Name: 공학적 심장 조직의 데이터 수집 및 모델 처리량을 개선하기 위한 바이오리액터 설계 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-02T12:50:00.000+00:00
Duration: 12 min 28 s
Description: 학습하세요 다중 조직 바이오리액터와 안정적인 포스트 트래커를 활용한 3D 심장 조직 제작 방법을. 줄기세포 유래 심근세포로 생체 모방성을 높이고 심장 질환 모델링 및 약물 선별 연구에 활용합니다.

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저자는 이 방법에 대한 이전 연구에 대해 Timothy Cashman 박사를 인정합니다. 이 연구는 미국 국립보건원(NIH)(R01-HL132226 및 K01 HL133424)과 Leducq Foundation International Networks of Excellence Program(CURE-PLaN)의 자금 지원을 받았습니다.

K.D.C.는 Novoheart의 공동 창립자이자 최고 과학 책임자이며 지주 회사인 Medera Biopharmaceutical의 지분을 보유하고 있습니다. Novoheart는 이 연구의 자금 지원, 계획 또는 실행에 기여하지 않았습니다. 그러나 이 연구 결과는 잠재적으로 노보하트와 메데라에 재정적 영향을 미칠 수 있다. 다른 저자들은 서로 상충되는 이해관계가 없다고 선언합니다.

문헌에 발표된 수많은 선형 공학 심장 조직 모델이 있으며, 그 중 일부는 표 1에 설명되어 있습니다. 일부 모델은 조직력의 직접 측정을 수반하지만, 이들은 전형적으로 작제물을 별도의 근육 욕조(38)로 이송할 것을 요구한다. 대부분의 모형은 PDMS 포스트 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16에 영구히 정박된 조직으로, 일반적으로 디자인됩니다 ...

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Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model the Throughput of Engineered Cardiac Tissues
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Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model Throughput of Engineered Cardiac Tissues

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64368">Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model the Throughput of Engineered Cardiac Tissues</a>. The title was corrected.

Erratum: Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model Throughput of Engineered Cardiac Tissues

엔지니어링된 심장 조직 모델은 기존의 2차원 세포 배양으로는 달성하기 어려운 천연 심장 틈새의 다양한 측면을 재현하기 위해 다양한 형상과 구성으로 제공됩니다. 가장 일반적인 구성 중 하나는 선형 조직 스트립으로, 각 끝에 유연한 앵커가 있어 조직 자가 조립을 유도하고 조직에 정의된 예압과 결과 경련력 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 ,22,23,24,25,26,27입니다. 생성된 힘은 조직 단축의 광학적 추적 및 탄성 빔 이론을 사용하여 앵커(1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11)의 측정된 편향 및 스프링 상수로부터 힘을 계산함으로써 견고하게 측정될 수 있습니다. 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22,25,26,28입니다.
그러나 심장 조직 공학은 여전히 진화하는 분야이며 몇 가지 과제가 남아 있습니다. 맞춤형 생물반응기 및 기능 평가 장치와 같은 특수 장비가 각 모델 시스템(10,29,30,31)에 필요합니다. 이러한 구성물의 미세환경의 크기와 복잡성은 노동 집약적인 프로토콜, 많은 수의 세포 및 조직 취약성으로 인한 낮은 처리량으로 인해 제한되는 경우가 많습니다. 이 문제를 해결하기 위해 일부 그룹은 약물 발견에 유용한 고처리량 분석을 용이하게 하기 위해 수백 또는 수천 개의 세포만 포함하는 미세 조직 제조로 전환했습니다. 그러나, 이러한 축소된 규모는 기능(12)의 정확한 평가를 복잡하게 하고, 본래 심장 틈새의 주요 측면(예: 영양소/산소 확산 구배 및 복잡한 구조(36))을 제거하며, 후속 분자 및 구조 분석에 사용할 수 있는 물질의 양을 제한한다(종종 조직의 풀링이 필요함). 표 1은 문헌 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15에 있는 선형 조직 스트립 모델의 일부 구성을 요약 한 것이다. 16,17,18,19,20, 21,22,23,24,25,26,37,38,39,40입니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2">그룹</td>
			<td>조직당 세포 수</td>
			<td>접시당 조직</td>
			<td colspan="2">플레이트 형식</td>
			<td colspan="2">앵커링 기능</td>
			<td colspan="2">기능적 데이터 수집 방법</td>
			<td>공유 미디어 목욕?</td>
			<td>기능적 측정- 멘트 in situ?</td>
		</tr><tr><td colspan="2">요시다 (ECT)38</td>
			<td>400만</td>
			<td>6</td>
			<td colspan="2">수정된 6웰 플레이트*</td>
			<td colspan="2">힘 변환기</td>
			<td colspan="2">직접 힘 측정</td>
			<td>아니요</td>
			<td>아니요</td>
		</tr><tr><td colspan="2">챈 (hESC-CM-ECT)26</td>
			<td>310의 케이</td>
			<td>6</td>
			<td colspan="2">맞춤형 6웰 접시</td>
			<td colspan="2">PDMS 게시물</td>
			<td colspan="2">직접 힘 측정</td>
			<td>예</td>
			<td>아니요</td>
		</tr><tr><td colspan="2">파인버그(dyn-EHT)16</td>
			<td>150만</td>
			<td>6</td>
			<td colspan="2">맞춤형 6웰 접시</td>
			<td colspan="2">PDMS 와이어</td>
			<td colspan="2">조직 형태</td>
			<td>아니요</td>
			<td>예</td>
		</tr><tr><td colspan="2">RADISIC(바이오와이어)39, 40</td>
			<td>110 케이</td>
			<td>8</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td colspan="2">폴리머 와이어</td>
			<td colspan="2">와이어 형상</td>
			<td>예</td>
			<td>예</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Costa(단일 HECT)1, 2</td>
			<td>1-200만</td>
			<td>4**</td>
			<td colspan="2">10cm 페트리 접시**</td>
			<td colspan="2">PDMS 게시물</td>
			<td colspan="2">광학 편향(에지/물체 추적)</td>
			<td>예</td>
			<td>예</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Costa (multi-hECT)3–9</td>
			<td>500 K-100만</td>
			<td>6</td>
			<td colspan="2">6cm 페트리 접시</td>
			<td colspan="2">PDMS 게시물</td>
			<td colspan="2">광학 편향(에지/물체 추적)</td>
			<td>예</td>
			<td>예</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Costa(다중 hECT W/ SPoT)</td>
			<td>100만</td>
			<td>6</td>
			<td colspan="2">6cm 페트리 접시</td>
			<td colspan="2">검은색 대문자가 있는 PDMS 게시물</td>
			<td colspan="2">광학 편향(물체 추적)</td>
			<td>예</td>
			<td>예</td>
		</tr><tr><td colspan="2">파시어 (EHT)17</td>
			<td>245 케이</td>
			<td>36</td>
			<td colspan="2">12웰 플레이트</td>
			<td colspan="2">검은색 대문자가 있는 PDMS 게시물</td>
			<td colspan="2">광학 편향(물체 추적)</td>
			<td>예</td>
			<td>예</td>
		</tr><tr><td colspan="2">분작-노바코비치13, 18</td>
			<td>100만</td>
			<td>12</td>
			<td colspan="2">6cm 페트리 접시</td>
			<td colspan="2">캡이 있는 PDMS 포스트</td>
			<td colspan="2">광학 편향(가장자리 감지)</td>
			<td>예</td>
			<td>예</td>
		</tr><tr><td colspan="2">분작-노바코비치(MilliPillar)14</td>
			<td>550의 케이</td>
			<td>6</td>
			<td colspan="2">맞춤형 6웰 접시</td>
			<td colspan="2">캡이 있는 PDMS 포스트</td>
			<td colspan="2">광학 편향(물체 추적); 칼슘 이미징</td>
			<td>아니요</td>
			<td>예</td>
		</tr><tr><td colspan="2">에셴하겐 (EHT)10, 19–21</td>
			<td>100만</td>
			<td>12</td>
			<td colspan="2">12웰 플레이트</td>
			<td colspan="2">캡이 있는 PDMS 포스트</td>
			<td colspan="2">광학 편향(포스트 편향의 가장자리 감지); 칼슘 이미징</td>
			<td>아니요</td>
			<td>예</td>
		</tr><tr><td colspan="2">잔드스트라 (카미리)22</td>
			<td>25-150 케이</td>
			<td>96</td>
			<td colspan="2">96웰 플레이트</td>
			<td colspan="2">후크가 있는 PDMS 게시물</td>
			<td colspan="2">광학 편향(가장자리 감지)</td>
			<td>아니요</td>
			<td>예</td>
		</tr><tr><td colspan="2">머리23, 24</td>
			<td>900 케이</td>
			<td>24</td>
			<td colspan="2">24웰 플레이트</td>
			<td colspan="2">캡이 있는 PDMS 포스트, 통합 자석</td>
			<td colspan="2">마그네틱 센서</td>
			<td>아니요</td>
			<td>예</td>
		</tr><tr><td colspan="2">라이히 (μTUG)11, 12, 25</td>
			<td>정의</td>
			<td>156</td>
			<td colspan="2">156웰디쉬</td>
			<td colspan="2">캡이 있는 PDMS 포스트, 통합 자석</td>
			<td colspan="2">광학 추적(형광 비드)</td>
			<td>예</td>
			<td>예</td>
		</tr></tbody></table>표 1: 문헌에 있는 일부 선형 공학 심장 조직 모델의 특성. 선형 엔지니어링 심장 조직 모델은 크기, 처리량, 고정 기능 설계, 공유 배지 수조의 용이성뿐만 아니라 기능적 특성화를 위한 별도의 근육 수조 시스템에 대한 요구 사항이 다양합니다. * 연구원들은 표준 6웰 플레이트의 치수를 기반으로 상업적으로 이용 가능한 엔지니어링 조직 시스템을 사용했습니다. ** 단일 조직 바이오리액터가 원하는 수와 위치의 모든 플라스틱 배양 접시에 고정되는 모듈식 시스템.
이 논문은 선형 인간 공학 심장 조직(hECT)1,2,3,4,5,6,7,8,9,15,27의 확립된 모델을 제작하기 위한 최신 프로토콜을 설명합니다 및 hECT 수축 기능을 평가하는 방법. 각 다중 조직 바이오리액터는 공유 배지 수조에 최대 6개의 hECT를 수용할 수 있으며 견고한 폴리설폰 프레임에 장착된 실리콘 엘라스토머 폴리디메틸실록산(PDMS)으로 만들어진 2개의 "랙" 부품으로 구성됩니다. 각 PDMS 랙에는 직경 0.5mm, 길이 3.25mm의 유연한 통합 힘 감지 포스트 6개가 포함되어 있으며, 2개의 랙은 각각 1개의 hECT를 수용하는 6쌍의 포스트를 제공합니다. 바이오리액터의 반전은 배양 배지의 수분 응축 또는 공기-액체 계면의 반월상 연골로 인한 왜곡으로 인해 아래에서 hECT를 시각화하는 데 방해가 되는 것을 극복하는 데 도움이 됩니다. hECT의 각 수축은 통합 단부 포스트의 편향을 유발하고, 편향 신호의 광학 측정은 hECT 1,2,3,4,5,6,7,8,9,15,27의 수축 함수를 나타내는 힘 대 시간 추적으로 처리됩니다 . 이 크기의 조직에 일반적으로 사용되는 단일 조직 바이오리액터와 비교했을 때, 다중 조직 설계는 실험 처리량을 개선하고 잠재적으로 다른 세포 조성의 인접 조직 간의 파라크린 신호 연구를 가능하게 합니다. 이 시스템은 질병 모델링 4,8, 파라크린 신호 전달 6,7, 이세포 배양 5,9 및 치료 스크리닝 7,9의 응용 분야를 설명하는 발표된 연구에서 검증되었습니다.
이 시스템에서 hECT는 길이 약 6mm, 직경 0.5mm로 설계되어 노이즈가 적은 힘 측정에 대한 강력한 광학 추적을 용이하게 합니다. 또한 확산 구배 및 세포 조직과 같은 조직 복잡성의 측면은 조직당 100만 개의 세포라는 관리 가능한 요구 사항과 균형을 이룹니다. 표준 CCD 카메라 기술을 사용하면 1μN의 약한 힘(편향 후 5μm 미만을 나타냄)이 명확한 신호를 생성하여 일부 hECT 질병 모델에서 관찰되는 것처럼 극도로 약한 수축 기능도 정확하게 측정할 수 있습니다. 이것은 또한 경련력 곡선의 상세한 분석을 용이하게 하여, 발달된 힘, 수축률(+dF/dt) 및 이완률(-dF/dt) 및 박동 변동성을 포함한 최대 16개의 수축성 지표(41)에 대한 고함량 분석을 가능하게 한다.
이 프로토콜은 생물반응기 구성 요소를 제조하기 위한 지침으로 시작합니다. hECT 수율을 극대화하고, 조직 기능의 기술적 변동성을 줄이며, 조직 평가의 품질과 깊이를 최적화하기 위한 단계에 특별한 주의를 기울입니다. 대부분의 심장 조직 공학 연구는 제조 및 장기 테스트 중 조직 손실률을 보고하지 않지만, 이는 현장에서 잘 알려진 과제이며 연구의 처리량과 효율성을 감소시킨다27. 여기에 설명된 조직 공학 방법은 대부분의 바이오리액터에서 모든 hECT의 머무름을 보장하기 위해 수년에 걸쳐 개선되었습니다(PDMS 랙 제조 방법에 관계없이). 그러나, 5%-20%의 조직 손실조차도 통계적 검증력에 상당한 영향을 미칠 수 있으며, 특히 이용 가능한 심근세포의 수(예: 일부 병든세포주4 의 분화 문제 또는 상업적으로 구매된 심근세포의 높은 비용으로 인해) 또는 치료 조건(예: 다양한 처리 화합물의 제한된 가용성 또는 높은 비용)에 의해 제한되는 소규모 실험에서 유의하게 영향을 미칠 수 있습니다.
이 프로토콜은 hECTs(27)를 고정하는 힘-감지 포스트의 끝에서 캡 역할을 하는 PDMS 랙의 새로운 기능인 SPoT(Stable Post Tracker)의 제작을 설명한다. 캡 형상이 포스트에서 떨어지거나 당겨질 때 발생하는 hECT 손실을 크게 줄여 캡이 없는 포스트에서 배양하기 어려운 다양한 강성과 장력을 가진 hECT를 배양할 수 있는 새로운 기회를 열어주는 방법을 보여줍니다. 또한, SPoT는 일관되고 잘 정의된 형상(27)을 통해 hECT 수축의 광학적 추적을 개선하기 위해 고대비 물체를 제공한다. 그 다음에는 이전에 발표된 프로토콜 3,42,43에 기반한 인간 유도 만능 줄기 세포(iPSC) 배양 및 심근세포 분화에 대한 설명과 hECT 제조, 배양 및 기능 측정에 대한 설명이 이어집니다.
이 기사에서는 생리학적 온도에서 조직 기능을 측정해야 할 필요성에 대해서도 다룹니다. 인간 심근(태아 및 성인 건강 및 질병 조직)과 다양한 동물 종(쥐, 고양이, 생쥐, 페럿 및 토끼 포함)의 심장 조직(44,45)은 생리적 온도에 비해 28°C-32°C의 온도에서 주파수 일치 경련력의 현저한 증가를 나타내며, 이는 저체온성 수축으로 알려진 현상입니다45, 46. 그러나 조작된 심근 조직 기능에 대한 온도의 영향은 아직 연구가 부족합니다. 문헌에 있는 많은 최근의 공학적 심장 조직 모델은 생리학적 조건을 근사화하기 위해 37°C에서 기능적으로 평가되도록 설계되었다 13,14,37. 그러나 우리가 아는 한, 조작된 심장 조직에 의해 생성된 힘에 대한 온도에 따른 영향은 체계적으로 조사되지 않았습니다. 이 프로토콜은 테스트 중 열 손실을 최소화할 뿐만 아니라 무균성을 손상시키지 않고 hECT를 생리적 온도로 유지할 수 있는 기능 측정을 위한 설정에 절연된 발열체를 통합할 수 있도록 하는 페이싱 전극 설계를 설명합니다(27). 그런 다음 발달된 힘, 자발적 박동 주파수, +dF/dt 및 -dF/dt를 포함하여 hECT 기능에 대한 온도의 관찰된 영향 중 일부를 보고합니다. 전체적으로, 이 논문은 인간이 설계한 심장 조직을 제작하고 수축 기능을 평가하기 위해 이 다중 조직 힘 감지 생물 반응기 시스템을 제조하는 데 필요한 세부 정보를 제공하며, 실온 및 37°C에서 측정을 위한 비교를 위한 기초를 제공하는 일련의 데이터를 제공합니다27.

<table><tbody><tr><td>0.25 mm 직경 304 스테인레스 스틸 와이어</td><td>McMaster Carr</td><td>6517K61&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 트립신-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>1.7 mL 마이크로튜브</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>10 cm 접시(높이 20 mm)</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 혈청학 피펫</td><td>Drummond</td><td>6-000-010</td><td></td></tr><tr><td>10 N NaOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS225-1</td><td>멸균 증류수 10X에 1:10 희석</td></tr><tr><td> 수정된 독수리 매체</td><td>시그마 Aldrich</td><td>M0275</td><td></td></tr><tr><td>20 - 200 &mu; L 마이크로피펫</td><td>Eppendorf</td><td>3123000055</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; L 마이크로피펫 팁</td><td>VWR</td><td>76322-150</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 혈청학 피펫</td><td>Drummond</td><td>6-000-005</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 원추형 원심분리기 튜브</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>6 cm 페트리 디쉬</td><td>Corning</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>6 와트 LED 듀얼 구즈넥 조명기</td><td>AmScope</td><td>&nbsp; LED-6W&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>6-웰 플레이트</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>90도 각도 거울</td><td>Edmund Optics</td><td>45-594</td><td></td></tr><tr><td>아크릴 본딩 접착제</td><td>SCIGRIP#</td><td>4</td><td></td></tr><tr><td>조정 가능한 10cm x 10cm 잭</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-673-50</td><td></td></tr><tr><td>알루미늄 6061</td><td>McMaster Carr</td><td>9008K82</td><td></td></tr><tr><td>A-Plan 10X 대물 렌즈</td><td>ZEISS</td><td>1020-863</td><td></td></tr><tr><td>오토클레이브 백</td><td>프로퍼</td><td>21002</td><td></td></tr><tr><td>B-27 보충제</td><td>ThermoFisher</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>B-27 보충제(인슐린 제외)</td><td>ThermoFisher</td><td>A1895601</td><td></td></tr><tr><td>벤치탑 원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R</td><td></td></tr><tr><td>블랙 ABS</td><td>Ultimaker</td><td></td><td>2.85mm 너비</td></tr><tr><td>소 콜라겐 I</td><td>Gibco</td><td>A1064401</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Tocris</td><td>4423</td><td></td></tr><tr><td>클래스 II 생물 안전 캐비닛</td><td>Labconco</td><td>3430009</td><td></td></tr><tr><td>투명 아크릴 시트</td><td>estreetplastics</td><td>1002502436</td><td>6.25 mm 두께</td></tr><tr><td>CNC 수직 밀</td><td>Haas</td><td>VF-1</td><td></td></tr><tr><td>전도성 흑연 바</td><td>McMaster Carr</td><td>1763T33</td><td></td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>Olympus</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 Nutrient Mix</td><td>ThermoFisher</td><td>11330032</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A4094</td><td>물에서 70%로 희석</td></tr><tr><td>EVE 자동 세포 계수기</td><td>NanoEntek</td><td>E1000</td><td></td></tr><tr><td>EVE 세포 계수 슬라이드</td><td>NanoEntek</td><td>EVS-050</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 혈청</td><td>Life Technologies</td><td>10438026</td><td></td></tr><tr><td>Fine Curved Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11253-25</td><td></td></tr><tr><td>Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator</td><td>Thermo Electron Corporation</td><td>3110</td><td>일명 "인큐베이터". HEPA 클래스 100 필터</td></tr><tr><td>Fusion360 소프트웨어 Autodesk</td><td></td><td></td><td>, 일명 "CAD 소프트웨어"</td></tr><tr><td>, 유리 혈구계</td><td>Reichert</td><td>1475</td>, <td>0.1mm 깊이</td></tr>, <tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3784</td><td></td></tr><tr><td>hESC 인증 matrigel</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>일명 "기저막 매트릭스". 냉동 부분 표본에 보관</td></tr><tr><td>고속 CCD 카메라</td><td>PixelLINK</td><td>P7410</td><td></td></tr><tr><td>도립 현미경</td><td>Carl Zeiss Werk</td><td>Axiovert 40 CFL</td><td>10X 위상차 대물</td></tr><tr><td>IWR-1</td><td>Selleck Chem</td><td>S7086</td><td></td></tr><tr><td>LabView 소프트웨어</td><td>National Instruments</td><td>2016</td><td></td></tr><tr><td>층류 클린 벤치</td><td>NuAire</td><td>NU-201-330</td><td>hECT 기능 분석에 필요</td></tr><tr><td>노트북</td><td>AsusTek</td><td>Strix</td><td>Intel Core i& 프로세서, CPU 2.8GHz, 16GB</td></tr><tr><td>RAM 레이저 절단기</td><td>Epilog</td><td>Helix 24</td><td></td></tr><tr><td>확대 헤드셋</td><td>ExcelBlades</td><td>70020</td><td>미세 조작이 필요한 단계에 권장</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td>버전 2019b 이상</td><td>일명 "데이터 분석" 소프트웨어 "</td></tr><tr><td>마이크로 Vannas 가위, 3mm 블레이드</td><td>WPI 기기</td><td>501839</td><td></td></tr><tr><td>현미경 붐 스탠드</td><td>올림푸스</td><td>SZ2-STU1</td><td></td></tr><tr><td>페니실린 - 스트렙토 마이신 재고 솔루션</td><td>ThermoFisher</td><td>15140122</td><td>10,000 IU / ml 페니실린; 10,000 &mu; g/ml 스트렙토마이신</td></tr><tr><td>2가 양이온이 없는 인산염 완충 식염수</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3813</td><td>증류수에 1X 및 10X 농도로 희석</td></tr><tr><td>피펫 컨트롤러</td><td>Drummond</td><td>4-000-100</td><td></td></tr><tr><td>PixelLINK 캡처 OEM</td><td>PixelLINK</td><td>10.2.1.6</td><td>일명 "카메라 소프트웨어"</td></tr> <tr><td>Polysulfone</td><td>McMaster Carr</td><td>86735K73</td><td>반투명 호박색</td></tr><tr><td>폴리테트라플루오로에틸렌 (PTFE)</td><td>McMaster Carr</td><td>8545K176&nbsp;</td><td>블랙, 몰드</td></tr><tr><td>ReLeSR</td><td>줄기 세포 기술</td><td>5872</td><td>일명 "iPSC 해리 매체"</td></tr> <tr><td>Rosewell Park Memorial Institute 1640 매체</td><td>ThermoFisher</td><td>11875135</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 시트</td><td>SMI 제조</td><td></td><td>광택, 두께 0.02, 경도계 40</td></tr><tr><td>크기 10/0 파란색, 녹색, 빨간색 및 노란색 유리 씨앗 구슬</td><td>Michael의</td> 색상은 견딜 수 있어야 합니다.<td></td><td> 고압클레이</td></tr>빙 <tr><td>스파툴라</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>14-373</td>은 PDMS 스퀘어 펄스 자극기를 <td>혼합하는 데 사용됩니다</td></tr><tr><td>.</td><td>Astro-Med / Grass Technologies</td><td>S88X</td><td></td></tr><tr><td>스테인레스 스틸 Razoblades</td><td>GEM</td><td>62-0179-CTN</td><td>경도가 낮기 때문에 비 스테인레스 스틸보다 선호</td></tr><tr><td>Stemflex</td><td>ThermoFisher</td><td>A3349401</td><td>일명 "iPSC 배양 매체"</td></tr><tr><td>멸균 증류수</td><td>ThermoFisher</td><td>5230</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 170 -&nbsp; 실리콘 엘라스토머 봉지재 블랙 0.9kg 키트</td><td>Dow</td><td>DOWSIL 170 2LB 키트</td><td>AKA 블랙 폴리디메틸실록산(블랙 PDMS)</td></tr><tr><td>Sylgard 184 - 실리콘 엘라스토머 투명 1lb 키트</td><td>Dow</td><td>DC 184 SYLGARD 0.5KG 1.1LB 키트</td><td>AKA 폴리디메틸실록산(PDMS)</td></tr><tr><td>온도 제어 가열 스테이지</td><td>Okolab</td><td>H401-HG-SMU</td><td>높이를 10cm로 설정</td></tr><tr><td>열가소성 3D 프린터</td><td>Ultimaker</td><td>Ultimaker 3</td><td></td></tr><tr><td>Thiazovivin</td><td>Selleck Chem</td><td>S1459</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>NanoEntek</td><td>EBT-001</td><td></td></tr><tr><td>진공 챔버</td><td>Bel-Art Parts</td><td>F42027-0000</td><td></td></tr><tr><td>가변 속도 미니 밴드 톱</td><td>Micro-Mark</td><td>82203</td><td></td></tr><tr><td>가변 속도 소형 드릴 프레스</td><td>Micro-Mark</td><td>82959</td><td></td></tr><tr><td>진동 절연 테이블</td><td>Labconco</td><td>3618000</td><td></td></tr><tr><td>계량 보트</td><td>VWR</td><td>10803-140</td><td></td></tr><tr><td>Talon 실린더 벤치 클램프</td><td>VWR</td><td>97035-528</td><td>AKA 나사 클램프</td></tr></tbody></table>

공학적 심장 조직의 데이터 수집 및 모델 처리량을 개선하기 위한 바이오리액터 설계

Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model Throughput of Engineered Cardiac Tissues

심부전은 전 세계적으로 주요 사망 원인으로 남아 있어 인간 심장에 대한 더 나은 전임상 모델이 절실히 필요합니다. 조직 공학은 기초 과학 심장 연구에 매우 중요합니다. 체외 인간 세포 배양은 동물 모델의 종간 차이를 제거하는 반면, 조직과 유사한 3D 환경(예: 세포외 기질 및 이세포 결합)은 플라스틱 페트리 접시에 대한 기존의 2차원 배양보다 생체 내 조건을 더 많이 시뮬레이션합니다. 그러나 각 모델 시스템에는 맞춤형 바이오리액터 및 기능 평가 장치와 같은 특수 장비가 필요합니다. 또한 이러한 프로토콜은 종종 복잡하고 노동 집약적이며 작고 섬세한 조직의 결함으로 인해 어려움을 겪습니다.
이 논문은 조직 기능의 종단 측정을 위해 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포를 사용하여 강력한 인간 공학 심장 조직(hECT) 모델 시스템을 생성하는 프로세스를 설명합니다. 선형 스트립 형상을 가진 6개의 hECT를 병렬로 배양하며, 각 hECT는 PDMS 랙에 부착된 한 쌍의 힘 감지 폴리디메틸실록산(PDMS) 포스트에 매달려 있습니다. 각 게시물은 사용 편의성, 처리량, 조직 보존 및 데이터 품질을 개선하는 새로운 기능인 검은색 PDMS SPoT(Stable Post Tracker)로 제한됩니다. 이 모양은 포스트 편향의 신뢰할 수 있는 광학 추적을 가능하게 하여 절대적인 능동 및 수동 장력으로 향상된 트위치 힘 추적을 제공합니다. 캡 형상은 포스트에서 미끄러지는 hECT로 인한 조직 손상을 제거하고, PDMS 랙 제조 후 두 번째 단계를 포함하므로 바이오리액터 제조 공정을 크게 변경하지 않고도 SPoT를 기존 PDMS 포스트 기반 설계에 추가할 수 있습니다.
이 시스템은 생리학적 온도에서 hECT 기능 측정의 중요성을 입증하는 데 사용되며 데이터 수집 중에 안정적인 조직 기능을 보여줍니다. 요약하면, 우리는 체외 응용을 위해 조작된 심장 조직의 생체 충실도, 효율성 및 엄격성을 발전시키기 위해 주요 생리학적 조건을 재현하는 최첨단 모델 시스템을 설명합니다.

위의 프로토콜에 따라, 심근세포는 이전에 우리 그룹 9,15에서 사용했던 건강한 iPSC 라인에서 생성되었으며 배양 8-61일 후에 hECT로 제조되었습니다. 그림 9A는 아래에서 본 hECT의 대표 이미지를 보여주며, SPoT를 사용하지 않고(위) SPoT를 사용하지 않고(아래) 만든 것입니다. 기능 측정은 hECT 제조 후 37일에서 52일 사이에 실온(23°C) 및 생리학적 온도(36°C)에서 수행되었습니다. PDMS 랙을 제작할 때 숙련된 사용자는 6개의 포스트가 모두 손상되지 않은 상태에서 PDMS 랙에서 80%의 수율을 기대할 수 있으며, 최소 5개의 포스트(당사 실험실의 3명의 사용자 기준)에서 전체 95%의 수율을 기대할 수 있으며, 포스트 높이의 변동성은 &lt;3%입니다.
SPoT는 PDMS 포스트의 팁에...

줄기 세포 유래 심근 세포를 사용하여 생체 공학적으로 설계된 3차원 심장 조직은 건강한 심근과 병든 인간 심근 을 체외 에서 연구하는 동시에 천연 심장 틈새 시장의 주요 측면을 요약하기 위한 유망한 모델로 부상했습니다. 이 원고는 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근세포에서 생성된 high-content engineered 심장 조직을 제작하고 분석하기 위한 프로토콜을 설명합니다.

Heart failure remains the leading cause of death worldwide, creating a pressing need for better preclinical models of the human heart. Tissue engineering ...

3차원 줄기세포 유래 인간 심장 근육의 체외 모델은 실험실 동물 실험과 관련된 종간 차이를 제거하면서 기존 2차원 세포 배양의 생체 충실도를 향상시킵니다. 안정적인 포스트 트래커를 갖춘 당사의 다중 조직 바이오리액터 설계는 조직 성공을 극대화하고 엔지니어링된 심장 조직 기능의 심층 특성 분석의 정확도를 향상시킵니다. 심부전이 전 세계적으로 여전히 주요 사망 원인이 됨에 따라, 당사의 엔지니어링 심장 조직을 통해 연구원들은 인간의 심장 질환을 모델링하고 잠재적인 치료법을 선별할 수 있습니다.시작하려면 기둥 구멍이 삼각형 선반 반대쪽의 데드 스페이스와 정렬되도록 주조 홀더에 4개의 알루미늄 네거티브 마스터 캐스트를 배치합니다. 두 개의 평행 브래킷 사이에 장치를 놓고 clamp액체 PDMS의 누출을 방지하기 위해 0.5mm 두께의 실리콘 시트의 직사각형 조각을 개스킷으로 사용하여 측면을 함께 고정합니다. 얕은 용기에 PDMS 경화제 0.5mL와 PDMS 엘라스토머 염기 5mL를 1:10 비율로 혼합하고 5분 동안 세게 저어줍니다.기포가 사라질 때까지 강한 진공 상태에서 진공 챔버에서 PDMS 혼합물을 탈기합니다. 다음으로, PDMS 혼합물을 주조 장치에 붓고 각 슬롯이 완전히 덮이도록 과도하게 채웁니다. 각 랙의 고유한 식별을 위해 포스트가 있는 측면 반대쪽에 PDMS 랙의 본체에 작은 컬러 유리 구슬을 추가합니다.수평으로 수평을 이루는 주조 장치를 최소 12시간 동안 강한 진공 상태에서 진공 챔버에 놓습니다. PDMS를 먼지가 없는 실온에서 48시간 동안 경화시켜 섬세한 포스트를 완전히 경화하고 강도를 극대화할 수 있습니다. cl 제거amp, 브래킷 및 실리콘 시트를 주조 장치에서 제거합니다.스테인리스 스틸 면도날을 사용하여 주조 장치 및 프레임 지지대 상단의 PDMS 필름을 잘라냅니다. 손가락을 사용하여 캐스트 홀더의 측면에서 PDMS 랙을 분리합니다. 무딘 스테인리스강 면도날을 주물과 주조 홀더 사이의 데드 스페이스에 삽입하고 들어 올려 데드 스페이스를 채우는 PDMS가 캐스트 홀더와 함께 유지되도록 합니다.그런 다음 날카로운 스테인리스 스틸 칼날을 사용하여 기둥 끝에서 남아 있는 PDMS 필름과 데드 스페이스 PDMS를 잘라냅니다. 손가락을 사용하여 포스트 반대쪽의 캐스트에서 PDMS 랙을 천천히 분리합니다. 기둥에 마스터 캐스트가 없어질 때까지 계속해서 측면을 번갈아 가며 사용합니다.앞에서 설명한 대로 모든 PDMS 랙과 포스트를 비우고 날카로운 면도날을 사용하여 랙에 남아 있는 여분의 PDMS를 잘라냅니다. 열가소성 용융 증착 모델링 3D 프린터를 사용하여 안정적인 포스트 트래커(SPoT) 주조 장치의 구성 요소를 인쇄합니다. 3D 프린팅된 조각 사이와 PDMS 랙과 세 갈래 지그 사이에 단단히 압입되도록 합니다.또한 PDMS 랙이 구부러지지 않고 웰 바닥에 닿는 기둥에 꼭 맞는지 확인합니다. 0.5 밀리리터의 검은색 PDMS 파트 A와 0.5 밀리리터의 파트 B를 작은 계량 보트 또는 얕은 용기에 용액의 색상이 균일해질 때까지 혼합합니다. 혼합된 검은색 PDMS를 강한 진공 상태에서 진공 챔버에서 20분 동안 탈기합니다.가스가 제거된 검은색 PDMS를 3D 프린팅 베이스에 부어 구멍을 채우고 두드려 기포가 남지 않도록 합니다. 베이스에서 여분의 PDMS를 최대한 많이 긁어냅니다. 세 갈래 조각을 베이스에 끼우고 PDMS 랙을 세 갈래 지그의 홈에 배치하여 포스트의 끝이 원형 웰의 검은색 PDMS에 담그도록 합니다.검은색 PDMS를 먼지가 없는 실온에서 48시간 동안 경화시킵니다. 기둥의 장력을 최소화하면서 세 갈래 조각을 밀어냅니다. 작은 집게를 사용하여 각 SPoT를 둘러싼 얇은 검은색 PDMS 필름을 긁어낸 다음 끝이 가늘고 구부러진 집게를 SPoT 웰에 삽입하여 3D 프린팅 베이스에서 분리합니다.SPoT를 검사하고 미세한 vannas 가위를 사용하여 주조 공정에서 남아 있는 검은색 PDMS 필름을 트리밍합니다. PDMS 랙을 폴리 휴대폰 프레임에 장착한 다음 검은색 베이스 플레이트에 밀어 넣어 완성된 기둥의 길이가 올바른지 확인합니다. 바이오리액터를 고압멸균하고 셀 혼합물을 준비한 후 hECT 제조를 진행합니다.멸균 장갑을 착용하고 생물반응기 부품이 들어 있는 오토클레이브 백에서 검은색 베이스 플레이트를 제거하고 웰이 위를 향하도록 하여 60밀리리터 접시에 넣습니다. 기포가 생기지 않도록 세포 혼합물 44마이크로리터를 각 웰에 천천히 피펫팅합니다. 새 멸균 장갑을 착용하고 오토클레이브 백에서 PDMS 랙이 있는 폴리설폰 프레임을 제거합니다.프레임의 끝이 베이스 플레이트 끝의 홈에 맞도록 프레임을 베이스 플레이트 위로 내립니다. 기둥이 모두 직선이고 프레임이 기울어지지 않았는지 확인하고 생물 반응기를 60mm 접시에 놓습니다. 심근세포 유지 배지에 10%FBS 1밀리리터를 60밀리리터 접시에 첨가하여 hECT가 응고됨에 따라 습도를 높입니다.뚜껑이 없는 접시를 100mm 접시에 넣고 100mm 접시 뚜껑으로 덮은 다음 생물 반응기를 섭씨 37도, 5% 이산화탄소 인큐베이터로 되돌려 콜라겐이 현탁액에 있는 세포와 함께 젤을 형성할 수 있도록 합니다. 2시간 후 인큐베이터에서 접시를 꺼냅니다. 심근세포 유지 배지에 13밀리리터의 10% FBS를 추가하고 배지가 PTFE 베이스 플레이트와 PDMS 랙 사이를 흐르도록 접시를 기울입니다.측면에서 바이오리액터에 기포가 없는지 검사하고 접시를 인큐베이터로 되돌립니다. 공기가 갇힌 경우 바이오리액터를 배지 밖으로 기울여 기포가 끊어지도록 하고 천천히 다시 내리거나 젤 로딩 팁이 있는 마이크로 피펫을 사용하여 포스트를 방해하지 않고 공기를 빨아들입니다. 프레임의 창을 통해 hECT 압축을 검사합니다.24시간에서 96시간 동안 hECT는 압축되고 불투명해집니다. hECT가 원래 직경에 비해 30% 이상 압축되면 베이스 플레이트를 제거합니다. 액체가 접시 가장자리와 함께 플러시될 때까지 생물 반응기가 들어 있는 60mm 접시에 심근세포 유지 배지를 채우고 새 14mm 접시에 60ml를 추가합니다.멸균 장갑을 낀 상태에서 접시에서 생물반응기를 뒤집어 베이스 플레이트가 위에 오도록 합니다. 갇힌 기포가 있는지 검사한 후 수평을 유지하면서 베이스 플레이트를 천천히 들어 올립니다. 게시물 팁에 초점이 맞춰져 있는지 확인합니다.임계값 스위치를 켜고 SPoT가 명확하게 구분되고 hECT가 수축할 때 모양이 변경되지 않을 때까지 슬라이더를 조정합니다. 사각형 도구를 사용하여 SPoT 중 하나 주위에 사각형을 그리고 포스트 경계 상자 안에 있는 하나 설정 버튼을 클릭하여 SPoT 주위의 사각형 위치를 설정하여 SPoT가 항상 사각형 경계 내에 유지되도록 합니다. 이 과정을 다른 포스트에 반복하고 세트 2에 기록합니다.프로그램이 더 작은 개체를 추적하지 않도록 개체 크기 설정을 조정하고 각 사각형에서 추적되는 개체 수가 일정하게 유지되도록 합니다. 인터페이스는 추적된 물체 사이의 측정된 거리를 실시간으로 보여줍니다. 이 그래프를 사용하여 노이즈를 모니터링합니다.페이싱 주파수 헤르츠 헤더 아래에서 원하는 주파수의 범위와 최소에서 최대로 단계별로 이동하기 위한 원하는 간격을 나타냅니다. 오른쪽 상자에서 hECT가 새 페이싱 주파수에 맞게 조정할 수 있도록 원하는 설정 시간을 선택한 다음 녹음 시간과 페이싱 볼륨을 지정합니다.tage. 프로그램 시작 버튼을 클릭하여 프로그램을 시작합니다.한 주파수의 데이터가 기록된 후 최대 주파수에 도달할 때까지 새 녹음을 위해 원하는 간격만큼 자극기 주파수를 높입니다. hECT의 대표 이미지는 SPoT 없이 SPoT를 사용하여 생성된 하단에서 본 것과 같습니다. SPoT는 데이터 수집 중에 추적할 수 있는 단일 정의된 형상을 제공했습니다.일부 극단적인 경우에는 추적 물체가 가려지기도 했습니다. 광학 추적 및 노이즈 감소를 위한 보다 신뢰할 수 있는 형태는 1마이크로뉴턴의 낮은 현상된 힘으로 약한 조직을 측정할 수 있게 했습니다. SPoT는 hECT 손실을 방지하는 캡 형상을 제공했습니다.측정된 hECT 기능은 가열된 스테이지가 있는 전류 페이싱 설정에서 확장된 배양 시간 동안 안정적이었습니다. 생리적 온도에서의 측정과 비교했을 때, hECT는 실온에서 수축 및 이완 속도가 느려진 수축 역학이 변경되었음을 보여주었습니다. 더 높은 주파수에서 hECT는 실온에서 더 약한 경향이 있었습니다.낮은 주파수에서 hECT는 실온에서 더 강한 경향이 있었습니다. 섭씨 36도에서 페이스를 조절할 때 hECT는 더 높은 자발적 박동률과 더 넓은 범위의 캡처 주파수를 가졌습니다. 온도 제어 환경은 측정된 hECT 기능의 생리학적 관련성을 보장합니다.또한 다중 조직 생물반응기의 공유 배지 배스는 서로 다른 세포 조성의 hECT 간 파라크린 신호 연구를 용이하게 합니다. 다조직 바이오리액터에 SPoT를 추가하면 연구원들이 비정상적으로 높거나 낮은 장력을 가진 병든 심근을 효율적으로 연구할 수 있으며, 그렇지 않으면 뚜껑이 없는 포스트의 끝에서 미끄러질 수 있습니다.

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생명공학

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여기서, 우리는 미리 분화된 인간 유도만능 줄기 세포 유래 심근세포, 심장 섬유아세포 및 내피 세포로 구성된 3D 자가 조립 심장 미세 조직 배열을 생성하는 사용하기 쉬운 방법론을 기술합니다. 심장 미세 조직을 생성하는 기술을 요구하는 이 사용자 친화적이고 낮은 세포는 질병 모델링 및 약물 개발의 초기 단계를 위해 구현될 수 있습니다.

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