Name: 3D 오가노이드에서 구강-식도 편평 세포 암종 모델링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-23T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: 학습하세요 4NQO로 유도한 구강-식도 편평 세포 암종의 3D 오가노이드 생성 및 특성 분석 방법을. 이 모델은 종양 유전적 이질성을 포착하여 새로운 치료 전략 테스트와 암 발생 유전자 변화 연구에 활용됩니다.

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기술 지원을 위해 컬럼비아 대학교 허버트 어빙 종합 암 센터(Herbert Irving Comprehensive Cancer Center)의 공유 리소스(유세포 분석, 분자 병리학, 공초점 및 특수 현미경)에 감사드립니다. 도움이 되는 토론을 해주신 Alan Diehl 박사, Adam J. Bass, Kwok-Kin Wong 박사(NCI P01 식도 발암 메커니즘)와 Rustgi 및 Nakagawa 연구소 구성원에게 감사드립니다. 이 연구는 다음 NIH 보조금의 지원을 받았습니다: P01CA098101(HN 및 AKR), R01DK114436(HN), R01AA026297(HN), L30CA264714(SF), DE031112-01(FMH), KL2TR001874(FCC), 3R01CA255298-01S1(JG), 2L30DK126621-02
(J.G.) R01CA266978 (CL), R01DK132251 (CL), R01DE031873 (CL), P30DK132710 (CM 및 HN) 및 P30CA013696 (AKR). HN과 CL은 Columbia University Herbert Irving Comprehensive Cancer Center Multi-PI Pilot Award를 수상했습니다. HN은 Fanconi Anemia Research Fund Award를 수상했습니다. FMH는 Mark Foundation for Cancer Research Award (20-60-51-MOME)와 American Association for Cancer Research Award를 수상했습니다. J.G.는 미국 위장병 학회 (AGA) 상을 수상했습니다.

<ol><li>Rustgi, A. K., El-Serag, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Esophageal+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Esophageal carcinoma.</a> The New England Journal of Medicine. 371 (26), 2499-2509 (2014).</li>
<li>Dotto, G. P., Rustgi, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Squamous+cell+cancers%3A+A+unified+perspective+on+biology+and+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Squamous cell cancers: A unified perspective on biology and genetics.</a> Cancer Cell. 29 (5), 622-637 (2016).</li>
<li>Giroux, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lived+keratin+15%2B+esophageal+progenitor+cells+contribute+to+homeostasis+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Long-lived keratin 15+ esophageal progenitor cells contribute to homeostasis and regeneration.</a> The Journal of Clinical Investigation. 127 (6), 2378-2391 (2017).</li>
<li>DeWard, A. D., Cramer, J., Lagasse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+heterogeneity+in+the+mouse+esophagus+implicates+the+presence+of+a+nonquiescent+epithelial+stem+cell+population%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Cellular heterogeneity in the mouse esophagus implicates the presence of a nonquiescent epithelial stem cell population.</a> Cell Reports. 9 (2), 701-711 (2014).</li>
<li>Kinugasa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+SOD2+regulates+epithelial-mesenchymal+transition+and+cell+populations+defined+by+differential+CD44+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial SOD2 regulates epithelial-mesenchymal transition and cell populations defined by differential CD44 expression.</a> Oncogene. 34 (41), 5229-5239 (2015).</li>
<li>Whelan, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+supports+generation+of+cells+with+high+CD44+expression+via+modulation+of+oxidative+stress+and+Parkin-mediated+mitochondrial+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Autophagy supports generation of cells with high CD44 expression via modulation of oxidative stress and Parkin-mediated mitochondrial clearance.</a> Oncogene. 36 (34), 4843-4858 (2017).</li>
<li>Natsuizaka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+Notch1+and+Notch3+promotes+EMT+and+tumor+initiation+in+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Interplay between Notch1 and Notch3 promotes EMT and tumor initiation in squamous cell carcinoma.</a> Nature Communications. 8 (1), 1758(2017).</li>
<li>Whelan, K. A., Muir, A. B., Nakagawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Esophageal+3D+culture+systems+as+modeling+tools+in+esophageal+epithelial+pathobiology+and+personalized+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Esophageal 3D culture systems as modeling tools in esophageal epithelial pathobiology and personalized medicine.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 461-478 (2018).</li>
<li>Sachdeva, U. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+cellular+origin+and+progression+of+esophageal+cancer+using+esophageal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Understanding the cellular origin and progression of esophageal cancer using esophageal organoids.</a> Cancer Letters. 509, 39-52 (2021).</li>
<li>Nakagawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+targeting+of+the+cyclin+D1+oncogene+by+an+Epstein-Barr+virus+promoter+in+transgenic+mice+causes+dysplasia+in+the+tongue%2C+esophagus+and+forestomach%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The targeting of the cyclin D1 oncogene by an Epstein-Barr virus promoter in transgenic mice causes dysplasia in the tongue, esophagus and forestomach.</a> Oncogene. 14 (10), 1185-1190 (1997).</li>
<li>Andl, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor+receptor+mediates+increased+cell+proliferation%2C+migration%2C+and+aggregation+in+esophageal+keratinocytes+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor receptor mediates increased cell proliferation, migration, and aggregation in esophageal keratinocytes in vitro and in vivo.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (3), 1824-1830 (2003).</li>
<li>Opitz, O. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+of+human+oral-esophageal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">A mouse model of human oral-esophageal cancer.</a> The Journal of Clinical Investigation. 110 (6), 761-769 (2002).</li>
<li>Stairs, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+p120-catenin+results+in+a+tumor+microenvironment+with+inflammation+and+cancer+that+establishes+it+as+a+tumor+suppressor+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Deletion of p120-catenin results in a tumor microenvironment with inflammation and cancer that establishes it as a tumor suppressor gene.</a> Cancer Cell. 19 (4), 470-483 (2011).</li>
<li>Tang, X. -H., Knudsen, B., Bemis, D., Tickoo, S., Gudas, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+cavity+and+esophageal+carcinogenesis+modeled+in+carcinogen-treated+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Oral cavity and esophageal carcinogenesis modeled in carcinogen-treated mice.</a> Clinical Cancer Research. 10, 301-313 (2004).</li>
<li>Fong, L. Y. Y., Mancini, R., Nakagawa, H., Rustgi, A. K., Huebner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+cyclin+D1+overexpression+and+zinc+deficiency+disrupts+cell+cycle+and+accelerates+mouse+forestomach+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Combined cyclin D1 overexpression and zinc deficiency disrupts cell cycle and accelerates mouse forestomach carcinogenesis.</a> Cancer Research. 63 (14), 4244-4252 (2003).</li>
<li>Zheng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+murine+esophageal+organoid+culture+method+and+organoid-based+model+of+esophageal+squamous+cell+neoplasia%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">A new murine esophageal organoid culture method and organoid-based model of esophageal squamous cell neoplasia.</a> iScience. 24 (12), 103440(2021).</li>
<li>Hisha, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+novel+lingual+organoid+culture+system%3A+generation+of+organoids+having+mature+keratinized+epithelium+from+adult+epithelial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Establishment of a novel lingual organoid culture system: generation of organoids having mature keratinized epithelium from adult epithelial stem cells.</a> Scientific Reports. 3, 3224(2013).</li>
<li>Kalabis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+mouse+and+human+esophageal+epithelial+cells+in+3D+organotypic+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of mouse and human esophageal epithelial cells in 3D organotypic culture.</a> Nature Protocols. 7 (2), 235-246 (2012).</li>
<li>Nguyen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%CE%B21+alters+esophageal+epithelial+barrier+function+by+attenuation+of+claudin-7+in+eosinophilic+esophagitis%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">TGF-β1 alters esophageal epithelial barrier function by attenuation of claudin-7 in eosinophilic esophagitis.</a> Mucosal Immunology. 11 (2), 415-426 (2018).</li>
<li>Sherrill, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+and+expansion+of+the+eosinophilic+esophagitis+transcriptome+by+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Analysis and expansion of the eosinophilic esophagitis transcriptome by RNA sequencing.</a> Genes and Immunity. 15 (6), 361-369 (2014).</li>
<li>Ruffner, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+2+stimulation+augments+esophageal+barrier+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Allergy%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor 2 stimulation augments esophageal barrier integrity.</a> Allergy. 74 (12), 2449-2460 (2019).</li>
<li>Kabir, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+transcriptomic+analysis+reveals+cellular+diversity+of+murine+esophageal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Single cell transcriptomic analysis reveals cellular diversity of murine esophageal epithelium.</a> Nature Communications. 13 (1), 1-15 (2022).</li>
<li>Shimonosono, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alcohol+metabolism+enriches+squamous+cell+carcinoma+cancer+stem+cells+that+survive+oxidative+stress+via+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Alcohol metabolism enriches squamous cell carcinoma cancer stem cells that survive oxidative stress via autophagy.</a> Biomolecules. 11 (10), 1479(2021).</li>
<li>Flashner, S., Yan, K. S., Nakagawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+organoids%3A+An+untapped+platform+for+studying+host-microbiome+interactions+in+esophageal+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">3D organoids: An untapped platform for studying host-microbiome interactions in esophageal cancers.</a> Microorganisms. 9 (11), 2182(2021).</li>
<li>Liu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox2+cooperates+with+inflammation-mediated+stat3+activation+in+the+malignant+transformation+of+foregut+basal+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Sox2 cooperates with inflammation-mediated stat3 activation in the malignant transformation of foregut basal progenitor cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (3), 304-315 (2013).</li>
</ol>

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

여기에 설명된 프로토콜에서 MEO의 생성 및 분석을 위한 몇 가지 중요한 단계와 고려 사항이 있습니다. MEO 실험에서 재현성과 엄격함을 보장하려면 생물학적 및 기술적 복제가 모두 중요합니다. 생물학적 복제물의 경우, ESCC를 보유하는 2-3개의 독립적인 마우스는 일반적으로 실험 조건당 충분합니다. 그러나 적절한 생물학적 복제 횟수는 개별 연구에서 테스트할 매개변수에 따라 달라질 수 있습니다. 예를 들어, 거시적으로 보이는 병변이나 조직학적 IEN 및 ESCC 병변이 없는 4NQO 처리된 마우스에서 신생물 오가노이드가 얼마나 일찍 그리고 얼마나 자주 검출될 수 있는지는 현재 알려져 있지 않습니다. 비록 4NQO가 다양한 마우스 균주에서 식도 병변을 유도하였지만14, MEO는 C57BL/6 마우스에서만 생성되었다. ESCC의 발달 및 진행은 Trp53 손실 및 사이클린 D1 과발현과 같은 유전자 조작 유전적 병변이 있는 마우스에서 가속화됩니다 7,14,15.<sup class="xref...

식도 편평 세포 암종(ESCC)은 늦은 진단, 치료 저항성 및 전이로 인해 인간 편평 세포 암종 중 가장 치명적입니다 1,2. ESCC는 식도의 내강 표면을 감싸는 층화 편평 상피에서 발생합니다. 편평 상피는 증식성 기저 세포와 기저상 세포층 내의 분화된 세포로 구성됩니다. 생리학적 조건에서 기저 세포는 p63, Sox2, 사이토케라틴 K5 및 K14와 같은 마커를 발현하는 반면 분화된 세포는 K4, K13 및 IVL을 발현합니다. 기저 세포 자체는 이질적이며 K153 및 CD734와 같은 마커에 의해 정의된 추정 줄기 세포를 포함합니다. 항상성에서 기저 세포는 기저 상부 세포층 내에서 유사분열 후 말단 분화를 겪는 반면, 분화된 세포는 내강으로 이동하여 박리되어 상피 재생을 완료합니다. 기원 세포를 연상시키는 ESCC는 다양한 정도로 편평 세포 분화를 나타냅니다. ESCC는 종종 비정형 기저 세포를 포함하는 상피내 종양(IEN) 또는 이형성증으로 알려진 다초점 조직학적 전구체 병변을 동반합니다. 상피 변화 외에도 ESCC는 암 관련 섬유아세포(CAF)의 활성화와 면역/염증 세포의 모집이 일어나 종양 촉진 미세 환경을 조성하는 상피하 구획 내의 조직 리모델링을 표시합니다.
ESCC의 발병기전은 유전적 변화와 환경적 위험 요인에 대한 노출을 포함합니다. 주요 유전적 병변에는 종양 억제 유전자 TP53 및 CDKN2A(p16INK4A)의 비활성화와 CCND1(사이클린 D1) 및 EGFR 종양 유전자의 활성화가 포함되며, 이는 세포 주기 체크포인트 기능 장애, 비정상적인 증식 및 환경 발암 물질에 대한 노출과 관련된 유전독성 스트레스 하에서의 생존을 초래합니다. 실제로 유전 적 변화는 행동 및 환경 적 위험 요소, 가장 일반적으로 담배 및 알코올 사용과 밀접하게 상호 작용합니다. 담배 연기에는 알코올의 주요 대사 산물이기도 한 아세트알데히드와 같은 인체 발암 물질이 포함되어 있습니다. 아세트알데히드는 DNA 부가물과 가닥 간 DNA 가교를 유도하여 DNA 손상과 DNA 돌연변이 및 염색체 불안정성의 축적을 유발합니다. 과도한 유사분열 자극과 종양유전자 활성화로 인한 비정상적인 증식이 주어지면 식도 상피 세포의 악성 형질전환은 항산화제, 자가포식 및 상피-중간엽 전이(EMT)의 활성화를 포함하여 유전독성 스트레스에 대처하는 메커니즘에 의해 촉진됩니다. 흥미롭게도, 이러한 세포 보호 기능은 높은 CD44 (CD44H) 발현을 특징으로하고 종양 개시, 침윤, 전이 및 치료 저항성의 능력을 갖는 ESCC 암 줄기 세포 (CSC)에서 종종 활성화된다 5,6,7.
ESCC는 세포 배양 및 설치류 모델 8,9에서 모델링되었습니다. 지난 삼십 년 동안 ESCC의 강력한 유전자 조작 마우스 모델이 개발되었습니다. 이들은 CCND1 및 EGFR 형질전환 마우스 10,11 및 p53 및 p120 Ctn 녹아웃 마우스 12,13을 포함한다. 그러나 단일 유전적 변화는 일반적으로 빠른 발병 ESCC를 초래하지 않습니다. 이 문제는 ESCC14에서 인간 유전적 병변을 잘 요약하는 식도 발암 물질을 사용하여 극복되었습니다. 예를 들어, 4-니트로퀴놀린-1-옥사이드(4NQO)는 CCND1 형질전환 마우스에서 ESCC 발달을 가속화한다15. 최근 몇 년 동안, 추정되는 식도 상피 줄기 세포, 전구 세포 및 이들의 각각의 운명이 세포 계통 추적 가능한 마우스 모델에서 조사되었습니다 3,4. 또한, 이들 세포계통 추적가능 마우스는 기존의 조직학 및 오믹스 기반 분자 특성 분석을 통해 ESCC의 기원 세포와 이러한 세포가 어떻게 CD44H CSC를 생성하는지 탐색하는 데 활용되어 왔다7.
이러한 마우스 모델과 관련된 새로운 영역 중 하나는 원래 조직의 구조가 생체 외에서 요약되는 3차원(3D) 오가노이드 시스템에서 살아있는 ESCC 및 전구체 세포를 분석하기 위한 세포 배양 기술의 새로운 적용입니다(7,8,9). 이러한 3D 오가노이드는 원발성 및 전이성 종양(예: 림프절, 폐 및 간 병변)을 포함한 쥐 조직에서 분리된 단일 세포 현탁액에서 빠르게 성장합니다. 세포는 기저막 추출물(BME)에 묻혀 잘 정의된 무혈청 세포 배양 배지를 공급합니다. 3D 오가노이드는 7-10일 이내에 성장하며, 생성된 구형 구조는 CSC 마커, EMT, 자가포식, 증식, 분화 및 세포사멸 세포 사멸을 포함한 다양한 세포 특성 및 기능을 분석하기 위한 계대 배양, 냉동 보존 및 분석에 적합합니다.
이러한 방법은 두경부 점막(구강, 혀, 인두 및 후두) 및 심지어 전위와 같은 모든 층화된 편평 상피 조직에서 확립된 3D 오가노이드 배양에 광범위하게 적용될 수 있습니다. 두경부 점막은 식도와 인접해 있으며 두 조직은 유사한 조직 조직, 기능 및 질병에 대한 감수성을 공유합니다. 두경부 편평 세포 암종(HNSCC)과 ESCC는 모두 유전적 병변과 담배 및 알코올 노출과 같은 생활 습관 관련 환경 위험 요소를 공유합니다. 이러한 유사성을 강조하면서, 담배 연기 모방체 4NQO로 처리된 마우스는 HNSCC와 ESCC 모두를 쉽게 발달시킨다. 아래에 설명된 프로토콜이 HNSCC 모델링에 쉽게 적용될 수 있다는 점을 감안할 때 이러한 병변에서 3D 오가노이드 배양을 설정하기 위한 특정 지침이 포함되어 있습니다.
여기에서 우리는 4NQO로 치료된 마우스에서 발생하는 정상, 전종양 및 ESCC 병변을 나타내는 쥐 식도 3D 오가노이드(MEO)를 생성하기 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. C57BL/6과 같은 일반적인 실험실 균주, 세포 계통 추적 가능 및 기타 유전자 조작 유도체를 포함하여 다양한 마우스 균주를 활용할 수 있습니다. 우리는 정상 또는 병에 걸린 쥐 식도 상피의 분리, 단일 세포 현탁액의 준비, 성장하는 3D 오가노이드의 배양 및 모니터링, 계대 배양, 냉동 보존, 형태학 및 기타 응용 분야를 포함한 후속 분석을 위한 처리를 포함한 주요 단계를 강조합니다.

<table><tbody><tr><td>0.05% 트립신-EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25-300-120</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 트립신-EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25-200-114</td><td></td></tr><tr><td>0.4% 트리판 블루</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 투베르쿨린 주사기(바늘 미포함</td>) <td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>100 &마이크로; m 세포 여과기</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22363549</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 코니컬 튜브</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; L 와이드 보어 마이크로 피펫 팁</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>212361A</td><td></td></tr><tr><td>21G 바늘</td><td>BD</td><td>305167</td><td></td></tr><tr><td>24웰 플레이트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-556-006</td><td></td></tr><tr><td>4-니트로퀴놀린-1-옥사이드(4NQO)</td><td>Tokyo Chemical Industry</td><td>NO250</td><td></td></tr><tr><td>50mL 원뿔형 튜브</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-565-270</td><td></td></tr><tr><td>6웰 플레이트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12556004</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro; m 세포 여과기</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>99.9% 에틸렌 프로필렌 글리콜</td><td>SK picglobal</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12634028</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td><td>15290018</td><td>재고 농도 250 &micro; g/mL, 최종 농도 0.5 & 마이크로; g/mL</td></tr><tr><td>항생제-항진균제</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15240062</td><td>재고 농도 100x, 최종 농도 1x</td></tr><tr><td>B-27 보충제</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td>재고 농도 50x, 최종 농도 1x</td></tr><tr><td>Bacto 한천</td><td>BD</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>CO2 incubator, e.g.Heracell 150i</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51026406</td><td>또는 동급</td></tr>의 <tr><td>Countess II FL 자동 세포 계수기</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMQAX1000</td><td>또는 동급</td></tr>의 <tr><td>Cryovials</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>03-337-7D</td><td></td></tr><tr><td>DietGel 76A</td><td>Clear H2O</td><td>72-07-5022</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>MilliporeSigma</td><td>D4540</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Corning</td><td>354235</td><td>재고 농도 50 U/mL, 최종 농도 2.5&ndash; 5 U/mL</td></tr><tr><td>해부 가위</td><td>VWR</td><td>25870-002</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco의 인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190250</td><td>재고 농도 1x</td></tr><tr><td>소 태아 혈청(FBS)</td><td>HyClone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>집게</td><td>VWR</td><td>82027-386</td><td></td></tr><tr><td>냉동 용기</td><td>Corning</td><td>432002</td><td>또는 등가</td></tr><tr><td>젤라틴</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>G7-500</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td>스톡 농도 100x, 최종 농도 1x</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630080</td><td>스톡 농도 1M, 최종 농도 10mM</td></tr><tr><td>핫 플레이트/교반기</td><td>Corning</td><td>PC-420D</td><td>또는 동급</td></tr><tr><td>Lab Armor bead bath (또는 water bath)VWR</td><td></td> <td>89409-222</td><td>또는 동급</td></tr>의 <tr><td>실험실 저울</td><td>Ohaus</td><td>71142841</td><td>또는 동급</td></tr><tr><td>의 Matrigel 기저 멤브레인 추출물 (BME)Corning</td><td></td> <td>354234</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge Minispin</td><td>Eppendorf</td><td>22620100</td><td>또는 동급의</td></tr><tr><td>Microcentrifuge 튜브 랙</td><td>Southern Labware</td><td>0061</td><td></td></tr><tr><td>N-2 보충제</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17502048</td><td>재고 농도 100x, 최종 농도 1x</td></tr><tr><td>N-아세틸시스테인(NAC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td>재고 농도 0.5 M, 최종 농도 1</td></tr><tr><td>mM Parafilm M wrap</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S37440</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드(PFA)</td><td>MilliporeSigma</td><td>158127-500G</td><td></td></tr><tr><td>병리학 카세트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22-272416</td><td></td></tr><tr><td>위상차 현미경</td><td>Nikon</td><td></td><td>또는 이에 상응하는</td></tr><tr><td>재조합 마우스 표피 성장 인자(mEGF)</td><td>Peprotech</td><td>315-09-1mg</td><td>재고 농도 500 ng/&micro; L, 최종 농도 100 ng/mL</td></tr><tr><td>R-Spondin1 및 Noggin(RN CM)을 발현하는 RN 세포 조절 배지</td>N<td>/A</td> N<td>/</td><td>A 요청 시 Organoid 및 Cell Culture Core를 통해 사용 가능, 최종 농도 2%</td></tr><tr><td>Sorval ST 16R 원심분리기</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75004380</td><td>또는 이에 상응하는</td></tr><tr><td>대두 트립신 억제제(STI)</td><td>MilliporeSigma</td><td>T9128</td><td>재고 농도 250 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>ThermoMixer C</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-285-562 PM</td><td>또는 동급</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1049</td><td>재고 농도 10 mM, 최종 농도 10 &마이크로; 미디엄</td></tr></tbody></table>

3d 오가노이드에서 구강-식도 편평 세포 암종 모델링

Modeling Oral-Esophageal Squamous Cell Carcinoma in 3D Organoids

식도 편평 세포 암종(ESCC)은 전 세계적으로 널리 퍼져 있으며 매년 모든 식도암 사례의 90%를 차지하며 모든 인간 편평 세포 암종 중에서 가장 치명적입니다. ESCC 시작 및 개발에 수반되는 분자 변화를 정의하는 최근의 진전에도 불구하고 환자의 예후는 여전히 좋지 않습니다. 이러한 분자 변화의 기능적 주석은 필요한 다음 단계이며 ESCC의 분자 특징을 포착하고 기능적 주석을 위해 쉽고 저렴하게 조작할 수 있는 모델이 필요합니다. 담배 연기 모방체 4-니트로퀴놀린 1-옥사이드(4NQO)로 처리된 마우스는 예상대로 ESCC 및 식도 전종양을 형성합니다. 참고로, 4NQO 병변은 구강, 가장 일반적으로 혀와 전위에서도 발생하며, 모두 층화 편평 상피를 공유합니다. 그러나 이러한 마우스는 동종 마우스 모델을 생성하는 데 시간과 리소스가 많이 소요되기 때문에 기능 가설 테스트를 위해 간단히 조작할 수 없습니다. 여기에서 우리는 생체 외에서 쥐 ESCC 또는 전종양 세포를 특성화하기 위해 4NQO로 처리된 마우스에서 단일 세포 유래 3차원(3D) 오가노이드를 생성함으로써 이러한 한계를 극복합니다. 이러한 오가노이드는 ESCC와 식도 전종양의 두드러진 특징을 포착하고, 저렴하고 신속하게 활용하여 동종 모델을 형성할 수 있으며, 동종 이식 실험에 활용할 수 있습니다. 우리는 정상, 전종양 및 SCC 쥐 식도 조직에서 3D 오가노이드를 생성하고 이러한 오가노이드를 유지 및 냉동 보존하는 방법을 보여줍니다. 이러한 다용도 오가노이드의 응용 분야는 광범위하며 유전자 조작 마우스의 활용과 유세포 분석 또는 면역조직화학에 의한 추가 특성 분석, CRISPR 기술을 사용한 동종 오가노이드 라인 생성, 약물 스크리닝 또는 동유전자 이식을 포함합니다. 우리는 이 프로토콜에서 입증된 기술의 광범위한 채택이 ESCC의 심각한 부담을 해결하기 위해 이 분야의 발전을 가속화할 것이라고 믿습니다.

이 프로토콜은 음용수로 투여된 16주간의 4NQO와 10주에서 12주간의 관찰 기간으로 구성된 특정 치료 요법에 따라 4NQO 처리된 마우스의 정상 식도 조직 또는 ESCC 종양 조직에서 쥐 식도 오가노이드(MEO)를 생성하는 과정을 설명합니다(그림 1). 그런 다음 마우스는 혀 또는 식도 조직의 해부를 위해 안락사됩니다(그림 2 및 그림 3). 우리는 손상되지 않은 식도에서 상피층을 분리하는 방법(그림 4)을 후속 단일 세포 분리에 활용하는 방법을 설명합니다. 식도 유래 상피 세포는 처음에 기저막 기질 및 잘 특성화된 무혈청 세포 배양 배지(그림 5)에 세포를 포함하는 50μL 액적에 웰당 5,000개의 세포로 도말하고 평균 7-10일 동안 오가노이드를 형성하도록...

이 프로토콜은 화학적 발암을 통해 유도된 정상, 전종양 및 편평 세포 암종 병변을 나타내는 쥐 구강-식도 3D 오가노이드를 생성하고 특성화하는 주요 단계를 설명합니다.

3D 오가노이드에서 구강-식도 편평 세포 암종 모델링

Esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) is prevalent worldwide, accounting for 90% of all esophageal cancer cases each year, and is the deadliest of all ...

식도 편평 세포 암종(ESCC)은 치명적이며 전 세계적으로 널리 퍼져 있습니다. 3차원 오가노이드는 ESCC의 심각한 부담을 해결하기 위해 현장의 진행을 가속화하는 데 활용될 수 있습니다. 4NQO로 처리된 마우스의 단일 세포 유래 3D 오가노이드는 ESCC 개시 및 개발에 수반되는 분자 변화의 기능적 주석을 위해 쉽고 저렴하게 조작할 수 있습니다.이 모델은 돌연변이원 유발 종양의 유전적 이질성을 포착합니다. 따라서 이러한 오가노이드는 새로운 치료 전략을 테스트하거나 종양 형성을 유발하는 두드러진 유전적 변화를 식별하기 위한 생리학적으로 관련된 플랫폼을 제공합니다. 동물 해부 및 장기 수집을 시연하는 데 도움을 주는 것은 직원 동료인 Yasuto Tomita가 될 것이며, 파라핀 포매 절차를 위한 오가노이드 준비를 시연하는 것은 제 실험실의 박사후 연구원인 Norihiro Matsuura가 될 것입니다.시작하려면 복부 중간 털을 꼬집고 수술 용 가위를 사용하여 안락사 된 생쥐의 피부를 열고 하복부에서 턱까지 두개골, 복부 정중선을 절개합니다. 정중선 절개에서 시작하여 마우스 양쪽의 팔다리까지 방사형 절단을하고 피부 플랩을 팽창시킵니다. 자궁 경부 기관을 노출시키기 위해 해부 가위를 사용하여 정중선에서 타액선을 나눕니다.흉부 기관을 노출시키려면 흉골을 제거하십시오. 집게로 복막을 부드럽게 꼬집고 들어 올리고 가위를 사용하여 복막을 두개골로 나눕니다. 그리고 흉곽을 따라 측면으로.횡격막의 꼬리 표면에서 간을 부드럽게 수축시키고 가위를 사용하여 흉골 노치, 특히 xiphoid process의 등쪽 표면에서 횡격막에 작은 절개를합니다. 흉곽이 흉부 내용물에서 분리되면 횡격막의 절개 부위에 가위를 삽입하고 흉골의 등쪽 표면에 밀착 된 자궁 경부 거들을 두개골로 해부하여 아래 장기의 손상을 방지합니다. 가위를 사용하여 흉골 양쪽의 갈비뼈를 자르고 흉골을 제거합니다.복부 식도를 노출시키려면 집게로 앞쪽을 잡고 위를 부드럽게 들어 올립니다. 가위를 사용하여 위와 식도에서 비장, 췌장 및 장간막을 해부합니다. 흉부 식도를 노출시키려면 즉시 갑상선 연골에 꼬리가 있는 기관을 부드럽게 들어 올리고 홍채 가위를 사용하여 기관 등쪽의 식도를 해부합니다.홍채 가위로 갑상선 연골의 기관을 나눕니다. 식도의 나머지 부분을 꼬리 방향으로 조심스럽게 해부하여 기관을 떼어냅니다. 기관과 함께 폐, 심장 및 흉선을 모두 제거하십시오.가위로 유문에

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Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

표시 셀 다중 광자 현미경을 통해 혀를 이내 구강 암 종양 침략의 양적 모니터링 마우스 모델을 생성에 관련된 기술의 포괄적인 개요는 제공됩니다. 이 시스템은 침입 방지 화합물의 분자 평가 및 약물 효능을위한 유용한 플랫폼이 될 수 있습니다.

구강 편평 세포 암종의 Orthotopic 마우스 모델에서 종양 세포 침략의 다중 광자 이미징

종양에서 유래한 오가노이드는 종양의 병리학적 특징과 장기 특이적 세포 계통을 유지할 수 있는 일종의 3D 세포 배양 모델입니다. 예시 프로토콜에서는 과학자들이 유전자 조작 마우스 모델로부터 전립선 종양으로부터 오가노이드를 생성하는 것을 볼 수 있습니다.

종양에서 오가노이드 준비: 3D 체외 종양 모델

이 비디오는 탈세포화된 돼지 골격 내에서 1차 인간 식도 섬유아세포와 편평 상피 세포를 공동 배양하여 인간 유기형 식도 구조를 생성하는 체외 배양 기술에 대해 설명합니다. 이러한 3D 배양 모델은 생체 내 조직 모델의 기능과 생리학을 모방합니다.

식도 3D 뗏목 배양 모델: 인간 식도 점막 모델을 생성하는 체외 배양 기술

이 원고는 생산, 특성화 및 일반 차 인간의 식도 섬유 아세포와 드 cellularized 돼지 비계 내에서 시드 편평 상피 세포로부터 제조 된 조직 설계 3D 식도 구조의 사용 가능성에 대해 설명합니다. 결과 정상적인 인간 식도 유사한 성숙한 상피 성층의 형성을 입증한다.

3 차원 조직 공학 인간의 식도 점막 모델의 제조, 특성 및 사용 가능성

여기, 우리이 두 아키텍처는 3D organotypic 흑색 종 회전 타원 체 피부 모델을 생성 하는 프로토콜을 제시 하 고 다세포 복잡 한 기관/종양에 vivo에 의 하지만 같은 시간에 수용 체계적인 실험 내정간섭입니다.

3D Organotypic 흑색 종 회전 타원 체 피부 모델

시험관내 모델 시스템은 폐암 관련 섬유아세포(CAFs)와 3차원(3D) 공동 배양에서 폐 편평상피암(LUSC) 진행 동안 조직 건축 변화를 포착하기 위해 개발되었다. 이 오르가노이드 시스템은 종양 표현형을 조절하는 다양한 종양 세포 본질 및 외인성 변화의 역할을 조사하는 독특한 플랫폼을 제공한다.

폐 편평상피암 진행을 모델링하는 다차원 동문화 시스템

이 기사는 근접성 및 말단 상피 폐 세포를 메센키메와 함께 포함하는 3차원 전체 폐 오르가노이드로 유도된 다능성 줄기 세포의 단계 현명한 분화를 설명합니다.

폐 발달 생물학 및 질병을 모델링하기위한 유도 다능성 줄기 세포에서 3D 전체 폐 오르간노이드의 생성

이 프로토콜은 단일 세포 소화가 있거나없는 식도 선암종 오가노이드의 계대 배양 및 냉동 보존 방법을 설명하여 연구자가 실험 설계에 따라 적절한 전략을 선택할 수 있도록합니다.

식도 선암종 오가노이드의 하위 배양 및 동결 보존 : 단일 세포 소화를위한 장단점

이 프로토콜은 차등 원심분리를 통해 원발성 정상 및 종양 유방 조직에서 상피 오가노이드를 생성하는 접근 방식에 대해 논의합니다. 또한 3차원 배양 및 포매된 오가노이드의 면역형광 이미징에 대한 지침이 포함되어 있습니다.

계대증 없이 정상 및 종양 유방 조직에서 마우스 및 인간 상피 오가노이드 생성 및 이미징

오가노이드-섬유아세포 공동배양은 생체 내 줄기세포 틈새를 연구하기 위한 모델을 제공한다. 여기서, 식도 오가노이드-섬유아세포 공동배양을 위한 프로토콜이 기재되어 있다. 또한 전체 마운트 이미징을 사용하여 섬유아세포-오가노이드 상호작용을 시각화합니다.

Functional Characterization and Visualization of Espacageal Fibroblasts using organoid co-cultures (오가노이드 공동 배양을 이용한 식도 섬유아세포의 기능적 특성 분석 및 시각화)

본 프로토콜은 종양 진행의 여러 단계를 나타내는 식도 오가노이드 모델의 확립 및 조직학적 분석을 설명합니다. 이 방법을 통해 연구자들은 정상 조직에서 암 조직으로 전환하는 동안 세포 형태, 공간 조직 및 분자 마커 발현 패턴의 변화를 연구할 수 있습니다.

정상 조직에서 암 조직으로의 진행을 모델링하는 식도 오가노이드의 확립 및 조직학적 분석

학습하세요 4NQO로 유도한 구강-식도 편평 세포 암종의 3D 오가노이드 생성 및 특성 분석 방법을. 이 모델은 종양 유전적 이질성을 포착하여 새로운 치료 전략 테스트와 암 발생 유전자 변화 연구에 활용됩니다.

3D 오가노이드에서 구강-식도 편평 세포 암종 모델링

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