 신호전달 메커니즘에 대한 기능적 타겟 검증을 용이하게 합니다.
- 골 관련 타겟의 우선순위 결정을 위한 예측 신뢰도를 향상시킵니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 정해진 기계적 부하에 반응하는 칼슘 신호 전달 역학을 정량화하기 위해 검증된 in vivo 시스템을 제공합니다.
- 후속 분석 개발을 위해 골세포 활성의 재현 가능하고 정량적인 판독을 가능하게 합니다.
- 화합물 평가를 위한 기계적 자극 수용 분석의 표준화를 지원합니다.
- 골 기계적 민감도에 영향을 미치는 조절제의 확장 가능한 스크리닝을 위한 기반을 마련합니다.
중개 및 전임상 연구
- 중개 연구의 연속성을 위해 기전적 통찰력을 질병 관련 골 모델과 일치시킵니다.
- in vivo 기전 데이터를 기반으로 골 표적 중재법의 위험 조정된 추진을 가능하게 합니다.
- 골세포 신호 전달 역학과 관련된 중개 바이오마커의 식별을 지원합니다.
- 발견 단계의 연구 결과를 온전한 시스템 내의 전임상 검증으로 연결합니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
이 생체 내 이미징 방법은 초기 발견과 전임상 연구의 접점에 통합되어, 살아있는 뼈 조직에서 직접적인 가설 검증과 경로 규명을 가능하게 합니다.
- 발견 생물학: 생체 내 기계적 자극에 대한 골세포 반응의 기전적 가설 검증을 지원합니다.
- 스크리닝: 분석 준비를 위한 정량적이고 재현 가능한 칼슘 신호 측정값을 제공합니다.
- 분석: 서로 다른 부하 조건에서의 신호 전달을 비교하기 위한 동적 형광 판독값을 제공합니다.
- 중개 연구: 질환 관련 모델에서 분자 신호 전달 사건을 전골 기능적 결과와 연결합니다.
- 기업적 재사용: 다양한 골 연구 프로그램 전반에서 기계생물학 연구를 위해 재사용 가능한 플랫폼을 구축합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 뼈의 기계적 신호 전달 연구에서 예측 신뢰도를 높이고 메커니즘적 모호성을 줄입니다.
- 운영적 가치: 재현성과 확장성을 위해 생체 내(in vivo) 영상 워크플로우를 표준화합니다.
- 전략적 가치: 추진 여부(go/no-go) 결정에 정보를 제공하고 뼈 표적 R&D의 자본 효율성을 높입니다.
- 포트폴리오 영향: 뼈 건강 및 골격계 질환 자산의 위험 조정 우선순위 지정을 가능하게 합니다.
구현 시 고려 사항
- 생체 내 이미지 분석(intravital imaging) 및 소동물 수술 기법에 대한 전문 지식이 필요합니다.
- 이광자 현미경(two-photon microscopy)과 정밀 기계적 부하 장비의 사용 가능 여부가 요구됩니다.
- 이미징 파라미터 및 데이터 분석을 위한 팀 간 표준화가 필요합니다.
- 다른 뼈 부위나 모델에 적용할 경우 프로토콜 최적화가 필요할 수 있습니다.
- 현재 데이터에 근거하여, 마우스 모델을 이용한 기초 과학 연구로 제한됩니다.
