Name: 유세포 분석 기술을 통한 일본 뇌염 백신 접종을받은 어린이의 다기능 T 세포 검출 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: 배우세요 일본 뇌염 백신 접종 어린이의 다기능 T 세포를 유세포 분석으로 검출하는 방법을. PBMC 자극과 세포 표면 및 세포내 사이토카인 염색을 통해 면역 반응을 평가합니다.

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R.W.는 중국 국립 자연 과학 재단 (82002130), 중국 베이징 자연 과학 재단 (7222059)의 지원을 받았습니다. ZD.X.는 CAMS 의료 과학 혁신 기금 (2019-I2M-5-026)의 지원을 받았습니다.

본 연구에 대한 윤리적 승인은 수도의과대학 베이징아동병원 윤리위원회(승인번호: 2020-k-85)에서 획득했다. 자원 봉사자는 베이징 어린이 병원, 수도 의과 대학에서 모집되었습니다. 말초 정맥 혈액 샘플은 이전에 약독 화 된 JE SA14-14-2 백신으로 반년 미만 동안 프라임 및 부스트 예방 접종을받은 건강한 어린이 (2 세)로부터 얻었습니다 (JE 예방 접종을받은 어린이, n = 5) 및 예방 접종을받지 않은 어린이 (6 개월, n = 5). 인간 피험자의 정보에 입각 한 동의는 임상 적으로 테스트 된 후 잔류 샘플 만이이 연구에서 사용되었으므로 포기되었습니다. 자원 봉사자의 개인 정보를 보호하기 위해 모든 데이터는 완전히 익명화되고 익명화되었습니다.
1. 말초 정맥혈에서 PBMC의 분리
<ol><li>표준 정맥 천자 기술18에 따라 EDTA-K2- 항 응고 튜브 (재료 표 참조)에서 JE 예방 접종을받은 어린이와 예방 접종을받지 않은 어린이로부터 말초 정맥혈 샘플 (2mL)을 수집합니다.</li>
	<li>인산염 완충 식염수(1x PBS) 2mL를 추가하여 말초 혈액을 희석합니다. 참고: 이 프로세스는 최대 생존성을 유지하기 위해 가능한 한 빨리 처리됩니다.</li>
	<li>4mL의 밀도 구배 배지( 재료 표 참조)를 15mL 원심분리 튜브에 추가하고 희석된 혈액을 분리 배지의 상층으로 천천히 옮깁니다. 알림: 혈액을 분리 매체와 혼합하거나 두 액체로 형성된 접촉면을 파괴하지 마십시오. 그렇지 않으면 분리 효과가 달성되지 않습니다.</li>
	<li>실온에서 20 분 동안 800 ×g에서 원심 분리합니다. 원심분리 후 유의층을 관찰한다.</li>
	<li>PBMC (중간 층)를 다른 15mL 원심분리 튜브로 옮기고 PBMC를 10% 소 태아 혈청(FBS, 재료 표 참조)을 함유하는 RPMI-1640 배지 10mL로 세척합니다.</li>
	<li>실온에서 10 분 동안 800×g으로 원심분리하고 피펫으로 상층액을 조심스럽게 버린다.</li>
	<li>10% FBS를 함유한 RPMI-1640 배지 1mL로 PBMC를 재현탁하고 트리판 블루 기반 자동 카운터로 세포를 계수합니다( 재료 표 참조).</li>
</ol>2. 사이토카인 발현을 유도하기 위해 비활성화된 JEV 입자에 의한 PBMC의 자극
<ol><li>JEV 자극의 두 하위군과 JE 백신접종된 대조군 및 백신접종되지 않은 샘플에서 각각 설정한다.</li>
	<li>PBMC의 수를 10% FBS를 함유하는 RPMI-1640 배지로 2 × 10 6 세포/mL로 조정하고, PBMC를 24-웰 플레이트에 시드한다(웰당 2 × 106 세포/1 mL 배지); 각 그룹에 대해 3 개의 웰을 접종하십시오.</li>
	<li>단클론 항체 CD28(1μg/mL, 1:1,000) 및 CD49d(1μg/mL), 골지플러그(1μg/mL, 1:1,000) 및 모넨신(1μg/mL, 1:1,000)의 존재하에 37°C에서 16시간 동안 농축된 비활성화된 JEV 입자 5(2 × 105 PFU)로 JEV 자극 그룹의 PBMC를 자극합니다. 표면 염색을 위해 BV605-anti-CD107a(1μg/mL, 1:1,000)를 사용하십시오(재료 표 참조). 참고: JEV는 앞서 설명한 대로 UV 조사에 의해 비활성화되었습니다19.</li>
	<li>단일 클론 항체 CD28 (1 μg/mL, 1:1,000) 및 CD49d (1 μg/mL, 1:1,000), GolgiPlug (1 μg/mL, 1:1,000) 및 모넨신 (1 μg/mL, 1:1,000)의 존재하에 37 °C에 16 h 동안 농축된 바이러스 입자 없이 대조군의 PBMCs를 자극하십시오. BV605-항-CD107a(1μg/mL, 1:1,000)로 표면을 염색합니다.</li>
</ol>3. 생체 외 세포 내 염색
<ol><li>각 그룹으로부터 세포 현탁액을 1.5 mL 미세원심분리 튜브에 모으고, 실온에서 5분 동안 500 × g 으로 원심분리하고, 피펫으로 상청액을 제거한다.</li>
	<li>세포를 1mL의 1x PBS에 재현탁하고 고정 가능한 생존 염료(1μL/mL, 1:1,000, 재료 표 참조)를 세포 현탁액에 추가하고 어두운 곳에서 실온에서 10분 동안 배양합니다. 500 × g (실온에서)에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 제거한다.</li>
	<li>세포를 1 mL의 1x PBS에 재현탁시킨다. 500 × g (실온에서)에서 5 분 동안 원심 분리합니다. 상청액을 조심스럽게 폐기하십시오.</li>
	<li>세포 표면 마커 염색을 수행합니다.<ol><li>세포를 100μL의 1x PBS에 재현탁시키고, 각 표면 마커 항체 (BV650-항-CD3, BUV395-항-CD4, BV421-항-CD8, BUV737-항-CD27, 및 BV480-항-CD45RO, 희석 인자: 1:50, 재료 표 참조)의 2μL를 각 튜브의 세포 현탁액에 첨가한다. 참고: 컬러 형광 항체 염색 프로토콜은 표 1에 나와 있습니다.</li>
		<li>튜브를 실온에서 30 분 동안 배양 (3.4.1 단계)하고 빛으로부터 보호하십시오. 500 × g 에서 5분 동안 원심분리하고 상청액을 제거한다. 참고: BUV737-항-CD27 및 BV480-항-CD45RO의 항체는 기억 T 세포의 주석으로서 BUV737-항-CCR7 및 BV480-항-CD45RA로 대체될 수 있다.</li>
	</ol></li>
	<li>세포를 1 mL의 1x PBS에 재현탁시킨다. 실온에서 5 분 동안 500 ×g에서 원심 분리합니다. 상청액을 조심스럽게 폐기하십시오.</li>
	<li>고정 및 멤브레인 파괴를 수행하십시오.<ol><li>500μL의 막 파괴 고정 용액( 재료 표 참조)으로 세포를 재현탁하고 실온의 어두운 곳에서 20분 동안 세포를 고정합니다. 500 × g 에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 제거한다.</li>
	</ol></li>
	<li>세포를 1 mL의 1x PBS에 재현탁시킨다. 실온에서 500 × g 에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 조심스럽게 제거한다.</li>
	<li>세포 내 사이토 카인 염색을 수행하십시오.<ol><li>세포를 100 μL의 1x PBS에 재현탁시키고, 2 μL의 각 사이토카인 항체 (FITC-항-IFN-γ, PE-항-TNF-α, BV785-항-IL-2, 및 APC-항-MIP-1α, 희석 계수: 1:50, 재료 표 참조)를 각 튜브의 세포 현탁액에 첨가한다. 참고: 형광단 접합 항체에 대한 부피 및 정보는 표 1에 나와 있습니다.</li>
		<li>튜브를 (단계 3.8.1) 어두운 곳에서 실온에서 30 분 동안 배양하십시오. 500 × g 에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 제거한다.</li>
	</ol></li>
	<li>세포를 1 mL의 1x PBS에 재현탁시킨다. 실온에서 5분 동안 500× g 으로 원심분리하고, 상층액을 조심스럽게 제거한다. 500μL의 1x PBS를 추가하여 세포를 재현탁시킵니다.</li>
</ol>4. 유세포분석 설정
<ol><li>PBMC 샘플을 단독으로 대조군 샘플로서 단계 1에 기재된 절차에 따라 단리한다. 아래에 언급된 대로 세포 현탁액을 1.5mL 미세 원심분리 튜브(100μL/튜브)에서 12등분으로 나눕니다.<ol><li>염색되지 않은, APC-Cy7-살아있는/죽은 고정 염색, BV650-항-CD3 단일 염색, BUV395-항-CD4 단일 염색, BV421-항-CD8 단일 염색, BUV737-항-CD27 단일 염색, BV480-항-CD45RO 염색, BV605-항-CD107a, FITC-항-IFN-γ 염색, PE-항-TNF-α 단일 염색, BV785-항-IL-2 단일 염색 및 APC-항-MIP-1α 단일 염색 샘플을 설정합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>세포 표면 마커를 추가하고 세포내 사이토카인 염색을 단계 3에 기재된 바와 같이 한다. 각각의 단일 염색 샘플에 대해, 염색 단계의 형광단 중 하나만 첨가한다. 500μL의 1x PBS를 추가하여 세포를 재현탁시키고 저속으로 와동시킵니다.</li>
	<li>염색되지 않은 샘플을 사용하여 전방 산란(FSC), 측면 산란(SSC) 및 다른 형광 염료 전압을 조정합니다. 참고 : 본 연구에서는 다음 전압이 설정되었습니다. FSC: 440 V, SSC: 233 V, BV650: 575 V, APC-Cy7: 449 V, BUV395: 500 V, BV421: 402 V, BUV737: 585 V, BV480: 444 V, BV605: 457 V, FITC: 475 V, PE: 469 V, APC: 623 V 및 BV785: 725 V.</li>
	<li>단일-염색 샘플을 사용하여, 상이한 형광단 사이의 오염 신호를 제거하기 위해 유동 세포분석 보상을 조정한다. 알림: 보정 매개변수는 표 2에 나와 있습니다.</li>
</ol>5. 게이팅 전략 및 데이터 분석
참고: 본 연구에서, 본 분석을 위해, CD27+ CD45RO+ 또는 CCR7+ CD45RA-로서 CD8+ 또는 CD4+ T 세포의 중앙 기억 T 세포 (TCM 및 CD8+ 또는 CD4+ T 세포의 이펙터 기억 T 세포 (TEM)를 CD27-CD45RO+ 또는 CCR7-CD45RA-로 각각 정의하였다16.
<ol><li>FSC 영역(FSC-A)/SSC-영역(SSC-A) 점도표를 통해 다각형 게이트를 그려 파편을 제외하고 손상되지 않은 림프구 집단을 선택합니다(그림 1A).</li>
	<li>FSC-A/FSC-너비(FSC-W) 점도표를 통해 직사각형 게이트를 그려 단일 셀을 선택합니다(그림 1B).</li>
	<li>살아있는/죽은 자/SSC-A 점도표를 통해 직사각형 게이트를 그려 살아있는 세포를 선택합니다(그림 1C).</li>
	<li>CD3/SSC-A 점도표를 통해 직사각형 게이트를 그려 CD3+ T 세포를 식별합니다(그림 1D).</li>
	<li>CD4 / CD8 점도표를 통해 쿼드 게이트를 그려 CD4 + 또는 CD8 + T 세포를 식별합니다 (그림 1E).</li>
	<li>CD45RO/CD27 점도표를 통해 쿼드 게이트를 그려 CD4+ 또는 CD8+ T 세포를T CM(CD27+ CD45RO+) 및TEM(CD27- CD45RO+)으로 세분화합니다(그림 1F-I).</li>
	<li>CD8+ 또는 CD4+ T 세포의 TCM 또는TEM으로부터 CD107a, IFN-γ, TNF-α, IL-2 및 MIP-1α의 게이트를 각각 그려 상이한 반응 패턴의 빈도를 결정한다.</li>
	<li>샘플을 세포분석에 순차적으로 로드합니다. 정지 게이트 20을 사용하여 1 ×10 6 림프구를 획득하십시오. 참고: 개별 사용자는 1개이상의 × 10개 6개의 셀을 수집할 수 있습니다. 이 숫자는 소요 시간과 의미있는 결과를 제공하기에 충분한 세포 수집 사이의 절충안이었습니다.</li>
</ol>

<ol><li>Vanden Eynde, C., Sohier, C., Matthijs, S., De Regge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Japanese+encephalitis+virus+interaction+with+mosquitoes%3A+A+review+of+vector+competence%2C+vector+capacity+and+mosquito+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens%22%5BJournal%5D)">Japanese encephalitis virus interaction with mosquitoes: A review of vector competence, vector capacity and mosquito immunity.</a> Pathogens. 11 (3), 317(2022).</li>
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<li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutralizing+antibody+rather+than+cellular+immune+response+is+maintained+for+nearly+20+years+among+Japanese+encephalitis+SA14-14-2+vaccinees+in+an+endemic+setting%5BTitle%5D)+AND+%22Infection%2C+Genetics+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Neutralizing antibody rather than cellular immune response is maintained for nearly 20 years among Japanese encephalitis SA14-14-2 vaccinees in an endemic setting.</a> Infection, Genetics and Evolution. 85, 104476(2020).</li>
<li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+immunity+rather+than+antibody+mediates+cross-protection+against+Zika+virus+infection+conferred+by+a+live+attenuated+Japanese+encephalitis+SA14-14-2+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">T cell immunity rather than antibody mediates cross-protection against Zika virus infection conferred by a live attenuated Japanese encephalitis SA14-14-2 vaccine.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 104 (15), 6779-6789 (2020).</li>
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<li>Lam, J. K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+CD4%2B+and+CD8%2B+polyfunctional+T+cell+responses+against+immunodominant+lytic+and+latent+EBV+antigens+in+children+with+primary+EBV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Emergence of CD4+ and CD8+ polyfunctional T cell responses against immunodominant lytic and latent EBV antigens in children with primary EBV infection.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 416(2018).</li>
<li>Meckiff, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imbalance+of+regulatory+and+cytotoxic+SARS-CoV-2-reactive+CD4%28%2B%29+T+cells+in+COVID-19%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Imbalance of regulatory and cytotoxic SARS-CoV-2-reactive CD4(+) T cells in COVID-19.</a> Cell. 183 (5), 1340-1353 (2020).</li>
<li>Ning, R. J., Xu, X. Q., Chan, K. H., Chiang, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+carriers+generate+Epstein-Barr+virus+%28EBV%29-specific+CD4%28%2B%29+and+CD8%28%2B%29+polyfunctional+T-cell+responses+which+show+immunodominance+hierarchies+of+EBV+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Long-term carriers generate Epstein-Barr virus (EBV)-specific CD4(+) and CD8(+) polyfunctional T-cell responses which show immunodominance hierarchies of EBV proteins.</a> Immunology. 134 (2), 161-171 (2011).</li>
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이 프로토콜은 JEV 백신 SA14-14-2로 백신을 접종한 어린이의 PBMC에서 TPF 프로파일에 대한 실현 가능한 유세포분석 기반 검출 방법을 나타냅니다. 이 연구는 예방 접종을받은 어린이와 예방 접종을받지 않은 어린이의 정맥혈 PBMC를 연구 자료로 사용했습니다. JEV 항원을 갖는 PBMCs의 자극과 함께, 이들 증폭된 항원-특이적 TPFs는 다색 유동 세포분석 항체 염색에 의해 특성화될 수 있다. 종래의 효소 결합 면역반점 분석법과 비교해, 유동 세포측정법의 현저한 이점은 단 하나 세포 수준에 PBMCs의 기능적인 특징을 가능한 한 다양하게 제시하는 것입니다, 검출을 위해 요구된 PBMCs의 수를 감소시키는 것입니다, 특히 아이들을 위해 적당합니다.
명확한 백신 접종 이력, 세포 생존력 유지, 자극기의 T 세포 면역원성 및 호환 가능한 색상 일치 전략은 이 프로토콜에서 중요한 단계입니다. 중국은 2008년부터 JEV SA14-14-...

일본 뇌염 바이러스 (JEV)는 Flaviviridae 가족1 내의 Flavivirus 속에 속하는 중요한 모기 매개 바이러스입니다. 많은 아시아 태평양 국가들은 일본뇌염(JE)으로 인한 막대한 질병 부담으로 인해 오랫동안 엄청난 공중 보건 문제에 직면해 왔지만 다양한 유형의 예방 접종의 가용성이 증가함에 따라 극적으로 개선되었습니다2. 자연 감염 또는 백신 접종에 의해 유발되는 적응 형 보호 면역 반응은 예방 및 항 바이러스 조절에 기여합니다. 체액 성 면역과 세포 매개 면역은 적응 면역으로 분류되며, 전자의 유도는 과거3에서 상대적으로 제한된 이해에도 불구하고 항상 백신 설계의 핵심 전략으로 간주되어 왔습니다. 그러나, 플라비바이러스 전파 및 바이러스 제거를 제한하는 T 세포 매개 면역의 역할은 점점 더 집중되고광범위하게 연구되고 있다4. 또한, T 세포 면역은 JEV 특이적 항바이러스 반응에 필수적일 뿐만 아니라이전 연구에서 입증된 이종 플라비바이러스의 2차 감염으로부터 교차 보호에 중요한 역할을 합니다5. 이 효과는 감염5에서 잠재적인 항체 매개 향상 효과를 우회할 수 있다고 추측됩니다. 참고로, 이러한 교차 반응성 T 세포 면역은 특히 플라비바이러스에 대한 백신 및 항바이러스 약물의 부재 하에서 중요하다. CD4+ 및 CD8+ T 세포6,7에 대한 JEV 감염에서 T 세포의 기여도를 결정하기 위해 많은 연구가 수행되었지만, 사이토카인을 분비하는 각각의 계통과 그 기능적 다양화는 아직 결정되지 않아 도우미 및 킬러 T 세포의 정확한 기능에 대한 해명이 방해를 받습니다.
항 바이러스 방어의 규모는 T 세포 반응의 질을 결정합니다. 사이토카인 분비 및 탈과립을 포함하는, 둘 이상의 기능을 양립가능하게 부여할 수 있는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포는 단일-세포 수준8에서 특이적 자극시 다기능성 T 세포(TPFs)로서 특성화된다. 단일 또는 다중 사이토카인을 생성하는 CD4+ T 세포는 다양한 효과와 면역 기억을 가질 수 있습니다. 예를 들어, IL-2+ IFN-γ+ CD4+ T 세포는 백신접종 효과를 평가하는데 중요한 파라미터로서 사용될 수 있는 IL-2+ CD4+ T 세포9보다 장기간 효과적인 보호 반응을 형성할 가능성이 더 높다. IL-2+ IFN-γ+ CD4+ T 세포의 빈도는 후천성 면역 결핍 증후군(AIDS)의 장기간 비진행 환자에서 증가하는 반면, AIDS 진행 환자의 CD4+ T 세포는 T 세포 증식에 대한 IL-2의 촉진 효과로 인해 IFN-γ 단독으로 생성하는 경향이 더 큽니다10. 또한, IL-2+ IFN-γ+ TNF-α+의 서브세트는 생체내에서 장기간 생존하고 상승적으로 살상 기능을 촉진하는 것으로 나타났다11. CD8+ T 세포가 세포독성 활성을 나타낼 가능성이 더 높지만, 일부 CD4+ T 세포는 또한 표면 CD107a 분자(12)의 간접적으로 검출된 발현으로서 세포독성 활성을 갖는다. 또한, 특정 T 세포 하위세트는 케모카인 MIP-1α를 발현하며, 이는 종종 T 세포-매개 호중구 모집에 참여하기 위해 단핵구에 의해 분비된다13. 유사하게, CD8+ TPFs는 또한 상기 마커의 다기능성을 특성화하는데 사용될 수 있다. 연구에 따르면 프라임 부스트 전략은 장기간 TPF 보호 효과13를 효과적으로 유도 할 수 있으며, 이는 백신 접종에 의해 유도 된 보호를 향상시킬 수 있습니다. 면역 체계를 검사하는 핵심 기능은 순진한 T 세포보다 2차 바이러스 문제에 대해 더 강력하고 빠르며 효과적인 반응을 촉진하는 기억 T 세포의 능력입니다. 이펙터 기억 T 세포 (TEM) 및 중앙 기억 T 세포 (TCM)는 CD27/CD45RO 또는 CCR7/CD45RA14의 복합 발현에 의해 종종 분화되는 중요한 T 세포 하위세트이다. TCM (CD27+ CD45RO+ 또는 CCR7+ CD45RA-)은 2차 림프성 조직에 국한되는 경향이 있는 반면, TM (CD27-CD45RO+ 또는 CCR7-CD45RA-)은 림프성 및 말초 조직에 국한된다15,16. TEM은 즉각적이지만 지속적이지 않은 방어를 제공하는 반면,TCM은 2차 림프성 기관에서 증식하고 새로운 이펙터(17)를 생성함으로써 반응을 지속한다. 따라서, 기억 세포가 바이러스에 대한 구체적이고 효율적인 회상 반응을 매개할 수 있다는 것을 감안할 때, 이러한 다기능의 서브세트의 기여에 대한 질문이 제기된다.
유세포 분석 기술의 발달로 10 개 이상의 클러스터, 표현형 및 분화 항원의 마커를 동시에 검출하는 것이 보편화되었으며, 이는 개별 T 세포의 기능적 면역 학적 특징을보다 풍부하게 주석으로 달아 T 세포 표현형에 대한 오해와 이해의 어려움을 줄이는 데 도움이됩니다. 이 연구는 생체 외 자극 및 유세포 분석을 사용하여 JEV 백신 접종 어린이 내의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 TPF 프로파일을 분석했습니다. 이 접근법을 적용하면 백신 접종에 의해 유도 된 단기 및 장기 JEV 특이 적 및 심지어 교차 반응성 T 세포 면역에 대한 이해가 확대 될 것입니다.

<table><tbody><tr><td>anti-human CD28</td><td>Biolegend</td><td>302934</td><td>항체</td></tr><tr><td>anti-human CD49d</td><td>Biolegend</td><td>304339</td><td>항체</td></tr><tr><td>APC anti-human MIP-1&alpha;</td><td>BD</td><td>551533</td><td>형광 항체&nbsp;</td></tr><tr><td>자동화된 세포 카운터</td><td>BIO RAD</td><td>TC20</td><td>세포 수</td></tr><tr><td>BD FACSymphony A5</td><td>BD</td><td>A5</td><td>흐름 세포 분석</td></tr><tr><td>BUV395 항인간 CD4</td><td>BD</td><td>563550</td><td>형광 항체&nbsp;</td></tr><tr><td>BUV737 항인간 CCR7</td><td>BD</td><td>741786</td><td>형광 항체&nbsp;</td></tr><tr><td>BUV737 항-인간 CD27</td><td>BD</td><td>612829</td><td>형광 항체&nbsp;</td></tr><tr><td>BV421 항 인간 CD8</td><td>Biolegend</td><td>344748</td><td>형광 항체&nbsp;</td></tr><tr><td>BV480 항-인간 CD45RA</td><td>BD</td><td>566114</td><td>형광 항체&nbsp;</td></tr><tr><td>BV480 항 인간 CD45RO</td><td>BD</td><td>566143</td><td>형광 항체&nbsp;</td></tr><tr><td>BV605 항인간 CD107a</td><td>Biolegend</td><td>328634</td><td>형광 항체&nbsp;</td></tr><tr><td>BV650 항인간 CD3</td><td>BD</td><td>563999</td><td>형광 항체&nbsp;</td></tr><tr><td>BV785 항인간 IL-2</td><td>Biolegend</td><td>500348</td><td>형광 항체&nbsp;</td></tr><tr><td>원심분리기 튜브</td><td>BD Falcon</td><td>BD-35209715</td><td>15 mL 원심분리기 튜브</td></tr><tr><td>Cytofix/Cytoperm 고정/투과화 솔루션 키트</td><td>BD</td><td>554714</td><td>세포 고정 및 투과화</td></tr> 밀도 <tr><td>구배 매체</td><td>Dakewe</td><td>DKW-KLSH-0100</td><td>Ficoll-Paque, 인간 림프구 분리 매체</td></tr><tr><td>FITC 항인간 IFN-&감마;</td><td>Biolegend</td><td>502506</td><td>형광 항체&nbsp;</td></tr><tr><td>Gibco 태아 소 세럼</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16000-044</td><td>태아 소 세럼</td></tr><tr><td>Gibco RPMI-1640 매체</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22400089</td><td>세포 배양 매체</td></tr><tr><td>고속&nbsp; 원심분리기</td><td>시그마</td><td>&nbsp; 15</td><td>mL 원심분리기 튜브용 3K15 세포 원심분리</td></tr><tr><td>고속&nbsp; Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td>1.5 mL Eppendorf (EP) 튜브용 세포 원심분리</td></tr>, <tr><td>Microcentrifuge 튜브</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td>1.5 mL microcentrifuge tube</td></tr><tr><td>PE anti-human TNF-&alpha;</td><td>Biolegend</td><td>502909</td><td>형광 항체&nbsp;</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>BI</td><td>02-024-1ACS</td><td>PBS</td></tr><tr><td>단백질 수송 억제제(Brefeldin A, GolgiPlug 함유)</td><td>BD</td><td>555029</td>는 <td>세포 내 단백질 수송 과정을 차단</td></tr>합니다 <tr><td>단백질 수송 억제제(모넨신 함유)</td><td>BD</td><td>554724</td>는 <td>세포 내 단백질 수송 과정을 차단</td></tr><tr><td>합니다 둥근 바닥 시험관</td><td>BD Falcon</td><td>352235</td><td>5 mL 시험관</td></tr><tr><td>Trypan 블루 염색 세포 생존율 분석 키트</td><td>Beyotime</td><td>C0011</td><td>Trypan 블루 염색</td></tr><tr><td>좀비 NIR 고정성 생존도 염료</td><td>Biolegend</td><td>423106</td><td>사세포 염색</td></tr></tbody></table>

유세포 분석 기술을 통한 일본 뇌염 백신 접종을받은 어린이의 다기능 t 세포 검출

Detection of Polyfunctional T Cells in Children Vaccinated with Japanese Encephalitis Vaccine via the Flow Cytometry Technique

T 세포 매개 면역은 백신 접종 후 또는 자연 감염 후 플라 비 바이러스 감염을 조절하는 데 중요한 역할을합니다. T 세포의 "품질"은 기능에 의해 평가되어야 하며, 더 높은 기능은 더 강력한 면역 보호와 관련이 있습니다. 단일 세포 수준에서 2개 이상의 사이토카인 또는 케모카인을 동시에 생산할 수 있는 T 세포를 다기능성 T 세포(TPFs)라고 하며, 이는 탈과립 마커(CD107a)를 발현하고 인터페론(IFN)-γ, 종양 괴사 인자(TNF)-α, 인터루킨(IL)-2 또는 대식세포 염증 단백질(MIP)-1α를 분비하는 다양한 분자 메커니즘을 통해 면역 반응을 매개합니다. TPF가 장기 면역 기억 및 보호의 유지와 밀접한 관련이 있으며, 이들의 증가 된 비율이 보호 면역의 중요한 마커이며 바이러스 감염 및 재 활성화의 효과적인 제어에 중요하다는 증거가 증가하고 있습니다. 이 평가는 특정 면역 반응뿐만 아니라 교차 반응 면역 반응의 평가에도 적용됩니다. 여기서, 일본뇌염 바이러스(JEV)를 예로 들면, 일본뇌염 백신접종을 받은 소아의 말초혈액단핵세포에서 생성되는 JEV 특이적TFs의 검출방법 및 유세포분석 색도를 시험하여 유사한 연구에 대한 참고자료를 제공하였다.

그림 1은 JE 백신 접종 아동의 대표적인 JEV 자극 그룹에서 CD8+ 또는 CD4+ T세포의 T CM 또는 TEM을 분할하는 데 사용되는 게이팅 전략을 보여줍니다. FSC-A/SSC-A 점도표는 림프구를 식별하는 데 사용되며 FSC-A/FSC-W 점도표는 단일 세포를 식별하는 데 사용됩니다. 생존 가능한 세포는 살아있는/죽은 / SSC-A 점도표에서 선택됩니다. CD3/SSC-A 점도표는 CD3+ T 세포를 식별하는 데 사용됩니다. CD4/CD8 점도표는 각각 CD3+ CD4+ 및 CD3+ CD8+ T 세포를 식별하는 데 사용됩니다. CD8+ 또는 CD4+ T 세포의T CM (CD27+ CD45RO+) 및TEM (CD27...

본 프로토콜은 생체 외 자극과 유세포 분석을 결합하여 일본 뇌염 바이러스 (JEV) 예방 접종을받은 어린이 내의 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)에서 다기능성 T 세포 (TPF) 프로파일을 분석합니다. JEV 특이적 TPF의 검출 방법 및 유세포분석 색 구성표를 테스트하여 유사한 연구에 대한 참조를 제공했습니다.

유세포 분석 기술을 통한 일본 뇌염 백신 접종을받은 어린이의 다기능 T 세포 검출

T cell-mediated immunity plays an important role in controlling flavivirus infection, either after vaccination or after natural infection. The "quality" ...

일본뇌염 바이러스 특이적 TPFS의 검출 방법 및 유세포분석 색 체계를 시험하여 유사한 연구에 대한 참고 자료를 제공하였다. 이 절차를 시연하는 것은 우리 실험실의 두 학생 인 Linlin Zhang과 Meng Zhang이 수행합니다. 시작하려면 단일 클론 항체, CD28 및 CD49d, CD107a, 골지플러그 및 모넨신의 존재하에 섭씨 37도에서 16시간 동안 농축된 비활성화된 JEV 입자로 JEV 자극 그룹의 PBMC를 자극합니다.이어서, 바이러스 입자가 농축되지 않은 대조군의 PBMCs를 모노클로날 항체, CD28 및 CD49d, CD 107a, 골지플러그 및 모넨신의 존재하에 섭씨 37도에서 16시간 동안 자극하였다. 각 그룹으로부터 세포 현탁액을 1.5 밀리리터 마이크로 원심분리 튜브에서 수집한다. 실온에서 5분 동안 500g에서 원심분리하고, 피펫으로 상층액을 제거한다.세포를 PBS 1밀리리터에 재현탁시킨다. 고정 가능한 생존 염료를 세포 현탁액에 첨가하고 어두운 곳에서 실온에서 10 분 동안 배양합니다. 실온에서 500 g에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 제거한다.세포를 1 밀리리터의 PBS에 재현탁시킨 후, 다시 실온에서 5분 동안 500 g으로 원심분리하고, 이전에 입증된 바와 같이 상청액을 버린다. 세포 표면 마커 염색을 수행하려면 세포를 100 마이크로리터의 PBS에 재현탁하고, 각 표면 마커 항체의 2 마이크로리터를 각 튜브 내의 세포 현탁액에 첨가한다. 튜브를 빛으로부터 보호하면서 실온에서 30분 동안 배양합니다.500g에서 5분 동안 원심분리하고, 앞서 입증된 바와 같이 상청액을 제거한다. 다시, 세포를 PBS 1 밀리리터에 재현탁시킨다. 실온에서 5분 동안 500g에서 원심분리하고 상청액을 조심스럽게 버린다.고정 및 막 파괴를 수행하려면 500 마이크로 리터의 막 파괴 고정 용액으로 세포를 재현탁하고 실온의 어두운 곳에서 20 분 동안 세포를 고정하십시오. 그 후 500g에서 5분간 원심분리하고 상층액을 제거한다. 세포를 1 밀리리터의 PBS에 재현탁시킨 후, 실온에서 500 g에서 5분 동안 원심분리하고, 앞서 입증된 바와 같이 상청액을 조심스럽게 제거하였다.이어서, 세포를 100 마이크로리터의 PBS에 재현탁시키고, 세포내 사이토카인 염색을 위해 각각의 튜브 내의 세포 현탁액에 2 마이크로리터의 각 사이토카인 항체를 첨가한다. 어둠 속에서 실온에서 30 분 동안 튜브를 배양하십시오. 다시, 500 g에서 5분 동안 원심분리하고, 이전에 입증된 바와 같이 상청액을 제거한다.다시 한번, 세포를 PBS 1 밀리리터에 재현 탁시킨다. 실온에서 5분 동안 500g에서 원심분리하고, 앞서 입증된 바와 같이 상청액을 조심스럽게 제거한다. 그런 다음 500 마이크로리터의 PBS를 추가하여 세포를 재현탁시킵니다.PBMC 샘플을 단독으로, 이전에 입증된 바와 같이 단리한 후, 세포 현탁액을 원고에 기재된 1.5 밀리리터 마이크로원심분리 튜브에서 12등분으로 나눕니다. 유사하게, 세포 표면 마커 및 세포내 사이토카인 항체를 첨가한 후, 이전에 입증된 바와 같이, 500 마이크로리터의 PBS를 첨가하여 세포를 재부유시키고 저속으로 와동시킨다. 염색되지 않은 샘플을 사용하여 전방 산란, 측면 산란 및 다른 형광 염료 전압을 조정하고 단일 염색 샘플을 사용하여 서로 다른 형광단 사이의 오염 신호를 제거하기 위해 유세포 분석 보상을 조정합니다.전방 산란 영역을 통해 다각형 게이트를 그리고, 측면 산란 영역을 통해 파편을 제외하고 온전한 림프구 집단을 선택하는 도트 플롯, 및 전방 산란 영역을 통해 직사각형 게이트를 그리며, 전방 산란 폭 도트 플롯을 통해 단일 세포를 선택하는 도트 플롯. 다음으로, 살아있는 사각 게이트를 통해 사각 게이트를 그리고, 살아있는 세포를 선택하는 데드 사이드 산점도 영역 도트 플롯을 통해 CD3 측면 산포 영역 도트 플롯을 통해 CD 3개의 양성 T 세포를 식별합니다. 그런 다음 CD4, CD8 도트 플롯을 통해 쿼드 게이트를 그려 CD4 양성 또는 CD8 양성 T 세포를 식별하고 CD45RO, CD27 도트 플롯을 통해 CD4 양성 또는 CD8 양성 T 세포를 TCM 및 TEM으로 세분화합니다.CD8 양성 또는 CD4 양성 T 세포의 TCM 또는 TEM으로부터 CD107a, 인터페론 감마, 종양 괴사 인자 알파, 인터루킨 2 및 마이크로파지 염증 단백질 중 하나의 알파를 그린 후 각각 다른 반응 패턴의 빈도를 확인하였다. 샘플을 세포분석에 순차적으로 로드합니다. 게이팅 전략은 전방 산란 영역 너비를 사용하여 CD8 양성 또는 CD4 양성 T 세포 및 그 하위 집합의 TCM 또는 TEM을 식별한 다음 측면 산란 영역 점도를 사용하여 사용되었습니다.JEV에 대한 CD4 양성 및 CD8 양성 T 세포 반응의 다기능적 특성화는 예방 접종을받지 않은 어린이의 CD107a, 인터페론 감마, 종양 괴사 인자 알파 및 인터루킨 2의 증가 된 수준이 JEV 자극 후 예방 접종을받은 어린이의 CD8 양성 TCM 세포에서 검출되었음을 나타냅니다. 그러나, 대식세포 염증성 단백질의 알파 수준은 두 군 간에 차이가 없었다. 백신을 접종하지 않은 그룹과 비교하여 JEV 자극하에 백신 접종 그룹의 CD8 양성 TEM 세포에서 더 높은 수준의 CD107a 및 인터페론 감마가 검출되었습니다.반면 종양 괴사 인자 알파, 인터루킨 2 및 대식세포 염증성 단백질 알파 1은 이들 양성 세포에서 유의하게 상승하지 않았다. JEV 항원은 백신을 접종하지 않은 그룹에 비해 백신을 접종한 그룹의 CD4 양성 TCM 세포에서 더 높은 수준의 CD107a, 인터페론 감마, 종양 괴사 인자 알파 및 대식세포 염증 단백질 원 알파를 성공적으로 유도했습니다. 그러나, 인터루킨 2 양성 세포의 비율은 JEV 자극 하에서 두 그룹 간에 차이가 없었다.백신접종군에서 CD107a 양성, 인터페론 감마 양성 및 종양 괴사 인자 알파 양성 서브세트, 서브 CD4 양성 TEM 세포의 비율은 백신접종되지 않은 군에서보다 JEV의 존재 하에서 더 높았다. 자극의 T 세포 면역원성과 호환 가능한 색상 일치 전략은 이 프로토콜에서 중요한 단계입니다.

detection-polyfunctional-t-cells-children-vaccinated-with-japanese

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

Source: Xu, C., et al. An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection. J. Vis. Exp. (2018).This video demonstrates the phenotyping of EBV-infected T and NK cell lines using flow cytometry, highlighting the preparation, antibody staining, and analysis steps to identify lineage-specific surface markers. It shows how marker profiles confirm distinct T-cell and NK-cell populations.

Phenotyping EBV-Infected Cell Lines Using Flow Cytometry

최근 몇 년 동안, 살아있는 세포 기반 분석은 표면과 형태 적 항원에 대한 항체를 검출하기 위해 성공적으로 사용되어왔다. 여기서, 우리는 많은 환자 코호트의 분석을 가능 계측법 높은 처리량의 흐름을 사용하는 방법을 설명한다. 새로운 항체의 검출은 면역 매개 질환의 진단과 치료를 향상시킬 것입니다.

인간 혈청에있는 N-메틸-D-아스파 라진 산염 수용체 또는 도파민 2 수용체에 대한 항체를 검출하는 높은 처리량 유동 세포 계측법 세포 기반 분석

유동 세포 계측법에 의해 면역 세포의 정의 모집단을 가진 나노 입자의 상호 작용의 분석.

유동 세포 계측법에 의해 주요 면역 세포 모집단과 형광 나노 입자의 상호 작용의 검출

쥐 백신 접종 모델에서 나노 입자를 사용한 면역에 대한 반응으로 항원 특이적 CD8+ T 세포의 확장을 모니터링하기 위한 전체 동물 이미징 및 유세포 분석 기반 기술에 대해 설명합니다.

나노 입자 백신 접종 후 분석 항원 특이 CD8 + T 세포 반응에 대한 전체 동물 이미징 및 유세포 기술

기능 및 표현형 분석 항원 반응성 B 세포를 검출하고 풍부 자성 나노 입자를 이용한 간단하면서도 효과적인 방법을 설명한다.

표현형 및 기능 분석에 대한 검색 및 희귀의 농축 항원 특이 적 B 세포

우리는 Zika 바이러스 미리 혈 청 뎅기열 바이러스 기자 바이러스 성 입자를 사용 하 여 감염의 항 체 의존 향상을 측정 하기 위한 간단 하 고 쉬운 프로토콜을 설명 합니다.

간단한 Cytometry 결정 체 외에서 항 체 의존의 향상 뎅기열 바이러스 Zika 바이러스 미리 혈 청을 사용 하 여 분석 결과 기반으로

여기, 전 대 한 프로토콜 선물이 vivo 항 원 특정 CD8의 질적 검색+ T 세포. 분석은 단일 셀 정지 적은 양의 혈액 또는 기관에서 가능 합니다. 광범위 한 연구는 세포 독성 T 세포 응답 (예방 접종과 암 immunotherapy 연구)의 분석을 필요로 합니다.

반대로 벡터 및 안티 transgene 특정 CD8의 동시 정량화+ T 세포가 MHC를 통해 내가 Tetramer 바이러스 성 벡터와 예방 접종 후 얼룩

이 원고는 마우스에서 활성 실험자가 면역 뇌척수염(EAE)을 유도하는 프로토콜을 제시한다. 중추신경계(CNS)에서 침투된 림프구의 분리 및 특성화 방법도 림프구가 CNS 자가면역 질환의 발병에 어떻게 관여하는지 보여주기 위해 제시된다.

실험적인 자가면역 뇌척수염 중 중추신경계에서 림프구 침투의 흐름 세포 분석

면역자기 비드와 형광 활성화 세포 분류를 결합하여 말초 혈액 단핵 세포(단핵구, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, B 세포 및 자연 살해 세포)의 정의된 면역 세포 하위 집단을 분리하고 분석하는 방법을 설명합니다. 이 방법을 사용하여 자기 및 형광 표지 된 세포를 정제하고 분석 할 수 있습니다.

감염성 단핵구증이 있는 어린이의 말초 혈액 샘플에서 면역 세포 하위 집단 분리

이 프로토콜은 나노 에멀젼 오피오포고닌 D 보조제가 효과적인 세포 면역 반응을 촉진하는지 여부를 평가하기 위한 상세한 방법을 제시합니다.

체외 나노에멀젼 백신 보조제인 오피오포고닌 D의 세포 활성 평가

이 연구에서는 일본 뇌염 예방 접종을 받은 어린이의 림프구 검출을 위해 두 실험실에서 두 개의 유세포 분석기 간에 실험 설정 및 분석 템플릿의 이동을 용이하게 하는 방법을 개발했습니다. 유세포 분석기 실험의 표준화 방법을 통해 여러 센터에서 연구 프로젝트를 효과적으로 수행할 수 있습니다.

일본 뇌염 예방 접종 아동의 림프구 검출을 위한 유세포 분석기 간 실험실 간 이동 표준화

배우세요 일본 뇌염 백신 접종 어린이의 다기능 T 세포를 유세포 분석으로 검출하는 방법을. PBMC 자극과 세포 표면 및 세포내 사이토카인 염색을 통해 면역 반응을 평가합니다.

유세포 분석 기술을 통한 일본 뇌염 백신 접종을받은 어린이의 다기능 T 세포 검출

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