Name: In Vitro (시험관 ) 결막 잔 세포의 성별 기반 차이를 연구하는 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-28T14:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: 학습하세요 수정된 결막 고블릿 세포 1차 배양법을 통해 호르몬 및 에스트로겐 물질을 제거하고 정확한 성호르몬 수준 제어를 가능하게 하는 안구 표면 건강의 성별 기반 차이 연구 방법을.

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이 연구는 미국 국립안과연구소(National Eye Institute) 보조금 EY019470(D.A.D)의 지원을 받습니다.

모든 인체 조직은 과학 연구에 사용하기 위해 기증자의 사전 동의와 승인을 받아 안구 은행에 기증되었습니다. 인간 결막 조직의 사용은 매사추세츠 눈과 귀 인간 연구 위원회(Massachusetts Eye and Ear Human Studies Committee)에서 검토했으며 면제 대상이며 인간 피험자를 대상으로 한 연구의 정의에 부합하지 않는 것으로 결정되었습니다.
1. 1차 인간 잔 세포 배양
<ol><li>안구 은행에서 인체 결막 조직16을 얻습니다.</li>
	<li>10% 소 태아 혈청(FBS), 2mM 글루타민, 2mM 비필수 아미노산(NEAA), 2mM 피루브산 나트륨, 100μg/mL 페니실린-스트렙토마이신 및 2mM 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진술폰산(HEPES)이 보충된 배양 배지인 RPMI-1640 배양 배지를 준비합니다.</li>
	<li>아래 설명된 대로 1차 세포 배양을 수행합니다.<ol><li>멸균 메스로 조직을 1mm3 조각으로 다지고 배양 후드의 배양 플레이트에 씨를 뿌립니다. 6웰 플레이트의 각 웰에 4개를 1mL의 완전한 RPMI 배지에 파종합니다. 조직 조각의 방향은 세포 성장에 영향을 미치지 않지만 메스 블레이드를 사용하여 세포가 성장할 수 있도록 조각이 배양 플레이트에 부착되도록 합니다.</li>
		<li>37 ° C에서 95 % 공기와 5 % CO2 가 들어있는 인큐베이터에 조직 조각을 넣습니다. 약 14일 내에 잔 세포가 70%-80% 밀도에 도달할 때까지 동일한 배양 배지를 이틀마다 새로 고칩니다. 씨를 뿌린 후 약 72시간 후에 티슈 플러그를 제거합니다. 참고: 인간 결막 상피는 주로 층화된 편평 세포와 잔 세포를 포함합니다. RPMI는 잔 세포에 대한 선택적 매체입니다. 드물게 인간 CGC 배양에서 섬유아세포는 7일째 즈음에 자랄 수 있습니다. 배양물을 정화하는 방법은 이전 간행물 22에 기술되어 있다.</li>
		<li>19에 설명된 표준 IFM 방법에 따라 사이토케라틴(CK)7 및 나선 포마티아 렉틴-1(HPA-1)22을 표적으로 하는 면역형광 현미경(IFM)을 사용하여 GC 배양의 순도를 확인합니다. 대표 결과를 참조하십시오.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 인간 결막 잔 세포 통로 및 실험 준비
<ol><li>PBS(pH = 7.4)로 세포를 헹구고 1x EDTA에서 0.05% 트립신을 사용하여 트립신화로 세포를 분리합니다. 현미경으로 매분 세포를 관찰하십시오. 셀이 바닥에서 분리되면 완전한 RPMI 배지를 사용하여 트립신을 비활성화합니다.</li>
	<li>실온에서 150× g 에서 5분 동안 세포를 원심분리합니다. 세포 펠릿을 전체 RPMI 배양 배지에 재현탁시키고 [Ca2+]i 측정을 위해 유리 바닥 배양 접시에 다시 파종합니다. 배지의 총 부피는 접시당 300μL입니다. 미디어를 접시의 유리 부분 중앙에 두십시오.</li>
	<li>배양 배지에서 호르몬 제거: 배양 배지에는 성 호르몬, 특히 FBS가 포함될 수 있습니다. RPMI-1640에 함유된 페놀 레드는 에스트로겐 활성 23,24를 가지므로 RPMI 배지를 페놀 레드가 없는 RPMI 배지로 교체하고 완전한 배지를 준비한 후 pH 스트립을 사용하여 pH를 7.45로 조정합니다. 전체 배지에 포함된 HEPES는 pH를 비교적 작은 범위로 유지합니다.</li>
</ol>3. [Ca2+]i 측정을 위한 Fura-2/acetoxymethyl(AM) 분석
<ol><li>아래 설명에 따라 Fura-2/AM 로딩을 수행합니다.<ol><li>37°C, 주변 대기에서 1시간 동안 유리 바닥 접시에 세포를 배양하고 Krebs-Ringer 중탄산염 완충액(KRB, 119mM NaCl, 4.8mM KCl, 1.0mM CaCl2, 1.2mM MgSO4 및 25mM NaHCO3 함유)과 0.5% HEPES(표 1) 및 0.5% BSA, 0.5μM fura-2/AM, 8 μM 플루론산 F127 및 250 μM 설핀피라존.</li>
		<li>사용하기 전에 pH 측정기를 사용하여 pH를 7.45로 조정하십시오. fura-2/AM으로 로딩 한 후 [Ca2 +] i 측정 직전에 250 μM 술핀피라존을 함유 한 KRB로 세포를 세척하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>아래 설명에 따라 [Ca2+]i 측정을 수행합니다.<ol><li>fura-2가 로드된 세포가 들어 있는 접시를 현미경 아래에 놓고 20x 배율로 20개에서 50개 사이의 세포가 포함된 대표 필드를 찾은 다음 Freehand 기능을 사용하여 각 세포 주위에 윤곽선을 그려 배경 형광과 배경 형광이 아닌 것을 소프트웨어에 표시합니다.</li>
		<li>소프트웨어가 측정에서 배경 형광을 자동으로 뺄 때까지 기다렸다가 실험 시작 버튼을 클릭합니다.</li>
		<li>그런 다음 8초에서 15초 사이에 기다렸다가 세포의 기초 칼슘 수치를 확인한 후 관심 작용제를 조심스럽게 피펫팅합니다. 작용제를 추가한 후 또는 칼슘 수치가 기준선으로 돌아올 때까지 최소 120초 동안 계속 측정하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>아래 설명에 따라 데이터 분석을 수행합니다.<ol><li>피크 [Ca2+]i 의 변화를 사용하여 자극의 작용을 나타냅니다. 측정의 처음 8-15초에서 각 셀의 평균 기초 칼슘 수준을 계산합니다. 해당 숫자가 500nM 이상이면 세포 사멸 또는 괴사가 진행 중이므로 데이터 세트에서 해당 셀을 제거합니다.</li>
		<li>각 셀의 기초 수준이 계산되면 동일한 셀에 대해 측정된 최대 [Ca2+]i 에서 해당 양을 뺍니다. 주어진 접시의 모든 세포에 대한 피크 [Ca2+]I 의 변화를 평균화합니다.</li>
		<li>일관성을 보장하기 위해 각 자극의 반응을 중복으로 기록하고 복제본에서 얻은 피크 [Ca2+]i 변화의 평균값을 개별 인간 샘플의 하나의 데이터 포인트로 계산합니다. 연구 설계에 따라 적절한 데이터 분석 방법을 사용하여 여러 그룹의 데이터를 비교합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Female-specific+downregulation+of+tissue+polymorphonuclear+neutrophils+drives+impaired+regulatory+T+cell+and+amplified+effector+T+cell+responses+in+autoimmune+dry+eye+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Female-specific downregulation of tissue polymorphonuclear neutrophils drives impaired regulatory T cell and amplified effector T cell responses in autoimmune dry eye disease.</a> Journal of Immunology. 195, 3086-3099 (2015).</li>
<li>Wang, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+negatively+regulates+epithelial+wound+healing+and+protective+lipid+mediator+circuits+in+the+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Estrogen negatively regulates epithelial wound healing and protective lipid mediator circuits in the cornea.</a> FASEB Journal. 26, 1506-1516 (2012).</li>
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<li>Yang, J. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormone+replacement+therapy+reverses+the+decrease+in+natural+killer+cytotoxicity+but+does+not+reverse+the+decreases+in+the+T-cell+subpopulation+or+interferon-gamma+production+in+postmenopausal+women%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Hormone replacement therapy reverses the decrease in natural killer cytotoxicity but does not reverse the decreases in the T-cell subpopulation or interferon-gamma production in postmenopausal women.</a> Fertility and Sterility. 74, 261-267 (2000).</li>
<li>Orucoglu, F., Akman, M., Onal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+age%2C+refractive+error+and+gender+related+changes+of+the+cornea+and+the+anterior+segment+of+the+eye+with+Scheimpflug+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Contact+Lens+%26+Anterior+Eye%22%5BJournal%5D)">Analysis of age, refractive error and gender related changes of the cornea and the anterior segment of the eye with Scheimpflug imaging.</a> Contact Lens & Anterior Eye. 38, 345-350 (2015).</li>
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</ol>

저자는 이해 상충이 없습니다.

안구 조직의 성별에 따른 차이를 조사하는 것은 질병, 특히 안구건조증과 알레르기성 결막염의 진행 과정을 이해하는 데 도움이 되며, 이는 한쪽 성별에 불균형적으로 영향을 미친다 4,5,6. 이러한 연구에는 동물 모델을 사용할 수 있지만 생체 내 인간 세포와의 유사성이 가장 높기 때문에 인간 조직에서 직접 얻은 데이터가 필수적입니다. 현재 실험 환경에서 사용되는 결막 조직은 70-85세(폐경 후)의 연령 범위에서 사망한 기증자의 것이어서 사망 전 호르몬 효과를 더 쉽게 제어할 수 있습니다. 여기에서 우리는 인간 CGC의 성별 기반 차이를 연구하는 비용 효율적인 방법을 제시했습니다.
일관된 데이터를 얻기 위한 중요한 단계는 성호르몬의 영향을 제거하기 위한 실험 전에 48시간 동안 FBS와...

성별에 따른 차이는 안구 표면의 여러 과정에 영향을 미친다 1,2,3. 이러한 성별에 따른 차이의 임상적 양상은 안구건조증 및 결막염과 같은 남성과 여성의 많은 안구 표면 질환의 유병률 차이입니다 4,5,6. 증거에 따르면 성별에 따른 차이는 X 염색체와 Y 염색체7의 유전자 프로필의 상이한 프로필과 호르몬8의 영향을 포함한 여러 생물학적 수준에서 발생한다. 성별에 따른 차이의 분자적 기초를 연구하면 질병에 대한 더 나은 이해를 제공할 수 있으며, 궁극적으로 맞춤형 의학을 개선할 수 있습니다.
안구 표면은 위에 놓인 눈물막, 각막 및 결막으로 구성됩니다. 눈물막(tear film)9,10, 각막(cornea)11, 눈물샘(larimal gland)12,13, 눈물샘(meibomian gland)12을 포함한 안구 표면의 여러 구성 요소에서 성별에 따른 차이가 관찰된다. 수많은 기계론적 연구에서 각막 및 관련 구성 요소에 대한 성 호르몬의 영향을 조사했습니다14,15; 그러나 결막과 결막 세포의 성별에 따른 차이에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 결막은 공막과 눈꺼풀 안쪽 표면을 덮고 있는 점막입니다. 결막의 상피는 각질화되지 않고 다층으로 된 층화된 편평 세포로 구성되어 있다16.
결막의 층화된 편평 세포 중에는 상피의 정점 표면에 산재된 잔 세포(CGC)가 있습니다. 이들 잔 세포는 정점 극(17)에 위치한 많은 수의 분비 과립을 특징으로 한다. CGC는 겔 형성 뮤신 MUC5AC를 합성 및 분비하여 안구 표면에 수분을 공급하고 눈 깜빡임 동안 윤활합니다17. 뮤신 분비는 세포 내 [Ca 2+] ([Ca2+]i)와 Ras 의존성 세포 외 신호 조절 키나아제 (ERK1/2)의 활성화에 의해 엄격하게 조절됩니다 18. 점액을 분비하지 못하면 안구 표면이 건조해지고 병리학적 이상이 후유증이 생깁니다. 그러나 염증이 있는 안구 표면에서는 염증 매개체에 의해 자극된 광범위한 점액 분비로 인해 눈의 끈적임과 가려움증이 유발된다19. 점액 분비가 방해를 받는 이러한 상태는 결국 안구 표면의 악화로 이어집니다.
안구 점액의 주요 공급원으로서 잔 세포의 역할은 오랫동안 인식되어 왔지만20 생리학적 및 병리학적 상태 모두에서 점액 조절의 성별 차이는 발견되지 않은 상태로 남아 있습니다. 체외 시스템은 호르몬 영향 없이 또는 정밀하게 조절된 수준의 성 호르몬으로 잔 세포의 기능을 모니터링하는 데 유용할 것입니다. 결막 상피 세포주가 발달했음에도 불구하고21 기능성 점액 분비를 가진 잔 세포주는 없습니다. 따라서 개발된 1차 인간 CGC 배양을 수정하여 in vitro16에서 성별에 따른 차이를 분석하는 방법을 확립하고 아래와 같이 제시하였다.

<table><tbody><tr><td>0.05% 트립신 1x EDTA</td><td>Gibco (Grand Island, NY)</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid</td><td>Fisher Bioreagent (Pittsburgh, PA)</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>Advanced RPMI media</td><td>Gibco (Grand Island, NY)</td><td>12633020</td><td></td></tr><tr><td>carbachol</td><td>Cayman Chemical (Ann Arbor, MI)</td><td>144.86</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovin Serum</td><td>R& D (미네소타주 미니애폴리스)</td><td>S11150H</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2- 아세톡시메틸 에스테르&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>F1221</td><td></td></tr><tr><td>Human conjunctival tissue</td><td>Eversight Eye Bank (Ann Arbor, MI)</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>무기염 for KRB buffer</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td><td></td><td>모든 브랜드는</td></tr><tr><td>L-glutamine을</td> 작동시킬 것입니다.<td>Lonza Group (Basel, Switzerland)</td><td>17-605F</td><td></td></tr><tr><td>비필수 아미노산</td><td>Gibco (Grand Island, NY)</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>Gibco (Grand Island, NY)</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>페놀 레드-프리 RPMI 미디어&nbsp;</td><td>Gibco (Grand Island, NY)</td><td>11835055</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic acid F127</td><td>MilliporeSigma (Burlington, MA, USA)</td><td>P2443-250G</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 배양 배지</td><td>Gibco (Grand Island, NY)</td><td>21875034</td><td></td></tr><tr><td>메스</td><td>Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>12460451</td><td>모든 멸균 수술용 메스는</td></tr><tr><td>피루브산 나트륨</td><td>Gibco (Grand Island, NY)를</td> 작동시킬 수 있습니다.<td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>설핀피라존</td><td>밀리포어시그마(미국 매사추세츠주 벌링턴)</td><td>S9509-5G</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro (시험관 ) 결막 잔 세포의 성별 기반 차이를 연구하는 방법

In Vitro Method to Study Sex-Based Differences in Conjunctival Goblet Cells

안구건조증은 안구 표면 건강에 영향을 미치는 여러 요인으로 인한 질환으로, 여성의 유병률이 매우 높습니다. 결막 잔 세포(CGC)가 안구 표면으로 분비하는 겔 형성 점액의 파괴는 여러 안구 표면 질환의 원인이 됩니다. 외인성 성 호르몬의 제거는 CGC의 성별 차이에 대한 시험관 내 연구 중에 일관된 결과를 얻는 데 필수적입니다. 이 논문은 생리적 기능을 유지하면서 CGC의 성별 차이 연구에서 외인성 호르몬의 존재를 최소화하는 방법을 설명합니다. 남녀 모두의 사후 인간 기증자로부터 얻은 CGC는 10% 소 태아 혈청(FBS)(완전 배지라고 함)이 있는 RPMI 배지의 결막 조각에서 합류할 때까지 배양되었습니다. 실험이 시작되기 거의 48시간 전에 CGC를 페놀 레드 또는 FBS가 없지만 1% BSA(페놀-레드-프리 배지라고 함)가 있는 RPMI 배지로 옮겼습니다. 정상적인 세포 기능은 fura 2/acetoxymethyl(AM) 현미경을 사용하여 카르바콜(Cch, 1 x 10-4 M) 자극 후 세포 내 [Ca 2+]([Ca2+]i)의 증가를 측정하여 연구되었습니다. 결과는 CGC가 48시간 후에도 페놀-적색-프리 배지에서 정상적인 기능을 유지했음을 보여줍니다. Cch 자극 시 페놀 적색이 없는 RPMI 배지와 완전 배지 간에 [Ca2+]i 반응의 유의한 차이는 관찰되지 않았습니다. 따라서 성별 차이 연구에서 CGC의 정상적인 기능을 변경하지 않고 외인성 호르몬을 제거하기 위해 1% BSA가 함유된 페놀-레드 프리 RPMI 배지를 사용하는 것이 좋습니다.

1차 배양에서 인간 CGC는 약 14일 만에 80%의 밀도로 성장합니다. 세포 유형은 잔 세포 마커 CK7 및 HPA-125 에 대한 항체로 면역형광 염색을 통해 확인되었습니다(그림 1). 배지에서 FBS를 제거하면 성 호르몬을 제거할 수 있지만, FBS가 부족하면 세포 반응에 잠재적으로 영향을 미칠 수 있습니다. 호르몬 제거 방법을 검증하기 위해, 콜린성 작용제(carbachol, Cch 1 × 10-4 M)를 자극제로서 잔 세포를 둘러싼 상이한 신경 말단에 의해 매개되는 생리적 잔 세포 분비를 모방하는 자극으로 사용하였다(26). 대조군 완전 RPMI 배지에서 칼슘 변화의 크기에 차이가 관찰되지 않았으며, 이는 이 방법이 세포 반응의 성별 기반 차이를 연구하는 데 적용될 수 있음을 나타냅니다.
프로토콜 섹션에 설명된 F...

페놀 레드-프리/태아 무혈청 배지는 성별에 따른 차이 연구에서 결막 잔 세포의 정상적인 기능을 변경하지 않고 외인성 호르몬을 제거하기 위해 고급 RPMI보다 더 나은 옵션입니다.

In Vitro (시험관 ) 결막 잔 세포의 성별 기반 차이를 연구하는 방법

Dry eye is a multi-factorial disease affecting ocular surface health, with a profoundly higher prevalence in women. Disruption of the gel-forming mucin ...

1차 배양에서 잔 세포 기능을 연구함으로써 안구 표면 건강의 성별에 따른 차이 뒤에 숨겨진 메커니즘에 대한 귀중한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 우리는 시스템에서 호르몬과 에스트로겐 물질을 제거함으로써 이미 확립된 결막 잔 세포 1차 배양 방법을 수정하여 성호르몬 수치를 보다 정밀하게 제어할 수 있도록 했습니다. 이 수정은 조사 결과의 정확성과 신뢰성을 향상시킵니다.세포 내 칼슘 측정은 다양한 자극 하에서 잔 세포 기능과 각 자극에 의해 유발되는 세포 내 신호 전달 경로를 연구하는 방법입니다. 이 기술은 안구 알레르기, 안구 건조증 또는 결막염과 같은 안구 표면 질환에 대한 약물 개발로 확장될 수 있습니다. 이 기술은 특정 호르몬 수준의 밑에 잔 세포에 대한 각종 분자의 효력의 검열을 촉진합니다.이 기술을 처음 접하는 사람들은 종종 결합 조직에서 결막 조직을 분리하는 데 어려움을 겪습니다. 우리의 조언은 조직의 질감과 재료 특성에 세심한 주의를 기울이는 것입니다. 결막은 탄력 있고 반투명해야 하며 결합 조직은 일반적으로 색상이 더 밝고 면 섬유와 비슷해야 합니다.먼저 멸균 메스를 사용하여 인체 결막 조직을 1mm 입방체 조각으로 다집니다. 6웰 플레이트에서 각 웰에 1mm의 완전한 RPMI 배지가 들어 있는 4개의 조각을 파종합니다. 조각을 접시에 고정해야 합니다.조직 조각을 섭씨 37도, 이산화탄소 5%, 공기 95%에서 배양합니다. 이틀에 한 번씩 배양 배지를 새로 고칩니다. 파종 후 72 시간 후, 조직 플러그를 제거하고 잔 세포가 70-80 % 밀도에 도달 할 때까지 배양을 계속하십시오.다음으로 PBS로 세포를 헹구고 0.05%트립신 EDTA를 추가하여 플레이트 바닥에서 세포를 분리합니다. 현미경으로 세포 분리를 관찰합니다. 그리고 세포가 분리되면 완전한 RPMI 배지를 추가하여 트립신을 비활성화합니다.셀 현탁액을 150G에서 5분 동안 원심분리하고 펠릿을 페놀 적색이 없는 RPMI 배지에 재현탁시킵니다. 그런 다음 세포 내 칼슘 농도 측정을 위해 세포 현탁액을 유리 바닥 배양 접시에 다시 파종합니다. Fura-2 AM 로딩의 경우 0.5%HEPES, 0.5%BSA 및 0.5마이크로몰 Fura-2 AM, 8마이크로몰 플루론산 F127 및 250마이크로몰 설핀피라존을 함유한 Krebs-Ringer 중탄산염 완충액을 잔 세포가 포함된 유리 바닥 접시에 추가합니다.세포를 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양하여 빛으로부터 보호합니다. 배양 후 250마이크로몰 설핀피라존을 함유한 Krebs-Ringer 중탄산염 완충액으로 세포를 세척합니다. 세포 내 칼슘 농도 측정을 위해 Fura-2가 로드된 세포가 포함된 접시를 현미경 아래에 놓습니다.그런 다음 200배 배율을 추가합니다. 20-50개의 셀이 포함된 대표 필드를 찾습니다. 프리핸드 기능을 사용하여 각 셀 주위에 윤곽선을 그려 배경 형광과 구별하고 소프트웨어가 측정값에서 배경 형광을 자동으로 뺄 때까지 기다립니다.실험 시작 버튼을 클릭하고 8-15초 동안 기다렸다가 세포의 기준선 칼슘 수치를 확인합니다. 그런 다음 콜린성 작용제인 카르바콜을 조심스럽게 첨가하고 최소 120초 동안 또는 칼슘 수치가 기준선으로 돌아올 때까지 계속 측정합니다. 최대 세포 내 칼슘 농도의 변화를 사용하여 측정 첫 8초에서 15초 사이에 각 세포의 평균 기초 칼슘 수준을 계산합니다.평균 기초 칼슘 수치가 500나노몰 이상인 세포를 데이터 세트에서 제거합니다. 다음으로 각 세포의 최대 세포 내 칼슘 농도를 계산합니다. 그런 다음 동일한 세포에 대해 측정된 최대 세포 내 농도에서 기초 칼슘 수준 값을 뺍니다.마지막으로, 접시에 있는 모든 세포에 대한 최대 세포 내 칼슘 농도의 변화를 평균화합니다. 인간 결막 잔 세포의 순도는 잔 세포 마커, 사이토케라틴 및 나선 포마티아 렉틴 1에 특이적인 항체를 활용한 면역형광 염색을 통해 확인되었습니다. Fura-2 AM 분석 결과는 1% BSA가 있는 페놀 레드 프리 RPMI와 완전한 RPMI 배지에서 배양된 세포 간에 유의미한 차이가 없음을 보여주었습니다.그러나, 카르바콜에 대한 세포내 칼슘 반응이 상당히 증가한 것은 진행된 RPMI 배지 그룹과 전체 RPMI 배지 그룹을 비교했을 때 관찰되었습니다. 가장 중요한 것은 충분한 세포 밀도의 1차 인간 잔 세포 배양을 얻는 것입니다. 성장하는 동안 조직 조각이 배양 플레이트에 달라붙어 효과적인 성장을 할 수 있는지 확인하십시오.연구진은 자극 전에 다양한 억제제를 적용하거나, 수용체를 표적으로 삼거나, 세포에 분자를 신호화하여 특정 경로의 관여를 탐구할 수 있었습니다. 잔 세포 기능을 나타내는 다른 매개 변수, 뮤신 분비 및 미토겐 활성화 단백질 키나아제의 비활성화와 같은 경우에도 평가할 수 있습니다. 보완 측정은 다양한 자극에 대한 잔 세포의 반응에 대한 포괄적인 이해를 제공합니다.

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