유전자 조작 마우스 모델 개발을 위한 배아 줄기 세포에서 CRISPR/Cas9 매개 고효율 유전자 표적화

유전자 변형 마우스를 생산하고 표현형을 분석하면 생체 내에서 특정 유전자 기능을 자세히 이해할 수 있습니다. 유전자 변형 동물 모델을 사용하여 수많은 중요한 발견이 밝혀졌습니다. 여기서 설명하는 방법은 긴 DNA가 약물 선택 없이 허용 가능한 효율로 줄기 세포를 이식할 수 있도록 합니다.

이 기술은 기초 생명 과학뿐만 아니라 의학 및 동물 과학과 같은 응용 과학에서도 연구 결과를 구현할 것입니다. 절차를 시연하는 것은 조교수 인 치히로 에모리 박사와 내 연구실의 부교수 인 마나부 오자와 박사가 될 것입니다. 마우스 배아 섬유아세포를 준비한 후, 원고에 기재된 젤라틴 코팅된 세포 배양 접시를 제조하고 습한 배양기에서 2시간 동안 배양한다.

젤라틴 용액을 제거하고 접시를 PBS로 두 번 씻은 다음 사용할 때까지 실온에서 보관하십시오. 동결된 MEF 스톡을 섭씨 37도에서 1분 동안 템퍼링한 수조를 사용하여 유사분열적으로 불활성화시켰다. ESC 파종 하루 전에 MEF를 젤라틴 코팅 60mm 접시에 놓습니다.

앞서 표시된 대로 냉동 ESC 스톡 튜브를 해동하고 미리 파종된 MEF가 들어 있는 60mm 접시에 10-5번째 ESC를 한 번 놓습니다. 그런 다음 4 밀리리터의 ESC 배양 배지를 추가하고 ESC가 50-70 % confluency에 도달 할 때까지 접시를 배양합니다. 배양 된 ESC를 4 밀리리터의 PBS로 세척 한 후 섭씨 37도에서 5 분 동안 800 마이크로 리터의 0.25 % 트립신 EDTA 용액으로 소화시킵니다.

트립신이 1 밀리리터의 ESCM으로 비활성화되면 1 밀리리터의 신선한 ESCM을 세포에 첨가하고 배지를 튜브로 옮기고 280G에서 5 분 동안 원심 분리하여 세포를 펠릿화합니다. 세포를 1 밀리리터의 신선한 ESCM에 재현탁시킨 후, 트리판 블루 염색과 함께 세포 카운터를 사용하여 세포 농도를 계수한다. 새로운 1.5 밀리리터 튜브에 10 내지 5 번째 ESC를 1 회 옮기고 원심 분리로 PBS로 세 번 세척 한 후, ESC 펠릿을 12 마이크로 리터의 Cas9 RNP DNA 혼합물에 재현탁시키고 거품을 피하기 위해 부드러운 피펫팅으로 잘 혼합한다.

그런 다음 전기 천공을 위해 매달린 ESC를 제공하십시오. 다음으로, 유사 분열 적으로 비활성화 된 MEF와 함께 4 밀리리터의 ECSM이 들어있는 60mm 접시에 전기 천공 된 ESC를 배양하고 매일 배지를 계속 교체하십시오. 전기 천공 후 3-5 일 후에 ESC를 4 밀리리터의 PBS로 씻은 다음 800 마이크로 리터의 0.25 % 트립신 EDTA로 소화하고 습한 인큐베이터에서 배양합니다.

그런 다음 2 밀리리터의 ESCM을 추가하여 트립신 소화를 중지시킵니다. 세포 혼합물이 펠릿화되면 펠릿을 1밀리리터의 신선한 ESCM에 재현탁하고 트리판 블루 염색이 있는 세포 카운터를 사용하여 세포 농도를 계산합니다. ESCs를 1회 10 내지 3 셀 당 60 밀리미터 디쉬에 ESCM 및 MEF 공급기를 포함하는 계대한다.

식민지가 집어 올 때까지 매체를 교체하십시오. 첫 번째 통과 후 5-7 일 후에 ESCM이 ESC 배양 접시에서 흡인되면 4 밀리리터의 PBS를 첨가하십시오. 20마이크로리터 피펫을 사용하여 실체현미경으로 5마이크로리터의 PBS로 단일 ESC 콜로니를 선택합니다.

개별 콜로니를 15마이크로리터의 0.25% 트립신 EDTA 용액이 들어 있는 둥근 바닥 96웰 플레이트의 웰에 놓습니다. 96웰 플레이트를 배양한 후 80마이크로리터의 ESCM을 추가하고 피펫팅을 통해 ESC 콜로니를 단일 세포로 해리하여 트립신 소화를 중지합니다. PCR 유전형 분석을 위해 40마이크로리터의 ESC 현탁액을 웰당 50마이크로리터의 ESCM을 포함하는 젤라틴 코팅된 피더가 없는 96웰 플레이트로 옮깁니다.

동결된 ESC 스톡을 만들기 위해 나머지 60마이크로리터의 ESC 현탁액을 500마이크로리터의 ESCM 및 피더 MEF가 포함된 젤라틴 코팅된 24웰 플레이트의 웰로 옮깁니다. 24웰 플레이트에서 배양된 개별 ESC 클론을 60 내지 80% 컨플루언시에 도달할 때까지 비축하고 앞서 입증된 바와 같이 트립신화에 의해 개별 ESC 클론을 회수한다. 원심분리에 의해 세포 펠렛을 얻은 후, 세포를 섭씨 영하 80도에서 동결시키기 위해 500 마이크로리터의 세포 동결 배지에 재현탁시킨다.

PCR 유전형 분석의 경우, 앞서 입증된 바와 같이 ESC 클론을 배양하고 100마이크로리터의 PBS로 2회 세척하기 전에 흡인하여 각 웰에서 ESCM을 제거합니다. PBS를 흡인 한 후 단백질 분해 효소 K를 함유 한 용해 완충액 100 마이크로 리터를 추가하고 잘 혼합합니다. 이제 ESC 용해물을 새 1.5 밀리리터 튜브로 옮기고 섭씨 65 도의 열 챔버에 최소 1 시간 동안 보관하십시오.

게놈 DNA가 20 마이크로 리터의 DNase가없는 물에 용해되면 분광 광도계를 사용하여 DNA의 순도와 농도를 결정합니다. 표적 영역을 증폭하기 위해 유전자좌 특이적 프라이머 세트를 사용하여 게놈 PCR을 수행한 후 서열을 확인하고 원하는 녹인 서열을 가진 ESC 클론을 선택합니다. 호르몬 처리된 암컷을 ICR 수컷과 교배하고 난관을 채취한 후, 채취한 난관을 FHM 방울에 넣고 안저에 삽입된 플러싱 바늘을 사용하여 난관을 FHM으로 플러싱하여 2세포 또는 4세포 병기 배아를 회수합니다.

수집 된 배아를 구강 피펫을 사용하여 여러 개의 신선한 FHM 방울로 옮겨 씻으십시오. 8 세포 또는 morula 단계에 도달 할 때까지 하루 동안 앞서 입증 된 바와 같이 미네랄 오일로 덮인 35mm 세포 배양 접시에 50 마이크로 리터의 KSOM 방울로 배아를 배양합니다. 배아를 고정하기위한 유리 피펫과 풀러와 마이크로 포지를 사용하여 ESC 주입을 준비하십시오.

FHM이 포함된 홀딩 피펫을 마이크로 주입기에 연결된 모세관 홀더에 통합한 후 마이크로 매니퓰레이터의 왼쪽에 설치합니다. 주입 피펫을 다른 마이크로 주입기에 연결하고 오른쪽에 설치하십시오. 두 개의 피펫을 현미경 시야에 똑바로 정렬합니다.

12 % 폴리 비닐 피 롤리 돈 5 마이크로 리터와 FHM 5 마이크로 리터 방울을 60mm 접시의 동일한 뚜껑에 나란히 놓습니다. 미네랄 오일로 방울을 덮으십시오. 배아를 5 마이크로리터의 FHM 방울로 옮기고, 1 내지 5 마이크로리터의 ESC 현탁액을 배아-함유 FHM 방울에 첨가한다.

주사 피펫이 폴리비닐 피롤리돈으로 세척되면 주입 피펫을 배아와 ESC가 포함된 방울로 옮깁니다. 주입 피펫에서 세포 분열을 막 마친 3개의 개별 ESC 이중선을 선택합니다. 홀딩 피펫을 사용하여 흡인에 의한 압축을 완료 한 8 세포 또는 morula 단계 배아를 잡고 압전 펄스로 zona pellucida에 구멍을 뚫습니다.

zona pellucida 내부의 6 세포 ESC를 배출하고 배아에서 피펫을 꺼냅니다. ESC 주입 배아를 구강 피펫을 사용하여 여러 KSOM 방울로 부드럽게 씻고 배아가 배반포 단계로 발전 할 때까지 앞서 입증 된 것처럼 미네랄 오일로 덮인 새로운 50 마이크로 리터 KSOM 방울에서 배양합니다. 녹인 표적에 특이적인 크기의 PCR 앰플리콘을 수득하고, 22개의 클론 중 9개가 녹인 특이적 밴드를 나타내었다.

이러한 결과는 약물 선택 없이 유전자 녹인에 대해 효율적이고 재현 가능합니다. ESC 식민지의 최적 크기를 선택하는 것은이 절차에서 매우 중요합니다. 너무 크거나 작은 식민지를 선택하지 마십시오.

접합체를 이용한 CRISPR Cas9 매개 직접 게놈 편집은 간단한 유전자 녹아웃 마우스를 만드는 데 적용할 수 있습니다. 이 CRISPR Cas9 매개 ESC 유전자 표적화 프로토콜은 생명 과학에서 향후 분석을 위해 다양한 유전자 변형 마우스의 생산을 용이하게합니다.