Name: CRISPR-Cas 시스템 및 Anti-CRISPR 단백질을 기반으로 하는 유전자 디지털 회로 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: 배우세요 Saccharomyces cerevisiae에서 CRISPR dCas 시스템과 anti-CRISPR 단백질을 활용한 유전자 디지털 회로 설계 및 분석 방법을. 이 프로토콜은 합성 생물학 연구에 활용됩니다.

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FACS 실험에 도움을 준 Zhi Li 및 Xiangyang Zhang과 함께 일반적인 도움을 주신 합성 생물학 연구소 SPST, TJU의 모든 학생들에게 감사드립니다.

<ol><li>Marchisio, M. A., Stelling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+design+of+digital+synthetic+gene+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">Automatic design of digital synthetic gene circuits.</a> PLOS Computational Biology. 7 (2), 1001083(2011).</li>
<li>Karnaugh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+map+method+for+synthesis+of+combinational+logic+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Transactions+of+the+American+Institute+of+Electrical+Engineers%22%5BJournal%5D)">The map method for synthesis of combinational logic circuits.</a> Transactions of the American Institute of Electrical Engineers. 72 (9), 593-599 (1953).</li>
<li>Mandell, J. G., Barbas, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+finger+tools%3A+custom+DNA-binding+domains+for+transcription+factors+and+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Zinc finger tools: custom DNA-binding domains for transcription factors and nucleases.</a> Nucleic Acids Research. 34, 516-523 (2006).</li>
<li>Bogdanove, A. J., Voytas, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAL+effectors%3A+customizable+proteins+for+DNA+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">TAL effectors: customizable proteins for DNA targeting.</a> Science. 333 (6051), 1843-1846 (2011).</li>
<li>Drinnenberg, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNAi in budding yeast.</a> Science. 326 (5952), 544-550 (2009).</li>
<li>Gander, M. W., Vrana, J. D., Voje, W. E., Carothers, J. M., Klavins, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+logic+circuits+in+yeast+with+CRISPR-dCas9+NOR+gates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Digital logic circuits in yeast with CRISPR-dCas9 NOR gates.</a> Nature Communications. 8, 15459(2017).</li>
<li>Farzadfard, F., Perli, S. D., Lu, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tunable+and+multifunctional+eukaryotic+transcription+factors+based+on+CRISPR%2FCas%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Tunable and multifunctional eukaryotic transcription factors based on CRISPR/Cas.</a> ACS Synthetic Biology. 2 (10), 604-613 (2013).</li>
<li>Nakamura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-CRISPR-mediated+control+of+gene+editing+and+synthetic+circuits+in+eukaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Anti-CRISPR-mediated control of gene editing and synthetic circuits in eukaryotic cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 194(2019).</li>
<li>Louvion, J. F., Havaux-Copf, B., Picard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+of+GAL4-VP16+to+a+steroid-binding+domain+provides+a+tool+for+gratuitous+induction+of+galactose-responsive+genes+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Fusion of GAL4-VP16 to a steroid-binding domain provides a tool for gratuitous induction of galactose-responsive genes in yeast.</a> Gene. 131 (1), 129-134 (1993).</li>
<li>DiCarlo, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+CRISPR-Cas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems.</a> Nucleic Acids Research. 41 (7), 4336-4343 (2013).</li>
<li>Gao, Y., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-processing+of+ribozyme-flanked+RNAs+into+guide+RNAs+in+vitro+and+in+vivo+for+CRISPR-mediated+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Integrative+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Self-processing of ribozyme-flanked RNAs into guide RNAs in vitro and in vivo for CRISPR-mediated genome editing.</a> Journal of Integrative Plant Biology. 56 (4), 343-349 (2014).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Zetsche, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cpf1+is+a+single+RNA-guided+endonuclease+of+a+class+2+CRISPR-Cas+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system.</a> Cell. 163 (3), 759-771 (2015).</li>
<li>Fonfara, I., Richter, H., Bratovic, M., Le Rhun, A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CRISPR-associated+DNA-cleaving+enzyme+Cpf1+also+processes+precursor+CRISPR+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpf1 also processes precursor CRISPR RNA.</a> Nature. 532 (7600), 517-521 (2016).</li>
<li>Yu, L., Marchisio, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saccharomyces+cerevisiae+synthetic+transcriptional+networks+harnessing+dCas12a+and+Type+V-A+anti-CRISPR+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Saccharomyces cerevisiae synthetic transcriptional networks harnessing dCas12a and Type V-A anti-CRISPR proteins.</a> ACS Synthetic Biology. 10 (4), 870-883 (2021).</li>
<li>Zhang, Y., Marchisio, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+bare+dSpCas9%2C+scaffold+gRNA%2C+and+type+II+anti-CRISPR+proteins+highly+favors+the+control+of+gene+expression+in+the+yeast+S.+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Interaction of bare dSpCas9, scaffold gRNA, and type II anti-CRISPR proteins highly favors the control of gene expression in the yeast S. cerevisiae.</a> ACS Synthetic Biology. 11 (1), 176-190 (2022).</li>
<li>Sheff, M. A., Thorn, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+cassettes+for+fluorescent+protein+tagging+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Optimized cassettes for fluorescent protein tagging in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 21 (8), 661-670 (2004).</li>
<li>Naito, Y., Hino, K., Bono, H., Ui-Tei, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPRdirect%3A+software+for+designing+CRISPR%2FCas+guide+RNA+with+reduced+off-target+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">CRISPRdirect: software for designing CRISPR/Cas guide RNA with reduced off-target sites.</a> Bioinformatics. 31 (7), 1120-1123 (2015).</li>
<li>Chee, M. K., Haase, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+and+redesigned+pRS+plasmid+shuttle+vectors+for+genetic+manipulation+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22G3%3A+Genes%7CGenomes%7CGenetics%22%5BJournal%5D)">New and redesigned pRS plasmid shuttle vectors for genetic manipulation of Saccharomyces cerevisiae.</a> G3: Genes|Genomes|Genetics. 2 (5), 515-526 (2012).</li>
<li>Gibson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+DNA+fragments+in+yeast+by+one-step+assembly+of+overlapping+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Synthesis of DNA fragments in yeast by one-step assembly of overlapping oligonucleotides.</a> Nucleic Acids Research. 37 (20), 6984-6990 (2009).</li>
<li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+plasmid+DNA+into+E.+coli+using+the+heat+shock+method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method.</a> Journal of Visualized Experiments. (6), e253(2007).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MR+%22Molecular+Cloning.+Fourth+edition%22">Molecular Cloning. Fourth edition</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY. (2012).</li>
<li>Sanger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+nucleotide+sequences+in+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Determination of nucleotide sequences in DNA.</a> Science. 214 (4526), 1205-1210 (1981).</li>
<li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+yeast+by+lithium+acetate%2Fsingle-stranded+carrier+DNA%2Fpolyethylene+glycol+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method.</a> Methods in Enzymology. 350, 87-96 (2002).</li>
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<li>Rauch, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+CRISPR-Cas9+with+bacteriophage+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Inhibition of CRISPR-Cas9 with bacteriophage proteins.</a> Cell. 168 (1-2), 150-158 (2017).</li>
<li>Hynes, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+anti-CRISPR+from+a+virulent+streptococcal+phage+inhibits+Streptococcus+pyogenes+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Microbiology%22%5BJournal%5D)">An anti-CRISPR from a virulent streptococcal phage inhibits Streptococcus pyogenes Cas9.</a> Nature Microbiology. 2 (10), 1374-1380 (2017).</li>
<li>Watters, K. E., Fellmann, C., Bai, H. B., Ren, S. M., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+discovery+of+natural+CRISPR-Cas12a+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic discovery of natural CRISPR-Cas12a inhibitors.</a> Science. 362 (6411), 236-239 (2018).</li>
<li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+quantification+of+microRNAs+by+stem-loop+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR.</a> Nucleic Acids Research. 33 (20), 179(2005).</li>
<li>Pfaffl, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+mathematical+model+for+relative+quantification+in+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR.</a> Nucleic Acids Research. 29 (9), 45(2001).</li>
<li>Hahne, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((flowCore%3A+a+Bioconductor+package+for+high+throughput+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">flowCore: a Bioconductor package for high throughput flow cytometry.</a> BMC Bioinformatics. 10 (1), 106(2009).</li>
<li>Li, J., Xu, Z., Chupalov, A., Marchisio, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-CRISPR-based+biosensors+in+the+yeast+S.+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Engineering%22%5BJournal%5D)">Anti-CRISPR-based biosensors in the yeast S. cerevisiae.</a> Journal of Biological Engineering. 12, 11(2018).</li>
<li>Dong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+anti-CRISPR+protein+disables+type+V+Cas12a+by+acetylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An anti-CRISPR protein disables type V Cas12a by acetylation.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 26 (4), 308-314 (2019).</li>
</ol>

저자는 경쟁적인 재정적 이익을 선언하지 않습니다.

이 프로토콜은 "DBTL(Design-Build-Test-Learn)" 생물 공학 주기에 따라 건식 실험실 및 습식 실험실 실험 모두에 대해 합성 유전자 디지털 회로에 대한 완전한 워크플로를 보여주었습니다. 여기서는 S. cerevisiae 의 작은 전사 네트워크를 설계하고 구축하여 CRISPR-Cas 시스템, 주로 dSpCas9, denAsCas12a, dLbCas12a 및 해당 항-CRISPR 단백질에 초점을 맞췄습니다. 그들 중 일부는 디지털 회로의 기본 구성 요소인 부울 게이트를 모방했습니다. 여기에 설명된 모든 회로를 통해 S. cerevisiae에서 CRISPR 관련 및 항-CRISPR 단백질의 특성과 특징을 묘사할 수 있었습니다. 이러한 결과는 유전자 디지털 회로의 계획에 이러한 단백질을 포함시키는 데 필수적입니다.
DBTL 개념은 합성 생물학의 프레임워크를 제공하는 반면, 새로운 아티팩트를 테스트한 후 많은 최적화와 개선이 이루어져야...

2011년, 연구자들은 디지털 합성 유전자 회로의 자동 설계를 위한 계산 방법을 제안하고 해당 소프트웨어를 개발했다1. 사용자는 입력 수(3개 또는 4개)를 지정하고 회로 진리표를 채워야 했습니다. 이것은 전자 공학의 기술을 사용하여 회로 구조를 도출하는 데 필요한 모든 정보를 제공했습니다. 진리표는 Karnaugh 지도 방법2를 통해 두 개의 부울 공식으로 변환되었습니다. 각 부울 공식은 회로 입력(일부)과 그 부정(리터럴) 간의 논리 연산(합계 또는 곱셈)을 설명하는 절로 구성됩니다. 절은 차례로 합산(OR) 또는 곱하기(AND)하여 회로 출력을 계산합니다. 모든 회로는 POS(합계 곱) 형식으로 작성된 공식과 SOP(곱 합계) 표현으로 작성된 공식의 두 가지 공식에 따라 실현될 수 있습니다. 전자는 리터럴의 논리 합계를 포함하는 절(즉, 부울 게이트)의 곱으로 구성됩니다. 대조적으로, 후자는 리터럴이 곱해지는 절의 합계입니다.
전기 회로는 브레드보드에서 서로 다른 게이트를 물리적으로 배선하여 실현할 수 있습니다. 전류는 게이트 간의 신호 교환을 허용하여 출력을 계산합니다.
생물학에서는 상황이 더 복잡합니다. 부울 게이트는 전사 또는 번역(또는 둘 다)이 조절되는 전사 단위(TU; 즉, 진핵 세포 내부의 서열 "프로모터-코딩 영역-터미네이터")로서 실현될 수 있다. 따라서, 적어도 두 종류의 분자는 생물학적 배선을 확립한다: 전사 인자 단백질과 비코딩, 안티센스 RNA1.
유전자 디지털 회로는 2 개 또는 3 개의 게이트 층으로 구성됩니다 : 1) YES (버퍼) 및 NOT 게이트로 만들어지고 입력 화학 물질을 배선 분자로 변환하는 입력 층; 2) 해당 부울 공식에 절이 있는 만큼의 TU로 구성된 내부 계층. 회로가 SOP 공식에 따라 설계되면 내부 계층의 모든 절은 소위 분산 출력 아키텍처에서 회로 출력(예: 형광)을 생성합니다. 합계 곱 (POS) 공식을 사용하는 경우 3) 최종 층이 필요하며, 여기에는 내부 층에서 배선 분자를 수집하는 단일 곱셈 게이트가 포함됩니다.
전반적으로 합성 생물학에서는 동일한 회로에 대해 다양한 계획을 설계할 수 있습니다. TU와 배선 분자의 수와 종류가 다릅니다. 효모 세포에서 구현하기 가장 쉬운 솔루션을 선택하기 위해 각 회로 설계는 다음과 같이 정의되는 복잡성 점수 S와 연관됩니다.
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/64539/64539eq01.jpg" style="margin: auto;">
여기서 A 는 활성제의 수를 나타내고, R 은 억제인자의 수를 나타내고, a 는 안티센스 RNA 분자의 양을 나타냅니다. 활성제 또는 억제자가 회로에 없으면 S에 대한 기여도는 0입니다. 따라서 많은 수의 직교 전사 계수가 필요한 경우 실험실에서 회로 방식(높은 S)을 실현하기가 더 어렵습니다. 이것은 디지털 회로 내부의 완전한 배선을 실현하기 위해 새로운 활성제와 억제기가 새로 설계되어야 함을 의미합니다. 원칙적으로, 새로운 DNA-결합 단백질은 징크 핑거 단백질(Zinc Finger protein)3 및 TAL 이펙터( TAL effector)4 를 주형으로 사용하여 조립할 수 있다. 그러나 이 옵션은 너무 힘들고 시간이 많이 걸리는 것처럼 보입니다. 따라서 복잡한 유전자 회로를 완성하기 위해 주로 작은 RNA와 번역 조절에 의존해야 합니다.
원래 이 방법은 박테리아의 디지털 회로를 제작하기 위해 개발되었습니다. 실제로, 진핵 세포에서는 안티센스 RNA 대신 마이크로RNA(miRNA) 또는 작은 간섭 RNA(siRNA)에 대해 이야기하는 것이 더 적합합니다.5. 그러나 RNAi 경로는 효모 S. cerevisiae에 존재하지 않습니다. 따라서 완전한 전사 네트워크를 선택해야 합니다. 회로에 5개의 활성기와 5개의 억제기가 필요하다고 가정합니다. 복잡성 점수는 S = 32입니다. 10개의 전사 인자를 활성화 도메인(AD)에 융합된 단일 dCas96 (뉴클레아제 결핍 Cas9)으로 대체함으로써 회로 복잡성을 줄일 수 있습니다. 도 7에서 보는 바와 같이, dCas9-AD는 TATA 박스와 TSS(transcription start site) 사이에 프로모터를 결합시킬 때 효모에서 억제인자로 작용하고, TATA 박스의 상류에 잘 결합할 때 활성화제로서 작용한다. 따라서 10개의 전사 인자를 단일 dCas9-AD 융합 단백질과 10개의 sgRNA(단일 가이드 RNA)로 대체하여 S = 11의 총 복잡성 점수를 얻을 수 있습니다. 10개의 sgRNA를 빠르고 쉽게 합성할 수 있는 반면, 앞서 언급했듯이 10개의 단백질을 조립하려면 훨씬 더 길고 복잡한 작업이 필요합니다.
대안적으로, 두 개의 직교 dCas 단백질(예: dCas9 및 dCas12a)을 사용할 수 있는데, 하나는 AD에 융합하기 위한 것이고, 다른 하나는 억제 도메인과 결합하기 위한 것입니다. 복잡성 점수는 한 단위(S = 12)만 증가합니다. 따라서 CRISPR-dCas 시스템은 S. cerevisiae에서 매우 복잡한 유전자 디지털 회로를 구성하는 열쇠입니다.
이 논문은 효모에서 dCas9 및 dCas12a 기반 억제인자 및 활성제의 효율성을 깊이 특성화합니다. 결과는 활성을 최적화하기 위해 많은 양의 sgRNA를 요구하지 않으므로 에피솜 플라스미드를 우선적으로 피하는 것으로 나타났습니다. 또한, dCas9 기반 활성제는 VP64 AD의 사본을 모집하는 스캐폴드 RNA(scRNA)를 사용할 때 훨씬 더 효과적입니다. 반면, dCas12a는 강력한 VPR AD에 직접 융합될 때 잘 작동합니다. 또한, 합성 활성화 프로모터는 활성화제의 구성에 따라 다양한 수의 표적 부위를 필요로 합니다(예: dCas12a-VPR을 사용할 때 3개, dCas9-VP64를 사용할 경우 6개, dCas9 및 scRNA를 사용하는 경우 1개만). 억제자로서, dCas12a는 프로모터보다는 코딩 영역을 결합할 때 더 예리하게 나타난다.
그러나 CRISPR-dCas9/dCas12a는 화학물질과 직접 상호 작용하지 않는다는 단점이 있습니다. 따라서 입력 계층에서는 아무 소용이 없을 수 있습니다. 이러한 이유로 항-CRISPR 단백질(Acrs)을 포함하는 대체 부울 게이트 설계가 조사되었습니다. Acrs는 (d)Cas 단백질에 작용하여 작용을 억제한다8. 따라서 CRISPR-(d)Cas 시스템의 활성을 조절하는 수단입니다. 이 논문은 S. cerevisiae에서 유형 II Acr과 (d)Cas9, 유형 V Acrs와 (d)Cas12a 사이의 상호 작용을 철저히 분석합니다. Acrs는 Cas 단백질보다 훨씬 작기 때문에 에스트로겐 β-에스트라디올에 반응하는 NOT 게이트는 인간 에스트로겐 수용체 9-HBD(hER)-를 AcrIIA4에 융합하여 구축되었습니다. 게다가, 갈락토오스 유도 시 dCas12a(-AD)와 AcrVA를 구성적으로 발현하는 소수의 YES 및 NOT 게이트가 실현되었습니다. 현재 이러한 게이트는 개념 증명으로만 사용됩니다. 그러나 그들은 또한 효모 세포에서 합성 유전자 디지털 회로의 계산 자동 설계를 수행하기 위한 알고리즘에 대한 심층적인 재고를 향한 첫 번째 단계를 나타냅니다.

<table><tbody><tr><td>0.1 mL PCR 8-스트립 튜브</td><td>NEST</td><td>403112</td><td></td></tr><tr><td>0.2 mL PCR 튜브</td><td>Axygen</td><td>PCR-02-C</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 마이크로튜브</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 원심분리기 튜브&nbsp;</td><td>BIOFIL</td><td>CFT011150</td><td></td></tr><tr><td>2 mL 마이크로튜브</td><td>Axygen</td><td>MCT-200-C&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 원심분리기 튜브&nbsp;</td><td>BIOFIL</td><td>CFT011500</td><td></td></tr><tr><td>아가로스-분자 생물학 등급</td><td>Invitrogen</td><td>75510-019</td><td></td></tr><tr><td>암피실린 나트륨 염</td><td>Solarbio</td><td>69-52-3</td><td></td></tr><tr><td>Applied biosystems veriti 96-well thermal cycler</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4375786</td><td></td></tr><tr><td>AxyPrep DNA 젤 추출 키트 Axygen</td><td></td><td>AP-GX-250</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSuite CS& 앰프; T 연구 구슬</td><td>BD</td><td>650621</td><td>형광 구슬</td></tr><tr><td>BD FACS전기 유세포 분석기&nbsp;</td><td></td><td></td><td>BD-Centrifuge</td></tr> <tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge Sorvall ST 16R</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75004380</td><td></td></tr><tr><td>E. coli competent cells (Strain DH5&alpha;)</td><td>Life Technologies</td><td>18263-012</td><td></td></tr><tr><td>ECL 선택 웨스턴 블로팅 검출 시약</td><td>GE 헬스케어</td><td>RPN2235</td><td></td></tr><tr><td>전기영동 장치</td><td>Beijing JUNYI Electrophoresis Co., Ltd</td><td>JY300C</td><td></td></tr><tr><td>플랫 8-스트립 캡</td><td>NEST</td><td>406012</td><td></td></tr><tr><td>유전자 합성 회사</td><td>Azenta Life Sciences</td><td></td><td>https://web.azenta.com/zh-cn/azenta-life-sciences</td></tr><tr><td>염소 안티 마우스 IgG (H+L) 교차 흡착 2차 항체 Alexa Fluor 568</td><td>Invitrogen</td><td>A-11004</td><td></td></tr><tr><td>HiFiScript cDNA 합성 키트</td><td>CWBIO</td><td>CW2569M</td><td>6.2.2.1단계에서 사용</td></tr> 용해 <tr><td>용액(Zymolyase)</td><td>zymoresearch</td><td>E1004-A</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse 80i 형광 현미경</td><td>Nikon</td><td>- </td><td>형광 현미경</td></tr><tr><td>Pipet 팁&mdash; 10 &뮤; L</td><td>Axygen</td><td>T-300-R-S</td><td></td></tr><tr><td>피펫 팁&mdash; 1000 &뮤; L</td><td>Axygen</td><td>T-1000-B-R-S</td><td></td></tr><tr><td>피펫 팁&mdash; 200 &뮤; L</td><td>Axygen</td><td>T-200-Y-R-S</td><td></td></tr><tr><td>pRSII403</td><td>Addgene</td><td>35436</td><td></td></tr><tr><td>pRSII404</td><td>Addgene</td><td>35438</td><td></td></tr><tr><td>pRSII405</td><td>Addgene</td><td>35440</td><td></td></tr><tr><td>pRSII406</td><td>Addgene</td><td>35442</td><td></td></tr><tr><td>pRSII424</td><td>Addgene</td><td>35466</td><td></td></tr><tr><td>pTPGI_dSpCas9_VP64&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>49013</td><td></td></tr><tr><td>Q5 High-fidelity DNApolymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0491</td><td></td></tr><tr><td>제한 효소-Acc65I</td><td>New England Biolabs</td><td>R0599</td><td></td></tr><tr><td>제한 효소-BamHI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0136</td><td></td></tr><tr><td>제한 효소-SacI-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3156</td><td></td></tr><tr><td>제한 효소-XhoI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146</td><td></td></tr><tr><td>Roche LightCycler 96&nbsp;</td><td></td><td>Roche-Real-Time PCR 기기</td><td></td></tr><tr><td>S. cerevisiae CEN. PK2-1C</td><td>-</td><td>-</td><td>부모 변형률. 유전자형은 다음과 같습니다 : MATa; 그의3D1; 레우2-3_112; 우라3-52; TRP1-289; MAL2-8C; SUC2</td></tr><tr><td>스템 루프 키트</td><td>SparkJade</td><td>AG0502</td><td>6.2.1.3</td></tr><tr><td>T100 Thermal Cycler</td><td>BIO-RAD</td><td>186-1096</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 리가제</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202</td><td></td></tr><tr><td>T5 Exonuclease</td><td>New England Biolabs</td><td>M0363</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA 리가제</td><td>New England Biolabs</td><td>M0208</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA 중합효소</td><td>New England Biolabs</td><td>M0495</td><td></td></tr><tr><td>TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)(2x) (SYBR Green I dye)</td><td>Takara</td><td>RR820Q</td><td></td></tr><tr><td>YeaStar RNA kit</td><td>Zymo Research</td><td>R1002</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-estradiol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E8875</td><td></td></tr></tbody></table>

crispr-cas 시스템 및 anti-crispr 단백질을 기반으로 하는 유전자 디지털 회로

Gene Digital Circuits Based on CRISPR-Cas Systems and Anti-CRISPR Proteins

합성 유전자 부울 게이트 및 디지털 회로는 의료 진단에서 환경 보호에 이르기까지 광범위한 응용 분야를 가지고 있습니다. CRISPR-Cas 시스템과 천연 억제제인 항-CRISPR 단백질(Acrs)의 발견은 생체 내 유전자 디지털 회로를 설계하고 구현하기 위한 새로운 도구를 제공합니다. 여기에서는 "설계-구축-테스트-학습" 생물 공학 주기의 아이디어를 따르고 해당 Acrs와 함께 dCas9/dCas12a를 사용하여 Saccharomyces cerevisiae에서 일부는 부울 게이트처럼 작동하는 작은 전사 네트워크를 설정하는 프로토콜을 설명합니다. 이러한 결과는 전사 인자로서 dCas9/dCas12a의 특성을 지적합니다. 특히, 유전자 발현의 최대 활성화를 달성하기 위해 dSpCas9는 VP64 활성화 도메인(AD)의 여러 사본을 수집하는 조작된 스캐폴드 RNA와 상호 작용해야 합니다. 대조적으로, dCas12a는 C 말단에서 강력한 VP64-p65-Rta(VPR) AD와 융합되어야 합니다. 또한, 두 Cas 단백질의 활성은 세포에서 sgRNA/crRNA의 양을 증가시킨다고 해서 향상되지 않습니다. 이 기사에서는 CRISPR-dCas-Acr 상호 작용을 기반으로 부울 게이트를 구축하는 방법도 설명합니다. 인간 에스트로겐 수용체의 AcrIIA4 융합 호르몬 결합 도메인은 β-에스트라디올에 반응하는 NOT 게이트의 핵심인 반면, 유도성 GAL1 프로모터에 의해 합성된 AcrVA는 갈락토오스를 입력으로 사용하여 YES 및 NOT 게이트를 모두 모방할 수 있습니다. 후자의 회로에서 AcrVA5는 dLbCas12a와 함께 최상의 논리 동작을 보여주었습니다.

RNA 중합효소 III형 프로모터에 의한 sgRNA/crRNA 발현 먼저, 이 작업은 그림 1A에 표시된 전사 활성화 회로(회로 1)의 엔지니어링을 다루었습니다. 그것은 세 가지 기본 구성 요소를 포함했다 : 1) yEGFP (리포터)를 암호화하는 유전자, dCas9 / dCas12a-AD에 대한 표적 부위를 제공하는 일련의 다른 합성 프로모터가 선행되었다. 2) 활성화 도메인 (각각 VP64 및 VPR)에 융합되고 하나 또는 두 개의 핵 국소화 서열 (NLS)을 함유하는 dCas9 또는 dCas12a의 효모 코돈 최적화 버전. 두 dCas 단백질 모두 강력한 구성 프로모터-pGPD에 의해 생성되었습니다. 및 3) dCas9/dCas12a-AD를 표적 부위로 유도하는 sgRNA/crRNA 서열. dCas9/dCas12a 기반 활성제의 활성화 효율을 리포터의 형광 강도(FACS 실험을 통해 측정)에 의해 시각화하고 반영했습니다...

CRISPR-Cas 시스템과 anti-CRISPR 단백질은 Saccharomyces cerevisiae의 부울 게이트 체계에 통합되었습니다. 새로운 소형 논리 회로는 우수한 성능을 보였으며 dCas9/dCas12a 기반 전사 인자와 항-CRISPR 단백질의 특성에 대한 이해를 심화시켰습니다.

CRISPR-Cas 시스템 및 Anti-CRISPR 단백질을 기반으로 하는 유전자 디지털 회로

Synthetic gene Boolean gates and digital circuits have a broad range of applications, from medical diagnostics to environmental care. The discovery of the ...

당사의 프로토콜은 유형 2 및 유형 5 CRISPR dCas 시스템과 해당 항-CRISPR 단백질을 사용하는 효모 유전자 디지털 회로를 설계, 구축 및 분석하는 방법을 설명합니다. 서비스에서 합성 전사 네트워크를 조립하고 테스트하기 위한 표준 절차를 전혀 수집하지 않기 때문에 조립 체류입니다. 시작하기 위해, 20 내지 40 나노그램의 DNA 주형, 1 마이크로리터의 정방향 프라이머, 1 마이크로리터의 역방향 프라이머, 5 마이크로리터의 DNTP 믹스, 0.5 마이크로리터의 DNA 중합효소, 10 마이크로리터의 5x DNA 중합효소 반응 완충액, 및 이중 증류수를 최대 50 마이크로리터의 총 부피까지 함유하는 반응 혼합물을 제조한다.원고에 설명된 대로 열순환기에서 터치다운 PCR 프로그램을 사용하여 DNA 서열을 증폭합니다. 겔 전기영동을 통해 PCR 산물을 분리하고 DNA 겔 추출 키트를 통해 아가로스 겔에서 DNA 서열을 희석합니다. Gibson 조립 방법을 사용하여 섭씨 50도에서 1시간 동안 등몰 DNA 혼합물을 넣어 정제된 PCR 산물을 절단된 셔틀 벡터에 삽입합니다.앞에서 설명한 대로 터치다운 PCR 및 Gibson 조립 방법을 통해 dCas12a 수용체 벡터를 구성합니다. 효모 코돈 최적화 dCas12a 단백질을 BamH1 및 Xhol1을 사용한 분해 및 T4 DNA 리가아제를 사용한 결찰을 통해 새로 구성된 두 개의 수용체 벡터에 삽입합니다. 유사하게, pRS2403 셔틀 벡터를 기반으로 플라스미드를 구성하여 터치다운 PCR 및 Gibson 조립 방법을 통해 항-CRISPR 단백질을 발현합니다.현미경 세포 검출을 수행하려면 2마이크로리터의 세포 용액을 유리 슬라이드에 놓고 커버 슬립으로 덮습니다. 형광 광원, 현미경 및 컴퓨터를 켜서 형광 현미경으로 세포를 관찰합니다. 형광등 번호를 적어 둔 후 컴퓨터에서 현미경 소프트웨어를 엽니 다.슬라이드를 현미경 스테이지에 놓고 녹색 조명 아래에서 세포를 관찰하면서 40x 대물 렌즈를 선택합니다. 효모 세포의 윤곽이 나타날 때까지 코스 초점 노브를 움직이고 미세 초점 노브를 움직여 세포의 초점을 맞춥니다. 세포를 감지하려면 현미경 시야를 닫은 후 컴퓨터 화면으로 전환하고 라이브를 클릭하십시오.3-5초 동안 기다립니다. 캡처를 클릭하여 사진을 찍고 저장합니다. 그런 다음 컴퓨터, 현미경 및 형광등을 끕니다.측정 20분 전에 FACS 기계를 켜서 레이저를 예열하

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연구

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Bioengineering

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