CRISPR-Cas 시스템 및 Anti-CRISPR 단백질을 기반으로 하는 유전자 디지털 회로

당사의 프로토콜은 유형 2 및 유형 5 CRISPR dCas 시스템과 해당 항-CRISPR 단백질을 사용하는 효모 유전자 디지털 회로를 설계, 구축 및 분석하는 방법을 설명합니다. 서비스에서 합성 전사 네트워크를 조립하고 테스트하기 위한 표준 절차를 전혀 수집하지 않기 때문에 조립 체류입니다. 시작하기 위해, 20 내지 40 나노그램의 DNA 주형, 1 마이크로리터의 정방향 프라이머, 1 마이크로리터의 역방향 프라이머, 5 마이크로리터의 DNTP 믹스, 0.5 마이크로리터의 DNA 중합효소, 10 마이크로리터의 5x DNA 중합효소 반응 완충액, 및 이중 증류수를 최대 50 마이크로리터의 총 부피까지 함유하는 반응 혼합물을 제조한다.

원고에 설명된 대로 열순환기에서 터치다운 PCR 프로그램을 사용하여 DNA 서열을 증폭합니다. 겔 전기영동을 통해 PCR 산물을 분리하고 DNA 겔 추출 키트를 통해 아가로스 겔에서 DNA 서열을 희석합니다. Gibson 조립 방법을 사용하여 섭씨 50도에서 1시간 동안 등몰 DNA 혼합물을 넣어 정제된 PCR 산물을 절단된 셔틀 벡터에 삽입합니다.

앞에서 설명한 대로 터치다운 PCR 및 Gibson 조립 방법을 통해 dCas12a 수용체 벡터를 구성합니다. 효모 코돈 최적화 dCas12a 단백질을 BamH1 및 Xhol1을 사용한 분해 및 T4 DNA 리가아제를 사용한 결찰을 통해 새로 구성된 두 개의 수용체 벡터에 삽입합니다. 유사하게, pRS2403 셔틀 벡터를 기반으로 플라스미드를 구성하여 터치다운 PCR 및 Gibson 조립 방법을 통해 항-CRISPR 단백질을 발현합니다.

현미경 세포 검출을 수행하려면 2마이크로리터의 세포 용액을 유리 슬라이드에 놓고 커버 슬립으로 덮습니다. 형광 광원, 현미경 및 컴퓨터를 켜서 형광 현미경으로 세포를 관찰합니다. 형광등 번호를 적어 둔 후 컴퓨터에서 현미경 소프트웨어를 엽니 다.

슬라이드를 현미경 스테이지에 놓고 녹색 조명 아래에서 세포를 관찰하면서 40x 대물 렌즈를 선택합니다. 효모 세포의 윤곽이 나타날 때까지 코스 초점 노브를 움직이고 미세 초점 노브를 움직여 세포의 초점을 맞춥니다. 세포를 감지하려면 현미경 시야를 닫은 후 컴퓨터 화면으로 전환하고 라이브를 클릭하십시오.

3-5초 동안 기다립니다. 캡처를 클릭하여 사진을 찍고 저장합니다. 그런 다음 컴퓨터, 현미경 및 형광등을 끕니다.

측정 20분 전에 FACS 기계를 켜서 레이저를 예열하고 20마이크로리터의 세포 배양물을 300마이크로리터의 이중 증류수와 혼합합니다. FACS 컴퓨터에 연결된 컴퓨터에서 FACS 소프트웨어를 실행하고 새 실험을 만듭니다. 그런 다음 측정 매개변수를 설정합니다.

다음으로, 샘플의 여기 및 방출 파장에 따라 필터를 선택하고 획득 셀 번호를 10, 000으로 설정합니다. 형광 비드의 강도를 측정하여 FITC 필터 전압을 조정하여 두 개의 연속 실험 사이의 비드 강도의 상대적 차이가 5%를 초과하지 않도록 이중 증류수로 기계를 몇 초 동안 세척하여 가능한 초과 비드를 제거합니다. 시료 형광 강도를 측정하고 시료 주입 안정성을 위해 3-5초 동안 기다리는 동안 미리보기를 클릭합니다.

마지막으로 획득을 클릭합니다. 실험이 끝나면 비드를 다시 측정합니다. 두 비드 측정값의 상대적 차이가 5%를 초과하는지 확인한 후 FACS 데이터를 FCS 파일로 내보냅니다.

R Studio를 열고 스크립트를 BDverse_analysis 로드합니다. R을 사용하여 FCS 파일을 분석합니다. 실험 이름을 ename으로 설정하고, FCS 파일이 dir_d로 저장되고 결과 파일이 dir_r로 생성되는 디렉터리 경로를 설정합니다.

다음으로 형광 채널을 설정합니다. 측정된 샘플 수를 설정합니다. 점 그림의 차원과 막대 그림과 상자 그림에 대한 x축과 y축의 최대 길이.

해당 줄에서 해시태그를 제거하여 채점 방법을 선택합니다. 선택한 게이팅 방법에 해당하는 flowSet 객체 제어와 도트 플롯 해상도(최소 256 이상)를 선택합니다. 형광이 음수인 측정값을 제거하고 원고에 설명된 다른 실험으로 인한 이상값을 제거하기 위해 두 개의 필터링 명령의 주석 처리를 제거합니다.

소스를 누르고 스크립트를 실행합니다. 분석 결과가 포함된 모든 파일이 dir_r로 작성됩니다. dSpCas9-VP64의 최고의 활성화 효율은 합성 프로모터에 6개의 lexOp 표적 부위가 있을 때 달성되었습니다.

반면 dCas12a-VPR의 경우 3개의 lexOp 카피가 합성 프로모터에 삽입되었을 때 가장 높은 활성화 효율을 보였다. 통합 플라스미드에 위치한 CRISPR RNA 및 단일 가이드 RNA에 의한 활성화는 에피솜 플라스미드에 배치했을 때보다 1.4배 내지 2.4배, 1.1배 내지 1.5배 더 높았다. RT-qPCR 결과는 에피솜 벡터가 발현 시스템에 관계없이 통합 벡터보다 훨씬 더 높은 수준의 단일 가이드 RNA CRISPR RNA를 생성한다는 것을 보여주었습니다.

dSpCas9 복합체 및 스캐폴드 RNA 모집 MCP-VP64의 활성화 효율을 시험하였다. 단일 야생형 및 F6MS2 헤어핀을 함유하는 스캐폴드 RNA는 각각 5.27 및 4.3배 활성화를 주었다. 그러나 두 헤어핀의 조합은 7.54배로 활성화 효율이 가장 높았습니다.

4가지 상이한 프로모터를 사용하여 3가지 2형 항 CRISPR의 발현을 유도하여 이들이 용량 의존적으로 작용한다는 것을 보여줬다. 강력한 프로모터는 형광 수준을 각각 값의 0.21, 0.11 및 0.13으로 감소시켰습니다. 적정 곡선은 회로가 온-오프 비율이 2.3에 가까운 매듭 보행처럼 작동한다는 것을 보여줍니다.

type 5 anti-CRISPR A one은 활성제로서 denAS-Cas12a와 dLB-Cas12a의 형광 발현을 19%에서 71%로 감소시킵니다.활성제와 억제인자 사이의 관계가 연구되었는데, Acr-VA는 pTEF1 하에서 pGAL1에 의해 생성되었을 때 성능에 큰 변동을 보였고 유전적 CYC1t-pCYC1noTata type 5 anti-CRISPR-A1은 베어 dLB Cas12a에서만 약간의 억제를 보였습니다. FACS 기계는 약하므로 조심스럽게 다루어야 합니다. 세포 용액은 너무 조밀해서는 안 되며 기계를 깨끗하게 유지해야 합니다.