Name: 루시페라아제 형질도입된 인간 T 세포를 이용한 이중특이적 항체 유도 T 세포 트래피킹 추적 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-12T12:05:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: 학습하세요 루시페라아제 형질도입된 인간 T 세포를 이용한 이중특이적 항체 유도 T 세포 트래피킹 추적 방법을. 이 기술은 종양으로의 T 세포 이동을 비침습적으로 실시간 모니터링하여 항암 면역 치료 효능을 평가하는 데 활용됩니다.

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저자는 이 기사의 대표 결과 섹션에 설명된 실험에 사용된 루시페라아제 구조를 공유해 주신 Vladimir Ponomarev 박사에게 감사드립니다.

다음 절차는 Memorial Sloan Kettering의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에서 평가하고 승인했습니다.
1. 루시페라아제를 이용한 293T 세포의 형질주입 및 바이러스 상청액 수확
<ol><li>293T 세포의 배양<ol><li>열 불활성화 소 태아 혈청(FBS) 110mL, 페니실린-스트렙토마이신 11mL를 각각 1리터의 DMEM에 추가하여 배지를 준비합니다.</li>
		<li>5 x 106 293T 세포를 해동하고, 상기와 같이 제조된 배지와 함께 T175 플라스크에 옮긴다.</li>
		<li>293T 세포를 6일 동안 3일마다 1:10으로 분할합니다. 세포가 90 % 이상 합류하지 않도록하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>293T 세포의 형질주입 참고: 293T 세포의 T175 플라스크 1개를 형질주입하기 위해 다음의 시약 수량을 계산합니다. 더 많은 플라스크를 변환해야 하는 경우 그에 따라 조정하십시오.<ol><li>피펫을 사용하여 1.5mL의 배지를 두 개의 50mL 튜브 각각에 옮깁니다. 하나의 튜브에 VSV-G 플라스미드 10μg, Gag/pol 20μg, 딱정벌레 레드 TD 토마토(CBR-TDR) 루시페라아제 플라스미드 20μg을 넣고 혼합합니다. 다른 튜브에 100 μL의 DNA in vitro transfection 시약을 넣고 혼합합니다. 두 튜브를 실온(RT)에서 5분 동안 배양합니다. 참고: 이 원고에 설명된 모든 플라스미드는 Vladimir Ponomarev 박사가 제공했습니다.</li>
		<li>시험 관내 형질주입 시약을 함유하는 배지를 DNA 플라스미드가 들어있는 튜브에 적가하고(약 30초에 걸쳐) 피펫으로 부드럽게 혼합한다. RT에서 20분 동안 배양합니다.</li>
		<li>이 20분 배양 동안 0.05% 트립신 5-10mL를 첨가하여 293T 세포를 분리합니다. 세포가 분리되면 10mL의 배지와 800 x g 에서 5분 동안 원심분리기를 추가합니다. 1.5mL의 배지에 세포를 재현탁합니다.</li>
		<li>DNA 시험 관내 형질주입 시약 및 DNA 플라스미드를 함유하는 배지를 293T 세포에 첨가하고, 37°C에서 30분 동안 인큐베이션한다.</li>
		<li>T175 플라스크로 옮기고 18mL의 배지를 추가합니다. 37°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.</li>
		<li>다음날, 세포를 분리하지 않고 유리 피펫으로 배지를 조심스럽게 흡인하십시오. 18mL의 새 배지로 교체합니다. 인큐베이터에서 하룻밤 동안 37°C에서 배양합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>바이러스 상청액 수확<ol><li>얼음 위에 놓인 피펫을 사용하여 바이러스 상청액을 제거합니다. 800 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 세포와 파편을 펠릿화합니다. 참고: 세포 펠릿이 크면 상층액을 제거할 때 플라스크에서 세포가 파열되었을 가능성이 있습니다. 이 세포는 새로운 플라스크에서 새로운 배지로 다시 도금 할 수 있습니다.</li>
		<li>0.22 μm 필터를 사용하여 바이러스 상청액을 여과합니다.</li>
		<li>바이러스 상청액을 즉시 사용하십시오. 얼음 또는 4°C에서 최대 24시간 동안 보관하거나 -80°C에서 냉동하여 장기간 보관할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 루시페라아제를 이용한 활성화된 인간 T 세포의 확장 및 형질도입
<ol><li>시험관 내에서 인간 T 세포의 활성화
	<ol><li>0.1% 소 혈청 알부민(BSA)과 2mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)을 함유하는 인산염 완충 식염수(PBS) 10mL를 멸균된 15mL 튜브에 첨가하여 비드를 세척하고, 비드(T 세포 2개당 비드 1개)를 추가하고, 자석 랙에 2분 동안 넣고, PBS를 흡입 꺼냈다.</li>
		<li>1.1.1 단계에 설명 된대로 배지를 준비한 다음 IL-2를 최종 농도 30 IU / mL에 추가하고 세척 된 비드를 추가합니다. T 세포 200만 개당 2.5mL의 배지를 만들어 활성화합니다.</li>
		<li>T 세포 (갓 정제된 또는 이전에 정제된, 냉동, 해동, 및 세척된)를 혈구계 및 트리판 블루 염색을 사용하여 계수한다. 단계 2.1.2에서 제조된 배지에 T 세포를 첨가하고 튜브를 부드럽게 뒤집어 혼합한다. T 세포는 세포의 출처 및 일반적인 건강 상태에 따라 최소 20배 확장됩니다. 마우스를 치료하는데 필요한 개수를 계산하고 20개로 나누어 활성화할 T 세포의 수를 결정한다. 여기서, 마우스당 20 x 106 T 세포를 예비 실험에 기초하여 사용하였다.</li>
		<li>24-웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 200만 T 세포, 비드 및 IL-2를 함유하는 배지 2.5mL를 플레이트에 넣었다. 가습된 5%CO2 인큐베이터에서 37°C에서 배양한다.</li>
		<li>다음 3일 동안 매일 20x 현미경으로 T 세포를 검사하여 루시페라아제로 형질도입할 시기를 결정합니다. 세포가 함께 뭉쳐서 배지를 고갈시켜 빨간색/분홍색에서 밝은 주황색으로 변할 때 준비가 된 것입니다.</li>
	</ol></li>
	<li>레트로넥틴 플레이트의 제조 참고: Retronectin은 유전자 형질도입을 향상시키기 때문에 형질도입에 사용되는 플레이트를 코팅하는 데 사용됩니다15.<ol><li>PBS에 20μg/mL 레트로넥틴 2mL를 처리되지 않은 6웰 플레이트의 웰에 추가합니다. 실온에서 2시간 또는 37°C에서 1시간 동안 배양합니다. 하나의 레트로넥틴-코팅된 웰은 200만 개의 T 세포가 형질도입될 때마다 필요하다.</li>
		<li>플레이트 바닥을 긁지 않고 retronectin을 흡인하십시오.</li>
		<li>6-웰 플레이트에 웰 당 PBS(멸균 여과)에 2% BSA 3mL를 추가합니다. RT에서 30 분 동안 배양하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>스피노툼<ol><li>플레이트 바닥을 긁지 않고 BSA를 흡인합니다.</li>
		<li>웰 당 3 mL의 PBS로 웰을 한 번 세척한다. 계속 또는 새로운 PBS로 교체하고 플레이트를 4°C에서 밤새 덮어 두십시오.</li>
		<li>웰당 2mL의 CBR-TDR 루시페라아제 바이러스 상청액(1.3단계에서 수집)을 추가합니다.</li>
		<li>32°C에서 90분 동안 1,240 x g 로 원심분리합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>변환<ol><li>T 세포를 셉니다.</li>
		<li>플레이트 바닥을 긁지 않고 바이러스 상청액을 흡인합니다.</li>
		<li>30 IU/mL 인간 IL-2를 함유하는 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM) 6 mL에서 웰당 200만 개의 T 세포를 플레이트합니다.</li>
		<li>매일 T 세포를 검사하십시오. T 세포는 거의 합류할 때, 보통 2일 후에 확장될 준비가 되어 있습니다.</li>
		<li>세포가 거의 융합되면 피펫을 사용하여 플레이트 바닥에서 부드럽게 씻어내고 각 웰을 별도의 T75 플라스크로 옮깁니다. 9mL의 배지를 추가하여 플라스크당 총 15mL의 배지를 만듭니다.</li>
		<li>다음 날 배지 15mL를 더 추가합니다. 세포는 배지를 첨가한 다음 날 생쥐에 주입할 준비가 되어 있어야 합니다. 유세포 분석을 수행하여 성공적인 형질도입을 확인합니다(루시페라아제 구조에는 PE 채널에서 볼 수 있는 TD 토마토 형광단이 포함되어 있음)16.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 면역저하 마우스에서 루시페라아제-형질도입된 T 세포의 생착
<ol><li>주입을 위해 T 세포를 준비하고 계수합니다.<ol><li>플라스크에서 T 세포를 제거하고 계산합니다. 세포는 일반적으로 활성화 후 7일째에 20x-30x 확장되면 주입할 준비가 됩니다.</li>
		<li>T 세포를 800 x g 에서 5분 동안 원심분리한다. 2mL의 배지에 재현탁하고 자석 랙을 사용하여 비드를 제거합니다.</li>
		<li>T 세포가 이중특이적 항체와 별도로 주입되는 실험의 경우, T 세포를 계수하고 최종 농도가 배지 100μL당 2,000만 T 세포가 되도록 재현탁합니다. 3.2단계로 건너뜁니다. 생체 외 무장 T 세포(EAT)를 사용한 실험의 경우 3.1.4단계로 건너뜁니다.</li>
		<li>생체 외 무장 T 세포를 사용한 실험의 경우, T 세포를 세고 각 그룹마다 개별 1.5mL 튜브로 분리하여 마우스당 2,000만 개의 세포를 사용합니다. 예를 들어, 각각 5마리의 마우스로 구성된 3개의 그룹이 있는 경우 각각 1억 개의 T 세포가 있는 3개의 1.5mL 튜브를 준비합니다.</li>
		<li>1.5mL 튜브를 800 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. T 세포 펠릿을 방해하지 않고 매체를 조심스럽게 제거합니다. 이중특이적 항체를 포함하는 배지 50μL 이하에서 재현탁합니다. RT에서 30분 동안 배양합니다. 참고: 이 연구에서 수행된 실험의 목적을 위해 실험실에서 생성된 독점적인 IgG-[L]-scFv T 세포 결합 이중특이적 항체가 사용되었습니다. T 세포 준비를 위해, 20 x 106 T 세포 당 5 μg의 항체를 사용한다. 시판되는 이중특이적 항체도 사용할 수 있다.</li>
		<li>각 튜브에 1,450μL의 배지를 추가하여 과잉 항체를 씻어냅니다. 800 x g 에서 5분 동안 원심분리하고, 배지를 조심스럽게 흡인하고, 100μL 배지당 2,000만 개의 무장 T 세포 농도로 재현탁합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>생쥐에 주입 및 생착<ol><li>1L/min 산소에 3.5%(v/v) 흡입 이소플루란을 공급하는 챔버에서 마우스를 마취합니다. 마우스는 뒷다리 페달 철수 반사가 사라졌을 때 완전히 마취됩니다. 알림: 절차 전반에 걸쳐 열 지원을 제공하십시오.</li>
		<li>26G 바늘을 사용하여 마우스당 100μL의 배지에 2천만 개의 T 세포를 안와후로 주입합니다.</li>
		<li>생체 내에서 T 세포 생존을 지원하기 위해 1,000U 재조합 IL-2를 피하 투여합니다.</li>
		<li>이중특이적 항체를 안와후(T 세포 주입에 사용되지 않는 눈 내로) 또는 복강내로 투여한다. 생쥐가 마취에서 회복하고 새장으로 돌아갈 수 있도록하십시오. 참고: 여기서도 실험실에서 생성된 독점 항체가 사용되었지만 상업적으로 이용 가능한 항체를 대신 사용할 수 있습니다. 여기의 실험에서, 투여량당 마우스당 0.3-10 μg의 항체를 투여하였다. 항체는 3-4주 동안 일주일에 두 번 투여되었습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>4. 루시페라아제 형질도입 T 세포가 생착된 마우스의 생체 내 이미징
참고: 이 단계는 이미징 당일에 수행되어야 하며, T 세포 및/또는 항체가 마우스에 투여되는 날과 반드시 같은 날은 아닙니다. 전형적으로, 우리는 루시페라아제-형질도입된 T 세포의 투여 후 24시간 후에 이미징을 수행합니다.
<ol><li>D-루시페린의 제조<ol><li>D-루시페린 1g을 멸균 PBS 33.3mL(최종 농도: 30mg/mL)에 녹입니다.</li>
		<li>용해된 D-루시페린을 33 x 1.5 mL 미세원심분리기 튜브에 분취하여 튜브를 -20°C로 유지합니다.</li>
		<li>이미징 당일, 이미징할 동물의 수에 대해 30mg/mL D-루시페린의 충분한 분취량을 해동합니다. 하나의 튜브로 10 마리의 동물에게 충분합니다. 알림: 사용 후 남은 D-루시페린을 다시 얼리십시오. D-루시페린은 최소 5번의 동결/해동 주기 동안 안정적입니다.</li>
	</ol></li>
	<li>생쥐에 D-루시페린 투여 참고: D-루시페린을 마우스에 투여하기 전에 이미징 소프트웨어를 열고 시스템을 초기화하십시오. 카메라는 냉각하는 데 몇 분이 걸릴 수 있으며, 이는 마우스에 D-luciferin을 주입하기 전에 수행되어야 기판 투여 후 5분 후에 이미징이 이루어질 수 있습니다.<ol><li>1L/min 산소에 3.5%(v/v) 흡입 이소플루란을 공급하는 챔버에서 최대 5마리의 마우스를 마취합니다. 마우스는 뒷다리 페달 철수 반사가 사라졌을 때 완전히 마취됩니다.</li>
		<li>마우스가 완전히 마취되면 26G 바늘로 안와 후 주사로 마우스당 30mg/mL D-루시페린 100μL(마우스당 3mg)를 투여합니다. D-luciferin을 다음 그룹에 투여하기 전에 이 마우스 그룹을 이미지화합니다. 다음 그룹의 마우스를 이소플루란 챔버에 넣어 이전 그룹이 이미징되는 동안 마취합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>루시페라아제 형질도입된 T 세포 이미징<ol><li>마취된 마우스를 이미저의 기밀 챔버로 옮기고 0.5L/min에서 3% 이소플루란을 계속 투여합니다. 이종 이식편을 지탱하는 측면이 카메라를 향하도록 마우스를 옆으로 눕힙니다. 마우스를 앙와위 자세로 사용하여 폐의 T 세포 존재를 평가하기 위해 또 다른 이미지 세트를 촬영합니다.</li>
		<li>획득 제어판을 사용하여 발광(Luminescent), 사진(Photograph) 및 오버레이(Overlay)를 선택합니다. 노출 시간을 자동으로, 비닝을 중간으로, F/정지를 1로 설정합니다. 이미지를 획득합니다. 첫 번째 이미지 이후에는 첫 번째 이미지에 대해 자동으로 계산된 노출 시간과 일치하도록 노출 시간을 설정하여 후속 이미지를 직접 비교할 수 있습니다. 픽셀 채도 없이 가장 밝은 신호를 얻기 위한 최적의 노출 시간을 결정하기 위해 여러 노출 시간으로 이미지를 캡처하는 것이 유용할 수 있습니다.</li>
		<li>이소플루란에서 생쥐를 제거하고 새장으로 돌아가 깨어 있고 걸을 수 있을 때까지 관찰합니다.</li>
		<li>모든 그룹이 이미지화될 때까지 4.2.1단계부터 단계를 반복합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Rabinovich, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+fewer+than+10+mouse+T+cells+with+an+enhanced+firefly+luciferase+in+immunocompetent+mouse+models+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Visualizing fewer than 10 mouse T cells with an enhanced firefly luciferase in immunocompetent mouse models of cancer.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (38), 14342-14346 (2008).</li>
<li>Skovgard, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+CAR+T-cell+kinetics+in+solid+tumors%3A+Translational+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+Oncolytics%22%5BJournal%5D)">Imaging CAR T-cell kinetics in solid tumors: Translational implications.</a> Molecular Therapy Oncolytics. 22, 355-367 (2021).</li>
</ol>

NKC는 Y-mAbs Therapeutics로부터 상업 연구 보조금을 받았다고 보고했습니다. NKC는 MSK가 Y-mAbs Therapeutics, Biotec Pharmacon/Lallemand 및 Abpro-labs에 라이선스를 부여한 특허의 발명가이자 소유자입니다. MSK와 NKC는 Y-mAb에 재정적 이해관계가 있습니다. NKC는 Eureka Therapeutics로부터 스톡 옵션을 받았다고 보고합니다. HFG 및 MEC에는 관련 공개가 없습니다.

T-BsAb 블리나투모맙이 CD19 양성 혈액 악성 종양에 대해 승인되었지만 고형 종양에서 T-BsAb를 성공적으로 구현하는 것은 훨씬 더 어려운 것으로 입증되었습니다. 상피세포 부착 분자(EPCAM)에 대한 T-BsAb인 카투막소맙(Catumaxomab)은 난소암 환자의 악성 복수 치료제로 승인되었으나, 이후 상업적 이유로 약물 생산이 중단되었다19. 다른 T-BsAb는 고형 종양에 대해 승인되지 않았으며, 이는 이러한 유형의 치료와 관련된 문제를 강조합니다. 사이토카인 방출 증후군(CRS)으로 인한 독성은 일반적인 문제이지만 스테로이드와 사이토카인 억제제로 관리할 수 있습니다. 독성 외에도 고형 종양에 대한 T-BsAb 시험에서 효능 부족이 일반적입니다. 종양에서 T 세포 밀매 및 지속성을 유도하는 것은 TME14의 다양한 면역억제 인자로 인해 어려운 것으로 입증되었습니다. 그러나 전임상적으로도 시험관 내에서 우수한 성능을 ...

T 세포 참여 이중특이적 항체(T-BsAbs)는 하나의 결합 아암을 통해 T 세포를 결합시키고 다른 결합 아암을 통해 종양 항원을 결합시킴으로써 다클론 T 세포에 인공 특이성을 제공하는 데 사용되는 조작된 항체입니다. 이 기술은 혈액암(CD19 표적 블리나투모맙1)에 성공적으로 적용되었으며, 수많은 T-BsAb가 다양한 고형 종양에 대한 전임상 및 임상 개발 중에 있습니다2. T-BsAbs는 주요 조직적합성 복합체(MHC)와 무관한 방식으로 다클론 T 세포에 관여하므로 인간 백혈구 항원(HLA)을 하향 조절하는 종양도 이러한 유형의 치료에 취약합니다 3,4. T-BsAbs는 T 세포와 종양 결합군의 원자가 및 공간 배열, 도메인 간 거리, 반감기에 영향을 미치고 존재하는 경우 이펙터 기능을 유도할 수 있는 Fc 도메인의 포함에 차이가 있는 수십 가지 다양한 형식으로 개발되었다5. 본 연구실의 이전 연구에서는 이러한 요인들이 T-BsAb의 항종양 효능에 상당한 영향을 미치며, 효능 차이는 최대 1,000배에 달하는 것으로 나타났다6. 이 작업을 통해 우리는 IgG-[L]-scFv 형식이 T-BsAb에 이상적인 플랫폼임을 확인했으며(T-BsAb 형식에 대한 자세한 내용은 대표 결과 섹션 참조), 이 플랫폼을 GD2(신경모세포종), HER2(유방암 및 골육종), GPA33(결장직장암), STEAP1(유잉 육종), CD19(B 세포 악성 종양) 및 CD33(B 세포 악성 종양)7, 8,9,10,11,12,13.
고형 종양에서 T-BsAb 요법을 성공적으로 시행하기 위한 주요 과제 중 하나는 면역억제 종양 미세환경(TME)을 극복하여 종양으로의 T 세포 이동을 유도하는 것입니다14. 상술한 T-BsAb 효능에 영향을 미치는 인자는 종양에 대한 T 세포 귀환을 효과적으로 유도하는 T-BsAb의 능력에 상당한 영향을 미치지만, 이 효과는 생체 내 시스템에서 실시간으로 평가하기 어렵다. 이 원고는 치료 중 실험적 면역저하 마우스 모델에서 다양한 조직으로의 T 세포 이동을 평가하기 위해 T-BsAb의 전임상 연구에서 루시페라아제-형질도입된 T 세포의 사용에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 이 방법의 전반적인 목표는 치료 중 동물을 희생할 필요 없이 종양 및 기타 조직에서 T 세포 침윤을 평가할 수 있는 수단뿐만 아니라 T 세포 귀환 동역학 및 지속성에 대한 실시간 통찰력을 제공하는 것입니다. 세포 면역 요법에 중점을 둔 연구자의 수가 증가함에 따라 전임상 동물 모델에서 생체 내에서 T 세포를 추적하는 능력이 중요합니다. 우리는 다른 연구자들이 이 기술을 쉽게 복제할 수 있도록 루시페라아제 형질도입 T 세포를 추적하기 위해 사용한 방법에 대한 철저하고 상세한 설명을 제공하는 것을 목표로 합니다.

<table><tbody><tr><td>293T 세포</td>, <td>ATCC</td>, <td>CRL-11268</td><td></td></tr>, <tr><td>BSA,</td><td>시그마, 알드리치</td><td>, A7030-10G</td><td></td></tr><tr><td>, CD3/CD28, 비드,</td><td>Gibco(ThermoFisher)</td><td>11161D</td><td></td></tr><tr><td>, D-루시페린, 칼륨염</td>, <td>Goldbio,</td><td>LUCK-1G</td><td></td>,</tr><tr><td>DMEM</td>, <td>Gibco(ThermoFisher)</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>DNA in vitro transfection 시약(폴리젯)</td><td>SignaGen Laboratories</td><td>SL100688</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E9884-100G</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco (ThermoFisher)</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>Gag/pol plasmid</td><td>Addgene</td><td>14887</td><td></td></tr><tr><td>GFP plasmid</td><td>Addgene</td><td>11150-DNA.cg</td> Penicilin-Streptomycin Gibco (ThermoFisher)15140122 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 IL-2</td><td>R& D Systems</td><td>202-IL-010/CF</td><td></td></tr><tr><td>Retronectin</td><td>Takara</td><td>T100B</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco (ThermoFisher)</td><td>25-300-120</td><td></td></tr><tr><td>VSV-G 플라스미드</td><td>Addgene</td><td>8454</td><td></td></tr></tbody></table>

루시페라아제 형질도입된 인간 t 세포를 이용한 이중특이적 항체 유도 t 세포 트래피킹 추적

Tracking Bispecific Antibody-Induced T Cell Trafficking Using Luciferase-Transduced Human T Cells

T 세포 참여 이중특이성 항체(T-BsAbs)는 고형 종양에 대한 전임상 개발 및 임상 시험의 다양한 단계에 있습니다. 원자가, 공간 배열, 도메인 간 거리 및 Fc 돌연변이와 같은 요인은 일반적으로 T 세포가 종양으로 귀환하는 데 영향을 미침으로써 이러한 치료법의 항종양 효능에 영향을 미치며, 이는 여전히 주요 과제로 남아 있습니다. 여기에서는 활성화된 인간 T 세포를 루시페라아제로 형질도입하여 T-BsAb 요법 연구 동안 T 세포를 생체 내 추적할 수 있는 방법을 설명합니다. T 세포를 종양으로 리디렉션하는 T-BsAbs의 능력은 치료 중 여러 시점에서 정량적으로 평가될 수 있으므로 연구자들은 T-BsAb의 항종양 효능 및 기타 개입을 종양에서 T 세포의 지속성과 연관시킬 수 있습니다. 이 방법은 T 세포 침윤을 조직학적으로 평가하기 위해 치료 동안 동물을 희생할 필요성을 완화하고, 치료 중 및 치료 후에 T 세포 밀매의 동역학을 결정하기 위해 여러 시점에서 반복될 수 있습니다.

단계 4.3에 기술된 바와 같이, 마우스는 상이한 조직에서의 T 세포의 존재를 평가하기 위해 영상화 동안 상이한 위치에 배향될 수 있다. 앙와위 자세는 폐의 T 세포를 평가할 수 있게 하며, 이는 주사 후 초기 시점에서 일반적입니다. 피하 이종이편이 위를 향하도록 하는 측면 위치는 종양으로의 T 세포 이동을 가장 잘 평가하는 데 사용됩니다. 암컷 C.Cg-Rag2 tm1Fwa Il2rgtm1Sug/JicTac 마우스를 본 원고에 기재된 모든 실험에 사용하였다. 그림 1은 GD2 양성 이종이식 보유 마우스에 GD2 BsAb 또는 루시페라아제 형질도입 T 세포와 별도로 주사된 GD2 BsAb로 무장한 루시페라아제 형질도입 T 세포 중 하나를 처리한 실험의 이미지를 보여줍니다17. 그림 1A는 무장한 T 세포가 비무...

여기에서 우리는 T 세포 참여 이중특이적 항체의 항종양 효능 및 메커니즘을 평가하기 위한 연구에서 종양에 대한 이중특이적 항체 유도 T 세포 이동의 생체 내 추적을 용이하게 하기 위해 인간 T 세포를 루시페라아제로 형질도입하는 방법을 설명합니다.

루시페라아제 형질도입된 인간 T 세포를 이용한 이중특이적 항체 유도 T 세포 트래피킹 추적

T cell-engaging bispecific antibodies (T-BsAbs) are in various stages of preclinical development and clinical testing for solid tumors. Factors such as ...

이 방법을 통해 사용자는 생체 내에서 T 세포를 쉽게 추적하여 귀환 동역학을 평가하고 T 세포 지속성을 모니터링할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 유세포 분석이나 면역조직화학에서 희생할 필요 없이 동일한 동물에서 여러 시점에서 반복될 수 있다는 것입니다. 이 기술은 다른 유형의 면역 세포도 추적하기 위해 수정될 수 있습니다.293T 세포를 배양하기 위해, 110 밀리리터의 열-불활성화 태아 소 혈청 및 11 밀리리터의 페니실린 스트렙토마이신을 첨가하여 1 리터의 DMEM을 준비한다. 6번째 293T 세포를 10회 5회 해동하고 DMEM이 포함된 T175 플라스크에 옮깁니다. 세포가 90% 이상 융합되기 전에 6일 동안 3일마다 세포를 1-10개로 분할합니다.트랜스펙션의 경우 피펫을 사용하여 1.5 밀리리터의 배지를 두 개의 50 밀리리터 튜브에 옮깁니다. 하나의 튜브에 10 마이크로그램의 VSVG 플라스미드, 20 마이크로그램의 개그 폴, 20 마이크로그램의 클릭 딱정벌레 레드 TDtomato 또는 CBRTDR 루시페라아제 플라스미드를 첨가하고 혼합합니다. 100 마이크로리터의 DNA in vitro transfection 시약을 다른 튜브에 첨가하고 혼합한다.두 튜브를 실온에서 5분 동안 배양합니다. 시험관내 형질주입 시약을 함유하는 배지를 DNA 플라스미드가 들어 있는 튜브에 적하하고 피펫으로 부드럽게 혼합한다. 실온에서 20 분 동안 배양하십시오.배양 중에 0.05% 트립신 5-10밀리리터를 첨가하여 293T 세포를 분리합니다. 세포가 분리되면 10 밀리리터의 배지를 추가하고 800G에서 5 분 동안 원심 분리합니다. 1.5 밀리리터의 배지에서 세포를 다시 일시 중단하십시오.DNA 시험관내 형질주입 시약 및 DNA 플라스미드를 함유하는 배지를 293T 세포에 첨가하고, 섭씨 37도에서 30분 동안 인큐베이션한다. 배양 후, 현탁액을 T175 플라스크로 옮긴다. 18 밀리리터의 배지를 넣고 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다.다음날, 세포를 분리하지 않고 유리 피펫으로 배지를 조심스럽게 흡인하고 18 밀리리터의 신선한 배지로 교체하십시오. 다시 말하지만, 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다. 다음날, 얼음 위에 놓은 피펫을 이용하여 바이러스 상층액을 제거하고 800G에서 5분 동안 원심분리하여 세포와 파편을 펠릿화하였다.0.22 미크론 필터를 사용하여 바이러스 상청액을 여과하고 즉시 얼음 위에 놓습니다. 인간 T 세포의 시험관 내 활성화를 위해, 0.1% 소 혈청 알부민 또는 BSA 및 2밀리몰 EDTA를 함유하는 PBS 10밀리리터를 멸균된 15밀리리터 튜브에 첨가한다. 그런 다음 구슬을 씻으려면 구슬을 튜브에 넣고 튜브를 마그네틱 랙에 넣습니다.2분 후, 튜브로부터 PBS를 제거한다. DMEM을 준비한 후, 세척 된 비드와 인터루킨 -2 또는 IL-2를 밀리리터 당 30 국제 단위의 최종 농도로 첨가한다. T 세포를 헤모세포분석기 및 트리판 블루 염색을 이용하여 계수하였다.계수 후 원하는 수의 T 세포를 배지에 추가하고 튜브를 부드럽게 뒤집어 혼합합니다. 24-웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 200만 개의 T 세포, 비드 및 IL-2를 함유하는 배지 2.5밀리리터를 플레이트에 넣었다. 섭씨 37도에서 가습 된 5 % 이산화탄소에서 배양하십시오.루시페라아제로 형질도입할 시기를 결정하기 위해 3일 동안 매일 20X 대물렌즈 하의 T 세포를 검사합니다. 다음으로, RetroNectin 플레이트를 준비하기 위해, PBS 중의 20 마이크로그램 RetroNectin 2밀리리터를 처리되지 않은 6웰 플레이트의 웰에 첨가하고 실온에서 2시간 동안 배양한다. 플레이트 바닥을 긁지 않고 RetroNectin을 흡인하고 6웰 플레이트에 웰당 PBS에 2% BSA 3밀리리터를 추가합니다.실온에서 30 분 동안 배양하십시오. 다음으로, spinoculation을 위해, BSA를 흡인하고 PBS의 3 밀리리터로 우물을 한 번 세척한다. 계속하거나 새 PBS로 교체하고 플레이트를 섭씨 4도에서 밤새 덮어 둡니다.다음날, 웰 당 2 밀리리터의 CBRTDR 루시페라아제 바이러스 상청액을 첨가하고, 섭씨 32도에서 90 분 동안 1, 240 G에서 원심 분리한다. 형질도입을 위해, T 세포를 계수한 후, 바이러스 상청액을 흡인하고, 인간 IL-2의 밀리리터당 30개의 국제 단위를 함유하는 DMEM의 6밀리리터에서 웰 당 200만 개의 T 세포를 플레이트한다. 이틀 동안 T 세포를 검사한다.세포가 거의 융합되면 피펫을 사용하여 플레이트 바닥에서 부드럽게 씻어내고 각 웰을 별도의 T75 플라스크로 옮깁니다. 플라스크당 총 15밀리리터 부피의 배지 9밀리리터를 추가합니다. 다음날 15 밀리리터의 배지를 추가하고 유세포 분석을 수행하여 성공적인 형질 도입을 확인합니다.마우스를 마취한 후, 26 게이지 바늘을 사용하여, 2,000만 개의 T 세포를 100 마이크로리터의 배지에 후안와적으로 주입한다. 생체 내에서 T 세포 생존을 지원하기 위해 1, 000 단위의 재조합 IL-2를 피하 투여한다. 그런 다음 이중특이적 항체를 후안와내 또는 복강내로 투여합니다.생체 내 이미징을 위해 마취된 마우스에 26게이지 바늘로 안와후 주사하여 3밀리그램의 D-루시페린 100마이크로리터를 투여합니다. 이미지를 캡처하려면 이종이식 베어링이 있는 측면이 카메라를 향하도록 이미저의 빛이 새지 않는 챔버에 마우스를 놓습니다. 획득 제어판을 사용하여 발광, 사진 및 오버레이를 선택합니다.노출 시간을 자동으로, 비닝을 중간으로, f-스톱을 1로 설정하여 이미지를 획득합니다. 첫 번째 이미지 이후에는 첫 번째 이미지에 대해 자동으로 계산된 노출 시간과 일치하도록 설정하여 후속 이미지를 직접 비교할 수 있습니다. 폐에서 T 세포 존재를 평가하기 위해 마우스 앙와위로 또 다른 이미지 세트를 촬영합니다.무장한 T 세포는 비무장 T 세포보다 더 빨리 종양으로 이동하여 이틀 더 빨리 폐를 떠났습니다. 시간 경과에 따른 종양 내로의 T 세포 침윤의 정량화는 생물발광에 의해 측정되었고, 종양 윤곽에 걸쳐 통합된 픽셀당 총 무리 또는 광도로서 표현되었다. T 세포 트래피킹은 루시페라아제-형질도입된 T 세포의 주입 후 28일 동안 모니터링될 수 있었고, 치료 전반에 걸쳐 T 세포 귀환 및 지속성을 추적할 수 있었다.DKO 마우스에서 HER2 양성 인간 유방암 환자 유래 이종이식편으로의 T 세포 트래피킹이 도시되어 있다. 침묵되지 않은 FC를 사용한 HER2 이중특이적 항체에 의한 처리는 대조된 이중특이적 항체에 비해 종양 성장에 영향을 미치지 않았다. 대조적으로, N297A 돌연변이를 단독으로 또는 K322A 돌연변이와 조합하여 포함하는 HER2 이중특이성 항체로 처리하면 종양 성장을 완전히 정지시킬 수 있었습니다.침묵 돌연변이가 있는 그룹의 경우, T 세포 발광 신호는 주사 후 3일째에 더 높은 피크에 도달했고, 대조된 이중특이적 항체 및 침묵되지 않은 HER2 이중특이적 항체와 비교하여 더 높은 수준으로 지속되었습니다. 신경모세포종 환자 유래 이종이식편을 보유한 마우스는 Ly6C 양성 대식세포의 고갈이 종양에 대한 T 세포 귀환을 유의하게 증가시켜 종양 성장을 감소시키고 생존을 연장하는 것으로 나타났습니다. 그 효과는 골육종 환자 유래 이종이식편에서 더 두드러졌다.종양 항원 STEAP1을 표적으로 하는 이중특이적 항체 중에서, IGGL SCFV 형식은 치료 기간 동안 지속되는 T 세포의 첫 번째 투여 후 6일째에 유의하게 더 많은 T 세포 침윤을 초래했습니다. 이러한 관찰은 시험관내 세포독성 분석에 의해 예측되지 않았다. 생체 내에서 T 세포를 추적한 후에도 사용자는 면역조직화학을 수행하여 T 세포가 종양 또는 기타 정상 조직 내에서 어디에 위치하는지 보다 구체적으로 결정할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

손쥐 골수 이식은 인간에 이식 - 대 - 호스트 질병에 관한 면역 메커니즘을 연구 할 수있는 널리 사용되는 기술이다. T 세포 거래 패턴을 모니터링 할 수있는...

이식 - 대 - 호스트 질병의 유도 및<em&gt; 생체 내</emMHC 검색 손쥐 모델을 사용&gt; T 셀 모니터링

따라서, 그것이 관여 단백질의 공간적 및 시간적 행위를 파악하는 것이 중요 신호 전달 이해하기 위해, 플라즈마 막 내에서 또는 세포 내 위치에 두 단백질의 compartmentalization 크게 신호 결과에 영향을 미칠 수있는 규제 메커니즘입니다. 우리는 여기서 T 세포의 신호 전달을 연구하는 TIRF 현미경 기반 시스템을 설명하지만, 광범위하게 적용됩니다.

실시간, TCR의 동시 이미징 및 관련 신호 전달 단백질에 대한 TIRF 현미경 기법

이 비디오는 마우스 모델에서 종양으로의 이중특이성 항체 유도 T 세포 이동을 추적하는 방법을 보여줍니다. 루시페라아제(Luciferase)에 의해 형질도입된 effector T 세포를 피하 종양 세포 이종이식편을 통해 마우스에 주입합니다. 그런 다음 이중특이성 항체를 도입하여 T 세포와 종양 세포에 결합합니다. T 세포의 국소화는 생물 발광 이미징을 사용하여 추적되며, 신호의 크기는 T 세포가 종양으로 침투하는 정도를 나타냅니다.

종양에 대한 이중특이성 항체 유도 T 세포 이동을 추적하는 In Vivo 기술

우리는 T 세포 활성화 과정 중에 단백질 역학에 대한 통찰력을 제공하는 라이브 세포 이미징 방법을 설명합니다. 우리는 정량적 인 결과는 T 세포 활성화에 걸쳐 복잡한 형성 신호를 따라 열매를 산출하는 T 세포의 확산 분석, 공 촛점 현미경 및 이미징 분석의 결합 사용을 보여줍니다.

T 세포의 실시간 라이브 영상은 복잡한 형성을 신호

세포 침전 매니폴드/슬라이드 장치를 사용하여 시험관 내에서 비부착 면역 세포의 방사상 이동성을 모니터링하는 프로토콜을 설명합니다. 세포 이동은 종양 세포의 단층 또는 세포외 기질 단백질에서 추적됩니다. 광학 및 형광 현미경에 의한 검사를 통해 세포 이동성 및 세포 독성 기능을 관찰할 수 있습니다.

레이디 얼 이동성 및 레트로 바이러스 복제 벡터 형질 도입, 비 접착 Alloresponsive T 림프구의 세포 독성 기능

형질 전환 쥐 T 세포 수용체에 결합하는 64의 Cu 변성 모노클로 날 항체의 제조에 이어 T 세포 생존, 기능, 표시 안정성과 세포 사멸 분석, 생체 내에서 방사성 표지하고, 적응 적기도 지연 형 과민 쥐에 옮기고 양전자 방출 단층 촬영 / 컴퓨터 단층 촬영 (PET / CT)에 의해 비 침습성 영상화 대한 반응.

에 의해 쥐 림프구 라벨링<sup&gt; (64)</sup&gt; CU-항체 수용체는 대한 타겟팅<em&gt; 생체</em&gt; PET / CT에 의한 세포 트래 피킹

림프 구 chemotaxis 및 마이그레이션에 대 한 양적 평가 대 한 프로토콜은 면역학 연구를 위한 중요 한 도구입니다. 여기, 생체 외에서 프로토콜 허용 실시간, 다중화 세포 이동의 평가 뿐만 아니라 상호 보완적인 vivo에서 기술 활성화 추적 기본 셀의 비장에 설명 되어 있습니다.

인간 Monocyte Chemotaxis에서 생체 외에서 그리고 Vivo에서 인신 매매 Murine 림프 구 측정

여기, 우리가 현재 생산과 retroviral 변환 및 또는 lymphodepleting 없이 BALB/c 마우스에서 설립된 syngeneic A20 B-세포 림프 종에 대 한 치료로 활용 하 여 murine CD19 차 T 세포의 전 임상 시험에 대 한 프로토콜 미리 컨디셔닝.

CD19 자동차 T 세포의 전 임상 평가 위한 Syngeneic 마우스 B-세포 림프 종 모델

이 프로토콜은 임상적으로 이용가능한 플랫폼으로 생체내에서 키메라 항원 수용체를 발현하도록 유전적으로 조작된 T 세포를 비침습적으로 추적하는 방법론을 기술한다.

키메라 항원 수용체 T 세포의 동적 이미징 [18F]테트라플루오로보레이트 양전자 방출 단층 촬영/컴퓨터 단층 촬영

이 프로토콜은 정량 분석을 통해 특정 환경 조건에서 T 세포 이동의 일차 쥐 T 세포 분리 및 타임 랩스 현미경 검사 방법을 제공합니다.

일차 쥐 CD8+ T 세포에 대한 Real-Time In Vitro Migration Assay

우리는 수용체 매개 장기 및 미세환경 특이적 림프구 위치를 연구하기 위해 트래픽 수용체의 레트로바이러스 전달과 경쟁적 귀환을 위한 개선된 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 면역 세포 이동 메커니즘에 대한 귀중한 통찰력을 제공하며 향후 기초 및 치료 연구에 잠재적으로 응용될 수 있습니다.

다양한 조직 미세환경에서 GPCR 매개 T 세포 국소화 연구를 위한 효율적인 레트로바이러스 형질도입 및 경쟁력 있는 호밍(Competitive Homing)

학습하세요 루시페라아제 형질도입된 인간 T 세포를 이용한 이중특이적 항체 유도 T 세포 트래피킹 추적 방법을. 이 기술은 종양으로의 T 세포 이동을 비침습적으로 실시간 모니터링하여 항암 면역 치료 효능을 평가하는 데 활용됩니다.

루시페라아제 형질도입된 인간 T 세포를 이용한 이중특이적 항체 유도 T 세포 트래피킹 추적

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