Name: 생쥐의 부분 간 절제술 후 재생 간세포의 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: 배우세요 생쥐 부분 간 절제술 후 지방 함유 간세포를 보존하는 최적화된 분리 방법. 밀도 구배 원심분리 없이 재생 간세포 연구에 필수적인 세포 회수율을 높여 간 재생 및 대사 질환 연구에 활용할 수 있습니다.

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이 연구는 스위스 국립 재단(프로젝트 보조금 310030_189262)의 지원을 받았습니다.

<ol><li>Higgins, G., Anderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+pathology+of+liver.+I.+Restoration+of+liver+of+white+rat+following+partial+surgical+removal%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Pathology+%26+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Experimental pathology of liver. I. Restoration of liver of white rat following partial surgical removal.</a> Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 12, 186-202 (1931).</li>
<li>Taub, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+regeneration%3A+from+myth+to+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Liver regeneration: from myth to mechanism.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (10), 836-847 (2004).</li>
<li>Nevzorova, Y. A., Tolba, R., Trautwein, C., Liedtke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+hepatectomy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Animal%22%5BJournal%5D)">Partial hepatectomy in mice.</a> Lab Animal. 49, 1 Suppl 81-88 (2015).</li>
<li>Lehmann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+failure+after+extended+hepatectomy+in+mice+is+mediated+by+a+p21-dependent+barrier+to+liver+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Liver failure after extended hepatectomy in mice is mediated by a p21-dependent barrier to liver regeneration.</a> Gastroenterology. 143 (6), 1609-1619 (2012).</li>
<li>Makino, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+good+model+of+hepatic+failure+after+excessive+hepatectomy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Surgical+Research%22%5BJournal%5D)">A good model of hepatic failure after excessive hepatectomy in mice.</a> Journal of Surgical Research. 127 (2), 171-176 (2005).</li>
<li>Lizardo Thiebaud, M. J., Cervantes-Alvarez, E., Navarro-Alvarez, N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLizardo+Thiebaud%2C+MJ+%22Liver+Pathology%22">Liver Pathology</a>. Gayam, V., Engin, O. , IntechOpen. (2019).</li>
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<li>Smedsrød, B., Pertoft, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+pure+hepatocytes+and+reticuloendothelial+cells+in+high+yield+from+a+single+rat+liver+by+means+of+Percoll+centrifugation+and+selective+adherence%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Preparation of pure hepatocytes and reticuloendothelial cells in high yield from a single rat liver by means of Percoll centrifugation and selective adherence.</a> Journal of Leukocyte Biology. 38 (2), 213-230 (1985).</li>
<li>Mederacke, I., Dapito, D. H., Affò, S., Uchinami, H., Schwabe, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-yield+and+high-purity+isolation+of+hepatic+stellate+cells+from+normal+and+fibrotic+mouse+livers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">High-yield and high-purity isolation of hepatic stellate cells from normal and fibrotic mouse livers.</a> Nature Protocols. 10 (2), 305-315 (2015).</li>
<li>Berry, M. N., Friend, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-yield+preparation+of+isolated+rat+liver+parenchymal+cells%3A+a+biochemical+and+fine+structural+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study.</a> Journal of Cell Biology. 43 (3), 506-520 (1969).</li>
<li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+rat+liver+cells.+I.+Effect+of+Ca+2%2B+on+enzymatic+dispersion+of+isolated%2C+perfused+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Preparation of rat liver cells. I. Effect of Ca 2+ on enzymatic dispersion of isolated, perfused liver.</a> Experimental Cell Research. 74 (2), 450-454 (1972).</li>
<li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+isolated+rat+liver+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Preparation of isolated rat liver cells.</a> Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).</li>
<li>Trotter, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fine+structure+study+of+lipid+in+mouse+liver+regenerating+after+partial+hepatectomy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A fine structure study of lipid in mouse liver regenerating after partial hepatectomy.</a> Journal of Cell Biology. 21 (2), 233-244 (1964).</li>
<li>Kachaylo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PTEN+down-regulation+promotes+%CE%B2-oxidation+to+fuel+hypertrophic+liver+growth+after+hepatectomy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">PTEN down-regulation promotes β-oxidation to fuel hypertrophic liver growth after hepatectomy in mice.</a> Hepatology. 66 (3), 908-921 (2017).</li>
<li>Jung, Y., Zhao, M., Svensson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture%2C+and+functional+analysis+of+hepatocytes+from+mice+with+fatty+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture, and functional analysis of hepatocytes from mice with fatty liver disease.</a> STAR Protocols. 1 (3), 100222(2020).</li>
<li>Dold, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Portal+hyperperfusion+after+extended+hepatectomy+does+not+induce+a+hepatic+arterial+buffer+response+%28HABR%29+but+impairs+mitochondrial+redox+state+and+hepatocellular+oxygenation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Portal hyperperfusion after extended hepatectomy does not induce a hepatic arterial buffer response (HABR) but impairs mitochondrial redox state and hepatocellular oxygenation.</a> PLoS One. 10 (11), 0141877(2015).</li>
<li>Boyce, S., Harrison, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+detailed+methodology+of+partial+hepatectomy+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">A detailed methodology of partial hepatectomy in the mouse.</a> Laboratory Animals. 37 (11), 529-532 (2008).</li>
<li>Mitchell, C., Willenbring, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reproducible+and+well-tolerated+method+for+2%2F3+partial+hepatectomy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice.</a> Nature Protocols. 3 (7), 1167-1170 (2008).</li>
<li>Chen, T., Oh, S., Gregory, S., Shen, X., Diehl, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+omics+analysis+reveals+functional+diversification+of+hepatocytes+during+liver+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Single-cell omics analysis reveals functional diversification of hepatocytes during liver regeneration.</a> JCI Insight. 5 (22), (2020).</li>
<li>Chembazhi, U. V., Bangru, S., Hernaez, M., Kalsotra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+plasticity+balances+the+metabolic+and+proliferation+dynamics+of+a+regenerating+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Cellular plasticity balances the metabolic and proliferation dynamics of a regenerating liver.</a> Genome Research. 31 (4), 576-591 (2021).</li>
<li>Fiegel, H. C., Kaufmann, P. M., Kneser, U., Kluth, D., Rogiers, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Priming+of+hepatocytes+for+cell+culture+by+partial+hepatectomy+prior+to+cell+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Priming of hepatocytes for cell culture by partial hepatectomy prior to cell isolation.</a> Journal of Tissue Engineering. 6 (6), 619-626 (2000).</li>
<li>Roche, <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoche%2C++%22Liberase+TM+Research+Grade%22">Liberase TM Research Grade</a>. , (2020).</li>
<li>Giugliano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+C+virus+infection+induces+autocrine+interferon+signaling+by+human+liver+endothelial+cells+and+release+of+exosomes%2C+which+inhibits+viral+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Hepatitis C virus infection induces autocrine interferon signaling by human liver endothelial cells and release of exosomes, which inhibits viral replication.</a> Gastroenterology. 148 (2), 392-402 (2015).</li>
<li>Shetty, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+lymphatic+endothelial+and+vascular+endothelial+receptor-1+mediates+the+transmigration+of+regulatory+T+cells+across+human+hepatic+sinusoidal+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Common lymphatic endothelial and vascular endothelial receptor-1 mediates the transmigration of regulatory T cells across human hepatic sinusoidal endothelium.</a> The Journal of Immunology. 186 (7), 4147-4155 (2011).</li>
<li>Edwards, S., Lalor, P. F., Nash, G. B., Rainger, G. E., Adams, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+traffic+through+sinusoidal+endothelial+cells+is+regulated+by+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte traffic through sinusoidal endothelial cells is regulated by hepatocytes.</a> Hepatology. 41 (3), 451-459 (2005).</li>
<li>Helling, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+failure+following+partial+hepatectomy%5BTitle%5D)+AND+%22HPB%22%5BJournal%5D)">Liver failure following partial hepatectomy.</a> HPB. 8 (3), 165-174 (2006).</li>
<li>Saran, U., Humar, B., Kolly, P., Dufour, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocellular+carcinoma+and+lifestyles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Hepatocellular carcinoma and lifestyles.</a> Journal of Hepatology. 64 (1), 203-214 (2016).</li>
<li>Park, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sugar-sweetened+beverage%2C+diet+soda%2C+and+nonalcoholic+fatty+liver+disease+over+6+years%3A+the+Framingham+Heart+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Gastroenteroly+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Sugar-sweetened beverage, diet soda, and nonalcoholic fatty liver disease over 6 years: the Framingham Heart Study.</a> Clinical Gastroenteroly and Hepatology. , (2021).</li>
<li>Pocha, C., Kolly, P., Dufour, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonalcoholic+fatty+liver+disease-related+hepatocellular+carcinoma%3A+a+problem+of+growing+magnitude%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Liver+Disease%22%5BJournal%5D)">Nonalcoholic fatty liver disease-related hepatocellular carcinoma: a problem of growing magnitude.</a> Seminars in Liver Disease. 35 (3), 304-317 (2015).</li>
<li>Roeb, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excess+body+weight+and+metabolic+%28dysfunction%29-associated+fatty+liver+disease+%28MAFLD%29%5BTitle%5D)+AND+%22Visceral+Medicine%22%5BJournal%5D)">Excess body weight and metabolic (dysfunction)-associated fatty liver disease (MAFLD).</a> Visceral Medicine. 37 (4), 273-280 (2021).</li>
</ol>

저자는 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.

공개된 프로토콜은 FACS 분류 후 단일 세포 다운스트림 분석 또는 세포의 벌크 분석을 위해 정상 및 지방성 쥐 간세포의 높은 수율을 분리하는 신뢰할 수 있고 간단한 방법을 제공합니다. 밀도 구배 정제에 비해 뚜렷한 이점은 세포 지질 함량이 본질적으로 간세포의 효과적인 수율에 영향을 미치지 않는다는 것입니다. 따라서 지방성 간세포의 비율은 유지되고 다운스트림 분석에 포함됩니다. 이것은 지방성 간 질환 연구에 중요할 뿐만 아니라 간세포가 재생 후 처음 2-3일 이내에 시간적, 공간적으로 역동적인 지방증을 나타내는 주요 간 절제술 이후의 과정 분석에 가장 중요합니다. 분리된 간세포에 대한 (단세포) 분석이 이미 간절제술 19,20,21 후에 수행되었지만, 분석된 세포 집단은 적어도 부분적으로 지질이 함유된 간세포가 결핍되어 그 결과가 완전히 대표적이지 않고 희박한 간세포로 치우쳐 있다고 가정해야 합니다.<s...

간은 주요 조직 손실 후에도 스스로 재생될 수 있습니다. 이 독특한 재생 능력은 1931년 Higgins와 Anderson이 쥐에서 처음 기술한 부분적(70%) 간 절제술의 실험 모델에 의해 명시적으로 설명됩니다1. 이 모델에서는 더 큰 간엽을 잘라내어 동물에서 간장의 70%를 외과적으로 제거합니다. 나머지 엽은 보상 비대를 통해 성장하여 수술 후 약 1 주일 이내에 원래의 간 덩어리를 회복하지만 원래의 간 구조를 복원하지는 않습니다 2,3. 간 잔여물이 너무 작아서 회복할 수 없는 86% 확장 간절제술과 같이 다양한 양의 조직 제거를 가진 추가 간 절제술이 개발되어 결국 간 절제술 후 간부전(PHLF) 및 동물의 30%-50%에서 후속 사망으로 이어집니다 4,5,6. 이 모델은 절제된 조직의 양에 따라 정상 및 실패한 간 재생에 대한 연구를 가능하게 합니다(그림 1).
간 절제술의 마우스 모델은 수년 동안 성공적으로 사용되어 왔지만 최근에야 단일 세포 수준에서 더 깊은 통찰력을 얻을 수 있는 고급 분석 방법이 있습니다. 그러나 이러한 방법의 대부분에서는 개별 간세포의 존재가 기본 전제 조건입니다. 원발성 간세포의 분리를 위한 대부분의 프로토콜은 2단계 콜라게나제 관류 기술과 사멸 세포뿐만 아니라 파편 및 비실질로부터 생존 가능한 간세포를 분리하기 위한 후속 밀도 구배 정제를 기반으로 합니다 7,8,9. 이 방법은 1969 년 Berry와 Friend에 의해 처음 기술되었으며 1972 년 Seglen과 동료들에 의해 채택되었습니다 11,12. 그러나 그래디언트 원심분리는 세포의 밀도와 크기에 의존하기 때문에 표준 정제 중에 지질이 함유된 간세포가 손실되는 경우가 많습니다. 이러한 손실은 많은 연구 질문에서 무시할 수 있지만 초기 간 재생에 중요한 측면입니다. 처음 2일 동안 재생 중인 마우스 간 내의 간세포는 지질을 축적하여 크기가 커지고 밀도가 떨어집니다. 이 일시적인 재생 관련 지방증 (TRAS)은 재생 연료를 제공하는 역할을하며 일시적이지만 주요 증식 단계와 부분적으로 겹치고 간 소엽 (간 기능 단위13,14) 내에 고르지 않게 분포되어 있습니다. 그러나 연장된 86% 간 절제술 이후에는 TRAS도 발생하지만 재생이 지연되고 지질이 산화되지 않기 때문에 지속된다14. 따라서 70% 또는 86% 간절제술 후 간세포의 기울기 정제는 대부분의 지질이 함유된 간세포가 저밀도로 인해 손실되기 때문에 비대표성 분획을 생성할 수 있다15.
이 수정된 분리 프로토콜에서 C57BL/6 마우스의 간세포는 고전적인 2단계 콜라게나제 관류 접근법에 의해 간 절제술 후 24-48시간 후에 분리됩니다. 일반적으로 세포 분리를 위한 잔류물의 캐뉼라 삽입 및 관류는 문맥을 통해 수행됩니다. 그러나, 대절제 후 남은 작은 잔해에서의 문맥혈관 저항성은 높으며16, 따라서 관류가 미묘하다. 대정맥은 간 절제술의 영향을 받지 않기 때문에 대정맥의 캐뉼라를 통해 역행 방향으로 관류를 쉽게 수행할 수 있습니다. 표준 연동 펌프는 문맥을 통한 유출과 함께 역행성 관류를 사용하여 카테터화된 하대정맥을 통해 따뜻해진 용액을 간 잔여물로 구동합니다(보충 그림 S1). 간세포는 콜라겐 분해 효소에 의해 해리되어 Glisson 캡슐에서 방출됩니다. 저속 원심분리 접근법을 사용하여 단계적 분리에 의해 생존 가능한 간세포를 세척하고 주의 깊게 처리한 후, 간세포는 모든 다운스트림 분석에 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Zombie green</td><td>BioLegend</td><td>423111</td><td>아민 반응성 생존 염료</td></tr><tr><td>Attane Isoflurane ad us. vet. 99.9%</td><td>Provet AG</td><td></td><td>QN01AB06 주의: 환기</td></tr><tr><td>필요 EDTA 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E8008-100ML-Ethanol</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V001229</td> 물로 <td>70%</td></tr><tr><td>소태아 혈청(FCS)</td>으로 희석<td>Gibco</td> <td>A5256701-Hanks</td><td></td></tr><tr><td>' Balanced Salt Solution(HBSS), Ca2+, Mg2+, 페놀 레드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9269-6x600ML</td><td>소화/보존용</td></tr><tr><td>Hanks' Balanced Salt solution(HBSS), Ca2+ 제외, Mg2+ 없음, 페놀 레드 없음</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6648-6x500ML</td><td>관류 완충액</td></tr><tr><td>HEPES 용액의 경우, 1 M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83264-100ML-F-Histoacryl</td><td></td></tr> <tr><td>조직 접착제(부틸-2-시아노아크릴레이트)</td><td>B. Braun</td><td>1050052</td><td>캐뉼레이션 사이트 안정화용</td></tr><tr><td>Hoechst 33258 염색 염료 용액</td><td>Abcam</td><td>ab228550</td><td>-</td></tr><tr><td>Liberase 연구 학년</td><td>Roche</td><td>5401119001</td><td>동결 건조 콜라겐 분해 효소 I / II</td></tr><tr><td>NaCl 0.9 % 500 mL Ecotainer</td><td>B. Braun</td><td>123-Paralube</td><td></td></tr> <tr><td>Vet Ointment</td><td>Dechra</td><td>17033-211-38-Phosphate</td><td></td></tr> <tr><td>완충 식염수 (PBS)</td> <td>Gibco</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>A1286301-Sudan IV &ndash; 지질 염색</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>V001423-Temgesic(부프레노르핀 염산염), 주입용 용액 0.3 mg/mL</td><td>Indivior Europe Ltd.</td><td>345928</td><td>마약. 안전하게 보관하십시오.</td></tr><tr><td>트리판 블루, 0.4%, 멸균 여과</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td>Williams의 세포 계수용</td></tr><tr><td> Medium E</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W4128-500ML</td><td>-</td></tr><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>25 mL 혈청학 피펫, Greiner Cellstar</td><td>Merck</td><td>P7865-50</td><td></td></tr> <tr><td>mL Falcon 튜브</td><td>TPP</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>BD Neoflon, Pro IV 카테터 26 G</td><td>BD Falcon</td><td></td> <td>391349-Cell</td></tr> <tr><td>스크레이퍼, 회전 블레이드 너비 25 mm</td><td>TPP</td><td>99004-Falcon</td><td></td></tr> <tr><td>Cell Strainer 100 &마이크로; m 나일론</td><td>BD Falcon</td><td>352360-Fenestrated</td><td></td></tr> <tr><td>무균 수술 드레이프</td><td></td><td>--</td><td>재사용 가능한 천 소재</td></tr><tr><td>16# 튜빙(ID 3.1mm)</td> <td>Drifton</td><td>FILLINGNOZZLE#16</td><td>튜브에 들어가려면</td></tr><tr><td>유세포 분석 튜브, 5mL</td><td>BD Falcon</td> <td>352008-Male</td><td></td></tr> <tr><td>Luer to Barb, 튜빙 ID 3.2mm</td><td>Drifton</td><td>LM41</td><td>연결 튜브 주사기에</td></tr><tr><td>페트리 접시, 96 x 21 mm</td><td>TPP</td><td>93100-Prolene</td><td></td></tr> <tr><td>5-0</td><td>Ethicon</td><td>8614H</td><td>흉골</td></tr><tr><td>Prolene 6-0</td><td>Ethicon</td><td>8695H</td><td>피부 봉합</td></tr>사 <tr><td>Prolene 8-0</td><td>Ethicon</td><td>EH7470E</td><td>합자 담낭</td></tr><tr><td>튜브 16#, WT 1.6 mm, ID 3.2 mm, OD 6.4 mm</td><td>Drifton</td><td>SC0374T</td><td>관류 튜브</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD LSRFortessa 세포 분석기 유세포 분석기</td><td>BD-</td><td></td><td>-</td></tr><tr><td>Isis 설치류 면도기</td><td>Aesculap</td><td>GT421-Isofluran</td><td></td></tr> <tr><td>스테이션</td><td>Provet</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>저속 원심분리기 &ndash; Scanspeed 416</td><td>Labogene</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>-Neubauer-개선된 계수 챔버</td><td>Marienfeld</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>산소 집중 장치 &ndash; 에버플로</td><td>필립스&nbsp;</td><td>1020007</td><td>0 &ndash; 5 L/min</td></tr><tr><td>Pipetboy &ndash; 피펫터 터보-픽스</td><td>TPP</td><td>94700-Shenchen</td><td></td></tr> <tr><td>관류 펌프 &ndash; YZ1515x</td><td>Shenchen</td><td>YZ1515x</td><td>-</td></tr><tr><td>외과 현미경 &ndash; SZX9</td><td>올림푸스</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>ThermoLux 온난화 매트</td><td>Thermo Lux</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Vortex Genie 2, 2700 UpM</td><td>NeoLab</td><td>7-0092</td><td>-</td></tr><tr><td>수조 &ndash; 정밀 GP 02</td><td>Thermo</td> <td>scientific-42</td> <td>&deg로 조정; 씨</td></tr></tbody></table>

생쥐의 부분 간 절제술 후 재생 간세포의 분리

Isolation of Regenerating Hepatocytes after Partial Hepatectomy in Mice

부분 간 절제술은 생쥐의 간 재생을 조사하는 데 널리 사용되어 왔지만 다운스트림 단일 세포 적용을 위한 생존 가능한 간세포의 높은 수율의 분리는 어려운 일입니다. 재생 간세포 내 지질의 현저한 축적은 생쥐에서 정상적인 간 재생의 처음 2 일 동안 관찰됩니다. 이 소위 일시적인 재생 관련 지방증(TRAS)은 일시적이지만 주요 증식 단계와 부분적으로 겹칩니다. 밀도 구배 정제는 원발성 간세포의 분리를 위한 대부분의 기존 프로토콜의 중추입니다. 그래디언트 정제는 세포의 밀도와 크기에 의존하기 때문에 비지방성 간세포 집단과 지방성 간세포 집단을 분리합니다. 따라서 지방 간세포는 종종 손실되어 비대표성 간세포 분획을 생성합니다. 
제시된 프로토콜은 지질 함량에 관계없이 재생 간세포의 생체 내 분리를 위한 쉽고 신뢰할 수 있는 방법을 설명합니다. 수컷 C57BL/6 마우스의 간세포는 고전적인 2단계 콜라게나제 관류 접근법에 의해 간 절제술 후 24-48시간 후에 분리됩니다. 표준 연동 펌프는 문맥을 통해 유출되는 역행 관류 기술을 사용하여 카테터가 삽입된 하대정맥을 통해 따뜻해진 용액을 잔여물로 구동합니다. 간세포는 Glisson 캡슐에서 방출하기 위해 콜라게나제에 의해 해리됩니다. 세척 및 신중한 원심분리 후, 간세포는 모든 다운스트림 분석에 사용될 수 있습니다. 결론적으로, 이 논문은 생쥐에서 부분 간 절제술 후 재생 간세포의 대표적인 집단을 분리하기 위한 간단하고 재현 가능한 기술을 설명합니다. 이 방법은 또한 지방간 질환의 연구에 도움이 될 수 있습니다.

TRAS는 간 절제술 후 16시간에 최고조에 달하고 표준 간 절제술 후 32-48시간 후에 점차 사라지지만 연장된 간 절제술 후 48시간 이상 지속됩니다. 거시적으로 TRAS는 간 잔여물의 창백한 안색으로 쉽게 볼 수 있으며(그림 1F) 수술 후 16시간에서 48시간 사이에 간 절제술을 받은 마우스에서 관찰할 수 있습니다.
추정 된 최종 수율은 마우스에서 70 % 간 절제술 후 10-15 × 10 6 간세포, 연장 된 86 % 간 절제술 후 4-9 × 106이며, 평균 최종 생존율은 각각 78 % 및 65 %이다. 이는 전체 마우스 간에서 50-70 × 106의 총 수율과 비교하여 예상되는 백분율에 해당합니다(그림 6A,C). 부분 간절제술 후, 간세포는 증가된 지질 함량에 상응하는 정...

지질이 함유된 간세포는 간 재생에 내재되어 있지만 일반적으로 밀도 구배 원심분리 시 손실됩니다. 여기에서 우리는 지방성 간세포를 유지하는 최적화된 세포 분리 프로토콜을 제시하여 마우스에서 부분 간 절제술 후 재생 간세포의 대표적인 집단을 생성합니다.

Partial hepatectomy has been widely used to investigate liver regeneration in mice, but the isolation of high yields of viable hepatocytes for downstream ...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 밀도 구배 원심분리 없이 부분 간절제술 후 마우스에서 간세포 분리를 위한 최적화된 방법을 제시하는 것입니다. 우리는 일반적으로 초기 재생 동안 많은 비율의 지질이 함유된 간세포를 봅니다. 저밀도로 인해 밀도 구배 원심분리 시 일반적으로 손실되는 지방성 간세포는 이 프로토콜로 유지됩니다.관류 장비를 준비하려면 Luer 잠금 커넥터를 사용하여 26게이지 IUI 캐뉼라를 튜브의 출구 끝에 연결합니다. 그런 다음 튜브를 세척하고 튜브의 입구 끝을 수조의 예열된 관류 버퍼 튜브에 삽입합니다. 분당 3밀리리터의 펌프 속도로 따뜻한 관류 완충액으로 프라이밍합니다.수술을 진행하기 전에 마우스가 적절하게 마취되었는지 확인하십시오. 그런 다음 수술 용 스크럽 용액과 70 % 에탄올로 복부를 청소하십시오. 그런 다음 봉합사를 절단하여 이전에 부분 간 절제술을 위해 만든 정중선 절개를 다시 열고 상처 가장자리를 부드럽게 잡아당깁니다.간 절제술이 24 시간에서 48 시간 이상 된 경우 봉합사를 제거하고 가위 또는 메스로 피부를 자릅니다. 견인기 또는 간단한 클립을 사용하여 복부를 열어 두십시오. 복강은 접근과 시각화를 최적화하기 위해 가능한 한 많이 노출되어야 합니다.5-0 폴리 프로필렌 봉합사를 흉골에 고정시킵니다. 두개골로 당겨서이 위치에 고정하십시오. 멸균 면봉을 사용하여 장을 오른쪽으로 움직여 문맥과 대정맥을 드러냅니다.젖은 천을 사용하여 내장을 유지하십시오. 금속 추 링과 같이 높이가 약 2cm인 무거운 물체를 마우스의 뒷다리 옆에 놓습니다. 그런 다음 연결된 26게이지 IUI 캐뉼라가 있는 튜브를 물체에 놓고 바늘을 대정맥 위에 조심스럽게 놓습니다.필요에 따라 튜브의 길이를 조정하십시오. 콜라게나제 원액을 예열된 소화 완충액 튜브에 옮깁니다. 동물 당 10-20 밀리리터의 소화 완충액을 준비하십시오.펌프 속도를 분당 3 밀리리터로 조정 한 후 펌프를 켭니다. 완충액이 바늘에 도달하면 미리 예열된 관류 완충액의 처음 2-3밀리리터를 버립니다. 하대정맥의 캐뉼라 삽입을 수행하려면 멸균 면봉을 사용하여 대정맥을 펑크 아래로 꼬리 방향으로 부드럽게 당겨 제공된 장력이 캐뉼라가 정맥에 쉽게 삽입되도록 합니다.완충액이 바늘을 통과하는 동안 26게이지 IUI 캐뉼라를 신장 아래의 하대정맥에 얕은 각도로 삽입합니다. 바늘 경사가 위쪽을 향하도록 하십시오. 바늘이 내강에 들어갈 때 카테터의 플래시 챔버에서 혈액을 찾으십시오.카테터의 끝이 정맥에 들어가도록 바늘을 2-3mm 더 전진시킵니다. 플라스틱 카테터를 바늘 위로 밀어 넣고 대정맥으로 5mm 더 밀어 넣습니다. 바늘을 천천히 그리고 아주 조심스럽게 제거하십시오.2-3 초 후, 간에서 흰 반점이 형성되거나 문맥이 부어 오르는 것을 발견하는데, 이는 관류 완충액이 간을 통해 흐르고 중심 정맥에서 간 소엽으로 들어가고 있음을 나타냅니다. 간 표면에 흰 반점이 생긴 후 1-2초 이내에 문맥이 눈에 띄게 부풀어 오를 때까지 기다리십시오. 간문에서 가능한 한 멀리 가위로 문맥을 자릅니다.동물의 체중, 간 크기 및 초기 간 절제술의 정도에 따라 분당 4-7 밀리리터의 유속을 증가시킵니다. 핀셋이나 혈관 클램프로 문맥을 7-10 초 동안 고정하십시오. 액체가 통과하지 않는지 확인하십시오.약 30 초 후에 두 번째 클램프를 수행하고 간이 부풀어 오르고 이완되도록하십시오. 3-4 분 동안 동물을 계속 씻어 내고 문맥에서 흘러 나오는 맑은 완충액을 관찰하십시오. 소화 완충액이 간에 도달하기 전에 3-4초 동안 문맥을 조입니다.cl을 놓을 때 간이 이완되는지 확인하십시오.amp 관류액이 깨끗하게 유지되는지 확인하십시오. 소화 완충액이 간에 도달하면 문맥을 다시 한 번 고정합니다. 간은 클램핑이 풀린 후에 이완되어서는 안됩니다.분당 5 밀리리터의 유속으로 약 4 분 동안 소화합니다. 소화가 진행됨에 따라 간이 부풀어 오르기 시작하는 징후와 간 표면의 작은 투명 부분을 찾으십시오. 간이 젖은 천 조각의 질감을 띠고 거의 눅눅해 보이는 것을 관찰하십시오.젖은 멸균 면봉으로 조심스럽게 만져 일관성을 조사하십시오. 간 표면 질감의 현저한 차이가 관찰 될 때까지 관류를 계속하십시오. 간은 매우 밝은 색과 거품이 많은 모양을 취하여 실질에서 분리되는 Glisson 캡슐을 나타냅니다.간이 이러한 특성을 획득하자마자 소화를 중단하십시오. 공기가 간으로 들어가기 전에 바늘을 제거하십시오. 집게를 사용하여 엽 사이의 중앙 결합 조직을 잡고 앵커 포인트로 사용하여 약간 위로 들어 올립니다.간과 다른 장기의 모든 연결을 자르고 담낭을 제거하십시오. 복강에서 간을 부드럽게 제거하십시오. 이 단계에서는 헐렁하고 깨지기 쉬우므로 주의하십시오.간을 얼음 냉장 완충액에 넣습니다. 간을 10cm 페트리 접시에 옮기고 간 표면을 따라 몇 군데에 미세한 팁 핀셋으로 Glisson의 캡슐을 얼음처럼 차가운 Williams'Medium E.Rupture 10ml를 추가합니다. 두 쌍의 핀셋으로 중앙 부분을 잡습니다.간세포를 손상시키지 않고 캡슐이 찢어지도록 천천히 떼어내고 캡슐을 부드럽게 흔들어 세포를 방출합니다. 5 밀리리터의 간 펄프를 100 마이크로 미터 셀 스트레이너를 통해 50 밀리리터 튜브로 여과합니다. 10 밀리리터의 신선한 얼음 차가운 매체로 필터를 헹구고 나머지 5 밀리리터의 펄프를 셀 스트레이너를 통해 걸러냅니다.추출물을 섭씨 4도에서 5분 동안 50G으로 돌립니다. 대부분의 상층액을 흡인하고 튜브를 부드럽게 소용돌이 치면서 세포를 재현 탁시키기 위해 1 밀리리터를 남겨 둡니다. 차가운 Williams'E Medium 40 밀리리터를 넣고 단계를 세 번 반복하십시오.텍스트 원고에 설명 된대로 간세포의 분리를 진행하십시오. 마우스에서 70 % 간 절제술 후, 최종 간세포 수율은 약 10-15 x 10-6 %였으며 최종 생존율은 78 %였습니다. 연장 된 86 % 간 절제술 후, 간세포 수율은 65 %의 평균 생존율로 4-9 x 10에서 6 번째였다.부분 간 절제술 후, 간세포는 증가된 지질 함량에 상응하는 정상 간에 비해 증가된 세포 크기를 나타낸다. 부분 간절제술 후 24시간 후에 쥐 간세포에서 증가된 지질 함량이 관찰되었는데, 이는 세분성의 증가로 보이거나 확대된 간세포 내부의 지질 소포의 존재에 의해 직접 관찰되었습니다. 고전적인 밀도 구배 정제 방법을 사용하는 동안 큰 지방 간세포는 상청액에서 손실되고 더 작은 희박한 간세포만 세포 펠릿에 수집됩니다.개선된 프로토콜로 지질로 채워진 간세포는 손실되지 않았고 모든 간세포는 펠릿화되었습니다. 반복적인 클램핑은 세척 과정을 용이하게 합니다. 이를 통해 간은 소화 효소를 억제할 수 있는 남아 있는 혈액 성분으로부터 최적으로 제거됩니다.

isolation-regenerating-hepatocytes-after-partial-hepatectomy

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

인간 간세포의 분리를위한 수정 된 두 단계의 콜라게나 제 관류 절차가 설명되어 있습니다. 이 방법은 다른 포유 동물의 간장에 적용될 수있다. 고립 된 간세포는 그 같은 간 재생, 약동학 및 독성 등의 분야에서 과학 연구에 적합한 모델을 만들고, 높은 수율과 생존에서 사용할 수 있습니다.

2 단계 콜라게나 제 관류 절차에 의한 인간의 간세포의 분리

혈관 재생을 시각화하는 데 사용되는 도구에는 혈관 나무를 대조하는 방법이 필요합니다. 이 필름은 혈관 나무의 최적 대비를 달성하는 데 사용되는 섬세한 주입 기술을 보여주고 μCT 및 조직학적 연속 절편을 사용하여 결과 표본의 자세한 분석으로 인한 잠재적 이점을 설명했습니다.

일반 마우스의 70 % 부분 간 절제술 후 혈관 및 실질 재생의 시각화

간 전이 절제 후 종양 재발률이 높은 것은 해결되지 않은 문제로 남아 있습니다. 예시된 마우스 모델은 이러한 재발의 이유를 조사하는 데 유용할 수 있습니다. 간 절제 모델과 간내 종양 세포 주입을 최초로 결합합니다.

간내 종양 성장에 대한 간 절제술의 영향

여기에서는 미성숙 및 확장 가능한 인간 간 줄기 세포의 이식 후 Alb-toxin receptor mediated cell knockout(TRECK)/SCID 마우스에서 생성된 새로운 인간화 마우스 간 모델을 제시합니다.

인간 간 줄기 세포를 이용한 인간형 마우스 간 세대

여기서는 성인 마우스로부터 일차 간세포를 분리하는 효소 방법을 보여, 우리는 ELISA 및 실시간 PCR을 이용하여 염증 반응을 정량 설명한다.

마우스에서 차 간세포 문화에 염증 반응의 유도

우리는 끄 덕의 부분 hepatectomy (PHx) 및 비장을 통해 세포 이식 수행을 위한 프로토콜을 설명 했습니다. SCID (끄 덕 임. CB17-Prkdcscid/J) 쥐. 이 프로토콜에서 절 개 노출 하 고 셀의 intrasplenic 이식에 대 한 또 다른 절 개에 의해 따라 간 좌 엽 resect 이루어집니다.

끄 덕 임에서 부분 Hepatectomy 후 Hepatocytes의 intrasplenic 이식 SCID 마우스

여기, 우리 신생아 (0 일) 쥐에서 왼쪽된 간 엽의 부분 절제 하는 새로운 방법을 제시. 이 새로운 프로토콜은 급성 간 상해 및 신생아 속에서 상해 응답 공부 적합 합니다.

부분 Lobular Hepatectomy: Morphologic 간 재생에 대 한 수술 모델

이 프로토콜은 특수 정맥 내 카테터, 표준화 된 멸균 일회용 튜브, 실시간 모니터링으로 보완 된 온도 제어 및 분리 된 일차 쥐 간세포의 생존력, 수율 및 기능의 일관성을 향상시키기 위해 두 단계 콜라게나제 관류 절차를위한 경보 시스템의 사용을 자세히 설명합니다.

다중 파라미터 관류 조절을 통한 원발성 쥐 간세포의 분리

단계적 간절제술(ALPPS)을 위한 간 분할 및 문맥 결찰술의 연관성은 1단계 수술 후 몇 주 후에 놀라운 간 재생을 초래하는 것으로 나타났습니다. ALPPS를 받은 동물 모델은 잠재적인 간 재생 능력을 탐색하고 유리한 임상 결과를 달성하기 위해 개발되었습니다.

현미경 검사의 도움을 받은 병기 간절제술 절차를 위한 연관 간 분할 및 문맥 결찰의 마우스 모델

부분 2/3(66%) 간절제술의 마우스 모델은 문헌에 잘 설명되어 있지만, 간 이식 후 소형 증후군을 모방한 더 확장된 간절제술은 거의 사용되지 않았습니다. 우리는 건강한 마우스에서 약 50%의 수술 후 치사율을 초래하는 마우스 모델에서 확장된 78% 간 절제술 절차에 대해 설명합니다.

마우스 수술 모델에서 확장된 78% 간절제술

배우세요 생쥐 부분 간 절제술 후 지방 함유 간세포를 보존하는 최적화된 분리 방법. 밀도 구배 원심분리 없이 재생 간세포 연구에 필수적인 세포 회수율을 높여 간 재생 및 대사 질환 연구에 활용할 수 있습니다.

생쥐의 부분 간 절제술 후 재생 간세포의 분리

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