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저자들은 K7 계열의 세포를 제공해준 Jared Sterneckert 박사에게 감사의 뜻을 전합니다. 또한 엔지니어링 측면에 도움을 준 애리조나 대학의 오랜 협력자인 Frederic Zenhausern 박사와 Matthew W. Barret 박사에게도 감사의 뜻을 전합니다. 또한 neuroHuMiX의 개략적인 표현을 설계하는 데 도움을 주신 Valentina Galata 박사님께도 감사드립니다. 이 프로젝트는 유럽 연합의 Horizon 2020 연구 및 혁신 프로그램(보조금 계약 863664)에 따라 유럽 연구 위원회(ERC)로부터 자금을 지원받았습니다. 그림 1 은 부분적으로 Biorender.com 사용하여 작성되었습니다.

<ol><li>Heintz-Buschart, A., Wilmes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+gut+microbiome%3A+function+matters%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Human gut microbiome: function matters.</a> Trends in Microbiology. 26 (7), 563-574 (2018).</li>
<li>Toor, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysbiosis+disrupts+gut+immune+homeostasis+and+promotes+gastric+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Dysbiosis disrupts gut immune homeostasis and promotes gastric diseases.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (10), 2432(2019).</li>
<li>Braak, H., de Vos, R. A. I., Bohl, J., Del Tredici, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastric+%CE%B1-synuclein+immunoreactive+inclusions+in+Meissner%27s+and+Auerbach%27s+plexuses+in+cases+staged+for+Parkinson%27s+disease-related+brain+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Gastric α-synuclein immunoreactive inclusions in Meissner's and Auerbach's plexuses in cases staged for Parkinson's disease-related brain pathology.</a> Neuroscience Letters. 396 (1), 67-72 (2006).</li>
<li>Schmit, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+fibre+deprivation+and+bacterial+curli+exposure+shift+gut+microbiome+and+exacerbate+Parkinson%27s+disease-like+pathologies+in+an+alpha-synuclein-overexpressing+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Dietary fibre deprivation and bacterial curli exposure shift gut microbiome and exacerbate Parkinson's disease-like pathologies in an alpha-synuclein-overexpressing mouse.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Fritz, J. V., Desai, M. S., Shah, P., Schneider, J. G., Wilmes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+meta-omics+to+causality%3A+experimental+models+for+human+microbiome+research%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">From meta-omics to causality: experimental models for human microbiome research.</a> Microbiome. 1 (1), 14(2013).</li>
<li>Fattahi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deriving+human+ENS+lineages+for+cell+therapy+and+drug+discovery+in+Hirschsprung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Deriving human ENS lineages for cell therapy and drug discovery in Hirschsprung disease.</a> Nature. 531 (7592), 105-109 (2016).</li>
<li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ-on-a-chip%3A+Recent+breakthroughs+and+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22BioMedical+Engineering+Online%22%5BJournal%5D)">Organ-on-a-chip: Recent breakthroughs and future prospects.</a> BioMedical Engineering Online. 19 (1), 9(2020).</li>
<li>May, S., Evans, S., Parry, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids%2C+organs-on-chips+and+other+systems%2C+and+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Topics+in+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Organoids, organs-on-chips and other systems, and microbiota.</a> Emerging Topics in Life Sciences. 1 (4), 385-400 (2017).</li>
<li>Shah, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidics-based+in+vitro+model+of+the+gastrointestinal+human-microbe+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A microfluidics-based in vitro model of the gastrointestinal human-microbe interface.</a> Nature Communications. 7, 11535(2016).</li>
<li>Greenhalgh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+in+vitro+and+in+silico+modeling+delineates+the+molecular+effects+of+a+synbiotic+regimen+on+colorectal-cancer-derived+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Integrated in vitro and in silico modeling delineates the molecular effects of a synbiotic regimen on colorectal-cancer-derived cells.</a> Cell Reports. 27 (5), 1621-1632 (2019).</li>
<li>Mao, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+metabolic+links+between+the+murine+microbiome+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Genetic and metabolic links between the murine microbiome and memory.</a> Microbiome. 8 (1), 53(2020).</li>
<li>Moysidou, C. M., Owens, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+modelling+the+human+microbiome-gut-brain+axis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Advances in modelling the human microbiome-gut-brain axis in vitro.</a> Biochemical Society Transactions. 49 (1), 187-201 (2021).</li>
<li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transneuronal+propagation+of+pathologic+%CE%B1-synuclein+from+the+gut+to+the+brain+models+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Transneuronal propagation of pathologic α-synuclein from the gut to the brain models Parkinson's disease.</a> Neuron. 103 (4), 627-641 (2019).</li>
<li>Hugenholtz, F., de Vos, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+for+human+intestinal+microbiota+research%3A+a+critical+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Mouse models for human intestinal microbiota research: a critical evaluation.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (1), 149-160 (2018).</li>
<li>Marshall, J. J., Mason, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+vs+man%3A+Organoid+models+of+brain+development+%26+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Mouse vs man: Organoid models of brain development & disease.</a> Brain Research. 1724, 146427(2019).</li>
<li>Goers, L., Freemont, P., Polizzi, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-culture+systems+and+technologies%3A+taking+synthetic+biology+to+the+next+level%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Society+Interface%22%5BJournal%5D)">Co-culture systems and technologies: taking synthetic biology to the next level.</a> Journal of the Royal Society Interface. 11 (96), 20140065(2014).</li>
<li>Sedrani, C., Wilmes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+hypothesis-driven%2C+personalized+microbiome+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports+Methods%22%5BJournal%5D)">Toward hypothesis-driven, personalized microbiome screening.</a> Cell Reports Methods. 2 (1), 100139(2022).</li>
</ol>

P.W.는 특허 PCT/EP2013/056607, PCT/EP2016/062024, PCT/US2017/061602 및 PCT/EP2019/081424에 발명자로 등재됨을 선언합니다. P.W., C.S. 및 L.G.는 특허 LU503075에 발명자로 등재되어 있음을 선언합니다.

인간의 장내 마이크로바이옴이 숙주의 건강과 질병에 영향을 미친다는 사실이 밝혀졌습니다. 특히 알츠하이머병이나 파킨슨병과 같은 신경 질환에서 마이크로바이옴의 중요성을 시사하는 지식에도 불구하고3,13 장내 마이크로바이옴이 장 신경계와 어떻게 상호 작용하는지, 그리고 더 나아가 뇌와 어떻게 상호 작용하는지는 거의 알려져 있지 않습니다.
장내 마이크로바이옴과 신경계 사이의 상호작용을 연구하는 대표적인 모델은 지금까지 발견되지 않았습니다. 장-뇌 축(gut-brain axis)에 관한 연구는 전통적으로 쥐 모델(murine model)을 사용하여 수행되어 왔다13. 생쥐와 인간은 게놈 염기서열의 85%를 공유하지만14, 생쥐와 인간을 비교할 때 고려해야 할 중요한 차이점이 있다. 장과 관련하여 인간에 비해 쥐는 독점적으로 초식 동물이라는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 그 결과, 위장관의 길이와 특징이 다르는데, 예를 들어 '위 배출'(gastric emptying)이 그것이다.14 쥐의 뇌는 또한 쥐와 인간의 전체적인 구조가 다르다는 중요한 차이점을 보여준다15. 중요한 것은, 인간은 신경 전구 세포의 세포주기 시간이 더 길다는 것이다15. 따라서 장 및 신경 세포를 포함한 인간 유래 세포를 포함하는 대표 모델을 개발하는 것이 중요하다5. 이러한 맥락에서 시험관 모델을 통해 보다 재현성 있는 연구를 개발하면 동물 모델을 사용할 필요성이 줄어들고 재현성이 향상됩니다.
neuroHuMiX는 이전 HuMiX 모델9의 고급 버전입니다. HuMiX는 상피 세포와 박테리아 세포의 근접 및 대표 공동 배양을 가능하게 하는 gut-on-a-chip 모델입니다. 세포 간 통신은 반투과성 막을 통한 분비 인자 및 대사 산물의 근위 공동 배양 및 확산을 통해 가능합니다. 그러나 인간의 장내 환경을 연구하기 위한 초기 장치의 유용성을 확장하기 위해서는 추가적인 세포 유형의 도입이 필요합니다. 이 문제를 해결하기 위해 iPSC 유래 EN의 도입으로 개발된 neuroHuMiX는 박테리아, 장 상피 세포 및 EN의 근위 공동 배양을 가능하게 합니다. 그 결과로 나온 체외 모델을 통해 인간 신경계와 관련된 인간 장내 마이크로바이옴에 관한 질문을 해결할 수 있습니다. 서로 다른 세포 유형, 특히 포유류 세포와 박테리아의 공동 배양은 생존력 손실, 접착력 저하 및 합류16의 전반적인 손실을 포함하여 몇 가지 문제가 있습니다. 여기에서 우리는 이 장치 내에서 세포 생존율을 높게 유지하면서 동일한 시스템 내에서 세 가지 다른 세포 유형을 공동 배양할 수 있음을 입증했습니다.
프로토콜의 중요한 단계는 장치에 접종하기 전에 신경 세포의 밀도(80%-90% 세포 밀도 및 생존율)를 보장하는 것입니다. 실행 중에는 세포 성장을 평가할 수 없기 때문에 모델에 세포를 도입하기 전에 세포가 합류하고 잘 성장하는지 확인하는 것이 가장 중요합니다. 이것이 제한 요인이 될 수 있지만 장치 내에서 관찰되는 전반적인 생존 가능성과 밀도는 일반적으로 높습니다.
이 장치는 튜브 라인을 통해 연동 펌프에 연결됩니다. 각 셀 챔버에는 특정 튜빙 라인이 있습니다. 튜빙은 매체의 관류를 위해 연동 펌프를 사용할 수 있는 펌프 튜빙과 펌프 튜빙을 장치에 연결하는 튜빙 및 장치를 유출/폐기물 병에 연결하는 튜빙으로 구성됩니다. 샘플링 포트는 유출 매체의 접종 및 샘플링을 허용하기 위해 장치 전후에 포함됩니다. 각 챔버는 서로 다른 배지에 연결할 수 있어 각 개별 세포 유형에 가장 적합한 배양 조건을 제공할 수 있습니다. 각 챔버는 매체 공급에 대한 특정 요구 사항에 따라 열거나 닫을 수 있습니다. 이 장치에서 신경 챔버는 대부분의 실험 동안 닫힌 상태로 유지되는 반면 박테리아 및 상피 챔버는 항상 열려 있어 전체 실험 실행 동안 신선한 배지를 얻습니다. 매체가 중단 없이 흐르도록 하려면 튜브, 커넥터 또는 장치에 공기가 남아 있지 않도록 하는 것이 중요합니다. 따라서 먼저 프라이밍 단계에서 장치를 몇 분 동안 실행하는 것이 중요합니다. 이렇게 하면 문제가 해결되는 경우가 많습니다. 그렇지 않은 경우 유출의 3방향 스톱콕을 닫아 떨어지는 다른 라인 중 하나를 짧은 시간 동안 닫을 수 있습니다. 이렇게 하면 매체가 기포가 있는 라인으로 리디렉션되어 튜브를 통해 기포를 바깥쪽으로 밀어 문제를 해결합니다.
모든 세포 배양 실험에서 배지는 각 세포 유형마다 해당 배지가 있는 핵심 구성 요소입니다. 공동 배양 설정에서 배지는 배지에서 자라는 세포 유형뿐만 아니라 공동 배양 내의 다른 세포 유형과도 호환되어야 합니다. 이것은 장치에서도 다르지 않으며, 내부에 박테리아, 상피 및 신경 세포의 세 가지 다른 세포 유형이 있는 세 개의 다른 구획이 있기 때문에 추가적인 문제를 제기합니다. 그러나 우리는 10% FBS가 있는 RPMI 1640에 5% MRS를 추가하여 박테리아 배지를 변형시킴으로써 모든 세포 유형, 특히 박테리아 및 상피 세포가 시스템 내에서 성공적으로 공동 배양될 수 있음을 보여주었습니다. 그러나 장치에서는 서로 다른 세포 유형이 근접하여 공동 배양되므로 서로 직접 접촉하지 않습니다. 이것이 인간 장에서 세포 간의 직접적인 접촉을 완전히 대표하지 못하여 한계가 있지만, 근위부 및 대표성 공동 배양 조건은 다운스트림 분석에 강점이 됩니다. 용해성 인자는 서로 다른 챔버와 세포 유형 사이에서 교환됩니다. 따라서 세포는 여전히 서로 상호 작용하고 있습니다. 또한 세포 유형을 개별적으로 채취하고 분석할 수 있다는 사실을 통해 다양한 세포 유형(신경 세포 포함)에 대한 건강한 및/또는 질병 마이크로바이옴의 영향을 연구하여 세포 유형별 판독값을 결정/검색할 수 있습니다. 또 다른 한계는 각 실험이 끝날 때만 장치를 열고 세포를 확인할 수 있기 때문에 실험 실행 중에 세포의 형태를 추적할 수 없다는 것입니다.
우리가 아는 한, neuroHuMiX는 EN을 포함한 최초의 gut-on-a-chip 모델입니다. 이는 장내 미생물군과 장 신경계 사이의 통신을 밝히기 위한 단계입니다. 박테리아 종, 상피층 및 EN 간의 상호 작용을 조사할 수 있는 모델입니다. 그 설계를 통해 서로 다른 세포 유형에 의해 분비되는 용해성 인자의 교환과 서로에 미치는 영향을 연구할 수 있습니다. 앞으로는 iPSC 유래 EN뿐만 아니라 iPSC 유래 상피 세포를 장치 내부에 두어 장치를 개인화된 모델로 전환하는 것이 중요할 것입니다. 중요한 것은, 이 개인화된 모델은 프리바이오틱스(pre-biotics), 프로바이오틱스(pro-), 그리고 신바이오틱스(synbiotics)10,11를 테스트하고 잠재적으로 개인화된 스크리닝 및 치료적 접근법을 개발하기 위해 사용될 수 있다는 것이다 17. 개인화된 neuroHuMiX는 궁극적으로 인간 장내 마이크로바이옴의 '암흑 물질'과 장내 마이크로바이옴-신경계 축을 따라 신경계와의 상호 작용을 밝혀 치료 평가 및 개입을 위한 길을 열 수 있습니다.
우리는 장 신경계를 포함한 gut-on-a-chip을 가질 수 있다는 것이 장내 마이크로바이옴-신경계 축을 따른 상호 작용에 대한 연구와 이해를 진전시키는 데 중요하다는 결론을 내릴 수 있습니다. NeuroHuMiX를 사용하면 박테리아 종이 숙주 세포에 미치는 영향을 연구할 수 있으며 생리학적으로 훨씬 더 대표적인 방식으로 모델을 더욱 개선할 수 있는 좋은 기반을 제공합니다.

인간의 장내 마이크로바이옴은 인간의 건강과 질병에 중요한 역할을 합니다. 지난 10년 반 동안 광범위하게 연구되어 왔으며, 건강과 질병을 조절하는 잠재적인 역할이 이제 확립되었습니다1. 불균형한 미생물 군집(dysbiosis)으로 이어지는 마이크로바이옴의 교란은 비만, 염증성 장 질환, 대장암과 같은 많은 만성 질환 또는 파킨슨병과 같은 신경 퇴행성 질환의 발병에 관여하는 것으로 추정되었습니다 2,3.
인간의 장내 마이크로바이옴은 신경학적 상태와 관련이 있지만, 장내 마이크로바이옴이 장 신경계와 어떻게 소통하고 영향을 미치는지는 아직 명확하지 않습니다. 인간의 장 신경계는 즉각적인 연구가 쉽지 않기 때문에 지금까지 동물 모델을 실험에 사용했습니다4. 그러나, 동물 모델과 인간 5 사이의 명백한 차이점을 감안할 때, 인간의 장을 모방한 시험관 내 모델의 개발은 즉각적인 관심의 대상이다. 이러한 맥락에서 인간 유도만능줄기세포(iPSC)의 급성장하고 발전하는 분야는 대표적인 장 뉴런(EN)6을 얻을 수 있게 해주었습니다. iPSC 유래 EN을 사용하면 세포 배양 삽입물, 오가노이드 또는 장기 칩(organs-on-a-chip)과 같은 체외 배양 모델에서 장 신경계를 연구할 수 있습니다 7,8.
인간-미생물 누화(HuMiX) 모델은 인간의 장을 모방한 gut-on-a-chip 모델이다9. 초기 HuMiX 모델(이하 초기 장치라고 함)은 상피 세포(Caco-2) 및 박테리아 세포(10,11)를 수용했습니다. 그러나 장내 마이크로바이옴-신경계 연관성을 연구하기 위해 iPSC 유래ENs 6도 시스템에 도입되었습니다(그림 1). 신경 세포, 상피 세포 및 박테리아 세포의 근위 공동 배양을 통해 다양한 세포 유형을 개별적으로 분석하고 인간 장과 유사한 환경에서 서로 다른 세포 유형 간의 상호 작용을 연구할 수 있습니다.
최근 몇 년 동안 장기 온 칩(organs-on-a-chip)(예: gut-on-a-chip) 모델을 사용하여 보다 생리학적으로 대표적인 방식으로 장기를 연구하기 위한 모델 개발이 이루어졌습니다. 이러한 모델은 지속적인 영양소 공급 및 노폐물 제거뿐만 아니라 산소 수준 또는 장벽 무결성 8,12의 실시간 모니터링으로 인해 인간의 장내 환경을 더 잘 나타냅니다. 이러한 모델은 특히 장내 세균이 숙주 세포에 미치는 영향을 연구할 수 있습니다. 그러나 장내 마이크로바이옴과 신경계 사이의 상호 관계를 연구하기 위해 장기 칩을 사용할 수 있으려면 신경 세포가 이러한 시스템에 통합되어야 합니다. 따라서 HuMiX를 더욱 발전시키고 neuroHuMiX 시스템(이하 장치)을 구축하기 위한 목적은 장 신경 세포를 장 상피 세포 및 박테리아와 근위 공동 배양하는 것을 포함하는 gut-on-a-chip 모델을 개발하는 것이었습니다.

<table><tbody><tr><td>2-메르캅토에탄올</td><td>시그마 알드리치</td><td>10712</td><td></td></tr><tr><td>폭기 캐뉼라(길이: 1.10 직경: 30mm)</td><td>VWR(B.Braun)</td><td>BRAU4190050</td><td></td></tr><tr><td>한천</td><td>Merck Millipore</td><td>1.01614.1000</td><td></td></tr><tr><td>알루미늄 크림프</td><td>글래스거&auml; tebau Ochs</td><td>102050</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>B-27 보충제 - 비타민 A (50x)</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>세균 세포막, 기공 크기: 1 &micro; m</td><td>VWR (Whatman)</td><td>515-2084</td><td></td></tr><tr><td>Caco-2 세포</td><td>DSMZ</td><td>ACC169</td><td></td></tr><tr><td>세포 계수기 & 분석기 CASY</td><td>OMNI Life Sceince</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CHIR</td><td>Axon Mechem BV</td><td>CT99021</td><td></td></tr><tr><td>Collagen I, Rat Tail</td><td>Invitrogen</td><td>A1048301</td><td></td></tr><tr><td>Costar 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Plate Corning</td><td></td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>Difco Lactobacilli MRS Broth</td><td>BD Biosciences</td><td>288130</td><td></td></tr><tr><td>Discofix 3-way stopcock</td><td>B. Braun</td><td>BRAU40951111</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12, 글루타민 없음</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>21331020</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, D-PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>14190-169</td><td></td></tr><tr><td>Essential 6 Medium</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A1516401</td><td></td></tr><tr><td>Essential 8 Medium</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A1517001</td><td></td></tr><tr><td>Female 미늘 커넥터에 대한 Luer Lock</td><td>Qosina</td><td>11733</td><td></td></tr><tr><td>FGF2</td><td>R& D Systems</td><td>233-FB</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>Foetal Bovine Serum, FBS</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>10500-064</td><td></td></tr><tr><td>GDNF</td><td>PeproTech</td><td>450-10</td><td></td></tr><tr><td>인간 세포막, 기공 크기: 50nm</td><td>Sigma Aldrich(GE Healthcare)</td><td>WHA111703</td><td></td></tr><tr><td>HuMiX 개스킷 콜라겐</td><td>Auer Precision</td><td>216891-003</td><td></td></tr><tr><td>HuMiX 개스킷 샌드위치 하단</td><td>Auer Precision</td><td>216891-002</td><td></td></tr><tr><td>HuMiX 개스킷 샌드위치 상단</td><td>Auer Precision</td><td>216891-001</td><td></td></tr><tr><td>iPSC</td><td>Max Planck Institute for Molecular Biomedicine</td><td>K7 line</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine (200 mM)</td><td></td>Engelbreth-Holmswarm Sigma Aldrich의 <td>Gibco</td> 25030081 <td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td></td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>LDN193189</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SML0559</td><td></td></tr><tr><td>Limosilactobacillus reuteri</td><td>ATCC</td><td>23272</td><td></td></tr><tr><td>Live/Dead BacLight 박테리아 생존도 키트</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>L7012</td><td></td></tr><tr><td>Male Luer with Spin Lock to Barb</td><td>Qosina</td><td>11735</td><td></td></tr><tr><td>Marprene 튜빙(0.8mm x 1.6mm)</td><td>Watson-Marlow</td><td>902.0008.J16</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel hESC 인증 매트릭스</td><td>Corning</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>Mucin, 돼지 위</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3924</td><td></td></tr><tr><td>N2 Supplement (100x)</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Needle (길이 : 120 mm, 직경 : 0.80 mm)</td> <td>B.Braun (색상 코드: 녹색)</td><td>466 5643</td><td></td></tr><tr><td>바늘 (길이 : 40mm, 직경 : 0.70mm)</td><td>Henke Sass Wolf (색상 코드 : 검정색)</td> <td>4710007040</td><td></td></tr><tr><td>바늘 (길이 : 80mm, 직경 : 0.60mm)</td><td>B.Braun (색상 코드 : 파란색)</td><td>466 5635</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>PE / Cy7 anti-human CD49d 항체</td><td>Biolegend</td><td>304314</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>시그마 알드리치</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>연동 펌프</td><td>왓슨말로우</td><td>205CA</td><td></td></tr><tr><td>폴리-L-오르니틴 하이드로브로마이드</td><td>시그마 알드리치</td><td>P3655</td><td></td></tr><tr><td>폴리카보네이트 뚜껑(HuMiX)</td><td>University of Arizona</td><td>HuMiX 1.0 / 2.0</td><td></td></tr><tr><td>레티노산</td><td>시그마 알드리치</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>RLT 완충액(RNeasy Minikit)</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>72400-021</td><td></td></tr><tr><td>SB431542, ALK 억제제</td><td>Abcam</td><td>ab120163</td><td></td></tr><tr><td>혈청 병</td><td>Glasger&auml; tebau Ochs</td><td>102091</td><td></td></tr><tr><td>주사기</td><td>BD Biosciences</td><td>309110</td><td></td></tr><tr><td>트립신-EDTA 솔루션</td><td>시그마 Aldrich</td><td>T3924</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 Dihydrochloride</td><td>R& D 시스템</td><td>1254</td><td></td></tr></tbody></table>

장내 마이크로바이옴-신경계 축을 연구하기 위한 gut-on-a-chip 모델

A Gut-on-a-Chip Model to Study the Gut Microbiome-Nervous System Axis

인체는 인간 세포로 구성된 미생물 세포와 적어도 동일한 수의 미생물 세포에 의해 군집화되어 있으며, 이러한 미생물의 대부분은 장에 있습니다. 장내 마이크로바이옴과 숙주 사이의 상호 작용은 광범위하게 연구되어 왔지만, 장내 마이크로바이옴이 장 신경계와 어떻게 상호 작용하는지는 아직 많이 알려져 있지 않습니다. 현재까지 장내 마이크로바이옴-신경계 상호작용을 연구하기 위한 생리학적으로 대표적인 체외 모델은 존재하지 않습니다. 
이 간극을 메우기 위해 유도만능줄기세포 유래 장 뉴런을 장치에 도입하여 인간-미생물 누화(HuMiX) gut-on-chip 모델을 추가로 개발했습니다. 그 결과 'neuroHuMiX'라는 모델을 통해 반투과성 막으로 분리된 미세유체 채널을 통해 박테리아, 상피 및 신경 세포를 공동 배양할 수 있습니다. 서로 다른 세포 유형의 분리에도 불구하고 세포는 용해성 인자를 통해 서로 통신할 수 있으며 동시에 각 세포 유형을 개별적으로 연구할 수 있는 기회를 제공합니다. 이 설정을 통해 장내 마이크로바이옴이 장 신경 세포에 어떤 영향을 미치는지에 대한 첫 번째 통찰력을 얻을 수 있습니다. 이는 인간의 장내 마이크로바이옴-신경계 축을 연구하고 이해하는 데 있어 중요한 첫 번째 단계입니다.

neuroHuMiX에서는 박테리아, 상피 및 신경 세포의 세 가지 다른 세포 유형을 함께 공동 배양했습니다(그림 1). 세포가 모두 생존 가능한지 확인하기 위해 다양한 세포 유형에 대해 다양한 분석을 수행했습니다. 예를 들어, 박테리아 세포에 대한 CFU 수, 상피 세포에 대한 세포 수 및 세포 생존도 분석을 수행했으며 신경 세포는 현미경 분석을 통해 평가했습니다.
<img alt="장-뇌 상호 작용 다이어그램; 생물학적 실험 분석을 위한 다중 챔버 배양 시스템." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64483/64483fig01.jpg" data-altupdatedat="1754907201000" data-alt="Figure 1"> 그림 1: neuroHuMiX 및 실험 설정의 개략도 . (A) 세 개의 챔버는 두 개의 PC 덮개 사이에 고정되어 닫힌 상태를 유지합니다. 각 챔버는 내부에서 자란 세포를 위한 특정 배지로 채워져 있습니다. 서로 다른 챔버는 반투과성 막으로 분리되어 멤브레인을 통과하는 용해성 인자를 통해 세포 통신이 가능합니다. (B) neuroHuMiX 설정의 표현. 각 챔버는 서로 다른 미디어 병에 연결되어 있습니다. 박테리아 챔버의 경우 처음 12.5일 동안 챔버는 RPMI + 10% FBS에 연결되고 마지막 36시간 동안 RPMI + 10% FBS + 5% MRS로 변경됩니다. 약어: PC = 폴리카보네이트; P/L/F = 폴리 L-오르니틴/라미닌/피브로넥틴; RPMI = 로스웰 파크 메모리얼 인스티튜트 세포 배양 배지; MRS = De Man, Rogosa, Shapre 배양 배지. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64483/64483fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
세포가 적절하게 부착되었는지 확인하기 위해 장치를 열 때 콜라겐 코팅 막에 세포층 형성을 평가했습니다(그림 6A). 장치의 세포가 생존 가능한지 확인하기 위해 자동 세포 카운터 계수(그림 6B)와 트리판 블루 배제 분석 세포 계수(그림 6C)를 수행했습니다. 분석은 (i) EN을 사용한 배양 중인 Caco-2, (ii) L. 루테리 를 사용한 배양 중인 Caco-2, (iii) 세 가지 세포 유형 모두의 공동 배양을 포함하는 장치의 세 가지 HuMiX 설정에서 Caco-2 세포에 대해 수행되었습니다. 일원 분산 분석(one-way ANOVA)을 사용한 통계적 테스트에서는 세포 유형 간에 유의미한 차이가 나타나지 않았으며, 이는 Caco-2 세포가 이 연구에서 테스트된 모든 초기 장치 설정 및 조건에서 생존 가능한 상태로 유지되었음을 시사합니다. 이는 L. 루테리 와 두 가지 인간 세포 유형의 공동 배양 중에 도달한 박테리아 밀도가 인간 세포에 대한 세포독성 효과를 갖지 않는다는 사실을 강조합니다.
<img alt="생존율 결과가 있는 바이오프린팅 설정에서 세포 배양; Casy 및 Trypan Blue 분석 상자 그림." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64483/64483fig06.jpg" data-altupdatedat="1754907201000" data-alt="Figure 6"> 그림 6: 콜라겐 코팅 막의 Caco-2 세포 평가. (A) 개봉 후 콜라겐 코팅 막의 Caco-2 세포 층. 화살표는 점선 원으로 둘러싸인 콜라겐 코팅 막을 나타냅니다. Caco-2 세포는 막의 나선형 모양에서 자라고 있었습니다. HuMiX에서 14일 후 Caco-2 세포의 세포 생존율. 세포 계수는 (B) 자동화된 세포 카운터 및 (C) 트리판 블루 배제 분석 세포 계수를 사용하여 얻었다. Caco-2 세포 수는 초기 장치의 다양한 배양 설정, 즉 장 뉴런(EN)과의 공동 배양(검은색), L. 루테리와의 공동 배양(주황색) 및 장치(EN 및 L. 루테리)(파란색)에서 측정되었습니다. 일원 분산 분석(one-way ANOVA)을 수행하여 서로 다른 배양 설정 간에 유의한 차이가 없음을 보여주었습니다(일원 분산 분석, p = 0.1234 [ns]; 오차 막대는 표준 오차를 나타냄). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64483/64483fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
포유류 세포로 L. 루테리 를 배양할 수 있도록 먼저 배양 배지를 장치에 사용할 수 있도록 최적화하고 조정했습니다. RPMI 1640(10% FBS 보충)의 MRS 5% 혼합은 L. 루테리 의 성장에 최적으로 적합하지만 이 분석에 사용된 포유류 세포에는 세포독성이 없음을 발견했습니다. 이어서, 24시간 동안 장치에서 배양했을 때 L. 루테리 의 성장을 평가하기 위해 CFU 계수를 수행했습니다. CFU 수는 두 가지 다른 초기 장치 설정에 대해 평가되었습니다(그림 7)-L. 루테리는 장치에서 Caco-2 및 L. 루테리 와 공동 배양되었습니다 . 두 설정 모두에서 CFU 수는 HuMiX 접종 및 수확된 세포(단방향 ANOVA, p = 0.0002)와 크게 달랐으며, 이는 초기 장치 내에서 박테리아 세포의 성장을 나타냅니다.
<img alt="막대 차트; CFU 분석; 실험군 비교; 통계적 유의성; 미생물학적 결과." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64483/64483fig07.jpg" data-altupdatedat="1754907201000" data-alt="Figure 7"> 그림 7: 접종물의 리모실락토바실러스 루테리 CFU 수(1:100,000 희석) 및 HuMiX에서 24시간 후. 두 가지 다른 설정: L. 루테리 및 장치와 공동 배양 중인 Caco-2 세포. 일원 분산 분석은 접종물과 채취된 세포 사이에 유의미한 차이(p = 0.0002 [***])를 보여주며, 이는 박테리아가 HuMiX 내부에서 성장하고 있음을 의미합니다. 오차 막대는 표준 오차를 나타냅니다. 약기 : CB. HX = Caco-2 박테리아 HuMiX; nHX = neuroHuMiX입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64483/64483fig07large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
장치 내에서 EN을 배양하면 세포의 표현형이 변경되는지 여부를 평가하기 위해 도립 위상차 현미경을 사용하여 EN의 총 형태를 관찰했습니다. 이 단계에서 밀도와 EN 형태를 모두 평가했습니다. 합류 신경 네트워크의 구축은 세포가 코팅된 장치의 PC 뚜껑에 잘 부착되었음을 나타냅니다. 중요한 것은, 이것은 그들이 Caco-2 및 L. reuteri와 함께 공동 배양에서 성장했다는 개념을 강조합니다. 합류하는 뉴런 네트워크와 개스킷으로 묘사된 나선 사이의 가장자리는 분명하게 분명했습니다(그림 8).
<img alt="현미경 이미지, 세포 배양 형태, 200μm 스케일, 생물학적 연구 분석." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64483/64483fig08.jpg" data-altupdatedat="1754907201000" data-alt="Figure 8"> 그림 8: 장치에서 14일 동안 배양한 후 장 뉴런. 이미지의 왼쪽에서 뉴런은 나선형의 합류 층으로 성장했습니다. 뉴런 층과 세포가 없는 공간 사이의 가장자리는 나선의 가장자리입니다. 10배 확대, 스케일 바 = 200μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64483/64483fig08large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="미세유체 칩, 투명 플라스틱, 유체 제어, 실험실 분석, 연구 장치에 사용됩니다." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64483/64483fig02.jpg" data-altupdatedat="1754907201000" data-alt="Figure 2"> 그림 2: 장치에 사용된 덮개. 이미지는 PC 덮개 상단(왼쪽) 및 하단(오른쪽)을 보여줍니다. PC 덮개의 각 면은 6.4cm입니다. 약어: PC = 폴리카보네이트. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64483/64483fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="미세유체 칩 설정, 유체 분리 실험을 위한 나선형 채널 설계, 실험실 분석." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64483/64483fig03.jpg" data-altupdatedat="1754907201000" data-alt="Figure 3"> 그림 3: 하단 PC 덮개의 상피 챔버 개스킷. 하단 PC 덮개에 놓인 상피 챔버 개스킷의 상단 모습(왼쪽)과 하단 뷰(오른쪽)는 상피 챔버 개스킷과 하단 PC 덮개의 입구 및 출구의 정렬을 보여줍니다. 개스킷의 각 측면과 PC 덮개의 크기는 6.4cm입니다. 약어: PC = 폴리카보네이트. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64483/64483fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="미세유체 장치 조립, 레이아웃 및 구성, 나선형 채널 설계, 실험 설정." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64483/64483fig04.jpg" data-altupdatedat="1754907201000" data-alt="Figure 4"> 그림 4: 장치 조립. (A) HuMiX 조립을 위한 다양한 부품: (1) 하단 PC 뚜껑; (2) (1) 위에 배치되는 콜라겐 코팅 미세 다공성 막이 있는 개스킷; (3) 그 사이에 뮤신-코팅된 나노다공성 멤브레인을 가지고, (2)의 상부에 놓인 샌드위치 개스킷; (4) 상단 PC 뚜껑을 (3) 위에 놓습니다. 개스킷과 PC 덮개의 각 측면은 6.4cm입니다. (B) (A)의 모든 부품을 함께 배치합니다. (씨,디) 조립된 장치 상단(왼쪽) 및 측면(오른쪽) view. B는 클램핑 시스템에 배치되어 시스템을 닫습니다. (C) 상단 클램프의 각 측면은 8cm입니다. 약어: PC = 폴리카보네이트. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64483/64483fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="정맥 수액 전달 설정 다이어그램; 튜브, 커넥터, 의료용 주입 시스템용 밸브." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64483/64483fig05.jpg" data-altupdatedat="1754907201000" data-alt="Figure 5"> 그림 5: 하나의 챔버에 대해 튜빙 라인과 조립된 튜빙 라인에 필요한 부품. (A) 튜빙 라인을 구축하기 위한 다른 부품: a. 펌프 튜빙 라인; b. 3방향 마개; c. 40mm 바늘; d. 80mm 바늘; e. 120mm 바늘; f. 긴 튜브 라인(20cm); g. 짧은 튜브 라인(8cm); h. 남성 루어; i. 여성 루어; J. 어댑터. (B) 박테리아 또는 상피 챔버를 위해 조립된 튜브 라인. 신경 챔버의 경우 120mm 바늘을 80mm 바늘로 변경해야 합니다. (C) 3방향 스톱콕 밸브를 돌려 장치의 매체 흐름을 '열린 커넥터'로 리디렉션하고 챔버를 닫습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64483/64483fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>하루</td>
			<td>0</td>
			<td>2</td>
			<td>4</td>
			<td>6</td>
			<td>8</td>
			<td>10</td>
		</tr><tr><td rowspan="6">미디어 구성</td>
			<td>100% E6</td>
			<td>100% E6</td>
			<td>75% 6회</td>
			<td>50% 6회</td>
			<td>25% 6회</td>
			<td>100% N2</td>
		</tr><tr><td>+ LDN</td>
			<td>+ LDN</td>
			<td>N2 25 %</td>
			<td>50% N2</td>
			<td>75% N2</td>
			<td>+ LDN</td>
		</tr><tr><td>+ SB</td>
			<td>+ SB</td>
			<td>+ LDN</td>
			<td>+ LDN</td>
			<td>+ LDN</td>
			<td>+ SB</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>+ 짹짹</td>
			<td>+ SB</td>
			<td>+ SB</td>
			<td>+ SB</td>
			<td>+ 짹짹</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td></td>
			<td>+ 짹짹</td>
			<td>+ 짹짹</td>
			<td>+ 짹짹</td>
			<td>+ RA</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>+ RA</td>
			<td>+ RA</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>분자</td>
			<td>[농도]</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>증권 시세 표시기</td>
			<td>100 nM 수준</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>에스비에스</td>
			<td>10 마이크로미터</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>차르</td>
			<td>3 μM의</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>레티노산(RA)</td>
			<td>1 μM의</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>표 1: 미디어 구성.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>미디어</td>
			<td>성분(농도는 재료 표에 나열됨)</td>
			<td>부피 (mL)</td>
		</tr><tr><td rowspan="5">N2 배지(50mL)</td>
			<td>DMEM-F12 시리즈</td>
			<td>48</td>
		</tr><tr><td>N2 보충제</td>
			<td>0.5</td>
		</tr><tr><td>L-글루타민</td>
			<td>0.5</td>
		</tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td>
			<td>0.5</td>
		</tr><tr><td>네아(NEAA)</td>
			<td>0.5</td>
		</tr><tr><td rowspan="5">N2B27/ENS 배지(50mL)</td>
			<td>신경기저(Neurobasal)</td>
			<td>48</td>
		</tr><tr><td>N2 보충제</td>
			<td>0.5</td>
		</tr><tr><td>L-글루타민</td>
			<td>0.5</td>
		</tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td>
			<td>0.5</td>
		</tr><tr><td>나27-ᅡ</td>
			<td>0.5</td>
		</tr></tbody></table>표 2: 미디어 레시피.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>멸균 온도(°C)</td>
			<td>116</td>
		</tr><tr><td>멸균 시간(분)</td>
			<td>20</td>
		</tr><tr><td>건조 시간(분)</td>
			<td>10</td>
		</tr><tr><td>펄스</td>
			<td>3</td>
		</tr><tr><td>끝 온도(°C)</td>
			<td>99</td>
		</tr></tbody></table>표 3: HuMiX 오토클레이브 실행. 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>분당 회전수(rpm)</td>
			<td>평균 유량(μL/min)</td>
		</tr><tr><td>0.5</td>
			<td>13</td>
		</tr><tr><td>2</td>
			<td>79</td>
		</tr><tr><td>5</td>
			<td>180</td>
		</tr></tbody></table>표 4: 연동 펌프의 유량.

neuroHuMiX는 근접 및 대표 공동 배양 조건에서 박테리아, 상피 및 신경 세포의 상호 작용을 연구하기 위한 고급 gut-on-a-chip 모델입니다. 이 모델을 통해 장내 마이크로바이옴과 신경계 사이의 통신의 기초가 되는 분자 메커니즘을 밝힐 수 있습니다.

The human body is colonized by at least the same number of microbial cells as it is composed of human cells, and most of these microorganisms are located ...

이 프로토콜은 장 신경계의 세포에 대한 박테리아 종의 영향을 처음으로 연구할 수 있다는 점에서 중요합니다. 장 신경계에 쉽게 접근할 수 없기 때문에 이 모델을 통해 장내 마이크로바이옴이 장 신경계의 세포에 미치는 영향을 연구할 수 있습니다. 앞으로 이 모델은 파킨슨병과 같이 질병을 앓고 있는 환자의 장내 마이크로바이옴이 장 신경계의 세포에 어떤 영향을 미치는지 확인하는 데 사용할 수 있습니다.가능한 미래의 목표는 이 모델을 다른 장기 칩 모델과 연결하여 장-뇌 축을 대표하는 모델을 구축하는 것입니다. 프로토콜에는 많은 단계가 포함되어 있고 각 단계는 이 모델의 성공적인 실현에 매우 중요하기 때문에 이 기술의 시각적 시연은 매우 중요합니다. 이 절차를 시연하는 것은 시스템 생태학 연구소의 박사 과정 학생인 Catherine Sedrani입니다.시작하려면 나사를 조여 클램프의 상단 및 하단 부분을 고정하고 코팅 및 건조된 하단 폴리카보네이트 뚜껑을 정사각형 페트리 접시에서 클램프 상단으로 옮깁니다.amp 뚜껑 모서리에 있는 4개의 나사를 잡아 베이스. 멸균 핀셋을 사용하여 멤브레인이 폴리카보네이트 뚜껑을 위로 향하도록 상피 챔버 개스킷을 배치합니다. 개스킷과 뚜껑을 나사로 정렬하여 모서리 입구 및 출구 포트가 개스킷 구멍과 정렬되도록 합니다.샌드위치 개스킷을 윗면이 위를 향하도록 콜라겐 개스킷 위에 놓습니다. 그런 다음 상단 폴리카보네이트 뚜껑을 샌드위치 개스킷 위에 놓습니다. 클램프 뚜껑의 미늘이 멤브레인 어셈블리 입구 및 출구 개구부와 정렬되고 하단 덮개 나사가 상단 덮개의 개구부에 맞는지 확인합니다.장치를 닫으려면 클램프 뚜껑을 폴리카보네이트 뚜껑 위에 놓고 걸쇠를 닫습니다. 튜빙 라인의 프라이밍을 위해 각 유입 및 유출 병의 격막에 필터가 있는 폭기 바늘을 삽입합니다. 깨끗한 멸균 핀셋을 사용하여 250mm 세럼 병에 120mm 바늘을 삽입하고 15mm 세럼 병에 80mm 바늘을 삽입합니다.각 튜브 라인 끝에 있는 40mm 바늘을 유출 혈청 병에 삽입합니다. 상피 및 신경 튜브 라인의 40mm 바늘은 배지 폐기를 위해 동일한 유출 병에 연결됩니다. 박테리아 튜브 라인은 두 번째 유출 병으로 이동합니다.펌프 튜브 라인을 펌프 카세트에 삽입합니다. 5RPM의 속도로 유입에서 유출 병으로 매체를 보내도록 연동 펌프를 설정하고 시작 버튼을 눌러 펌프를 시작합니다. 튜빙 라인의 3방향 마개가 모두 열려 있는지 확인하십시오.매체가 유출 병에 떨어지면 튜브 라인과 연결 지점에 누출이나 기포가 없는지 확인하십시오. 모든 튜브 라인이 유출 병으로 떨어지면 유량을 2RPM으로 설정하여 초기 장치를 연결합니다. 라인을 연결하려면 유출 쪽부터 시작하여 3방향 스톱콕 밸브를 닫습니다.암 루어 커넥터에서 짧은 튜브를 분리하고 튜브를 미늘 위로 밀어 장치의 출구 포트에 부착합니다. 누출 없는 안전한 연결을 위해 튜브를 커넥터 위로 끝까지 밀어 덮개에 닿도록 합니다. 한 줄이 장치에 완전히 연결되면 마개를 엽니다.펌프의 유량을 2RPM으로 설정하고 펌프 속도를 최대 2.5RPM으로 높여 압력 상승으로 인한 누출을 방지하십시오. 펌프가 챔버를 프라이밍하도록 합니다. 모든 챔버가 세포 배양 배지로 채워지고 장치에 기포가 남지 않으면 펌프 속도를 0.5RPM으로 줄입니다.상피 세포의 경우 트립신 EDTA를 사용하여 플라스크에서 Caco-2 세포를 분리합니다. RPMI 1640 플러스 10% FBS에 다시 현탁시키고 트리판 블루 배제 분석을 사용하여 Neubauer 세포 카운터에서 계수합니다. Caco-2 세포 현탁액을 3G에서 3분 동안 원심분리하고 상층액을 폐기하여 EDTA의 나머지 트립을 제거합니다.RPMI 1640에 10%FBS를 더한 Caco-2 세포를 재현탁시켜 밀리리터당 35만 세포의 현탁액을 얻습니다. 1.5ml의 Caco-2 세포 현탁액을 멸균 2mL 주사기에 옮기고 주사기에 남아 있는 기포를 제거합니다. 박테리아 챔버와 신경 챔버의 튜브에 있는 3방향 스톱콕 밸브를 닫고 로터에서 해당 튜브가 있는 카세트를 제거하여 펌프에서 튜브를 분리합니다.상피 챔버로 이어지는 유입 튜브의 스톱콕 밸브 캡을 열고 밸브를 돌려 장치에서 열린 커넥터로 매체 흐름을 리디렉션합니다. 스톱 밸브의 열린 끝에 매체 방울이 나타날 때까지 매체가 흐르도록 하십시오. 상피 세포가 있는 주사기를 드롭-드롭 연결 방식을 사용하여 열린 커넥터에 삽입하여 삽입 중 기포 유입을 방지합니다.꼭지의 밸브를 돌려 유입 병에서 매체의 흐름을 멈추고 연결된 주사기에서 초기 장치로 흐르도록 합니다. 펌프에서 상피 챔버를 분리하고 주사기를 천천히 눌러 상피 챔버에 1.5ml의 세포 현탁액을 접종합니다. 유출 마개의 밸브를 닫고 주사기를 분리합니다.캡으로 마개의 열린 끝을 닫고 챔버를 최소 2시간 동안 닫아 두십시오. 그동안 신경 세포를 접종하십시오. 인큐베이터에서 장치를 제거하고 튜브 라인을 제거한 후 클램프를 천천히 열고 뚜껑을 제거합니다.상단 폴리카보네이트 뚜껑을 조심스럽게 제거하십시오. 1.5밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에 배지를 모아 얼음 위에 놓습니다. 샌드위치 개스킷을 조심스럽게 제거하면서 세포층을 건드리지 않고 상피 챔버에서 배지를 수집합니다.샌드위치 개스킷을 정사각형 페트리 접시에 놓고 챔버가 완전히 덮일 때까지 멸균 0.9% 염화나트륨과 수용액을 박테리아 챔버에 추가합니다. 신경 챔버에서 배지를 수집하면서 콜라겐 개스킷을 천천히 제거합니다. 미디어를 마이크로 원심분리기 튜브로 옮긴 후 튜브를 얼음 위에 놓습니다.콜라겐 개스킷을 정사각형 접시에 넣고 세포층이 완전히 덮일 때까지 Caco-2 층에 PBS 몇 밀리리터를 부드럽게 추가합니다. 하단 폴리카보네이트 뚜껑을 정사각형 페트리 접시에 놓고 샘플링 과정에서 마르지 않도록 신경 세포 위에 약 2ml의 PBS를 부드럽게 추가합니다. 미디어 튜브를 섭씨 4도에서 5분 동안 원심분리합니다.각 튜브의 상층액을 새 마이크로 원심분리기 튜브로 옮긴 후 즉시 드라이아이스 위에 놓습니다. CFU 수는 두 가지 다른 초기 디바이스 설정에 대해 평가되었습니다. 인간 미생물 누화 장치에서 Caco-2 및 L.루테리와 공동 배양된 L.루테리.두 설정 모두에서 CFU 수는 HuMix 접종 및 채취된 세포와 크게 달랐으며, 이는 초기 장치 내부의 박테리아 세포가 성장했음을 나타냅니다. 장치에서 장 뉴런을 배양하면 세포 표현형이 변경되는지 평가하기 위해 역 위상차 현미경을 사용하여 총 형태를 관찰했습니다. 합류 신경 네트워크의 확립은 세포가 코팅 된 장치 폴리 카보네이트 뚜껑에 잘 부착되었음을 나타냅니다.합류하는 뉴런 네트워크와 개스킷으로 묘사된 나선형 사이의 가장자리는 분명하게 드러났습니다. 신경 휴믹스의 잠재력은 대표 모델이 없기 때문에 인간-장내 마이크로바이옴과 장 신경계 간의 상호 작용과 관련하여 이전에 다루기 어려웠던 질문에 답하는 데 있습니다.

a-gut-on-a-chip-model-to-study-the-gut-microbiome-nervous-system-axis

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 인간의 장 - 온 - 어 - 칩 microphysiological 시스템을 사용하여 확장 된 기간 동안 체외 프로토콜 공동 문화 장내 마이크로 바이 옴과 장 융모에 대해 설명합니다.

에 Microengineered 인간의 장내 융모와 생활 마이크로 바이 옴의 공동 문화 창자 - 온 - 어 - 칩 미세 유체 장치

이 문서는 전 생체 내 실험을 위한 새로운 창자 기관 배양 시스템을 사용하여 호스트-미생물군유전체 상호 작용을 분석하기 위한 독특한 방법을 제시합니다.

호스트-미생물군유병 상호 분석을 위한 장 내 장관 장기 배양 시스템

생검 유래 장 오가노이드 및 장기 온 칩 기술은 미세 생리학 플랫폼으로 결합되어 영역 별 장 기능을 재구성합니다.

인간 오가노이드와 장기 온 칩 기술을 결합하여 장 영역별 기능 모델링

이 프로토콜은 질병 발병에 대한 기계론적 연구에 사용할 수 있는 괴사성 장염(NEC)의 시험관 내 모델을 설명합니다. 인간 신생아 장, 내피 세포 및 중증 NEC가 있는 신생아의 장내 마이크로바이옴에서 추출한 장내 장내형 칩을 파종한 것이 특징입니다.

인간 신생아 장 장내염과 디스바이오틱 마이크로바이옴을 통합한 괴사성 장염의 미세유체 모델

개의 장 오가노이드와 Gut-on-a-Chip 미세유체 시스템의 통합은 인간 장 질환에 대한 관련 번역 모델을 제공합니다. 제시된 프로토콜은 장의 3D 형태 형성 및 동적 체외 모델링을 가능하게 하여 One Health를 통해 개와 인간의 장 질환에 대한 효과적인 치료법 개발을 지원합니다.

염증성 장 질환 환자에서 유래한 장 오가노이드를 사용한 개 장내 칩의 3차원 형태 형성

미주 신경에 의해 촉진되는 장과 뇌의 소통은 위장 내분비계와 뇌 사이의 소통에 매우 중요합니다. 그러나 위내 포도당 주입이 대뇌 피질 활동을 변화시킬 수 있는지는 아직 이해되지 않았습니다. 여기에서는 십이지장에 포도당을 주입한 후 대뇌 피질 활동의 변화를 관찰하기 위한 포괄적인 프로토콜을 제공합니다.

장-뇌 신경 통신의 실시간 분석: 장 포도당 자극에 대한 반응의 피질 전체 칼슘 역학

이 기사에서는 미세공기성 조건에서 살아있는 질 마이크로바이옴과 인간 숙주의 상호 작용을 연구할 수 있는 미세유체 질 온 칩(Vagina Chip) 배양 장치를 만들기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 칩은 질 질환을 조사하고 잠재적인 치료 대책을 개발 및 테스트하는 도구로 사용할 수 있습니다.

인간 Vagina-on-a-Chip에서 건강하고 dysbiotic 질 미세환경 모델링

당사의 상세 프로토콜은 3D 구조와 다양한 세포 유형으로 인간의 장 점막을 시뮬레이션하는 고급 intestine-on-chip 모델의 생성 및 사용을 간략하게 설명하여 미생물 집락화에 대한 면역 반응 및 세포 기능에 대한 심층 분석을 가능하게 합니다.

장 점막 면역 반응을 분석하기 위한 Immunocompetent Intestine-on-Chip 모델

임의의 점 kinematograms과 컴퓨터 - 생성 무척추 동물의 비디오 재생을 고용 op​​erant 조절 패러다임을 사용하는 도마뱀의 시각적 감도를 테스트.

도마뱀의 운동의 속도와 방향에 시각 민감도 테스트

컴퓨터에서 생성된 모델로 재키 용이를 사용하여 자극합니다.

컴퓨터가 만든 동물 모델 자극

배우세요 장내 마이크로바이옴과 장신경계 상호작용을 연구하는 neuroHuMiX gut-on-a-chip 모델을 사용하는 방법을. 이 혁신적인 공배양 시스템은 세균, 상피세포, 신경세포 간의 복잡한 교차작용을 시각화하여 파킨슨병 등 신경퇴행성 질환의 장-뇌 축 메커니즘을 규명하는 데 필수적인 연구 도구를 제공합니다.

장내 마이크로바이옴-신경계 축을 연구하기 위한 gut-on-a-chip 모델

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