Name: 바이러스 동시 감염 시 콜로니자에서 병원체로 Streptococcus pneumoniae 의 전환을 위한 마우스 모델은 연령 악화 질병을 요약합니다. (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-28T14:15:00.000+00:00
Duration: 12 min 21 s
Description: 학습하세요 바이러스 동시 감염 시 폐렴구균이 병원체로 전환되는 과정을 마우스 모델로 연구하는 방법을. 노화된 숙주의 감수성을 재현하여 면역 반응과 치료 표적을 탐색할 수 있습니다.

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이 원고를 비판적으로 읽고 편집해 주신 Nick Lenhard에게 감사드립니다. 또한 박테리아 균주에 대해 Andrew Camilli와 Anthony Campagnari에게, 바이러스 균주에 대해 Bruce Davidson에게 감사드립니다. 이 작업은 국립 보건원 보조금(R21AG071268-01)에서 JL로, 국립 보건원 보조금(R21AI145370-01A1), (R01AG068568-01A1), (R21AG071268-01)에서 E.N.B.G.로 지원했습니다.

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저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

기존의 S. pneumoniae/IAV 동시 감염 실험 연구의 대부분은 IAV에 사전 감염된 마우스의 폐로의 박테리아 전달에 의존합니다. 이러한 모델은 숙주를 2차 세균 감염에 취약하게 만드는 폐 환경 및 전신 면역 반응의 변화를 식별하는 데 도움이 되었습니다 15,16,17,32,33,34,35,36,37. 그러나 이러한 모델은 S. pneumoniae가 무증상 식민지 개척자에서 심각한 폐 및 전신 감염을 일으킬 수 있는 병원체로의 전환을 모방하는 데 실패했습니다. 또한, 이들 모델은 감염에 대한 감수성에 기여하는 상부 호흡기에서 숙주 인자 및 숙주-병원체 상호작용을 연구하는 데 적합하지 않습니다. IAV 감염 후 비인두에서 폐로 폐렴구균의 이동에 대한 이전 모델은 비인두의 세균 감염에 이어 바이러스 감염에 의존했습니다. 그러나, 인간 환자에서 관찰된 심각한 질환 징후를 재현하지 못했다21. 여기에 설명된 변형된 쥐 감염 모델은 S. pneumoniae가 무증상 보균에서 심각한 임상 질환을 유발하는 병원체로의 전환을 요약합니다.
이 모델의 중요한 단계는 비인두에서 S. pneumoniae 감염을 확립하는 것입니다. Streptococcus pneumoniae는 생물막을 형성하고 다른 효율로 비 인두를 식민지화합니다21,38. 지속적인 감염을 확립하기 위해서는 지금까지 시험한 생물막 성장 박테리아 균주 중 최소 5 ×10 6 CFU가 필요하다23. 새로운 박테리아 균주는 바이러스 감염 전에 비 인두의 안정적인 감염에 대해 테스트하는 것이 좋습니다. 바이러스 동시 감염의 경우, 이전 연구에서는 비 인두에서 박테리아의 분산을 위해 IAV에 의한 비강 내 감염이 필요하다는 것을 발견했습니다21,22,23. 이전 연구에서는 비강 내 전달을 위해 500 PFU의 IAV가 사용되었지만 이 연구에서는 200 PFU가 비인두의 박테리아 수를 증가시키기에 충분했습니다. IAV 감염은 상기도에 국한되지 않고 폐로 퍼질 수 있으며(39,40), 이는 폐 환경을 세균 감염에 대해 더 관대하게 만드는 데 핵심이다(15,16,41). IAV의 폐로의 전달은 마취된 마우스의 비강내 전달 또는 기관내 설치에 의해 달성될 수 있다. BALB/cByJ 마우스를 사용한 이전 연구에서 비강 내 전달이 바이러스성 폐렴을 유발한다는 사실이 밝혀졌습니다21; 그러나 비강 내 접종 후 폐에 대한 접종물의 접근은 C57BL/6 마우스에서 더 제한적입니다. C57BL/6 마우스에서는 바이러스의 일관된 전달을 위해 기관 내 설치가 필요하다23. 이 모델에서, 이전의 박테리아 집락화는 바이러스 감염 후 질병 증상의 발현을 가속화한다23. 바이러스 감염 자체가 동역학의 잠재적인 변화와 함께 질병 증상을 유발할 수 있으므로 먼저 테스트된 새로운 바이러스 균주에 대해 다양한 용량을 테스트하고 동시 감염된 숙주에서 가속화된 동역학을 나타내는 용량을 선택하는 것이 좋습니다.
폐는 이 모델에서 질병 평가를 위한 또 다른 중요한 판독값을 제공합니다. 병원균 부담 및 면역 세포 유입을 평가하기 위해 동일한 마우스의 폐를 사용할 수 있습니다. 그러나 감염과 염증의 중증도는 엽마다 다를 수 있으므로 다양한 평가를 위해 동일한 폐의 다른 엽을 복용하지 않는 것이 좋습니다. 오히려, 모든 로브는 작은 조각으로 다져지고, 함께 잘 섞인 다음, 다른 평가를 위해 동등하게 구문 분석 될 수 있습니다. 유사하게, 비 인두는 박테리아 CFU 또는 바이러스 PFU 및 면역 반응의 열거에 사용될 수 있습니다. 그러나, 세척 및 조직으로부터 얻어진 세포의 수가 너무 적기 때문에 동일한 그룹 내의 마우스로부터 샘플을 풀링하지 않고 유세포 분석을 수행할 수 없다. 대안적으로, 비인두의 염증은 조직학적으로 평가될 수 있다23.
이 모델의 중요한 특징은 환자에서 볼 수 있는 임상 질병을 요약한다는 것입니다. 인간의 경우, IAV 감염 후 이차성 폐렴구균성 폐렴은 종종 입원, 호흡 부전, 심지어 사망으로 이어질 수 있는 기침, 호흡곤란, 발열 및 근육통을 포함한 명백한 질병의 징후를 초래한다 8,15,42,43. 이 모델은 생쥐가 보여주는 호흡 곤란(호흡 점수에 반영됨) 및 전반적인 불쾌감(자세 및 움직임 점수에 반영됨) 측면에서 인간에서 관찰되는 임상 질병의 심각한 징후와 일부 건강한 젊은 대조군의 사망을 요약합니다. 동시 감염된 마우스에서 악화된 질병 증상은 폐에 박테리아가 전파되고 폐렴구균 운반이 있는 마우스에서 바이러스 제거가 손상된 결과일 가능성이 높다23. 모델의 한계는 비인두에서 임상 질환 및 박테리아 전파의 발생률이 마우스마다 다르며 박테리아 균주, 숙주 연령 및 유전자형의 영향을 받는다는 것입니다21,22,23. 이를 반영하여 침습성 균주의 경우 국소 감염(검출 가능한 균혈증 없음)에서 사망으로의 진행이 24시간 이내에 발생할 수 있습니다. 따라서 전신 확산에 대한 진정한 평가를 위해서는 더 짧은 간격 (6-12 시간마다)에 걸쳐 균혈증을 추적해야합니다. 유사하게, 질병 점수는 특히 동시 감염 후 처음 72시간 동안 빠르게 변할 수 있습니다. 따라서 질병 증상을 면밀히 추적하려면 IAV 감염 후 1-3 일 동안 하루에 세 번 마우스를 모니터링하는 것이 좋습니다.
요약하면, 이 모델은 비인두의 무증상 집락자에서 IAV 감염 시 폐 및 전신 질환을 유발할 수 있는 병원체로 S. pneumoniae 의 이동을 복제합니다. 이 모델에서 IAV는 비인두의 박테리아 행동을 수정하고, 폐로의 박테리아 확산을 증가시키고, 항균 면역을 변경하여 S. pneumoniae 의 전이를 유발합니다23. 유사하게, 박테리아 운반은 항바이러스 면역 반응을 둔화시키고 폐에서 IAV 제거를 손상시킨다23. 따라서 이 모델은 단일 대 다미생물 감염에서 면역 반응의 변화를 분석하는 데 이상적입니다. 또한, 동시 감염 후 질병의 경과는 부분적으로 비인두에 존재하는 폐렴구균의 균주에 의존합니다. 따라서 이 모델은 S. pneumoniae 의 무증상 집락화 대 병원성 전이에 필요한 박테리아 인자를 해부하는 데 적합합니다. 마지막으로, 이 모델은 동시 감염에 대한 노화의 감수성을 재현하며, 여기에서 테스트되지는 않았지만 숙주 배경이 질병 경과에 미치는 영향을 평가하는 데 쉽게 사용할 수 있습니다. 결론적으로, 운반과 질병을 별개의 단계로 분리하면 병원체와 숙주의 유전적 변이를 분석할 수 있는 기회가 제공되어 질병 진행의 여러 단계에서 중요한 병리와 숙주의 상호 작용을 자세히 검사할 수 있습니다. 앞으로 이 모델은 취약한 호스트에 대한 치료 옵션을 맞춤화하는 데 사용할 수 있습니다.

폐렴구균(Streptococcus pneumoniae, 폐렴구균)은 그람 양성균으로 대부분의 건강한 사람의 비인두에 무증상으로 존재한다 1,2. 완전히 정의되지 않은 요인에 의해 촉진되는 폐렴구균은 비인두의 양성 집락 형성자에서 다른 장기로 퍼져 중이염, 폐렴, 균혈증 등 심각한 감염을 초래하는 병원체로 전환될 수 있다3. 폐렴구균성 질환 발현은 부분적으로 협막 다당류의 조성에 기초하는 혈청형을 포함한 균주 특이적 차이에 의존합니다. 지금까지 100가지 이상의 혈청형이 특징지어졌으며 일부는 보다 침습적인 감염과 관련이 있습니다 4,5. 몇 가지 다른 요인들이 폐렴 구균 성 질환의 위험을 증가시킵니다. 그러한 요인 중 하나는 폐렴 구균 성 폐렴의 위험이 IAV 6,7에 의해 100 배 증가하는 바이러스 감염입니다. 역사적으로 S. pneumoniae는 인플루엔자 이후 이차성 세균성 폐렴의 가장 흔한 원인 중 하나이며, 더 나쁜 결과와 관련이 있다8. 또 다른 주요 위험 요소는 고령입니다. 사실, S. pneumoniae는 65세 이상의 노인에서 지역사회 획득 세균성 폐렴의 주요 원인입니다 9,10. 노인은 폐렴 및 인플루엔자로 인한 사망의 대부분(>75%)을 차지하며, 이는 노화와 IAV 감염의 두 가지 위험 요소가 질병 감수성을 상승적으로 악화시킨다는 것을 나타낸다11,12,13,14. 그러나 바이러스 감염이 폐렴구균을 무증상 집락 형성자에서 침습성 병원체로 전환하도록 유도하는 메커니즘과 이것이 숙주 요인에 의해 형성되는 방식은 아직 잘 정의되어 있지 않습니다. 이것은 주로 무증상 폐렴구균 집락화에서 중대한 임상 질환으로의 전환을 요약하는 작은 동물 모델이 없기 때문입니다.
동시 감염 연구는 인플루엔자 감염 후 7일 후에 폐렴구균을 폐에 직접 접종한 마우스에서 고전적으로 모델링되었습니다15,16. 이는 이차성 세균성 폐렴에 대한 감수성을 재현하며, 항바이러스 면역 반응이 어떻게 항균 방어를 손상시키는지를 연구하는 데 이상적이다17. 그러나, 인간을 대상으로 한 종단적 연구는 박테리아가 무증상 생물막을 형성할 수 있는 비인두의 폐렴구균 운반(pneumococcal carriage)이 침습성 질병(invasive diseases)과 균일하게 연관되어 있음이 입증되었다19,20. 중이, 폐 및 혈액의 감염으로부터 분리된 박테리아는 비인두에서 발견되는 것과 유전적으로 동일하다20. 따라서, IAV 감염 후 무증상 운반에서 침습성 질환으로의 전환을 연구하기 위해, 마우스를 비강 내 투여한 후 비인두의 IAV 감염을 초래하는 모델을 확립하였다21,22. 상기도의 바이러스 감염은 숙주 환경의 변화로 이어져 생물막에서 폐렴구균이 분산되고 하부 기도로 퍼졌다21. 이 분산된 박테리아는 감염에 중요한 독성 인자의 발현을 상향 조절하여 식민지 개척자에서 병원체로 전환시켰다21. 이러한 관찰은 바이러스, 숙주 및 박테리아 사이의 복잡한 상호 작용을 강조하고 바이러스 감염에 의해 유발된 숙주의 변화가 폐렴구균 행동에 직접적인 영향을 미치며, 이는 차례로 박테리아 감염 과정을 변화시킨다는 것을 보여줍니다. 그러나 이 모델은 바이러스가 비강에 국한되어 있고 숙주 면역 및 폐 손상에 대한 바이러스 감염의 전신 효과가 요약되지 않기 때문에 인간에서 관찰되는 질병의 심각한 징후를 요약하지 못합니다.
우리는 최근에 숙주와 병원체 사이의 복잡한 상호 작용을 통합하지만 인간에서 관찰되는 질병 중증도를 더 가깝게 모방하는 모델을 구축했습니다23. 이 모델에서, 마우스는 먼저 생물막 성장 폐렴 구균에 비강 내 감염되어 무증상 운반을 확립한 다음, 비인두와 폐 모두의 IAV 감염이 뒤따른다. 그 결과 폐에 박테리아가 전파되고, 폐 염증이 발생했으며, 어린 생쥐의 일부에서 치사율로 진행된 질병이 발생했다23. 이 이전 연구는 바이러스 및 박테리아 감염 모두 숙주 방어를 변경했음을 입증했습니다: 바이러스 감염은 박테리아 전파를 촉진하고 이전의 박테리아 집락화는 폐 IAV 수준을 제어하는 숙주의 능력을 손상시켰습니다23. 면역 반응을 조사한 결과, IAV 감염은 호중구의 항균 활성을 감소시키는 반면, 박테리아 집락화는 항바이러스 방어에 중요한 I형 인터페론 반응을 둔화시키는 것으로 나타났다23. 중요한 것은 이 모델이 노화의 감수성을 재현했다는 것입니다. 어린 생쥐에 비해 늙은 생쥐는 질병의 징후를 더 일찍 보였고, 더 심각한 임상적 질병을 보였으며, 감염에 더 자주 굴복했다23. 이 원고에 제시된 연구는 침습성 폐렴구균 균주가 IAV 감염 시 더 효율적인 전파를 나타내고, 폐 염증의 더 명백한 징후를 보여주며, 비침습적 균주에 비해 질병의 속도를 가속화하기 때문에 질병의 정도도 박테리아 균주에 의존한다는 것을 보여줍니다. 따라서 이 S. pneumoniae/IAV 동시 감염 모델은 병원체와 숙주 인자 모두에 대한 자세한 검사를 허용하며 질병 진행의 여러 단계에서 다미생물 감염에 대한 면역 반응을 연구하는 데 매우 적합합니다.

<table><tbody><tr><td>4-아미노벤조산&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>AAA1267318</td><td>Mix 96</td></tr><tr><td>웰 원형 바닥 플레이트</td>를 보유하고 있습니다. <td>Greiner Bio-One</td><td>650101</td><td></td></tr><tr><td>100 &micro; m 필터</td><td>Fisher</td><td>07-201-432</td><td></td></tr><tr><td>Adenine</td><td>Fisher</td><td>AC147440250</td><td>Mix 나는</td></tr><tr><td>Avicel</td><td>Fisher</td><td>501785325</td><td>Microcyrstalline cellulose를 재고하고 있습니다&nbsp;</td></tr><tr><td>BD Cytofix 고정 버퍼&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>BDB554655</td><td>고정 버퍼</td></tr><tr><td>BD Fortessa</td><td></td><td></td><td>플로우 사이토미터&nbsp;</td></tr><tr><td>BD 인트라메딕 폴리에틸렌 튜빙&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>427410</td><td>코 세척용 튜빙</td></tr><tr><td>BD&nbsp; Luer-Lok 팁이 있는 일회용 주사기 (1 mL)</td> <td>Fisher</td><td>14-823-30</td><td></td></tr><tr><td>BD&nbsp; Microtainer Capillary Blood Collector and BD Microgard Closure</td><td>Fisher</td><td>02-675-185</td><td>채혈 튜브</td></tr><tr><td>베타 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드</td><td>Fisher</td><td>AAJ6233703</td><td>Mix IV 주식</td></tr><tr><td>비오틴</td><td>Fisher</td><td>AC230090010</td><td>비타민 주식</td></tr><tr><td>C57BL/6J 마우스</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>#000644</td><td>이 연구에 사용된 마우스</td></tr> 염화<tr><td>칼슘 무수</td><td>피셔 케미컬</td><td>C77-500</td><td>믹스 I 재고</td></tr><tr><td>CD103 BV 421</td><td>BD Bioscience</td><td>BDB562771</td><td>클론 : M290 DF 1:200</td></tr><tr><td>CD11b APC</td><td>Invitrogen</td><td>50-112-9622</td><td>클론 : M1 / 70, DF 1:300</td></tr><tr><td>CD11c PE</td><td>BD Bioscience</td><td>BDB565592</td><td>클론 : N418 DF 1 : 200</td></tr><tr><td>CD3 AF 488</td><td>BD Bioscience</td><td>OB153030</td><td>클론 : 145-2C11 DF 1 : 200</td></tr><tr><td>CD4 V450</td><td>BD Horizon</td><td>BDB560470</td><td>클론 : RM4.5 DF 1:300</td></tr><tr><td>CD45 APC eF-780</td><td>BD Bioscience</td><td>50-112-9642</td><td>클론 : 30-F11 DF 1:200</td></tr><tr><td>CD45 PE</td><td>Invitrogen</td><td>50-103-70</td><td>클론 : 30-F11 DF 1:200</td></tr><tr><td>CD8&alpha; BV 650</td><td>BD Horizon</td><td>BDB563234</td><td>클론: 53-6.7 DF 1:200</td></tr><tr><td>콜린 클로라이드</td><td>Fisher</td><td>AC110290500</td><td>CDM</td></tr><tr><td>Corning 일회용 진공 필터/저장 시스템의</td> 최종 보충 장치 <td>Fisher</td><td>09-761-107</td><td>필터 멸균 장치&nbsp;</td></tr><tr><td>코닝 조직 배양 처리된 T-25 플라스크</td><td>피셔</td><td>10-126-9</td><td></td></tr><tr><td>코닝&nbsp; Costar Clear 다중 우물 플레이트</td><td>Fisher</td><td>07-201-590</td><td></td></tr><tr><td>Corning&nbsp; L-글루타민 및 4.5g/L 포도당을 함유한 DMEM; 피루브산 나트륨</td><td>피셔</td><td>MT10017CM</td><td></td></tr><tr><td>시아노코발라민</td><td>피셔</td><td>AC405925000</td><td>믹스 없이 나는</td></tr><tr><td>D39</td><td>국립 유형 배양 컬렉션(NCTC)을 재고하고</td> <td>있습니다: NCTC 7466</td> 폐렴구<td>균 폐렴 균주</td></tr><tr><td>D-알라닌</td><td>피셔</td><td>AAA1023114</td><td>믹스 I 재고</td></tr><tr><td>D-칼슘 판토텐산</td><td>염 피셔</td><td>AC243301000</td><td>비타민 원료</td></tr><tr><td>덱스트로스</td><td>피셔 케미컬</td><td>D16-500</td><td>스타터 재고</td></tr><tr><td>Dnase&nbsp;</td><td>워딩턴 생화학&nbsp;</td><td></td><td></td>LS002147</tr><tr><td>Eagles 최소 필수 매체</td><td>ATCC</td><td>30-2003</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>VWR</td><td>BDH4616-500G</td><td></td></tr><tr><td>EF3030</td><td>질병 통제 및 예방 센터&nbsp;</td><td>분리 은행 요청을 통해 사용 가능한</td><td>Streptococcus pneumoniae 균주, 균주 이름</td></tr><tr><td>F480 PE Cy7</td><td>BD Bioscience</td><td>50-112-9713</td><td>클론: BMB DF 1:200</td></tr><tr><td>Falcon 50 mL 원추형 원심분리기 튜브</td><td>Fisher</td><td>14-432-22</td><td>50 mL 라운드 바텀 튜브</td></tr><tr><td>Falcon&nbsp; 캡이 있는 둥근 바닥 폴리프로필렌 시험관</td><td>Fisher</td><td>14-959-11B</td><td>15 mL 둥근 바닥 튜브</td></tr><tr><td>Falcon&nbsp; 라운드-바텀 폴리스티렌 시험관 (5 mL)</td><td>Fisher</td><td>14-959-5</td><td>FACS 튜브&nbsp;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermofisher</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Ferric Nitrate Nonahydrate</td><td>Fisher</td><td>I110-100</td><td>Mix III 주식</td></tr><tr><td>Fisherbrand 섬세한 해부 가위</td><td>Fisher</td><td>08-951-5</td><td>수확에 사용되는 기구</td></tr><tr><td>Fisherbrand 일회용 접종 루프&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>22-363-602</td><td>접종 루프&nbsp;</td></tr><tr><td>Fisherbrand 해부 조직 집게</td><td>Fisher</td><td>13-812-38</td><td>수확용 집게</td></tr><tr><td>Fisherbrand 프리미엄 마이크로 원심분리기 튜브: 1.5 mL</td><td>Fisher</td><td>05-408-137</td><td>미코원심분리기 튜브</td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp; 일회용 멸균 주사기 (10 mL)</td> <td>Fisher</td><td>14-955-459</td><td></td></tr><tr><td>엽산</td><td>Fisher</td><td>AC216630500</td><td>비타민 스톡</td></tr><tr><td>Gibco RPMI 1640 (ATCC)</td><td>Fisher</td><td>A1049101</td><td></td></tr><tr><td>Gibco&nbsp; DPBS, 칼슘 없음, 마그네슘 없음</td><td>Fisher</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>Gibco&nbsp; HBSS, 칼슘, 마그네슘, 페놀 레드</td><td>없음 Fisher</td><td>14025134</td><td></td></tr><tr><td>Gibco&nbsp; MEM (Temin's modification) (2x), 페놀 레드</td><td>없음 Fisher</td><td>11-935-046</td><td></td></tr><tr><td>Gibco&nbsp; 페니실린-스트렙토마이신 (10,000 U/mL)</td><td>Fisher</td><td>15-140-122</td><td></td></tr><tr><td>Gibco&nbsp; Trypan 블루 솔루션, 0.4%</td><td>Fisher</td><td>15-250-061</td><td></td></tr><tr><td>Gibco&nbsp; 트립신-EDTA (0.25%), 페놀 레드</td><td>Fisher</td><td>25-200-056</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤 (ACS 인증)</td><td>Fisher</td><td>G33-4</td><td></td></tr><tr><td>글리신</td><td>Fisher</td><td>AA3643530</td><td>아미노산 스톡</td></tr><tr><td>구아닌</td><td>Fisher</td><td>AAA1202414</td><td>Mix II 스톡</td></tr><tr><td>Invitrogen UltraComp eBeads 보상 비드</td><td>Fisher</td><td>50-112-9040</td><td></td></tr><tr><td>황산철(II) 헵타하이드레이트</td><td>피셔</td><td>AAA1517836</td><td>믹스 III 주식</td></tr><tr><td>L-알라닌</td><td>피셔</td><td>AAJ6027918</td><td>아미노산 주식</td></tr><tr><td>L-아르기닌</td><td>피셔</td><td>AAA1573814</td><td>아미노산 주식</td></tr><tr><td>L-아스파라긴</td><td>피셔</td><td>AAB2147322</td><td>아미노산 주식</td></tr><tr><td>L-아스파르트산&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>AAA1352022</td><td>아미노산 주식</td></tr><tr><td>L-Cysteine</td><td>Fisher</td><td>AAA1043518</td><td>아미노산 주식</td></tr><tr><td>L-Cysteine hydrochloride monohydrate</td><td>Fisher</td><td>AAA1038914</td><td>CDM</td></tr><tr><td>L-Cystine</td><td>Fisher</td><td>AAA1376218</td><td>아미노산 주식</td></tr><tr><td>L-글루타민산에 대한 최종 보충교재&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>AC156211000</td><td>아미노산 스톡</td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>Fisher</td><td>O2956-100</td><td>아미노산 스톡</td></tr><tr><td>L-히스티딘</td><td>Fisher</td><td>AC166150250</td><td>아미노산 스톡</td></tr><tr><td>LIFE TECHNOLOGIES LIVE/DEAD 수정 가능한 블루 데드 셀 염색 키트, UV 여기용</td><td>Invitrogen</td><td>50-112-1524</td><td>클론: N/A DF 1:500</td></tr><tr><td>L-이소류신</td><td>피셔</td><td>AC166170250</td><td>아미노산 주식</td></tr><tr><td>L-류신</td><td>Fisher</td><td>BP385-100</td><td>아미노산 주식</td></tr><tr><td>L-라이신</td><td>피셔</td><td>AAJ6222514</td><td>아미노산 주식</td></tr><tr><td>L-메티오닌</td><td>피셔</td><td>AAA1031822</td><td>아미노산 주식</td></tr><tr><td>저 엔도톡신 BSA&nbsp;</td><td>시그마 Aldrich</td><td>A1470-10G</td><td></td></tr><tr><td>L-페닐알라닌</td><td>피셔</td><td>AAA1323814</td><td>아미노산 스톡</td></tr><tr><td>L-프롤린</td><td>피셔</td><td>AAA1019922</td><td>아미노산 스톡</td></tr><tr><td>L-세린</td><td>피셔</td><td>AC132660250</td><td>아미노산 스톡</td></tr><tr><td>L-트레오닌</td><td>피셔</td><td>AC138930250</td><td>아미노산 스톡</td></tr><tr><td>L-트립토판</td><td>피셔</td><td>AAA1023014</td><td>아미노산 주식</td></tr><tr><td>L-Valine</td><td>Fisher</td><td>AAA1272014</td><td>아미노산 주식</td></tr><tr><td>Ly6C BV 605</td><td>BD Bioscience</td><td>BDB563011</td><td>클론: AL-21 DF 1:300</td></tr><tr><td>Ly6G AF 488&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>NC1102120</td><td>클론: IA8, DF 1:300</td></tr><tr><td>Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) 세포&nbsp;</td><td>PFU 분석을 위한 American Type Culture Collection (ATCC)</td><td>CCL-34</td><td>MDCK 세포주&nbsp;</td></tr><tr><td>마그네슘 황산염 7-수화물</td><td>Fisher</td><td>60-019-68</td><td>CDM 스타터 재고</td></tr><tr><td>망간 황산염</td><td>Fisher</td><td>M113-500</td><td>믹스 나는</td></tr><tr><td>MilQ 물을</td><td></td><td></td> 재고하고 있습니다<td>. 초순수</td></tr><tr><td>마우스 Fc 블록</td><td>BD Bioscience</td><td>BDB553142</td><td>클론: 2.4G2 DF 1:100</td></tr><tr><td>MWI 수복&nbsp; PURALUBE VET OINTMENT</td><td>Fisher</td><td>NC1886507</td><td>감염용 눈 윤활제</td></tr><tr><td>NCI-H292 점액표피암종 세포주&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CRL-1848</td><td>H292 폐 상피 세포주 생물막 성장용</td></tr><tr><td>나이아신아마이드</td><td>Fisher</td><td>18-604-792</td><td>비타민 스톡</td></tr><tr><td>NK 1.1 AF 700</td><td>BD Bioscience</td><td>50-112-4692</td><td>클론 : PK136 DF 1:200</td></tr><tr><td>Oxyrase for Broth 50Ml Bottle 1/Pk</td><td>Fisher</td><td>50-200-5299</td> PBS Thermoscientific의 <td>액체 배양에서 산소를 제거하려면</td></tr><tr><td>파라포름알데히드 4%</td><td></td><td>J19932-K2</td><td></td></tr><tr><td>피베탈 이소플루란&nbsp;</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-893-8440</td><td>감염 중 마취를 위한 이소플루란&nbsp;</td></tr><tr><td>Potassium Phosphate Dibasic</td><td>Fisher Chemical</td><td>P288-500</td><td>스타터 재고</td></tr><tr><td>Potassium Phosphate Monobasic</td><td>Fisher Chemical</td><td>P285-500</td><td>스타터 스톡</td></tr><tr><td>Pyridoxal hydrochloride&nbsp;</td><td>피셔</td><td>AC352710250</td><td>비타민 주식</td></tr><tr><td>피리독사민 디하이드로클로라이드</td><td>피셔</td><td>AAJ6267906</td><td>믹스 I 재고</td></tr><tr><td>리보플라빈</td><td>피셔</td><td>AC132350250</td><td>비타민 주식</td></tr><tr><td>아세테이트 나트륨</td><td>VWR</td><td>0530-500G</td><td>스타터 재고</td></tr><tr><td>아지드화 나트륨&nbsp;</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP922I-500</td><td>FACS 완충용</td></tr><tr><td>소듐 바이카보네이</td>트 <td>피셔 케미컬</td><td>S233-500</td><td>스타터 재고 및 CDM</td></tr><tr><td>소듐 인산염 이염기성</td><td>피셔 케미컬</td><td>S374-500</td><td>스타터 재고</td></tr><tr><td>소듐 인산염 단일염기</td><td>성 피셔 케미컬</td><td>S369-500</td><td>스타터 스톡</td></tr><tr><td>TCR APC&nbsp;</td><td>BD Bioscience</td><td>50-112-8889</td><td>클론: GL-3 DF 1:200</td></tr><tr><td>TCR&beta; APC-Cy7</td><td>BD Pharmigen</td><td>BDB560656</td><td>클론 : H57-597 DF 1 : 200</td></tr><tr><td>Thermo Scientific 혈액 한천 with Gentamicin</td><td>Fisher</td><td>R01227</td><td>항생제 겐타 마이신이 함유 된 혈액 한천 플레이트;</td></tr><tr><td>써모 사이언티픽&nbsp; Trypsin, TPCK 처리</td><td>Fisher</td><td>PI20233</td><td></td></tr><tr><td>Thiamine hydrochloride</td><td>Fisher</td><td>AC148991000</td><td>Vitamin stock</td></tr><tr><td>TIGR4</td><td>ATCC</td><td>BAA-334</td><td>Streptococcus pneumoniae strain</td></tr><tr><td>Uracil</td><td>Fisher</td><td>AC157300250</td><td>Mix II stock</td></tr><tr><td>Worthington Biochemical Corporation&nbsp; 콜라겐 분해 효소, 유형 2, 1 g</td><td>피셔</td><td>NC9693955</td><td></td></tr></tbody></table>

바이러스 동시 감염 시 콜로니자에서 병원체로 streptococcus pneumoniae 의 전환을 위한 마우스 모델은 연령 악화 질병을 요약합니다.

A Mouse Model for the Transition of Streptococcus pneumoniae from Colonizer to Pathogen upon Viral Co-Infection Recapitulates Age-Exacerbated Illness

폐렴 연쇄상 구균 (폐렴 구균)은 대부분의 개인에서 비 인두의 무증상 식민지 개척자이지만 인플루엔자 A 바이러스 (IAV) 감염시 폐 및 전신 병원체로 진행될 수 있습니다. 고령은 이차성 폐렴구균성 폐렴에 대한 숙주 감수성을 향상시키고 질병 결과를 악화시키는 것과 관련이 있습니다. 이러한 과정을 주도하는 숙주 요인은 부분적으로는 무증상 집락화에서 심각한 임상 질환으로의 전환을 재현하는 동물 모델이 부족하기 때문에 잘 정의되어 있지 않습니다. 
이 논문은 바이러스 감염 시 폐렴구균이 무증상 보균에서 질병으로 전환되는 것을 재현하는 새로운 마우스 모델을 설명합니다. 이 모델에서, 마우스는 먼저 생물막 성장 폐렴 구균을 비강 내 접종하여 무증상 운반을 확립 한 다음, 비 인두와 폐 모두의 IAV 감염을 확립한다. 그 결과 폐로의 박테리아 전파, 폐 염증 및 치사율로 진행될 수 있는 질병의 명백한 징후가 나타납니다. 질병의 정도는 박테리아 균주 및 숙주 인자에 따라 다릅니다. 
중요하게도, 이 모델은 젊은 생쥐에 비해 늙은 생쥐가 더 심각한 임상 질환을 나타내고 질병에 더 자주 굴복하기 때문에 노화의 감수성을 재현합니다. 운반과 질병을 별개의 단계로 분리하고 병원체와 숙주의 유전적 변이를 분석할 수 있는 기회를 제공함으로써 이 S. pneumoniae/IAV 동시 감염 모델은 질병 진행의 여러 단계에서 숙주와 중요한 병리의 상호 작용에 대한 자세한 검사를 허용합니다. 이 모델은 또한 감수성 숙주에서 이차성 폐렴구균성 폐렴에 대한 잠재적인 치료 표적을 식별하기 위한 중요한 도구 역할을 할 수 있습니다.

이 논문은 바이러스 감염 동안 폐렴구균이 무증상 집락 상태에서 질병을 유발하는 병원체로 전환하기 위한 새로운 마우스 모델을 설명합니다. 이 모델은 질병 진행의 여러 단계 동안 다양한 숙주에서 다미생물 및 숙주-병원체 상호작용을 연구하는 데 쉽게 적용할 수 있습니다.

바이러스 동시 감염 시 콜로니자에서 병원체로 Streptococcus pneumoniae 의 전환을 위한 마우스 모델은 연령 악화 질병을 요약합니다.

Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) is an asymptomatic colonizer of the nasopharynx in most individuals but can progress to a pulmonary and systemic ...

이 방법은 바이러스 감염 동안 폐렴 구균이 무증상 식민지 개척자에서 질병을 유발하는 병원체로의 전환을 연구하기위한 새로운 마우스 모델을 설명합니다. 그것은 인간에게서 일어나는 일을 더 가깝게 모방합니다. 이 모델은 감수성 숙주에서 이차성 폐렴구균성 폐렴에 대한 잠재적인 치료 표적을 식별하기 위한 중요한 도구가 될 수 있다.이 모델은 노화의 감수성을 재현합니다. 따라서 숙주의 어떤 측면이 나이가 들어감에 따라 결함이 있는지 이해하고 취약한 노인 숙주에 대한 치료 옵션을 맞춤화하는 데 사용할 수 있습니다. 폐렴구균 생물막을 성장시키는 것은 균주마다 시간이 다르기 때문에 어려운 일입니다.제 조언은 동물 연구를 실행하기 전에 생물막을 성장시키는 것입니다. H292 세포가 100% 융합되면 PBS로 세포를 세 번 세척합니다. 그런 다음 웰 당 250 마이크로 리터의 4 % 파라 포름 알데히드를 첨가하여 세포를 고정시키고 얼음 위에서 1 시간 동안 또는 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다.Strake streptococcus pneumoniae 혈액 한천 플레이트에 관심 균주를 넣고 섭씨 37도와 5% 이산화탄소에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음날 CDM과 Oxyrase 1 밀리리터를 첨가하여 플레이트에서 박테리아를 씻어 내고 1 밀리리터 피펫 팁의 측면을 사용하여 박테리아 콜로니를 부드럽게 들어 올려 플레이트의 박테리아를 화학적으로 정의 된 신선한 배지 또는 CDM 플러스 옥시 라아제에 접종합니다. 박테리아 배양물을 CDM 플러스 옥시라제에서 0.05의 출발 OD600으로 희석한다.그런 다음 섭씨 37도에서 느슨하게 덮인 50밀리리터 원추형 튜브에서 OD 0.2에 도달할 때까지 5% 이산화탄소에서 박테리아를 성장시킵니다. 다음으로 박테리아 배양 튜브를 소용돌이칩니다. 고정된 H292 세포에 배양물 0.5밀리리터를 시딩하고 웰당 CDM 플러스 옥시라제 배지 0.5밀리리터를 추가합니다.박테리아가 없는 대조군 웰에 CDM과 Oxyrase를 추가합니다. 플레이트를 섭씨 34도와 5% 이산화탄소에서 48시간 동안 배양합니다. 초기 파종 후 12 시간마다 0.5 밀리리터의 배지를 신선한 CDM과 옥시 라제로 부드럽게 교체하십시오.생물막 형성을 방해하지 않도록 주의하십시오. 플레이트 바닥에 생물막이 있는지 확인하고 생물막 성장으로 인해 시간이 지남에 따라 흐림이 증가하는 것을 확인합니다. 48시간 후, 상층액을 제거하고, 1밀리리터의 PBS로 생물막을 2회 세척한다.그런 다음 1밀리리터의 신선한 CDM에 생물막을 다시 현탁하고 위아래로 세게 피펫하여 생물막을 들어 올립니다. 각 박테리아 균주에 대해 모든 웰의 배양액을 50밀리리터 튜브에 풀링합니다. 단단히 덮인 튜브를 위아래로 여러 번 부드럽게 기울여 잘 섞습니다.다음으로, 40 % 글리세롤과 CDM을 동일한 부피로 첨가하여 최종 농도가 20 % 글리세롤인 박테리아 현탁액을 얻습니다. 마이크로 원심분리기 튜브에 1밀리리터를 분취하고 드라이아이스에서 급속 동결한 다음 섭씨 영하 80도에서 저장합니다. 생물막 성장 분취액을 얼음 위에서 해동하고 1, 700 G에서 5분 동안 회전시킨다.펠릿을 방해하지 않고 상청액을 조심스럽게 제거하고 폐기하십시오. 그런 다음 펠릿을 PBS 1 밀리리터에 재현 탁하여 세척하고 다시 회전시킵니다. 상청액을 제거하고 원하는 농도에 도달하는 데 필요한 부피로 펠릿을 다시 현탁합니다.C57 검정색 6마리 수컷 마우스를 5회 10회 6번째 콜로니 형성 단위 또는 CFU로 5 마이크로리터의 희석된 접종물을 각 나리스에 피펫팅하여 비강내 접종한다. 접종 후 마우스를 단단히 잡고 볼륨이 흡입 될 때까지 머리를 안정시킵니다. 바이러스가 해동되면 PBS에서 원하는 농도로 바이러스를 희석합니다.마취 전에 마우스의 눈에 안과용 윤활제를 바르십시오. 뭉툭한 핀셋을 사용하여 혀를 입 밖으로 빼내고 액체의 양을 기관 아래로 피펫팅하여 인플루엔자 A 바이러스 또는 IAV의 50마이크로리터의 20 플라크 형성 단위 또는 PFU로 마취된 마우스를 즉시 감염시킵니다. 회복 후, 앞서 설명한 접종 방법을 사용하여 IAV 200 PFU 10 마이크로리터를 비강 내 접종합니다.폐 채취를 위해 해부 가위를 사용하여 노출된 흉곽의 측면을 자르고 갈비뼈를 마우스 머리 쪽으로 부드럽게 당겨 심장을 노출시킵니다. PBS로 미리 채워진 25밀리리터 주사기에 부착된 10게이지 바늘을 우심실에 삽입하고 천천히 관류를 시작합니다. 성공적인 관류의 지표로 폐 표백을 찾으십시오.폐 조직이 부러지지 않도록 천천히 씻어 내십시오. 집게로 심장을 들어 올리고 폐와 심장을 분리하기 위해 절개하십시오. 분리되면 집게로 폐의 모든 엽을 집어 들고 멸균 PBS가 있는 접시에 헹구어 잔류 혈액을 제거합니다.페트리 접시에 폐를 작은 조각으로 다듬고 잘 섞는다. 폐 혼합물의 절반을 제거하여 박테리아 CFU 또는 바이러스 PFU를 결정하고 균질화를 위해 0.5 밀리리터의 PBS로 미리 채워진 둥근 바닥 15 밀리리터 튜브에 넣습니다. 유세포 분석을 위해 폐의 나머지 절반을 제거하고 각 웰에 0.5밀리리터의 RP10으로 미리 채워진 비조직 배양 처리된 24웰 플레이트에 넣습니다.처리 될 때까지 실온에서 방치하십시오. 수집된 조직을 균질화하려면 균질화 프로브를 70% 에탄올에 넣고 60% 전력에서 30초 동안 균질기를 켜서 세척합니다. 멸균수에서 이 단계를 10초 동안 반복합니다.각 조직을 1분 동안 균질화합니다. 박테리아 수의 열거를 위해, 혈액 한천 플레이트에 일련의 희석액을 플레이트. 총 CFU를 계산하려면 10마이크로리터를 사용하여 각 샘플의 최종 부피(밀리리터)를 도금하고 기록하십시오.밀리리터 젠타마이신당 3마이크로그램이 보충된 혈액 한천 플레이트에 비인두 샘플을 플레이트하여 다른 미생물의 성장을 억제하면서 S pneumoniae의 성장을 선택합니다. 섭씨 37도와 이산화탄소 5%에서 하룻밤 배양합니다. 유세포 분석을 위해 폐 샘플이 들어 있는 24웰 플레이트의 각 웰에 500마이크로리터의 소화 완충액을 추가합니다.플레이트를 45분 내지 1시간 동안 배양한다. 다음으로 P-1000 마이크로 피펫을 사용하여 소화된 폐를 움직여 필터에 올려 놓습니다. 그런 다음 3 밀리리터 주사기의 플런저를 사용하여 샘플을 으깬다.생물막 성장 S.pneumoniae 접종물은 체계적인 확산을 피하면서 비인두로 제한된 일관된 폐렴구균 운반을 초래합니다. S pneumoniae, IAV 동시 감염된 마우스에서의 질환 발현은 박테리아 균주에 의존적이었다. 어떤 균주들 사이에서 비인두의 박테리아 수에는 유의미한 차이가 없었지만, S 폐렴, TIGR4 및 D39, 그러나 EF3030은 IAV 감염 후 48시간까지 폐로 전파되지 않았습니다.S pneumoniae TIGR4에 감염된 마우스의 40%가 폐에 박테리아 전파를 나타냈고 그 중 절반이 세균이 되었습니다. S pneumoniae D39에 감염된 마우스는 폐에 100% 전파되는 것으로 나타났고 그 중 절반은 균혈증을 경험했습니다. 박테리아 균주에 관계없이 전체 생존율을 추적함에 있어서, 동시 감염된 마우스의 생존율은 S 폐렴에 단독으로 도전한 마우스보다 유의하게 낮았다.이 모델은 또한 IAV 감염 후 폐에서 다양한 면역 세포의 존재를 평가하는 데 사용되었습니다. 박테리아 균주 D39 및 TIGR4는 호중구 및 단핵구와 같은 순환에서 염증성 면역 세포의 유입에서 기준선보다 유의한 증가를 유도했지만 EF3030은 그렇지 않았습니다. IAV 감염 단독으로 NK 세포 및 감마 델타 T 세포와 같은 면역 세포의 유입이 기준선보다 크게 증가했습니다.이러한 항바이러스 반응은 바이러스 챌린지 전에 S pneumoniae에 비강내 감염된 마우스에서 상당히 둔화되었습니다. 단독으로 감염된 마우스에서 바이러스 역가는 젊은 코호트와 노인 코호트 간에 변하지 않았습니다. 늙은 쥐는 더 일찍 그리고 훨씬 더 심각한 질병 징후를 보였고 24시간 이내에 더 빨리 사망한 반면, 젊은 대조군은 감염에서 더 잘 살아남았습니다.운반과 질병을 별개의 단계로 분리하면 질병 진행의 여러 단계에서 중요한 면역 반응과 박테리아 및/또는 바이러스 요인을 모두 검사할 수 있습니다. 우리는 이 모델이 질병 진행의 여러 단계와 다양한 숙주에서 다른 다미생물 상호 작용 및 숙주 병원체 상호 작용을 연구하기 위해 다른 실험실에서 적용되기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

영구와 만성 세균 감염 마우스 모델...

만성의 살모넬라균 감염된 마우스 모델

출처: Lenhard, A. 외. 바이러스 공동 감염 시 폐 렴 구균이 집착자에서 병원체로 전환되는 마우스 모델은 연령에 따른 악화된 질병을 재현합니다. J. Vis. 경험 (2022)이 영상은 인플루엔자 바이러스가 폐 렴구 균을 정착자에서 병원체로 전환시키는 쥐 공동 감염 모델을 보여줍니다. 박테리아 정착, 바이러스 감염, 질병 진행에 관련된 단계를 개괄합니다.

바이러스 공동 감염 후 폐렴구 균 의 병원성 전이를 연구하기 위한 마우스 모델

출처: Lenhard A. 외. 바이러스 공동 감염 시 폐 렴 구균이 집착자에서 병원체로 전환되는 마우스 모델은 연령에 따른 악화된 질병을 재현합니다. J. Vis. 경험 (2022)이 영상은 병원성 박테리아와 바이러스에 공동 감염된 쥐의 폐 처리 과정을 보여줍니다. 폐 조직을 다지고 균질화하며 플레이트링을 하면 박테리아 부하를 정량화하여 폐로의 박테리아 확산과 질병의 심각도를 알 수 있습니다.

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Citrobacter rodentium 감염이 장의 세균 감염을 공부뿐만 아니라 마우스의 면역 반응 및 대장염를 개최 할 수있는 중요한 모델을 제공합니다. 이 프로토콜은 장벽 무결성, 병원체 부하와 손쥐 전염성 대장염에 대한 병원체 및 호스트 공헌의 철저한 특성을 허용하는 조직 학적 손상의 측정을 설명합니다.

<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; 마우스 모델 : 감염성 대장염에 대한 공부 병원체 및 호스트 기부

연쇄상 구균 폐렴을 이용한 뮤린 비소하린의 식민지화및 신봉또는 모집된 세포의 후속 추출이 설명된다. 이 기술은 나아레를 통해 유체의 비소하린과 수집을 플러시하는 것을 포함하며, 시투에서mRNA 발현의 차동 세포 정량화 및 분석을 포함한 다양한 판독에 적응할 수 있다.

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