Name: 생체 외 장내 줄기세포 기능을 연구하기 위한 쥐 결장 음와의 3차원 배양 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: 배우세요 쥐 결장 음와의 3차원 배양을 통해 장내 줄기세포 기능을 연구하는 방법을. Claudin-7 녹아웃 효과 분석 및 염증성 장질환 연구에 활용할 수 있습니다.

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이 연구는 NIH DK103166의 자금 지원을 받았습니다.

모든 동물 실험 및 절차는 이스트 캐롤라이나 대학교 (ECU) 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 받았으며 실험실 동물 관리 및 사용에 관한 국립 보건원 및 ECU의 지침에 따라 수행되었습니다. 유도성, 장 특이적 클로딘-7 녹아웃 마우스를 C57BL6 클로딘-7-플록스 형질전환 마우스와 Villin-CreERT2 마우스19를 교배시킴으로써 생성하였다. 3개월령의 수컷 및 암컷 마우스를 본 연구에 사용하였다.
1. 시약/장비 준비
<ol><li>관련 실험을 시작하기 전에 다음 시약/장비를 냉각하십시오: 지하실 분리 동안 결장 조직을 세척하기 위한 인산염 완충 식염수(PBS); 상피 해리 매체와의 배양을 위한 로커/로테이터(4°C 냉장고에 배치).<ol><li>-20°C에서 겔 매트릭스( 재료 표 참조)를 제거하고 도금하기 전에 얼음에서 해동합니다.</li>
		<li>도금을 위해 크립트를 회전시키기 전에 원심분리기를 4°C로 사전 냉각합니다.</li>
		<li>0.1% 구연산나트륨 완충액( 재료 표 참조)을 식히고 현장 세포 사멸 감지 전에 얼음 위에 보관하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>관련 실험을 시작하기 전에 다음 시약을 따뜻하게 합니다: 도금하기 전에 24시간 동안 96-웰 배양 플레이트; L-WRN 미디어( 재료 표 참조) 도금된 크립트에 추가하기 전과 각 미디어를 변경하기 전에.<ol><li>염색하기 전에 수조를 94°C로 가열합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 쥐 결장 지하실 분리
<ol><li>아래 단계에 따라 필요한 미디어를 준비합니다. 참고: 배지 부피는 여기에서 두 마우스의 결장 조직에 대해 계산됩니다.<ol><li>상피 해리 배지를 준비합니다: 30mL의 1x PBS + 400μL의 0.5M EDTA + 50μL의 10mM Y-27632 디하이드로클로라이드( 재료 표 참조). 사용할 때까지 얼음 위에 보관하십시오.</li>
		<li>음와해리 배지를 준비합니다: 10mL의 1x PBS + 10μL의 10mM Y-27632 디하이드로클로라이드. 사용할 때까지 얼음 위에 보관하십시오.</li>
		<li>L-WRN 배지 보충: L-WRN 배지 50mL + L-글루타민이 함유된 DMEM 고혈당 47.5mL + L-글루타민 500μL + 페니실린/스트렙토마이신 500μL + B-27 보충제 1,000μL + N2 보충제(100x) + 50μL HEPES(1M) 완충액(재료 표 참조).</li>
		<li>전체(보충된) L-WRN 배지와 분취량을 여과하여 -20°C에서 최대 3개월 동안 보관합니다. 참고: 해동된 매체는 4°C에서 최대 2주 동안 안정적입니다.</li>
	</ol></li>
	<li>암호 격리를 수행합니다.<ol><li>전신 마취의 경우 면에 이소플루란 1mL를 넣고 0.09입방피트 마취실 내의 플라스틱 카세트 안에 넣습니다( 재료 표 참조). 호흡이 멈출 때까지 (약 3-5 분) 마우스를 마취실에 넣은 다음 자궁 경부 탈구20을 수행하십시오.</li>
		<li>마우스의 정중선을 따라 약 2인치를 절개하고 등 피부를 고정하여 복부를 노출시킵니다. 맹장 바로 아래를 근위부에서 절단하고 직장 위를 원위부21에서 절단하여 결장을 분리합니다.</li>
		<li>집게를 사용하여 결장에 부착 된 지방 조직을 제거하십시오. 집게의 평평한 끝을 사용하여 대변을 부드럽게 밀어내고 조직을 세로로 자릅니다.</li>
		<li>세척 사이에 PBS에서 조직을 "소용돌이치기"위해 집게를 사용하여 차가운 1x PBS로 조직을 10-15회 세척합니다.</li>
		<li>깨끗하고 날카로운 가위를 사용하여 조직을 약 3-5mm 크기의 작은 조각으로 자릅니다.</li>
		<li>두 번째 마우스에 대해 이 과정을 반복하고 차가운 상피 해리 배지가 포함된 50mL 튜브에 조직 조각을 합친다(단계 2.1.1).</li>
		<li>결장 조직 조각을 상피 해리 배지에서 4°C에서 90분 동안 부드러운 흔들림으로 배양합니다.</li>
		<li>조직 조각이 튜브의 바닥으로 가라앉도록 한 다음 조직을 방해하지 않고 상피 해리 배지를 조심스럽게 버립니다. 차가운 1x PBS로 조직을 10-15 회 씻을 때이 과정을 반복하십시오. 최종 세척 중에 가능한 한 많은 PBS를 폐기하십시오.</li>
		<li>결장 조직 조각이 들어 있는 50mL 튜브에 암호 해리 배지(단계 2.1.2)를 넣고 손으로 5-10분 동안 계속 흔듭니다. 참고: 미디어는 해리된 지하실에서 흐려져야 합니다.</li>
		<li>세포 배양 후드 아래에서 70μm 나일론 세포 여과기( 재료 표 참조)로 조직과 배지를 여과하여 새로운 50mL 튜브에 넣습니다.</li>
		<li>실온에서 10분 동안 200 x g 로 원심분리하고 지하실 함유 펠릿을 방해하지 않고 상청액을 버립니다. 알림: 장비에 따라 변형된 매체를 15mL 튜브로 옮겨 원심분리할 수 있습니다.</li>
		<li>펠릿을 ~3-4mL의 차가운 1x PBS에 재현탁합니다.</li>
		<li>현미경 슬라이드의 라인에 분리된 음와를 10μL의 피펫팅합니다. 현미경으로 10μL당 음핵 농도를 추정하기 위해 완전하고 긴 음와의 수를 세십시오.</li>
		<li>96웰 플레이트에 10 crypts/μL를 도금하기 위해 스핀다운할 크립트의 적절한 부피를 계산합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 크립트 도금
<ol><li>1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 200 x g 의 적절한 부피의 분리된 음와를 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다.</li>
	<li>펠릿화된 음와를 방해하지 않고 1,000μL 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 제거합니다.</li>
	<li>100μL의 겔 매트릭스(9웰에 충분)를 펠릿화된 크립트와 피펫에 조심스럽게 추가하여 기포가 유입되지 않도록 합니다. 참고: 젤 매트릭스와 크립트를 혼합하는 방법에 대한 자세한 설명은 토론 섹션을 참조하십시오. 일반적으로 9개의 웰에 대해 100μL이면 충분합니다.</li>
	<li>겔 매트릭스가 부분적으로 응고되도록하십시오 (~ 1-2 분).</li>
	<li>예열된 96-웰 배양 플레이트의 각 웰에 있는 토와 혼합된 겔 매트릭스 10 μL를 플레이트하여 돔 모양을 형성하였다. 알림: 돔을 우물 중앙에 놓습니다. 젤 매트릭스가 우물의 측면으로 퍼지지 않도록주의하십시오. 응고 및 도금에 대한 자세한 설명은 토론 섹션을 참조하십시오.</li>
	<li>겔 매트릭스가 5%CO2로 37°C의 인큐베이터에서 10-20분 동안 완전히 설정되도록 합니다.</li>
	<li>L-WRN 미디어의 최종 작업 솔루션을 준비합니다.<ol><li>L-WRN 배지 10mL 분취량에 100μL 페니실린/스트렙토마이신을 추가합니다(단계 2.1.3 참조)(4°C에서 2주 동안 안정).</li>
		<li>페니실린/스트렙토마이신이 함유된 900μL의 L-WRN 배지에 보충제를 추가합니다: 0.9μL의 1mg/mL EGF + 0.9μL의 10mM Y-27632 디하이드로클로라이드. 참고: 볼륨은 9개의 웰을 기준으로 합니다. Y-27632 디 하이드로 클로라이드는 0 일 (도금시)에만 첨가됩니다.</li>
	</ol></li>
	<li>각 웰에 100μL의 배지를 추가합니다. 돔을 방해하지 않도록주의하십시오.</li>
	<li>37°C에서 5%CO2 로 24시간 동안 배양한다.</li>
</ol>4. 문화에서 클로딘 -7 녹아웃 만들기
<ol><li>도�이 도금 후 24시간 동안 배양에서 정상적으로 자라도록 합니다.</li>
	<li>1.5mL 미세 원심분리 튜브에 2.7μL의 1mmol/L 4-하이드록시타목시펜(4OH-타목시펜)을 900μL의 L-WRN 배지(최종 농도 3μmol/L) + 0.9μL의 1mg/mL EGF에 추가합니다. 참고 : 4OH- 타목시펜의 저장 용액은 분말 4OH- 타목시펜 ( 재료 표 참조)을 1x PBS와 혼합하여 1mmol / L 농도로 혼합하여 준비됩니다.</li>
	<li>진공 흡입을 통해 우물에서 오래된 매체를 제거하십시오.</li>
	<li>각 웰에 100μL의 4OH-타목시펜 함유 배지를 추가하고 클로딘-7 cKO/4OH-TAM으로 표시합니다. 알림: DMSO를 제어 웰에 추가해야 합니다. 신선한 4OH- 타목시펜 함유 배지는 2 일마다 추가해야합니다.</li>
	<li>다음 배지가 바뀔 때까지 37°C에서 배양합니다(~2-3일).</li>
</ol>5. 결장 오가노이드 유지
참고: 미디어는 2-3일마다 교체해야 합니다. 최대 12 일 문화.
<ol><li>L-WRN 배지의 새로운 최종 작업 용액을 준비합니다: L-WRN 배지 900μL + 1mg/mL EGF 0.9μL.</li>
	<li>진공 흡입을 통해 우물에서 오래된 매체를 제거하십시오. 우물에 신선한 미디어를 추가하십시오. 알림: 돔을 방해하지 않도록주의하십시오.</li>
	<li>다음 배지가 바뀔 때까지 37°C에서 배양합니다. 참고: 배양물은 실험에 원하는 기간 동안 유지되고 계대배양될 수 있습니다. 본 연구를 위한 배양물은 전형적으로 9-12일 동안 유지되었지만, 15 또는 20일 동안 더 계속하기를 원할 수 있다.</li>
</ol>6. 결장 오가노이드 수확 및 매립
<ol><li>진공 흡입을 통해 우물에서 오래된 매체를 제거하십시오.</li>
	<li>오가노이드를 4% 파라포름알데히드(PFA)로 실온에서 1시간 동안 고정합니다. 알림: PFA는 독성 물질입니다. 이 시약을 사용할 때 예방 조치를 취하십시오.</li>
	<li>진공 흡입을 통해 웰에서 4% PFA를 제거하고 4°C에서 24시간 동안 30% 슈크로스를 추가합니다.</li>
	<li>플라스틱 몰드에 라벨을 붙이고 최적 절단 온도(OCT) 컴파운드로 90%까지 채웁니다( 재료 표 참조).</li>
	<li>진공 흡입을 통해 웰에서 30% 자당을 제거합니다. 각 웰에 10μL의 1x PBS를 추가합니다.</li>
	<li>피펫 팁으로 우물 바닥을 부드럽게 긁어 오가노이드가 들어있는 돔을 해리시킵니다.</li>
	<li>피펫으로 해리된 오가노이드가 포함된 PBS를 제거하고 OCT가 포함된 몰드에 액체를 넣습니다. 참고: OCT 화합물에 기포가 들어가지 않도록 하십시오.</li>
	<li>모든 웰에서 모든 유기체가 제거 될 때까지이 과정을 계속하십시오.</li>
	<li>스테인리스 스틸 Dewar 플라스크에 드라이 아이스 펠릿과 2- 메틸 부탄 (드라이 아이스 펠릿을 덮을만큼 충분)을 첨가하십시오 ( 재료 표 참조).</li>
	<li>오가노이드 함유 OCT 블록을 2-메틸부탄 이상으로 꾸준히 유지하여 급속 동결시킨다.</li>
	<li>오가노이드 함유 OCT 블록을 절편할 준비가 될 때까지 -80°C에서 보관하십시오(최대 1년 동안 보관 가능).</li>
</ol>7. 면역형광법
<ol><li>절편화된 오가노이드-함유 OCT 블록을 -20°C에서 동결유지장치( 재료 표 참조)를 사용하여 5 μm 두께로 절단하였다.</li>
	<li>각 섹션에 대해 현미경으로 확인하여 오가노이드가 캡처되었는지 확인합니다. 절단이 완료되면 얼룩이 질 준비가 될 때까지 슬라이드를 -80°C에서 보관하십시오(최대 6개월 동안 보관 가능).</li>
	<li>슬라이드를 10 mM 시트르산나트륨 완충액에서 94°C에서 10분 동안 가열한다. 알림: 완충액은 구연산나트륨을 탈이온수에 용해시켜 만듭니다. 염산으로 pH를 6으로 조정하십시오.</li>
	<li>슬라이드를 벤치 탑에서 20 분 동안 식히십시오. 증류수로 5 분 동안 헹굽니다.</li>
	<li>슬라이드를 0.2% Triton X-100이 있는 염색 랙( 재료 표 참조)에 조립하고 100mM 글리신과 함께 15분 동안 배양합니다.</li>
	<li>1x PBS로 각각 5분 동안 3회 헹굽니다. 실온에서 45분 동안 5% 소 혈청 알부민(BSA)으로 차단합니다.</li>
	<li>클로딘-7 항뮤린 토끼 1차 항체22 (1% BSA로 희석)와 함께 4°C에서 밤새 인큐베이션한다. 1x PBS로 각각 10분 동안 3회 헹굽니다.</li>
	<li>Cy3 항-토끼 2차 항체23 (1% BSA로 희석)과 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션합니다. 1x PBS로 각각 10분 동안 3회 헹굽니다.</li>
	<li>DAPI를 사용하여 적절한 장착 매체( 재료 표 참조)로 슬라이드를 장착하고 커버슬립을 추가합니다.</li>
</ol>8. 세포 사멸 검출
<ol><li>실온에서 1 시간 동안 4 % 파라 포름 알데히드로 웰 내부의 유기체를 고정하십시오. 1x PBS로 5분 동안 헹굽니다.</li>
	<li>배양 플레이트를 차가운 0.1% 시트르산나트륨 완충액에 0.1% Triton X-100과 함께 얼음 위에서 2분 동안 배양합니다. 1x PBS로 각각 5분 동안 두 번 헹굽니다.</li>
	<li>현장세포 사멸 검출 키트인 TMR Red를 사용하여 TUNEL 반응24,25를 준비합니다(재료 표 참조). 각 웰에 50μL의 TUNEL 반응 시약을 추가합니다.</li>
	<li>어두운 곳에서 37 ° C에서 1 시간 동안 가습 된 분위기에서 배양하십시오. 알림: 나머지 모든 단계는 어둠 속에서 완료해야 합니다.</li>
	<li>1x PBS로 각각 5분 동안 3회 헹굽니다. 1:2,500 Hoechst(1x PBS로 희석, 재료 표 참조)와 함께 3분 동안 배양합니다.</li>
	<li>1x PBS로 각각 5분 동안 3회 헹굽니다. TRITC 필터를 사용하여 형광 현미경에서 이미지를 시각화합니다( 재료 표 참조).</li>
</ol>

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</ol>

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

오가노이드 배양은 줄기 세포 기능, 장 생리학, 약물 발견, 인간 장 질환, 조직 재생 및 복구 7,8,9,10,11,26을 연구하기 위한 훌륭한 모델입니다. 많은 장점이 있지만 설정하기가 어려울 수 있습니다. 프로토콜 전체의 모든 단계에서 주의를 기울여야 하지만 가장 중요한 것은 도금 단계에서 주의해야 합니다. 분리된 크립을 겔 매트릭스와 혼합할 때 원심분리 후 형성된 크립트 펠릿을 분해하고 매트릭스 전체에 크립트를 고르게 분배하기 위해 위아래로 완전히 피펫팅해야 합니다. 동시에 피펫팅하는 동안 매트릭스에 기포가 유입되지 않도록 하십시오. 이를 위해서는 피펫 팁이 1.5mL 튜...

장 오가노이드 배양은 줄기 세포를 일차 조직의 장 음와에서 분리하고 겔 매트릭스 1,2로 도금하는 3차원(3D) 생체 외 시스템입니다. 이 줄기 세포는자가 재생,자가 조직 및 장기 기능이 가능합니다2. 오가노이드는 조직 미세 환경을 모방하고 세포 3,4보다 조작이 적지 만 2 차원 (2D) 시험관 내 세포 배양 모델보다 생체 내 모델과 더 유사합니다. 이 모델은 적절한 세포-세포 유착, 세포-매트릭스 상호 작용 및 균질 개체군의 부족과 같은 2D 모델에서 발생하는 장애물을 제거하고 높은 비용과긴 기간을 포함하여 동물 모델의 한계를 줄입니다5. 장내 오가노이드(결장 토굴 유래 줄기 세포에서 성장한 경우 콜로노이드라고도 함)는 본질적으로 생체 내에 존재하는 모든 세포 유형과 내강을 포함하는 상피를 포함하는 미니 기관입니다. 이 모델을 사용하면 시스템을 조작하여 줄기 세포 틈새, 장 생리학, 병태 생리학 및 장 형태 형성 3,5,6과 같은 장의 여러 측면을 연구 할 수 있습니다. 또한 약물 발견, 염증성 장 질환 (IBD) 및 대장 암과 같은 인간 장 질환 연구, 환자 별 개인화 된 치료 개발 및 조직 재생 4,7,8,9 연구를위한 훌륭한 모델을 제공합니다. 또한 오가노이드 시스템은 세포 통신, 약물 대사, 생존력, 증식 및 자극에 대한 반응을 연구하는 데에도 사용할수 있습니다7,8. 동물 모델은 장 병리학적 상태에 대한 잠재적인 치료제를 테스트하는 데 사용될 수 있지만 한 번에 여러 약물을 연구하는 것이 어려울 수 있으므로 매우 제한적입니다. 생체 내에는 더 많은 교란 변수가 있으며 관련 비용과 시간은 각각 높고 길다. 반면에, 오가노이드 배양 시스템은 더 짧은 기간에 한 번에 많은 치료제의 스크리닝을 허용하고, 또한 환자 유래 오가노이드 배양 4,8의 사용을 통해 개인화된 치료를 가능하게 한다. 결장 오가노이드가 조직 조직, 미세 환경 및 기능을 모방하는 능력은 또한 재생 및조직 복구를 연구하기 위한 훌륭한 모델입니다9. 우리 연구실은 소장 줄기 세포 기능에 대한 claudin-7의 효과를 연구하기 위해 소장 오가노이드 배양 시스템을 구축했습니다10. 이 연구에서는 조건부 claudin-7 녹아웃(cKO) 모델에서 줄기세포의 자가 갱신, 분화 및 증식 능력 또는 능력 부족을 연구하기 위해 대장 오가노이드 배양 시스템을 구축했습니다.
Claudin-7은 장에서 고도로 발현되고 TJ 기능 및 무결성11을 유지하는 데 필수적인 매우 중요한 단단한 접합 (TJ) 단백질입니다. cKO 마우스는 IBD 유사 표현형을 앓고 있으며 심각한 염증, 궤양, 상피 세포 슬라우링, 선종 및 증가된 사이토카인 수치11,12를 나타냅니다. 클로딘이 상피 장벽 기능에 필수적이라는 것은 널리 받아 들여지고 있지만, 클로딘의 새로운 역할이 등장하고 있습니다. 그들은 증식, 이동, 암 진행 및 줄기 세포 기능 10,12,13,14,15,16,17에 관여합니다. claudin-7이 줄기 세포 틈새와 결장 줄기 세포의 기능에 어떤 영향을 미치는지는 현재 알려져 있지 않습니다. 장이 약 5-7 일마다 빠르게 자체 재생되기 때문에 줄기 세포 틈새의 유지와 활성 줄기 세포의 적절한 기능이 중요합니다18. 여기에서는 결장 줄기 세포 틈새에 대한 claudin-7의 잠재적 인 조절 효과를 조사하기위한 시스템이 구축됩니다.

<table><tbody><tr><td>0.09 큐빅 피트 공간 절약형 진공 탈착기&nbsp;</td><td>United States Plastic Corp</td><td>78564</td><td>마취실</td></tr><tr><td>0.5 M EDTA pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>AM9261</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>ThermoFisher</td><td>69715</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 원추형 원심분리기 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>1x Dulbecco' s 인산염 완충 식염수</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>2-메틸부탄</td><td>시그마</td><td>277258</td><td></td></tr><tr><td>4% 파라포름알데히드</td><td>ThermoFisher</td><td>J61899. </td><td></td>AK</tr><tr><td>4-hydroxytamoxifen (4OH-TAM)</td><td>Sigma</td><td>579002</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 원추형 원심분리기 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro; m 나일론 세포 여과기</td><td>Corning</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>96 웰 배양 플레이트</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>B-27 보충제 (50x)</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1605-100</td><td></td></tr><tr><td>Claudin-7 항쥐 토끼 항체</td><td>Immuno-Biological Laboratories&nbsp;</td><td>18875</td><td></td></tr><tr><td>커버 유리(24 x 50-1.5)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12544E</td><td></td></tr><tr><td>극저온 몰드</td><td>vwr</td><td>25608-916</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex RCF BME, 유형 2</td><td>R& D Systems</td><td>3533-005-02</td><td>겔 매트릭스</td></tr><tr><td>Cy3 안티 토끼 항체</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>111-165-003</td><td></td></tr><tr><td>듀어 플라스크</td><td>Thomas Scientific</td><td>1173F61</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민이 있는 DMEM 고포도</td>당 <td>ATCC</td><td>30-2002</td><td></td></tr><tr><td>EVOS FLoid 이미징 시스템</td><td>ThermoFisher</td><td>4477136</td><td></td></tr><tr><td>DAPI Electron이 있는 Fluoro-Gel II</td><td> Microscopy Sciences</td><td>17985-50</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX (100x)</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>JT Baker</td><td>4059-02</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M) 완충 용액</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>ThermoFisher</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>현장 세포 사멸 검출 키트, TMR Red</td><td>Roche</td><td>12156792910</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Pivetal</td><td>07-893-8440</td><td></td></tr><tr><td>L-WRN Media</td><td>하버드 의과대학 위장 오가노이드 유도 및 배양 코어</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>마우스 수술 키트</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>INSMOUSEKIT</td><td></td></tr><tr><td>Murine EGF</td><td>PeproTech</td><td>315-09-500UG</td><td></td></tr><tr><td>N2 Supplement (100x)</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>최적 절단 온도(OCT) 화합물&nbsp;</td><td>Agar Scientific</td><td>AGR1180</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Sequenza Rack</td><td>vwr</td><td>10129-584</td><td></td></tr><tr><td>구연산나트륨</td><td>Fisher Scientific</td><td>S-279</td><td></td></tr><tr><td>수크로오스</td><td>시그마</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>진공 필터 (0.22 &마이크로; m; 셀룰로오스 아세테이트)</td><td>Corning</td><td>430769</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 dihydrochloride</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1254</td><td></td></tr></tbody></table>

생체 외 장내 줄기세포 기능을 연구하기 위한 쥐 결장 음와의 3차원 배양

Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo

장 상피는 5-7 일마다 재생되며 음낭 부위의 바닥에 위치한 장 상피 줄기 세포 (IESC) 집단에 의해 제어됩니다. IESC에는 자체 재생되어 다양한 상피 세포 유형으로 분화하는 활성 줄기 세포와 손상시 예비 줄기 세포 역할을하는 정지 줄기 세포가 포함됩니다. 장 상피의 재생은 이러한 활성 IESC의 자체 재생 및 분화 능력에 의해 제어됩니다. 또한, 지하실 줄기 세포 집단의 균형과 줄기 세포 틈새의 유지는 장 재생에 필수적입니다. 오가노이드 배양은 줄기 세포의 생존과 기능을 조절하는 단백질, 신호 분자 및 환경 신호를 연구하는 데 중요하고 매력적인 접근 방식입니다. 이 모델은 동물 모델보다 저렴하고 시간이 덜 걸리며 조작이 가능합니다. 오가노이드는 또한 조직 미세 환경을 모방하여 생체 내 관련성을 제공합니다. 본 프로토콜은 결장 종루의 분리, 이러한 분리된 종와를 3차원 겔 매트릭스 시스템에 매립하고 자가조직화, 증식, 자가 재생 및 분화가 가능한 결장 오가노이드를 형성하기 위해 종와세포를 배양하는 방법을 설명합니다. 이 모델을 통해 claudin-7과 같은 특정 단백질을 녹아웃하고 신호 경로를 활성화 / 비활성화하는 등 환경을 조작하여 이러한 효과가 결장 줄기 세포의 기능에 어떻게 영향을 미치는지 연구 할 수 있습니다. 구체적으로, 결장 줄기세포 기능에서 밀착접합 단백질 claudin-7의 역할을 조사하였다. Claudin-7은 장 항상성과 장벽 기능 및 무결성을 유지하는 데 필수적입니다. 마우스에서 claudin-7의 녹아웃은 장 염증, 상피 증식, 체중 감소, 점막 궤양, 상피 세포 슬라우킹 및 선종을 나타내는 염증성 장 질환 유사 표현형을 유도합니다. 이전에는 claudin-7이 소장에서 장 상피 줄기 세포 기능에 필요한 것으로보고되었습니다. 이 프로토콜에서는 대장에서 claudin-7의 역할을 연구하기 위해 결장 오가노이드 배양 시스템이 구축됩니다.

결장 줄기 세포에 대한 claudin-7의 조절 효과를 조사하기 위해, 결장 음와를 상기 기재된 바와 같이 뮤린 결장 조직으로부터 분리하고 도 1A에 나타내었다. 지하실이 1차 조직에서 분리되면 96웰 플레이트의 3D 매트릭스에 도말하여 11일 동안 성장시켰습니다(그림 1). 정상적인 건강한 음와(Crypt)는 2일째에 내강을 닫고 스페로이드가 되며 결국 약 5일째에 다양한 상피 세포 유형을 형성하기 시작합니다(그림 1B). 콜로노이드는 11일까지 성장하도록 허용한 다음, 추가 실험을 위해 수확하였다(그림 1B). 배양에서 claudin-7을 녹아웃하기 위해 지하실은 24 시간 동안 정상적으로 성장할 수있었습니다. 24시간 후, 크립트를 3μmol/L 4OH-타목시펜(TAM)으로 처리하고 추가로 10일 동안 배양했습니...

본 프로토콜은 claudin-7 녹아웃 모델에서 결장 줄기 세포의 활성 및 기능을 연구하기 위해 쥐 결장 오가노이드 시스템을 확립하는 것을 설명합니다.

The intestinal epithelium regenerates every 5-7 days, and is controlled by the intestinal epithelial stem cell (IESC) population located at the bottom of ...

이 프로토콜은 동물 모델보다 시간이 적게 소요되는 조작 가능한 환경에서 결장 줄기 세포의 기능을 연구하는 방법을 제공합니다. 오가노이드 배양을 통해 면역이 없는 환경에서 줄기세포 기능을 연구할 수 있습니다. 이를 통해 claudin-7의 녹아웃과 같은 특정 원인의 영향을 정확히 찾아낼 수 있습니다.줄기 세포 기능의 메커니즘을 이해하면 염증성 장 질환 및 대장 암과 같은 쇠약 질환에 대한 새로운 치료 표적을 밝힐 수 있습니다. 안락사 된 마우스에서 결장 음와를 분리하기 시작하려면 마우스의 정중선 아래로 약 2 인치의 절개를하십시오. 그런 다음 피부를 다시 고정하여 복부를 노출시킵니다.결장을 분리하기 위해 근위부에서 코쿰 바로 아래, 원위부에서 직장 위의 결장을 자릅니다. 다음으로 집게를 사용하여 결장에 부착 된 지방 조직을 제거하십시오. 집게의 평평한 끝으로 격리 된 결장에서 대변을 밀어 낸 후 조직을 세로로 자릅니다.집게로 씻는 사이에 PBS에서 조직을 소용돌이 치면서 차가운 PBS로 조직을 10-15 회 씻으십시오. 그런 다음 깨끗하고 날카로운 가위를 사용하여 조직을 약 3-5 밀리미터의 작은 조각으로 자릅니다. 안락사된 다른 마우스로부터 결장을 분리한 후, 차가운 상피 해리 배지가 들어 있는 50밀리리터 원심분리 튜브에 모든 조직 조각을 결합하고 결장 조직 조각을 상피 해리 배지에서 섭씨 4도에서 90분 동안 부드러운 흔들림으로 배양합니다.배양 후 조직 조각이 튜브 바닥으로 가라 앉도록하십시오. 일단 침전되면 조직 조각을 방해하지 않고 상피 해리 배지를 폐기하십시오. 차가운 PBS로 조직을 10-15 회 세척 할 때이 과정을 반복하십시오.최종 세척 중에 가능한 한 많은 PBS를 폐기하십시오. 다음으로, 50 밀리리터 튜브에서 씻은 결장 조직 조각에 차가운 지하실 해리 배지를 넣고 손으로 5-10 분 동안 흔 듭니다. 세포 배양 후드 아래에서 70미크론 나일론 세포 여과기로 조직이 포함된 배지를 신선한 50밀리리터 원심분리 튜브에 여과합니다.여과 후, 실온에서 10분 동안 200G에서 튜브를 원심분리한 다음, 펠렛화된 음와를 방해하지 않고 상청액을 버립니다. 펠릿을 3-4 밀리리터의 차가운 PBS에 다시 현탁시킵니다. 현미경 슬라이드의 한 줄에 10 마이크로 리터의 지하실 현탁액을 피펫팅합니다.현미경을 사용하여 완전하고 긴 음굴의 수를 계산하여 음핵 농도를 추정하고 96웰 플레이트에 마이크로리터당 10개의 음

three-dimensional-culture-murine-colonic-crypts-to-study-intestinal

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

이 비디오에서는 마우스의 소장에서 전체 소변선을 분리하는 기술을 보여줍니다. 분리된 전체 crypt는 수명이 길고 자가 재생되는 3D 오가노이드를 in vitro에서 증식시키는 데 사용할 수 있습니다.

Intestinal Crypts Isolation: A Method to Isolate Whole Crypts from Small Intestine of Murine 모델

향상된 이미징 기술은 발달 중에 장기의 3차원 이미징을 가능하게 합니다. 여기에서는 태아 쥐의 장에서 발달 중인 융모의 실시간 이미징을 허용하는 전체 장기 배양 시스템에 대해 설명합니다.

에 대한 마우스 태아의 전체 소장 문화 시스템 전의 VIVO 신호 전달 경로와 융모 개발의 3 차원 라이브 영상의 조작

우리는 수술 조직과 생검에서 수집한 결장 소굴에서 인간 장류를 확립하고 결장 소굴에서 콜로노이드를 확립하는 방법을 설명합니다. 이 방법론적 기사에서는 인간 장 및 콜로노이드의 성공적인 성장과 유지에 필수적인 배양 방식을 제시합니다.

전체 조직과 조직 검사에서 인간 상피 Enteroids과 Colonoids 설립

장 상피 줄기 세포 (ISCS)는 Paneth 셀과 혼합된다. 이러한 세포 ISCS을 지원 항균 보호를 제공 ISC의 자손을 차별화한다. 여기에서 우리는 우리가 Paneth 세포가 장 상피 세포를 유지하는데 중요한 역할을한다는 설정하는 형질 전환 조건부 마우스 모델을 사용하는 방법을 보여줍니다.

조건을 사용하여 쥐 소장에서 재생성 Paneth 세포의 역할을 분석하기위한 프로토콜<em&gt; Cre 호텔-LOX</em&gt; 마우스 모델

우리는 단계별 지침을 설명합니다 : 1) 렌티 또는 레트로 바이러스 변환을위한 자기 나노 입자를 사용하여 장 오르가노이드를 효율적으로 엔지니어링하고, 2) 엔지니어링 된 오르가노이드에서 냉동 섹션을 생성합니다. 이 접근은 다운스트림 효력의 조사를 위한 organoids에 있는 유전자 발현을 능등하게 바꾸는 강력한 공구를 제공합니다.

냉동 절편을 위한 자기 나노입자 전착 바이러스성 벡터를 사용하여 1 차적인 마우스 장 오르가노이드의 유전 공학

여기, 우리 문화 인간 enteroid 또는 셀룰러 및 생 화 확 적인 수준에서 호스트 상피 microbiota 상호 작용 연구를 그대로 배리어 기능이 있는 colonoid monolayers 프로토콜을 제시.

병원 균, 공생, 그리고 호스트 창 자 상피 사이 상호 작용을 공부 하는 인간 Colonoid Monolayers

절차는 그들의 오르가노이드 형성 잠재력을 결정하기 위하여 변태를 겪고 있는 마우스 상피에서 융모의 격리를 기술합니다.

장내 빌리 상피에서 오르가노이드의 3D 배양

이 프로토콜에서, 우리는 장 지하실에서 직접 뮤린 기본 상피 결장 단층층을 생성하는 방법을 설명합니다. 우리는 투과성 필터에 컨천단층을 생성하기 위한 실험적 접근법, 스크래치 상처 치유 및 생화학 연구를 위한 컨큐리 단층, 면역 형광 분석을 위한 희소및 응수 단층층을 제공합니다.

장 내 토굴에서 뮤린 기본 결장 상피 단층의 세대

우리는 3차원 결장류의 발달을 위한 쥐 결장 선와(miline colonic crypt)의 분리를 자세히 설명하는 프로토콜을 설명합니다. 확립된 콜로노이드는 염증성 챌린지를 받거나 상피 단층을 형성하도록 지시되기 전에 숙주 상피의 세포 구성을 반영하도록 최종적으로 분화될 수 있습니다.

확립된 쥐 콜로노이드에 대한 시험관 내 장 염증의 상피 효과 연구

우리는 쥐의 소장 선와와 배양 장 3D 오가노이드를 선와에서 분리하는 프로토콜을 설명합니다. 또한, 우리는 상피하 세포 틈새가 없는 단일 장 줄기 세포에서 오가노이드를 생성하는 방법을 설명합니다.

쥐 장 선와에서 오가노이드와 오가노이드 연구를 위한 단일 줄기 세포의 3D 배양

여기서는 기본 3차원(3D) 장 세포주 모델 시스템과 고정 장 등가물의 광학 현미경 평가를 위한 파라핀 임베딩 프로토콜을 구성하는 방법을 설명합니다. 선택한 단백질의 염색을 통해 단일 실험에서 여러 시각적 파라미터를 분석하여 전임상 약물 스크리닝 연구에 사용할 수 있습니다.

면역 성분이 있는 기본 3차원(3D) 장 모델 시스템

배우세요 쥐 결장 음와의 3차원 배양을 통해 장내 줄기세포 기능을 연구하는 방법을. Claudin-7 녹아웃 효과 분석 및 염증성 장질환 연구에 활용할 수 있습니다.

생체 외 장내 줄기세포 기능을 연구하기 위한 쥐 결장 음와의 3차원 배양

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