Name: 2D 구조에서 체 외에서 인간 소뇌 발달 모델링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 14 s
Description: 배우세요 iPSC에서 2D 단층 소뇌 세포 배양법을 통해 인간 소뇌 초기 발달을 연구하는 방법을. 이 비용 효율적인 기술은 신경정신질환 관련 발달 메커니즘 규명에 활용됩니다.

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우리는 Jenny Gringer Richards가 통제 대상을 검증하는 데 철저한 노력을 기울인 것에 대해 감사 드리며, 그로부터 통제 iPSC를 생성했습니다. 이 작업은 NIH T32 MH019113 (D.A.M. 및 K.A.K.), Nellie Ball Trust (T.H.W. 및 AJW), NIH R01 MH111578 (V.A.M. 및 J.A.W.), NIH KL2 TR002536 (A.J.W.), 및 Roy J. Carver Charitable Trust (V.A.M., J.A.W. 및 AJW). 수치는 BioRender.com 로 만들어졌습니다.

인간 피험자 연구는 아이오와 대학교 기관 검토위원회 승인 번호 201805995 및 아이오와 대학교 인간 다 능성 줄기 세포위원회 승인 번호 2017-02에 따라 승인되었습니다. 피부 생검은 서면 사전 동의를 얻은 후 피험자로부터 얻었습니다. 섬유아세포를 37°C 및 5%CO2에서 15% 소 태아 혈청(FBS) 및 1% MEM-비필수 아미노산 용액으로 DMEM에서 배양하였다. 섬유아세포는 전기천공을 위해 뉴클레오펙터를 사용하는 제조자의 프로토콜( 재료 표 참조)에 따라 에피솜 재프로그래밍 키트를 사용하여 재프로그래밍되었습니다. 모든 절차는 클래스 II 유형 A2 생물 안전 캐비닛 (줄여서 "후드")에서 수행되었습니다. 모든 세포 배양 배지는 항생제가 없었습니다. 따라서 후드에 들어간 모든 구성 요소는 70 % 에탄올로 세척되었습니다. 모든 세포 배양 배지 및 성분은 멸균 여과되거나 후드에서 개봉되어 이들의 멸균성을 유지하였다.
1. 실험 준비
<ol><li>기저막 매트릭스(BMM) 코팅 플레이트를 준비합니다. 알림: BMM은 따뜻한 온도에서 더 빨리 응고됩니다. 플레이트는 보관을 위해 신속하고 즉시 4 ° C에 배치해야합니다.<ol><li>BMM( 재료 표 참조)을 얼음 위에서 4°C에서 최소 2시간 동안 또는 밤새 해동합니다.</li>
		<li>DMEM/F12와 BMM을 최종 농도 80μg/mL로 혼합합니다. BMM 용액을 조직 배양 접시(35mm의 경우 1mL, 60mm 접시의 경우 2mL)에 분배하고 세포를 플레이팅하기 전에 최소 1시간 또는 밤새 37°C에서 배양합니다. 알림: 사용하지 않은 접시는 4 ° C에서 2 주 동안 보관할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>폴리 -L- 오르니 틴 / 라미닌 (PLO / 라미닌) 코팅 플레이트를 준비하십시오.<ol><li>멸균 DPBS+/+에서 20μg/mL PLO( 재료 표 참조)를 준비하고 1웰 플레이트의 각 웰에 6mL를 추가합니다. 인큐베이터에서 37°C에서 밤새 배양한다.</li>
		<li>다음날 진공 흡인기로 PLO를 흡입하고 DPBS+/+로 두 번 세척합니다. 후드에서 자연 건조하십시오. 알림: 공기 건조 플레이트는 향후 사용을 위해 알루미늄 호일로 싸서 최대 4 ° C에서 2 주 동안 보관할 수 있습니다.</li>
		<li>DPBS+/+에서 10μg/mL 라미닌( 재료 표 참조)을 준비하고 1웰 플레이트의 각 웰에 6mL를 추가합니다. 인큐베이터에서 3 시간 이상 또는 37 ° C에서 밤새 배양하십시오.</li>
		<li>진공 흡인기로 라미닌을 흡인하고 1mL의 중간 또는 멸균 DPBS+/+를 추가합니다. 알림: 라미닌 코팅이 마르지 않아야합니다. 이를 방지하기 위해 PBS 또는 적절한 배양 배지를 즉시 추가해야 합니다. 코팅된 플레이트는 4°C에서 최대 2주 동안 보관할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>PSC 통과 솔루션을 준비합니다. 알림: 삼투압계( 재료 표 참조)는 PSC 통과 솔루션10을 만드는 데 필요합니다.<ol><li>11.49g의 염화칼륨(KCl)과 0.147g의 시트르산나트륨 이수화물(HOC(COONa)(CH2COONa)2*2H2O)을 400mL의멸균 세포 배양 등급수에 녹입니다(재료 표 참조).</li>
		<li>용액의 부피를 측정하고 초기 부피 (Vi)로 기록하십시오.</li>
		<li>오스몰 농도를 측정하고 공식 Vi × Oi = Vf × 570mOsm을 사용하여 멸균 세포 배양 등급 물을 추가하여 570mOsm으로 조정합니다.</li>
		<li>0.20μm 필터로 용액을 필터 멸균하고 10mL 분취량을 만듭니다. 분취량을 실온(RT)에서 최대 6개월 동안 보관하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>만능줄기세포(PSC) 배지를 준비합니다. 알림: iPSC는 열에 안정적인 FGF2( 재료 표 참조)가 포함된 배지에서 유지되어 주말에 없는 수유 일정을 제공합니다. 상업적으로 이용 가능한 다른 PSC 미디어는 이 프로토콜에 대해 시도되지 않았습니다.<ol><li>PSC 배지 보충제를 4°C에서 밤새 해동합니다.</li>
		<li>기본 PSC 배지 10mL에 500mL의 PSC 배지 보충제를 추가합니다. 25mL 분취량을 만들어 -20°C에서 보관합니다. 알림: 냉동 분취량은 -20°C에서 6개월 동안 보관할 수 있습니다. 해동된 분취량은 4°C에서 보관하고 2주 이내에 사용해야 합니다. 세포는 10%(v/v) 디메틸설폭사이드(DMSO)가 있는 PSC 배지에서 장기 보관을 위해 냉동될 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>PSC 해동 매체를 준비하십시오.<ol><li>50 nM 크로만, 1.5 μM 엠리카산, 1x 폴리아민 보충제 및 0.7 μM 트랜스-ISRIB(CEPT 칵테일11)로 PSC 배지를 보충합니다( 재료 표 참조).</li>
		<li>0.20μm 필터로 필터 멸균하고 4°C에서 최대 4주 동안 보관합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>뽑은 유리 피펫을 준비하십시오.<ol><li>22.9cm(9인치) 유리 파스퇴르 피펫을 분젠 버너 위의 목 아래 ~2cm 두 조각으로 당겨 두 개의 피펫을 만들고 더 얇은 면이 다른 쪽보다 ~4cm 짧습니다.</li>
		<li>화염의 도움으로 당겨진면의 끝을 구부려 부드러운 "r"을 만듭니다.</li>
		<li>추출한 피펫을 멸균을 위해 오토클레이브 슬리브와 오토클레이브에 넣습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>소뇌 분화 배지 (CDM)를 준비하십시오.<ol><li>IMDM과 Ham의 F12 영양소 혼합물을 1:1 비율로 혼합합니다. 1x L- 알라닌 -L- 글루타민 보충제, 1 % (v / v) 화학적으로 정의 된 지질 농축액, 0.45mM 1- 티오 - 글리세롤, 15 μL / mL 아포 - 트랜스페린, 5 mg / mL 소 혈청 알부민 (BSA) 및 7 μg / mL 인슐린으로 혼합물을 보충하십시오 ( 재료 표 참조).</li>
		<li>0.20μm 필터로 필터 멸균하고 4°C에서 보관한 후 1개월 이내에 사용합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>소뇌 성숙 배지 (CMM)를 준비하십시오.<ol><li>1x L- 알라닌 -L- 글루타민 보충제와 1x N-2 보충제로 신경 기저 배지를 보충하십시오 ( 재료 표 참조).</li>
		<li>0.20μm 필터로 필터 멸균하고 4°C에서 보관한 후 2주 이내에 사용하십시오.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 피더가 필요 없는 iPSC 배양
<ol><li>아래 단계에 따라 세포를 해동하십시오.<ol><li>BMM 플레이트(단계 1.1)를 37°C 인큐베이터 내로 넣고 세포를 해동하기 전에 적어도 1시간 또는 밤새 겔화시킨다.</li>
		<li>37°C에서 PSC 해동 배지 10mL(단계 1.5)를 예열합니다.</li>
		<li>세포를 액체 질소로부터 37°C의 수조로 극저온으로 옮긴다. 참고: 세포 배양 공간에서 오염원이 발생하지 않도록 하려면 표준 수조를 사용하지 않는 것이 좋습니다. 대신, 담수를 작은 비커에서 37 ° C로 가열하여 일회용 수조를 생성 할 수 있습니다.</li>
		<li>튜브에 작은 얼음 조각이 남아 있으면 수조에서 꺼내 튜브를 말린 다음 70 % 에탄올을 뿌립니다. 튜브를 후드로 옮기고 2mL 또는 5mL 혈청학적 피펫( 재료 표 참조)을 사용하여 세포를 15mL 원뿔형 튜브로 부드럽게 옮깁니다.</li>
		<li>원뿔형 튜브를 소용돌이치면서 8mL의 PSC 해동 배지를 세포에 적가합니다. RT에서 5분 동안 200 x g 로 원심분리합니다.</li>
		<li>세포 펠릿을 방해하지 않고 진공 흡인기로 상청액을 조심스럽게 흡인하십시오. 세포를 2mL의 PSC 해동 배지에 재현탁시킨다.</li>
		<li>플레이트에서 BMM을 흡인하고 균일한 분포를 위해 플레이트 전체에 재현탁 셀을 적가합니다.</li>
		<li>플레이트를 37°C, 5%CO2의 인큐베이터에 넣는다. 다음 날 PSC 미디어로 미디어를 새로 고칩니다. 그런 다음 매일 매체를 변경하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>아래 단계에 따라 셀을 유지 관리합니다.<ol><li>필요한 부피의 PSC 배지를 37°C에서 예열합니다(예: 35mm 플레이트당 배지 1mL).</li>
		<li>플레이트에서 분화된 세포 또는 콜로니를 조사하고 당겨진 유리 피펫으로 분화된 세포를 제거합니다(단계 1.6). 참고: iPSC 콜로니는 형태학적으로 동일한 세포가 있는 매끄러운 가장자리를 가지고 있습니다.</li>
		<li>소비 된 매체를 매일 변경하고 3-4 일마다 또는 70 % 컨플루언스에 도달하면 통과하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>세포를 통과시킵니다.<ol><li>통과하기 전에 필요한 양의 BMM 플레이트를 최소 1 시간 또는 밤새 인큐베이터에 넣으십시오. 필요한 양의 PSC 배지를 37°C에서 예열합니다(단계 1.3).</li>
		<li>뽑은 유리 피펫을 사용하여 분화된 세포나 콜로니를 제거합니다.</li>
		<li>진공 흡인기로 사용한 배지를 흡인하고 35mm 접시당 1mL의 PSC 해리 배지를 추가합니다. 37°C에서 1-3분 동안 배양합니다. 알림: 콜로니가 PSC 배지를 추가하기 전에 PSC 계대 숙성 용액에서 리프팅되는 경우 배양 시간을 줄일 수 있습니다.</li>
		<li>PSC 통과 용액을 흡인하고 예열된 PSC 매체를 추가합니다.</li>
		<li>멸균 200μL 피펫 팁을 사용하여 한 방향으로 서로 평행한 스크래치 라인을 긁고 플레이트를 90° 돌리고 이전 스크래치 라인에 수직인 두 번째 스크래치 라인 세트를 만듭니다(플레이트를 가로질러 크로스해칭 패턴 만들기).</li>
		<li>세트 플레이트에서 BMM 용액을 흡인합니다. 혈청 피펫을 사용하여 콜로니를 수집하고 새로운 BMM 플레이트에 분배합니다.</li>
		<li>37°C, 5%CO2에서 배양한다. 매일 매체를 교체하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>세포를 동결하십시오.<ol><li>내용물에 라벨을 부착하여 냉동 바이알을 준비하고 후드의 자외선(UV) 아래에서 30분 동안 살균합니다( 재료 표 참조).</li>
		<li>PSC 배지에 10%(v/v) DMSO를 보충하여 PSC 동결 배지를 준비합니다. 2.3.2-2.3.5 단계를 따르십시오.</li>
		<li>세포를 5mL 혈청학적 피펫이 있는 15mL 원뿔형 튜브로 옮기고 RT에서 5분 동안 200 x g 로 원심분리합니다.</li>
		<li>배지를 조심스럽게 흡인하고 PSC 동결 배지에 세포 펠릿을 재현탁합니다.</li>
		<li>냉동 비알에 배포하십시오. 바이알을 냉동 용기에 넣고 -80 ° C 냉동고에 보관하십시오.</li>
		<li>다음날, 장기 보관을 위해 냉동 비알을 액체 질소로 옮깁니다.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 소뇌 분화
알림: 차별화를 시작하기 전에 iPSC는 6개의 35mm 접시로 통과되며 70% 컨플루언스에 있을 때 차별화할 준비가 됩니다. 각 35mm 플레이트는 6웰 플레이트의 한 웰로 옮겨집니다.
<ol><li>0일째에 EB 형성을 위해 건강한 iPSC 콜로니를 들어 올립니다.<ol><li>10μM Y-27632 및 10μM SB431542( 재료 표 참조)가 보충된 1mL의 CDM(단계 1.7)을 6웰 초저 부착(ULA) 플레이트의 각 웰에 추가하고 들어 올린 콜로니를 웰에 추가할 준비가 될 때까지 인큐베이터에 넣습니다.</li>
		<li>뽑은 유리 피펫을 사용하여 분화된 세포를 세척합니다. 배지를 흡인하고 각 35mm 접시에 1mL의 PSC 계대 숙성 용액을 추가합니다. 37°C에서 3분 동안 배양하고, 흡인하고, 10 μM Y-27632 및 10 μM SB431542가 보충된 CDM 2 mL를 첨가한다. 알림: CDM을 추가하기 전에 PSC 계대 배양 용액에서 콜로니가 이륙하는 경우 배양 시간을 줄일 수 있습니다.</li>
		<li>투과광 도립 현미경에서 4배 배율을 사용하여 당겨진 유리 피펫의 구부러진 가장자리를 사용하여 콜로니를 부드럽게 들어 올립니다. 모든 콜로니가 들어 올려지면 10mL 혈청학적 피펫을 사용하여 6웰 ULA 플레이트의 한 웰로 모든 것을 부드럽게 옮깁니다. 각 iPSC 플레이트에 대해 이 과정을 반복합니다. 세포를 37°C에서 5%CO2로 배양한다. 알림: 콜로니가 너무 크거나 병합된 경우 당겨진 유리 피펫의 끝으로 슬라이스하여 더 작은 EB를 만들 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>2일째에 FGF2를 각 웰에 최종 농도 50ng/mL로 추가합니다. 참고: 소뇌 분화에 사용되는 FGF2는 열에 안정적이지 않습니다. 이 프로토콜은 열 안정성 FGF2로 테스트되지 않았습니다.</li>
	<li>7 일째에 1/3 중간 변경을하십시오. 웰에서 총 배지 3mL의 경우 1,000μL 피펫터를 사용하여 사용한 배지 1mL를 부드럽게 흡입하고 1mL의 새 CDM으로 교체합니다. EB를 7 일 동안 배양하십시오.</li>
	<li>14일째에 1,000μL 피펫터를 사용하여 거의 모든 사용한 배지를 부드럽게 흡입합니다. EB의 손상을 최소화하려면 플레이트를 소용돌이 치면서 플레이트 중앙에 모든 EB를 모은 다음 플레이트를 기울여 가장자리에서 천천히 흡인합니다.<ol><li>중간 양이 감소하면 천천히 판을 평평하게 놓고 계속 흡인하십시오. EB가 마르지 않도록 충분한 매체를 남겨 두십시오. 그런 다음 10μM Y-27632가 보충된 신선한 CDM 3mL를 추가합니다. 10mL 혈청학적 피펫을 사용하여 EB를 PLO/라미닌 코팅 접시에 옮깁니다(단계 1.2). 알림: 다운스트림 응용 분야에 따라 EB를 6웰 PLO/라미닌 플레이트로 옮기거나 단일 EB를 PLO/라미닌 코팅 24웰 플레이트 또는 커버슬립의 단일 웰로 옮길 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>15 일째에 배지를 흡인하고 신선한 CDM으로 교체하십시오. 알림: 시간이 지남에 따라 증발이 발생하므로 공급 사이에 충분한 배지를 확보하기 위해 웰에 충분한 배지를 추가하는 것이 중요합니다(예: 6웰 플레이트의 웰의 경우 배지 3mL 추가). 배지가 산성화되기 시작한 경우 (투명하고 노란색으로 변함) 프로토콜이 끝날 때까지 공급 일정에 있지 않더라도 배지를 새로 고칩니다.</li>
	<li>21 일에 사용한 배지를 흡인하고 CMM으로 교체하십시오. 28일째에 새 CMM으로 배지를 교체합니다. 35일째에, 추가 적용을 위해 세포를 수확한다.</li>
</ol>4. RNA 분리를 위한 샘플 준비
<ol><li>배지를 흡인하고 500μL의 세포 해리 시약( 재료 표 참조)을 6웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 몇 초 동안 그대로두고 흡인하십시오.</li>
	<li>뚜껑을 덮은 상태에서 접시를 실온에서 2분 동안 배양합니다. 플레이트의 측면을 탭하여 셀을 분리합니다.</li>
	<li>1mL의 CMM을 추가하고(단계 1.8) 세포를 1.5mL 튜브에 수집합니다.</li>
	<li>RT(최대 속도 2000 x g)에서 30초 동안 벤치탑 미니 원심분리기(재료 표 참조)를 사용하여 원심분리하여 세포를 펠릿화하고, 배지를 버리고, 1 mL의 1 mL PBS pH 7.4를 첨가하여 세포 펠릿을 세척한다.</li>
	<li>RT에서 30초 동안 벤치탑 미니 원심분리기를 사용하여 셀을 다시 펠릿하고 PBS로 한 번 더 세척합니다.</li>
	<li>세포를 펠릿하고 PBS를 버립니다. 시약을 함유하는 페놀 및 구아니딘 이소티오시아네이트에서 세포를 용해시킨다( 재료 표 참조). 참고: 시약을 함유한 페놀 및 구아니딘 이소티오시아네이트에서 용해된 세포는 -80°C에서 최대 1년 동안 보관할 수 있습니다. 세포는 RNA 분리 방법 및 사용되는 시약에 따라 접시에서 직접 용해될 수 있습니다. 접시에 있는 세포 수가 적기 때문에 실리카 스핀 컬럼( 재료 표 참조)을 사용하여 RNA를 분리하면 RNA 수율이 높아집니다.</li>
</ol>5. 면역형광염색을 위한 세포 준비
참고: 24웰 플레이트의 경우 웰당 1EB이면 충분합니다.
<ol><li>35일째에 사용한 배지를 흡인하고 웰당 1mL의 DPBS+/+를 추가하여 세포를 세척합니다(24웰 플레이트의 한 웰에 대해).</li>
	<li>DPBS+/+를 흡인하고 DPBS+/+로 웰당 준비된 차가운 4% 파라포름알데히드(PFA, 재료 표 참조) 500μL를 추가합니다. RT에서 20 분 동안 배양하십시오.</li>
	<li>4% PFA를 제거하고 5.1단계에서와 같이 DPBS+/+로 세포를 두 번 세척합니다. 1mL의 DPBS+/+를 추가하고 염색이 완료될 때까지 세포를 4°C에서 보관합니다. 참고: 세포 분리 및 항원 손실을 피하기 위해 고정 후 1주일 이내에 면역형광 염색을 수행하는 것이 좋습니다. 그러나, 항체 및 표적의 세포 위치에 따라, 염색은 고정 후 최대 4 주까지 나중에 수행 될 수있다.</li>
</ol>

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<li>Mizuhara, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purkinje+cells+originate+from+cerebellar+ventricular+zone+progenitors+positive+for+Neph3+and+E-cadherin%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Purkinje cells originate from cerebellar ventricular zone progenitors positive for Neph3 and E-cadherin.</a> Developmental Biology. 338 (2), 202-214 (2010).</li>
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<li>Kim, D., Ackerman, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+UNC5C+netrin+receptor+regulates+dorsal+guidance+of+mouse+hindbrain+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The UNC5C netrin receptor regulates dorsal guidance of mouse hindbrain axons.</a> Journal of Neuroscience. 31 (6), 2167-2179 (2011).</li>
<li>Maier, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semaphorin+4C+and+4G+are+ligands+of+Plexin-B2+required+in+cerebellar+development%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Semaphorin 4C and 4G are ligands of Plexin-B2 required in cerebellar development.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 46 (2), 419-431 (2011).</li>
<li>Telley, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+function+of+NRP1+in+axon+guidance+and+subcellular+target+recognition+in+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Dual function of NRP1 in axon guidance and subcellular target recognition in cerebellum.</a> Neuron. 91 (6), 1276-1291 (2016).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+to+mature+functional+Purkinje+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human induced pluripotent stem cells to mature functional Purkinje neurons.</a> Scientific Reports. 5, 9232(2015).</li>
<li>Shabanipour, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+of+neurons+isolated+from+embryonic+mouse+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Primary culture of neurons isolated from embryonic mouse cerebellum.</a> Journal of Visualized Experiments. (152), e60168(2019).</li>
</ol>

저자는 선언 할 이해 상충이 없습니다.

시험관 내에서 인간 소뇌 발달을 모델링하는 능력은 질병 모델링뿐만 아니라 정상적인 뇌 발달에 대한 이해를 높이는 데 중요합니다. 덜 복잡하고 비용 효율적인 프로토콜은 복제 가능한 데이터 생성 및 여러 과학 실험실에서 광범위한 구현을 위한 더 많은 기회를 만듭니다. 소뇌 분화 프로토콜은 Muguruma et al.에 의해보고 된 성장 인자를 사용하여 효소 또는 해리 제를 필요로하지 않는 EB를 생성하는 수정 된 방법을 사용하여 여기에 설명되어 있습니다. 도 4는 Holmes et al.으로부터의 방법과 유사한 변형된 2D 단분자층 세포 성장 프로토콜을 포함한다. 5.
전체 프로토콜은 iPSC에서 EB를 생성하는 것으로 시작하여 소뇌 분화를 유도하고 마지막으로 2D 단층 배양을 위한 도금으로 이어집니다. 이 과정에서 7-14 일 사이에 상당한 양의 세...

인간의 소뇌 발달과이 과정의 중요한 시간 창을 이해하는 것은 신경 발달 장애의 가능한 원인을 해독 할뿐만 아니라 치료 적 개입을위한 새로운 표적을 식별하는 데에도 중요합니다. 시험관 내에서 인간 소뇌 발달을 모델링하는 것은 어려운 일이었지만 시간이 지남에 따라 소뇌 혈통 운명을 가진 인간 배아 줄기 세포(hESC) 또는 iPSC를 분화하는 많은 프로토콜이 등장했습니다.1,2,3,4,5,6,7,8 . 또한 재현 가능한 결과를 생성하고 비교적 간단하며(오류를 줄이기 위해) 금전적 비용이 많이 들지 않는 프로토콜을 개발하는 것이 중요합니다.
소뇌 분화를 위한 첫 번째 프로토콜은 도금된 배아체(EB)의 2D 배양에서 생성되어 WNT, BMP 및 FGF 1,9를 포함하여 생체 내 발달과 유사한 다양한 성장 인자로 소뇌 운명을 유도했습니다. 보다 최근에 발표된 프로토콜은 주로 FGF2 및 인슐린을 사용한 3D 오가노이드 배양에서 분화를 유도하고, 이어서 마름모꼴 립형 구조3,4에 대해 FGF19 및 SDF1을 유도하거나, FGF2, FGF4 및 FGF85의 조합을사용했습니다. 두 소뇌 오가노이드 유도 방법 모두 동일한 시점에서 유사한 소뇌 마커 발현을 보고했기 때문에 유사한 3D 소뇌 오가노이드를 생성했습니다. Holmes와 Heine은 3D 프로토콜5를 확장하여 2D 소뇌 세포가 3D 응집체로 시작하는 hESC 및 iPSC에서 생성될 수 있음을 보여주었습니다. 또한 Silva et al.7은 3D에서 2D로 전환하고 성장 및 성숙 시간을 연장하는 다른 시점을 사용하여 Holmes와 Heine과 유사한 접근 방식으로 2D에서 성숙한 소뇌 뉴런을 나타내는 세포를 생성 할 수 있음을 입증했습니다.
현재 프로토콜은 인슐린과 FGF2를 사용하여 자유 부동 배아체(EB)를 생성한 다음 2D 성장 및 분화를 위해 14일째에 PLO/라미닌 코팅 접시에 EB를 플레이팅하여 피더가 없는 iPSC에서 소뇌 운명을 유도합니다. 35 일째에 소뇌 정체성을 가진 세포가 얻어진다. 특히 2D 환경에서 소뇌 발달의 초기 단계를 요약하는 기능을 통해 연구원은 단층 구조 실험이 필요한 특정 질문에 답할 수 있습니다. 이 프로토콜은 또한 원하는 세포 집단을 풍부하게하기 위해 마이크로 패턴 표면, 축삭 성장 분석 및 세포 분류와 같은 추가 수정이 가능합니다.

<table><tbody><tr><td>10 mL 혈청학적 피펫</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-26D</td><td></td></tr><tr><td>1-thio-glycerol</td><td>Sigma</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>2 mL 혈청학적 피펫</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-26B</td><td></td></tr><tr><td>250 mL 필터 장치, 0.2 &마이크로; m aPES, 50 mm Dia</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB12566502</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Easy Grip Tissue Cluture Dish</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>4D Nucleofector 코어 유닛</td><td>Lonza</td><td>276885</td><td>Nucleofector</td></tr><tr><td>5 mL 혈청학 피펫</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-25D</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Easy Grip Tissue Culture Dish</td><td>Falcon</td><td>353004</td><td></td></tr><tr><td>6-well 초저 부착 플레이트</td><td>Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>9" 일회용 파스퇴르 피펫</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20D</td><td></td></tr><tr><td>아포 트랜스페린</td><td>Sigma</td><td>T1147</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA)</td><td>Sigma</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 등급 물</td><td>Cytiva</td><td>SH30529.02</td><td></td></tr><tr><td>화학적으로 정의된 지질 농축액</td><td>Gibco</td><td>11905031</td><td></td></tr><tr><td>Chroman 1</td><td>Cayman</td><td>34681</td><td></td></tr><tr><td>Class II, Type A2, 생물 안전 캐비닛</td><td>NuAire, Inc.</td><td>NU-540-600</td><td>후드, 자외선</td></tr><tr><td>Costar 24웰 플레이트, TC 처리</td><td>Corning</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>Costar 6웰 플레이트, TC 처리</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>DAPI 솔루션</td><td>Thermo Scientific</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>DMSO(Dimethly sulfoxide)</td><td>Sigma</td><td>D2438</td><td></td></tr><tr><td>DPBS+/+</td><td>Gibco</td><td>14040133</td><td></td></tr><tr><td>Emricasan</td><td>Cayman</td><td>22204</td><td></td></tr><tr><td>Epi5 episomal iPSC 재프로그래밍 키트</td><td>Life Technologies</td><td>A15960</td><td></td></tr><tr><td>Essential 8-Flex</td><td>Gibco A2858501</td><td></td><td>PSC 매체, 열 안정성 FGF2</td></tr><tr><td>EVOS XL Core 이미징 시스템</td><td>, Life Technologies</td><td>AMEX1000</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 세럼 - Premium Select</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>FGF2</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX 보충제</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>L-알라닌-L-글루타민 보충제</td></tr><tr><td>Ham's F12 영양 믹스</td><td>Gibco</td><td>11765054</td><td></td></tr><tr><td>HERAcell VIOS 160i CO2 인큐베이터</td><td>Thermo Scientific</td><td>50144906</td><td></td></tr><tr><td>인간 안티 EN2, 마우스</td><td>산타 크루즈 생명 공학</td><td>sc-293311</td><td></td></tr><tr><td>인간 안티 Ki67 / MKI67, 토끼</td><td>R & D Systems</td><td>MAB7617</td><td></td></tr><tr><td>Human anti-PTF1a, rabbit</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-98726</td><td></td></tr><tr><td>Human anti-TUBB3,</td><td>mouse Biolegend</td><td>801213</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Gibco 12440053</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Gibco</td><td>12585</td><td></td></tr><tr><td>Laminin Mouse Protein</td><td>Gibco</td><td>23017015</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Matrix</td><td>Corning</td><td>354234</td><td>Basement membrane matrix</td></tr><tr><td>MEM-NEAA</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Mini Centrifuge</td><td>Labnet International</td><td>C1310</td><td>벤치탑 미니 원심분리기</td></tr><tr><td>Monarch RNA Cleanup Kit (50 &micro; g)</td> <td>New England BioLabs</td><td>T2040</td><td>실리카 스핀 컬럼</td></tr><tr><td>Monarch Total RNA Miniprep Kit</td><td>New England BioLabs</td><td>T2010</td><td>실리카 스핀 컬럼</td></tr><tr><td>N-2 보충제</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>PFA 16%</td> <td>전자 현미경 과학</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>폴리아민 보충제</td><td>Sigma</td><td>P8483</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Ornithine (PLO)</td><td>Sigma</td><td>3655</td><td></td></tr><tr><td>염화칼륨</td><td>Sigma</td><td>746436</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Sigma</td><td>54317</td><td></td></tr><tr><td>투명 셀프 밀봉 파우치</td><td>Steriking</td><td>SS-T2 (90x250)</td><td>오토클레이브 파우치</td></tr><tr><td>나트륨 구연산 이수화물&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S279-500</td><td></td></tr><tr><td>주사기 필터, 멸균, PES 0.22 &마이크로; m, 30 mm Dia</td><td>Research Products International</td><td>256131</td><td></td></tr><tr><td>Trans-ISRIB</td><td>Cayman</td><td>16258</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol 시약</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td>Phenol 및 guanidine isothiocyanate</td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme (1x)</td><td>Gibco</td><td>12604039</td><td>세포 해리 시약&nbsp;</td></tr><tr><td>증기압 삼투압계</td><td>Wescor, Inc.</td><td>모델 5520</td><td>삼투압계</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Biogems</td><td>1293823</td><td></td></tr></tbody></table>

2d 구조에서 체 외에서 인간 소뇌 발달 모델링

Modeling Human Cerebellar Development In Vitro in 2D Structure

소뇌의 정확하고시기 적절한 발달은 정확한 운동 조정과 균형뿐만 아니라인지에도 중요합니다. 또한 소뇌 발달의 혼란은 자폐증, 주의력 결핍 과잉 행동 장애 (ADHD) 및 정신 분열증을 포함한 많은 신경 발달 장애와 관련이 있습니다. 인간의 소뇌 발달에 대한 조사는 이전에 사후 연구 또는 신경 영상을 통해서만 가능했지만 이러한 방법은 많은 신경 발달 장애가 발생하는 초기 발달 동안 생체 내에서 발생하는 분자 및 세포 변화를 이해하기에 충분하지 않습니다. 체세포에서 인간 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)를 생성하는 기술의 출현과 iPSC를 뉴런으로 재 분화시키는 능력은 초기 뇌 발달의 시험관 내 모델링을위한 길을 열었습니다. 본 연구는 2차원(2D) 단층 구조가 필요한 응용 분야를 위해 소뇌 세포를 생성하기 위한 단순화된 단계를 제공합니다. 초기 발달 단계를 나타내는 소뇌 세포는 다음 단계를 통해 인간 iPSC에서 파생됩니다 : 먼저 배아체를 3 차원 (3D) 배양으로 만든 다음 FGF2 및 인슐린으로 처리하여 소뇌 운명 사양을 촉진하고 마지막으로 폴리 -l- 오르니 틴 (PLO) / 라미닌 코팅 기판에서 단층으로 말단으로 분화됩니다. 분화 35일째에 iPSC 유래 소뇌 세포 배양은 ATOH1, PTF1α, PAX6 및 KIRREL2를 포함한 소뇌 마커를 발현하며, 이는 이 프로토콜이 글루타메이트성 및 GABAergic 소뇌 뉴런 전구체와 푸르킨제 세포 전구체를 생성함을 시사합니다. 또한, 분화 된 세포는 뚜렷한 뉴런 형태를 나타내며 TUBB3와 같은 뉴런 정체성의 면역 형광 마커에 양성입니다. 이 세포는 세마포린 -4C, 플렉신 -B2 및 뉴로 필린 -1을 포함한 축삭 유도 분자를 발현하며 신경 돌기 성장 및 시냅스 연결성의 분자 메커니즘을 조사하기위한 모델이 될 수 있습니다. 이 방법은 2D 단층 형식이 필요한 유전자 발현, 생리학 및 형태학적 연구를 포함한 다운스트림 응용 분야에 유용한 인간 소뇌 뉴런을 생성합니다.

3D에서 2D로의 소뇌 분화 개요 소뇌 세포는 iPSC에서 시작하여 생성됩니다. 그림 1A 는 전체 워크플로와 차별화를 위한 주요 구성 요소의 추가를 보여줍니다. 0일째에 EB는 SB431542 및 Y-27632가 포함된 CDM의 당겨진 유리 피펫을 사용하여 iPSC 콜로니(그림 1B)를 부드럽게 들어 올리고 초저 부착 플레이트에 배치하여 만듭니다. FGF2는 2일째에 추가됩니다. 7 일째에 배지의 1/3이 변경되고 EB 형성이 관찰됩니다 (그림 1C). 14일째에 확대된 EB(그림 1D)를 Y-27632가 보충된 CDM의 PLO/라미닌 코팅 접시에 도금합니다. 15일째에, 배지는 Y-27632가 없는 CDM으로 대체된다. 세포는 코팅된 표면을 따라 EB(<strong class="...

본 프로토콜은 소뇌 발달의 초기 단계를 조사하기 위해 유도 만능 줄기 세포로부터 소뇌 세포의 2D 단층 생성을 설명합니다.

2D 구조에서 체 외에서 인간 소뇌 발달 모델링

The precise and timely development of the cerebellum is crucial not only for accurate motor coordination and balance but also for cognition. In addition, ...

이 방법은 초기 인간 소뇌 발달과 신경 정신 장애에서 어떻게 변경 될 수 있는지 연구하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법의 주요 장점은 복잡한 단계를 수행하지 않고 2D 층 구조로 발달 초기 인간 소뇌 세포를 생성한다는 것입니다. 또한 비용 효율적입니다.당김 피펫을 만드는 것은 처음에는 까다로울 수 있지만 연습과 시간을 통해 작업하기 쉬운 방식으로 피펫을 당기는 것이 더 쉬워집니다. 분젠 버너 위의 목 아래 약 22.9cm 파스퇴르 피펫을 당겨 실험 준비를 시작하여 두 개의 유리 피펫을 만듭니다. 더 얇은 쪽은 다른 쪽보다 약 4cm 짧습니다.당겨진 쪽의 끝을 화염에 구부려 부드러운 R을 만든 다음 당겨진 피펫을 오토 클레이브 슬리브에 넣고 오토 클레이브에서 멸균하십시오. 0일째에 10마이크로몰 Y-27632 및 SB-431542가 보충된 소뇌 분화 배지 1밀리리터를 6웰 초저 부착물 또는 ULA, 플레이트의 각 웰에 추가하고 들어 올린 콜로니를 웰에 추가할 준비가 될 때까지 인큐베이터에 넣습니다. 뽑은 유리 피펫을 사용하여 분화된 세포를 세척합니다.배지를 흡인하고 각 35mm 접시에 1mm의 iPSC 패시징 솔루션을 추가합니다. 섭씨 37도에서 3 분간 배양 한 후 배지를 흡인하고 10 마이크로 몰 Y-27632 및 SB-431542가 보충 된 소뇌 분화 배지 2mm를 추가합니다 투과광 도립 현미경의 4 배 배율에서 당겨진 유리 피펫의 구부러진 가장자리를 사용하여 콜로니를 들어 올립니다. 모든 콜로니가 들어 올려지면 10 밀리리터 혈청 학적 피펫을 사용하여 모든 콜로니를 6 웰 ULA 플레이트의 한 웰로 부드럽게 옮깁니다.각 iPSC 플레이트에 대해 이 과정을 반복하고 세포를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소와 함께 배양합니다. 둘째 날에 FGF2를 각 웰에 추가하여 밀리리터당 50나노그램의 최종 농도를 조정합니다. 일곱째 날에는 1 밀리리터의 사용 된 배지를 흡인하고 1 밀리리터의 신선한 소뇌 분화 배지로 교체하여 배지의 1/3을 변경하십시오.배아체를 7 일 동안 배양하십시오. 14일째에 플레이트를 소용돌이치게 하여 플레이트 중앙에 있는 모든 배아체를 모은다. 그런 다음 플레이트를 기울이고 가장자리에서 1000 마이크로 리터 피펫을 사용하여 모든 사용 된 매체를 흡인합니다.중간 양이 감소함에 따라 천천히 판을 평평하게 놓고 계속 흡인하여 배아체가 빠져 나오지 않도록 충분한 배지를 남겨 둡니다. 다음으로, 10 마이크로 몰 Y-27632가 보충 된 신선한 소뇌 분화 배지 3 밀리리터를 첨가하십시오. 그런 다음 10 밀리리터의 혈청 학적 피펫을 사용하여 배아 체를 Poly-L- 오르니 틴 라미닌 코팅 접시로 옮깁니다.15 일째에 배지를 흡인하고 새로운 소뇌 분화 배지로 교체하십시오. 0일째에 iPSC 콜로니를 세척하고 SB-431542 및 Y-27632를 포함하는 소뇌 분화 배지로 들어 올리고 배아체를 생성하기 위한 초저 부착 플레이트에 넣었습니다. 2일째에 FGF2를 첨가하고 7일째에 배지를 1/3로 변경한 결과, 14일째에 배아체가 확대되었습니다.세포는 15일째에 코팅된 표면을 따라 배아체로부터 바깥쪽으로 이동하기 시작했다. 21일째부터 배지가 소뇌 성숙 배지로 완전히 변화한 결과 35일째까지 뉴런과 유사한 형태와 복잡성을 가진 세포의 단층이 생성되었습니다. 35일째의 유전자 발현 분석은 세포가 글루타메이트성 전구 마커, ATOH1, GABA 전구 전구 세포, PTF1 알파 및 푸르킨제 전구 세포 마커 KIRREL2 및 SKOR2와 같은 초기 소뇌 전구 마커를 발현한다는 것을 밝혀냈다.또한, 마름모꼴 립 마커인 OTX2와 대부분 전방 뉴런 특이적 SIX3의 발현도 관찰되었다. 35일째에 수확한 세포의 면역형광 표지는 소뇌 마커 EN2 및 PTF1 알파, 뉴런 마커 베타 튜불린 III 및 증식 마커 KI67에 대해 양성 염색을 나타내었다. 4'6-디아미디노-2-페닐인돌 또는 DAPI를 사용한 핵 염색은 세포핵을 보여주었습니다.성공적인 차별화를 위해서는 건강하고 미분화된 iPSC 콜로니로 시작하여 가능한 한 신선하게 재구성된 시약을 사용하는 것이 중요합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오는 인간 유도 만능 줄기 세포를 소뇌 전구 세포로 분화시키는 프로토콜을 보여줍니다. 여기에는 줄기세포 군체를 초저 부착 플레이트로 옮겨 배아체를 형성하고, 성장 인자로 분화를 촉진한 다음, 배아체를 접착을 위해 매트릭스 코팅된 플레이트로 옮기는 작업이 포함됩니다. 후속 단계에는 세포 이동을 유도하고 성숙 배지를 추가하여 글루타메이터 및 GABAergic 소뇌 신경 세포 전구체와 Purkinje 세포 전구체의 발달을 안내하는 것이 포함됩니다.

유도 만능 줄기 세포에서 소뇌 세포의 2D 단층을 생성하는 기술

이 비디오는 마우스의 일차 소뇌 과립 뉴런에서 뉴런 손상 모델의 생성을 보여줍니다. 흥분성 신경전달물질 수용체 작용제인 NMDA와 공동 작용제인 글리신을 사용하여 신경 손상을 유도하는 데 필요한 단계를 설명합니다. NMDA와 글리신은 특정 신경 수용체에 결합하여 과도한 자극을 유발하고 세포 내 칼슘을 대량으로 유입시켜 신경 세포 손상과 사멸을 초래합니다.

Modeling Neuronal Injury in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons(마우스 1차 소뇌 과립 뉴런의 뉴런 손상 모델링)

소뇌 외부 과립 층은 개발 뇌에서 가장 큰 교통 증폭의 사이트입니다. 여기, 우리는 배아의 날 (14) 병아리 배아에서 생체 전기와 소뇌 조각의 문화를 사용하여 확산의 절정에이 계층에 유전자 변형을 대상으로하는 프로토콜을 제시한다.

예 생체 병아리 소뇌 조각의 문화가 공간적으로 Electroporation에 과립 세포 전구체의 표적

이 프로토콜 분리 하 고 기본 마우스 뇌과 립 신경 (CGNs) 6-7 주 오래 된 강아지, 손실에 대 한 CGNs의 효율적인 변환 및 기능 연구의 이득에서에서 경작 하 고 NMDA 유발 신경 excitotoxicity, 모델링에 대 한 간단한 방법을 설명 합니다. 낮은 칼륨-유도 된 세포 죽음, DNA 손상 및 산화 스트레스 같은 문화 모델을 사용 하...

신경 죽음 및 마우스 기본 소 뇌과 립 신경에 변성을 모델링

우리 간단한 3D 차별화를 사용 하 여 hPSCs에 대 한 프로토콜 정의 매체를 설명 하 고 초기 neuroepithelial 구조와 셀 집계를 생성할 수와 소 뇌 관련 표식으로 옵션에 대 한 긍정적인 성장 요인 감소 기능적 뉴런을 생성 하는 단층으로 셀을 차별화 하는 데 2D 수정.

효율적인된 3D 소 뇌 분화 프로토콜 옵션 2D 수정

여기 우리 organotypic 슬라이스 문화 마우스 소 뇌 및 myelination와 중앙 신 경계에 remyelination의 메커니즘을 조사 적합 immunohistochemistry에 의해 얼룩 myelin 칼 집에서 준비 하는 방법을 제시.

준비 및 Immunostaining Myelinating Organotypic 소 뇌 조각 문화

이 프로토콜은 인간 다능성 줄기 세포의 제어된 크기 응집을 생성하고 단일 사용 생물 반응기를 사용하여 화학적으로 정의되고 피더가 없는 조건하에서 소뇌 유기체의 분화를 더욱 자극하는 동적 배양 시스템을 설명합니다.

인간 다능성 줄기 세포에서 성숙한 소뇌 오르가노이드의 확장 가능한 생성 및 면역 염색에 의한 특성화

여기에서 우리는 출생 후 뇌 발달 과정에서 마우스 소뇌에서 과립 뉴런의 시냅스 형성을 시각화하는 방법을 설명합니다.이 세포는 시냅스 구조를 개선하고 시냅스를 형성하여 전체 뇌 회로에 통합됩니다.

소뇌 과립 뉴런 형태 및 시냅스 발달을 연구하기 위해 생체 내 출생 후 전기천공법 활용

당사는 2D 및 3D 인간 유도 다능성 줄기세포(hIPSC)의 생성 및 특성화에 대한 상세한 프로토콜뿐만 아니라 1차 실슘(PC) 생체 발생 및 기능의 질적 및 정량적 분석을 가능하게 하는 보완적 방법론을 제시합니다.

2D 및 3D 인간 유도 만능 줄기 세포 기반 모델은 신코르티컬 개발 중 1 차용성 개입을 해부합니다.

이 동영상은 E13 쥐 등의 척수에서 뉴런을 해부하다 commissural과 문화에 대한 방법을 보여줍니다. Dissociated commissural 뉴런이 축삭의 성장과지도의 세포 및 분자 메커니즘을 연구하는 데 유용합니다.

배아 척수에서 뉴런의 Commissural 해부와 문화

배우세요 iPSC에서 2D 단층 소뇌 세포 배양법을 통해 인간 소뇌 초기 발달을 연구하는 방법을. 이 비용 효율적인 기술은 신경정신질환 관련 발달 메커니즘 규명에 활용됩니다.

2D 구조에서 체 외에서 인간 소뇌 발달 모델링

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